CN107831198B - 一种基于多级微米立方锡酸锌复合材料的光电化学心肌钙蛋白i传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于多级微米立方锡酸锌复合材料的光电化学心肌钙蛋白i传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于多级微米立方锡酸锌复合材料的光电化学心肌钙蛋白I传感器的制备方法及应用，属于光电化学传感器领域。以聚吡咯/氮缺位的石墨相氮化碳为模板，合成多级结构的Zn2SnO4立方体，用氮、硫掺杂的石墨烯量子点N,S‑GQDs来敏化Zn2SnO4，增强其可见光吸收，再原位生长CdS纳米粒子，得到光电活性显著提高的多级微米立方锡酸锌复合材料Zn2SnO4/N,S‑GQDs/CdS，通过层层自组装方法，将心肌钙蛋白I抗体、牛血清白蛋白和心肌钙蛋白I抗原组装到Zn2SnO4/N,S‑GQDs/CdS复合材料上，利用Zn2SnO4/N,S‑GQDs/CdS优异的光电活性以及心肌钙蛋白I抗原抗体之间的特异性结合，实现对心肌钙蛋白I的超灵敏检测，这对心肌钙蛋白I的分析检测具有重要的意义。

Description

一种基于多级微米立方锡酸锌复合材料的光电化学心肌钙蛋 白I传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种基于多级微米立方锡酸锌复合材料的光电化学心肌钙蛋白I传感器的制备方法及应用，使用电化学工作站以三电极体系进行测试，以LED灯为光电化学发光信号源，以聚吡咯/氮缺位的石墨相氮化碳为模板，合成多级结构的Zn2SnO4立方体，用N,S-GQDs来敏化Zn2SnO4，再原位生长CdS纳米粒子，得到光电活性显著提高的多级微米立方锡酸锌复合材料Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS，以Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS作为基底材料，制备了一种基于多级微米立方锡酸锌复合材料的光电化学心肌钙蛋白I传感器，属于光电化学传感器领域。
背景技术
流行病学数据表明心血管疾病是世界死亡率升高的主要原因之一。出于这个原因，欧洲美国心脏病学会和美国心脏病学会委员会决心建议人类CRP与人心肌肌钙蛋白进行高灵敏度测试。人的心肌钙蛋白I是心肌钙蛋白复合物的亚单位之一，具有较高的心肌特异性及敏感度，是心肌损伤的特异性生物标志物，被称为临床的“黄金标准”。因此，对心肌钙蛋白I的早期诊断很重要。
目前，心肌钙蛋白I的测定方法很多，1987年Commins采用多克隆抗体建立放射免疫分析法检测心肌钙蛋白I浓度；Larued等的心肌钙蛋白I单抗酶免疫检测法；还有研究者将金或硒标记单克隆抗体与免疫层析技术相结合，用纸条法定量或半定量检测心肌钙蛋白I浓度。应当注意的是，虽然心肌钙蛋白I的检测方法很多，但因其定量测定受到许多因素的影响，具有灵敏度低，检测周期长，步骤繁琐等缺点。为了克服以上传统分析方法的缺点，本发明设计了一种特异性强，灵敏度高，选择性好，操作快速简便的光电化学免疫分析方法。
本发明利用光电化学分析法，以聚吡咯/氮缺位的石墨相氮化碳为模板，合成多级结构的Zn2SnO4立方体，其较大的表面积和优良的导电性能能够有效减小背景信号并提高传感器的导电性。用N,S-GQDs来敏化Zn2SnO4，增强其可见光吸收。再原位生长CdS纳米粒子，得到光电活性显著提高的多级微米立方锡酸锌复合材料Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS。该复合材料具有非常优异的光电化学活性，提高了传感器的灵敏度，扩宽了线性范围，有效地降低了传感器的检出限，实现了对心肌钙蛋白I的超灵敏分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测心肌钙蛋白I提供了新途径。
发明内容
本发明的目的之一是以聚吡咯/氮缺位的石墨相氮化碳为模板，合成多级结构的Zn2SnO4立方体，用N,S-GQDs来敏化Zn2SnO4，以原位生长窄带隙的CdS作为信号放大材料，得到多级微米立方锡酸锌复合材料Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS。
本发明的目的之二是以Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS复合材料为基底材料，利用抗原抗体的特异性结合，构建一种选择性好、快速且超灵敏的光电化学传感器，实现心肌钙蛋白I的快速、灵敏检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于多级微米立方锡酸锌复合材料的光电化学心肌钙蛋白I传感器的制备方法，所述的多级微米立方锡酸锌复合材料为氮、硫掺杂石墨烯量子点N,S-GQDs和硫化镉CdS共敏化的多级微米立方锡酸锌Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS，所述的光电化学心肌钙蛋白I传感器由ITO工作电极、Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS、心肌钙蛋白I抗体、牛血清白蛋白、心肌钙蛋白I抗原组成；
其特征在于，所述的制备方法包括以下制备步骤：
一、Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS的制备；
二、光电化学心肌钙蛋白I传感器的制备；
其中，步骤一制备Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS的具体步骤为：
（1）在10 ~ 20 mL超纯水和10 ~ 20 mL乙醇混合物中加入0.03 ~ 0.3 g聚吡咯/氮缺位的石墨相氮化碳PPy/g-C3N4-VN模板，超声0.5 ~ 1 h，然后继续加入1.25 ~ 2.5mmol锌盐和0.625 ~ 1.25 mmol锡盐，之后，逐滴滴加5 ~ 10 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，搅拌15 ~ 30 min，把悬浮液转移至50 ~ 100 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在200℃中加热反应20 ~ 28 h，将所得产物用乙醇和超纯水各离心洗涤3次，最后干燥得到Zn2SnO4粉末，将其溶于超纯水中，得到Zn2SnO4悬浮液；
（2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，用氮气吹干后，将8 ~ 10 µL的Zn2SnO4悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干；
