CN111273022B - 一种基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于纳米金‑石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，采用了K2CO3加入金纳米颗粒溶液中混合，然后加入肌钙蛋白抗体，从而使得肌钙蛋白抗体负载于金纳米颗粒上，再加入牛血清白蛋白溶液，来封闭掉肌钙蛋白抗体上的其它活性位点。然后在对检测溶液进行洗涤后，重悬于牛血清白蛋白溶液中，来稳定制备得到的检测溶液。对肌钙蛋白检测溶液进行的检测中引入了石墨烯量子点，被肌钙蛋白抗体修饰的纳米金与石墨烯量子点的荧光共振能量转移，快速准确的检测出肌钙蛋白的浓度，从而快速检测出待测血清样品中肌钙蛋白的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及肌钙蛋白的检测技术领域，具体涉及一种基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法。
背景技术
肌钙蛋白是组成横纹肌细肌丝的结构蛋白，其亚单位为肌钙蛋白I(CTnI)、肌钙蛋白T(cTnT)和肌钙蛋白C(cTnC)。心肌钙蛋白I(cTnI)是一个分子量为22 .5KD的心肌蛋白，它与肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白C(TnC)一起形成一个心肌钙蛋白复合物，共同完成细胞内肌动蛋白间相互作用的钙信号传递的基本功能。
目前，检测肌钙蛋白的方法有：酶联免疫吸附法、化学发光法、酶联荧光分析法、胶体金免疫层析法、免疫比浊法、金标银染法、质谱分析法、生物传感器技术等。其中，酶联免疫吸附法的测定周期长、灵敏度相对较低、线型范围偏窄的问题，从而限制了该方法的进一步应用。化学发光法是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术。酶联荧光分析法采用了一步夹心与酶联荧光相结合的方法，操作方便，但是检测范围受限。胶体金免疫层析法仅能用于肌钙蛋白的定性分析。免疫比浊分析法属于液相沉淀实验，其原理是将抗体、抗原在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物，在增浊剂的作用下，迅速形成免疫复合物微粒，使反应液出现浊度。金标银染法是预先准备好膜基底和免疫金探针，集合一步法双单克隆抗体夹心技术、蛋白质芯片技术、纳米金探针技术以及纳米颗粒上的银染放大技术对肌钙蛋白进行快速测定的方法，但是目前还处于初步探索阶段，尚不成熟。质谱分析法通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量于电荷壁纸的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质，这种方法也只能定性分析，不能定量分析，尚需进一步探索研究。生物传感器由生物敏感膜、换能器和电子线路三部分构成，待分析物扩散进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生生物学反应，产生的信息被换能器转变成可定量处理的电信号，再经电子线路放大并输出，尽管有广谱的测定能力，但是，目前的检测质量控制手段不完善，有待进一步提高和成熟。
因此，亟需探索研究新的肌钙蛋白检测方法来实现对肌钙蛋白的快速、准确的定量检测并且检测质量可控。
发明内容
为了克服以上问题，本发明旨在提供一种基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白检测溶液的制备方法和肌钙蛋白浓度的检测方法，从而实现肌钙蛋白的快速、准备地检测。
为了实现上述目的，本发明提供了一种基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，包括：
步骤A1：制备肌钙蛋白检测溶液：其中，
步骤01：将K2CO3加入金纳米颗粒溶液中混合，得到第一混合溶液；
步骤02：向第一混合溶液中加入肌钙蛋白抗体，搅拌均匀，得到第二混合溶液；
步骤03：向第二混合溶液中加入第一浓度的牛血清白蛋白溶液，搅拌均匀，得到肌钙蛋白检测溶液；