（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰3 ~ 4 µL、浓度为1 ~ 7 mg/mL的N,S-GQDs溶液，室温下晾干；在电极表面进一步修饰3 ~ 4 µL、0.08 mol/L的Cd(NO3)2，室温下反应20~ 40 min，超纯水冲洗，继而修饰3 ~ 4 µL、0.1 mol/L的Na2S，室温下反应20 ~ 40 min，超纯水冲洗，制得Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS；
所述的锌盐选自下列之一：氯化锌、硫酸锌、硝酸锌；
所述的锡盐选自下列之一：氯化锡、硫酸锡、硝酸锡；
其中，步骤二制备光电化学心肌钙蛋白I传感器的具体步骤为：
（a）在步骤一中得到的Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS修饰的ITO工作电极表面修饰3 ~ 4µL、0.1 mol/L的巯基乙酸，室温下晾干，继续滴加3 ~ 4 μL的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
（b）在步骤（a）中得到的电极表面修饰4 ~ 5 µL、8 ~ 10 µg/mL的心肌钙蛋白I抗体，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
（c）在步骤（b）中得到的电极表面修饰4 ~ 5 µL的1 ~ 1.5 %牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即制得光电化学心肌钙蛋白I传感器；
所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺含1×10-2mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺。
2. 所制备的光电化学心肌钙蛋白I传感器的应用，其特征在于，包括如下应用步骤：
a. 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液；
b. 工作电极修饰：将所制备的光电化学心肌钙蛋白I传感器作为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液分别滴涂到工作电极表面；
c. 工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系，在PBS缓冲溶液中进行测试；采用i-t测试手段对分析物进行检测，设置电压为0 V，运行时间100 s，激发光源为LED灯；检测对不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；含有不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液的光电流强度记为I i，I i与心肌钙蛋白I标准溶液浓度c的对数之间成线性关系，绘制I i -logc工作曲线；
d. 心肌钙蛋白I的检测：用待测的人体血清样品代替步骤b中的心肌钙蛋白I标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光电流强度I和工作曲线，得到待测样品中心肌钙蛋白I的含量；
所述的PBS缓冲溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的含0.1 mol/L抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。
本发明的有益成果
（1）本发明以聚吡咯/氮缺位的石墨相氮化碳为模板，合成多级结构的Zn2SnO4立方体，它具有良好的光电活性、大的表面积、高稳定性和低成本等优点，能有效减小背景信号，增加对功能材料的负载，提高材料的导电性，增强传感器的灵敏度。
（2）用N,S-GQDs来敏化Zn2SnO4，可以加速电子空穴对的分离、增加其导电性，提高传感器的光电性能。同时，以原位生长窄带隙的CdS作为信号放大材料，得到多级微米立方锡酸锌复合材料Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS，该复合材料具有非常优异的光电化学活性，有效促进电子转移和降低电子空穴对的复合，从而提高光电转化效率，进一步增强传感器的光电活性。
（3）以Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS复合材料为基底材料，它优异的光电活性提高了传感器的灵敏度，扩宽了线性范围，有效地降低了传感器的检出限，实现了对心肌钙蛋白I的超灵敏检测。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此
实施例1 制备Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS的具体步骤为：
（1）在10 mL超纯水和10 mL乙醇混合物中加入0.03 g聚吡咯/氮缺位的石墨相氮化碳PPy/g-C3N4-VN模板，超声0.5 h，然后继续加入1.25 mmol氯化锌和0.625 mmol氯化锡，之后，逐滴滴加5 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，搅拌15 min，把悬浮液转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在200℃中加热反应24 h，将所得产物用乙醇和超纯水各离心洗涤3次，最后干燥得到Zn2SnO4粉末，将其溶于超纯水中，得到Zn2SnO4悬浮液；
（2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，用氮气吹干后，将10 µL的Zn2SnO4悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干；
（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰4 µL、浓度为1 mg/mL的N,S-GQDs溶液，室温下晾干；在电极表面进一步修饰4 µL、0.08 mol/L的Cd(NO3)2，室温下反应40 min，超纯水冲洗，继而修饰4 µL、0.1 mol/L的Na2S，室温下反应40 min，超纯水冲洗，制得Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS；
实施例2制备Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS的具体步骤为：
（1）在10 mL超纯水和10 mL乙醇混合物中加入0.1 g聚吡咯/氮缺位的石墨相氮化碳PPy/g-C3N4-VN模板，超声0.5 h，然后继续加入1.25 mmol氯化锌和0.625 mmol氯化锡，之后，逐滴滴加5 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，搅拌15 min，把悬浮液转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在200℃中加热反应24 h，将所得产物用乙醇和超纯水各离心洗涤3次，最后干燥得到Zn2SnO4粉末，将其溶于超纯水中，得到Zn2SnO4悬浮液；
（2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，用氮气吹干后，将10 µL的Zn2SnO4悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干；
（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰4 µL、浓度为3 mg/mL的N,S-GQDs溶液，室温下晾干；在电极表面进一步修饰4 µL、0.08 mol/L的Cd(NO3)2，室温下反应40 min，超纯水冲洗，继而修饰4 µL、0.1 mol/L的Na2S，室温下反应40 min，超纯水冲洗，制得Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS；
实施例3制备Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS的具体步骤为：
（1）在10 mL超纯水和10 mL乙醇混合物中加入0.3 g聚吡咯/氮缺位的石墨相氮化碳PPy/g-C3N4-VN模板，超声1 h，然后继续加入2.5 mmol氯化锌和1.25 mmol氯化锡，之后，逐滴滴加5 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，搅拌30 min，把悬浮液转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在200℃中加热反应28 h，将所得产物用乙醇和超纯水各离心洗涤3次，最后干燥得到Zn2SnO4粉末，将其溶于超纯水中，得到Zn2SnO4悬浮液；
（2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，用氮气吹干后，将10 µL的Zn2SnO4悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干；
（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰4 µL、浓度为7 mg/mL的N,S-GQDs溶液，室温下晾干；在电极表面进一步修饰4 µL、0.08 mol/L的Cd(NO3)2，室温下反应40 min，超纯水冲洗，继而修饰4 µL、0.1 mol/L的Na2S，室温下反应40 min，超纯水冲洗，制得Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS；
实施例4制备光电化学心肌钙蛋白I传感器的具体步骤为：
（1）在Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS修饰的ITO工作电极表面修饰3 µL、0.1 mol/L的巯基乙酸，室温下晾干，继续滴加4 μL的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
（2）在步骤（1）中得到的电极表面修饰4 µL、8 µg/mL的心肌钙蛋白I抗体，反应40min后用超纯水冲洗，自然晾干；
（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰4 µL的1 %牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应40 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即制得光电化学心肌钙蛋白I传感器；
所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺含1×10-2mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺。
实施例5制备光电化学心肌钙蛋白I传感器的具体步骤为：
（1）在Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS修饰的ITO工作电极表面修饰4 µL、0.1 mol/L的巯基乙酸，室温下晾干，继续滴加4 μL的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
（2）在步骤（1）中得到的电极表面修饰5 µL、10 µg/mL的心肌钙蛋白I抗体，反应40min后用超纯水冲洗，自然晾干；
（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰5 µL的1.5 %牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应40 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即制得光电化学心肌钙蛋白I传感器；
所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺含1×10-2mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺。
实施例6所制备的光电化学心肌钙蛋白I传感器的应用，其特征在于，包括如下应用步骤：
a. 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液；
b. 工作电极修饰：将所制备的光电化学心肌钙蛋白I传感器作为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液分别滴涂到工作电极表面；
c. 工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系，在PBS缓冲溶液中进行测试；采用i-t测试手段对分析物进行检测，设置电压为0 V，运行时间100 s，激发光源为LED灯；检测对不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；含有不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液的光电流强度记为I i，I i与心肌钙蛋白I标准溶液浓度c的对数之间成线性关系，绘制I i -logc工作曲线；
d. 心肌钙蛋白I的检测：用待测的人体血清样品代替步骤b中的心肌钙蛋白I标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光电流强度I和工作曲线，得到待测样品中心肌钙蛋白I的含量；
所述的PBS缓冲溶液为10 mL、pH为5.0 ~ 8.0的含0.1 mol/L抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。

Claims (2)

1.一种基于多级微米立方锡酸锌复合材料的光电化学心肌钙蛋白I传感器的制备方法，所述的多级微米立方锡酸锌复合材料为氮、硫掺杂石墨烯量子点N,S-GQDs和硫化镉CdS共敏化的多级微米立方锡酸锌Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS，所述的光电化学心肌钙蛋白I传感器由ITO工作电极、Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS、心肌钙蛋白I抗体、牛血清白蛋白、心肌钙蛋白I抗原组成；
其特征在于，所述的制备方法包括以下制备步骤：
一、Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS的制备；
二、光电化学心肌钙蛋白I传感器的制备；
其中，步骤一制备Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS的具体步骤为：
（1）在10 ~ 20 mL超纯水和10 ~ 20 mL乙醇混合物中加入0.03 ~ 0.3 g聚吡咯/氮缺位的石墨相氮化碳PPy/g-C3N4-VN模板，超声0.5 ~ 1 h，然后继续加入1.25 ~ 2.5 mmol锌盐和0.625 ~ 1.25 mmol锡盐，之后，逐滴滴加5 ~ 10 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，搅拌15 ~30 min，把悬浮液转移至50 ~ 100 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在200℃中加热反应20 ~ 28 h，将所得产物用乙醇和超纯水各离心洗涤3次，最后干燥得到Zn2SnO4粉末，将其溶于超纯水中，得到Zn2SnO4悬浮液；
（2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30min，用氮气吹干后，将8 ~ 10 µL的Zn2SnO4悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干；
（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰3 ~ 4 µL、浓度为1 ~ 7 mg/mL的N,S-GQDs溶液，室温下晾干；在电极表面进一步修饰3 ~ 4 µL、0.08 mol/L的Cd(NO3)2，室温下反应20 ~ 40min，超纯水冲洗，继而修饰3 ~ 4 µL、0.1 mol/L的Na2S，室温下反应20 ~ 40 min，超纯水冲洗，制得Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS；
所述的锌盐选自下列之一：氯化锌、硫酸锌、硝酸锌；
所述的锡盐选自下列之一：氯化锡、硫酸锡、硝酸锡；
其中，步骤二制备光电化学心肌钙蛋白I传感器的具体步骤为：
（a）在步骤一中得到的Zn2SnO4/N,S-GQDs/CdS修饰的ITO工作电极表面修饰3 ~ 4 µL、0.1 mol/L的巯基乙酸，室温下晾干，继续滴加3 ~ 4 μL的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
（b）在步骤（a）中得到的电极表面修饰4 ~ 5 µL、8 ~ 10 µg/mL的心肌钙蛋白I抗体，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
（c）在步骤（b）中得到的电极表面修饰4 ~ 5 µL的1 ~ 1.5 %牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即制得光电化学心肌钙蛋白I传感器；
所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺含1×10-2 mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺。
2.如权利要求1所述的制备方法所制备的光电化学心肌钙蛋白I传感器的应用，其特征在于，包括如下应用步骤：
a. 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液；
b. 工作电极修饰：将如权利要求1所述的制备方法所制备的光电化学心肌钙蛋白I传感器作为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液分别滴涂到工作电极表面；
c. 工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系，在PBS缓冲溶液中进行测试；采用i-t测试手段对分析物进行检测，设置电压为0 V，运行时间100 s，激发光源为LED灯；检测对不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；含有不同浓度的心肌钙蛋白I标准溶液的光电流强度记为I i，I i与心肌钙蛋白I标准溶液浓度c的对数之间成线性关系，绘制I i - logc工作曲线；
d. 心肌钙蛋白I的检测：用待测的人体血清样品代替步骤b中的心肌钙蛋白I标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光电流强度I和工作曲线，得到待测样品中心肌钙蛋白I的含量；
所述的PBS缓冲溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的含0.1 mol/L抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。
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