步骤A2：在所述肌钙蛋白检测溶液中加入不同预设浓度肌钙蛋白的血清样品；
步骤A3：在完成步骤A2的肌钙蛋白检测溶液中加入石墨烯量子点，得到具有不同预设浓度肌钙蛋白的荧光检测溶液。
步骤A4：对含有不同预设浓度的肌钙蛋白的所述荧光检测溶液进行激发，得到不同预设浓度的肌钙蛋白所对应的标准光致发光图谱；
步骤A5：根据不同预设浓度的肌钙蛋白所对应的标准光致发光图谱进行拟合得到，肌钙蛋白浓度与荧光强度的关系；
步骤A6：将实际待测血清样品加入采用步骤A1的方法制备的肌钙蛋白检测溶液中；
步骤A7：在完成步骤A6的检测溶液中加入石墨烯量子点，得到实际荧光检测溶液；
步骤A8：对实际荧光检测溶液进行激发，得到实际待测血清样品的光致发光图谱；
步骤A9：根据实际待测血清样品的光致发光图谱中的荧光强度，对应所述步骤A5中得到的肌钙蛋白浓度与荧光强度的关系，计算出实际待测血清样品中的肌钙蛋白浓度。
在一些实施例中，所述步骤03之后，还包括步骤04：首先，将检测溶液进行洗涤；然后，重悬于第二浓度的牛血清白蛋白溶液中。
在一些实施例中，所述步骤04中，将检测溶液进行洗涤的过程包括：采用多次离心，将上清液倒掉的方法；所述步骤04中，所述第二浓度小于所述第一浓度。
在一些实施例中，所述第一浓度为牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白的质量百分比为5~10%；所述第二浓度为牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白的质量百分比为1~3%。
在一些实施例中，所述步骤01中，所述K2CO3与金纳米颗粒混合后，调节第一混合溶液的PH值大于8；所述K2CO3的摩尔质量与所述金纳米颗粒的摩尔质量的比为（1~2）:1；所述金纳米颗粒溶液的体积为2~3ml。
在一些实施例中，所述步骤02中，所述肌钙蛋白抗体的浓度为10~15mg/ml，所述肌钙蛋白抗体的体积为1~1.5ml；所述步骤03中，所述牛血清白蛋白溶液的体积为800~890μl。
在一些实施例中，所述步骤A5中，拟合得到的肌钙蛋白浓度与荧光强度的关系为：Y=932X+2444，其中，X表示lgC，C为肌钙蛋白浓度；Y表示荧光强度差，Y=(F-F0)/F0；其中，F加入肌钙蛋白血清样品的荧光强度，F0为没有加入肌钙蛋白血清样品的荧光强度。
在一些实施例中，所述步骤A2中，血清样品的体积与所述肌钙蛋白检测溶液的体积比为1:1；所述步骤A2中，还同时对肌钙蛋白检测溶液进行恒温加热。
在一些实施例中，所述恒温加热的温度为30~40°C。
在一些实施例中，所述步骤A3中，加入的石墨烯量子点的浓度为0.05~0.1mg/ml；所述步骤A3中，还同时对肌钙蛋白检测溶液进行恒温加热。
本发明提供了一种基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，包括肌钙蛋白检测溶液的制备方法和肌钙蛋白浓度的检测方法，采用了K2CO3加入金纳米颗粒溶液中混合，得到第一混合溶液，在第一混合溶液中加入肌钙蛋白抗体，从而使得肌钙蛋白抗体负载于金纳米颗粒上，并且，加入牛血清白蛋白溶液，来封闭掉肌钙蛋白抗体上的其它活性位点，使得所制备的检测溶液仅能够结合肌钙蛋白抗原，来达到检测肌钙蛋白抗原的目的。此外，在对检测溶液进行洗涤后，重悬于牛血清白蛋白溶液中，来稳定制备得到的检测溶液。本发明的制备方法，制备简单，成本低廉，有利于后续对肌钙蛋白的快速检测。此外，在本发明的肌钙蛋白检测溶液的制备方法的基础上，对肌钙蛋白检测溶液进行的检测方法，引入了石墨烯量子点，被肌钙蛋白抗体修饰的纳米金与石墨烯量子点的荧光共振能量转移，快速准确的检测出肌钙蛋白的浓度。这里，由于纳米金被肌钙蛋白抗体修饰后，可以在激光辐射下，与石墨烯量子点发生能量共振，激发出荧光，从而使得肌钙蛋白抗原与荧光强度之间产生线性相关关系，快速检测出待测血清样品中肌钙蛋白的浓度。
附图说明
图1为本发明的一个实施例的肌钙蛋白检测溶液的制备方法的流程示意图
图2为本发明的一个实施例的肌钙蛋白浓度的检测方法的流程示意图
图3为本发明的一个实施例的在440nm激发光波长下，得到的具有不同预设浓度肌钙蛋白的荧光检测溶液的光致发光谱
图4为图3的光致发光谱的拟合曲线图
实施方式
为使本发明的内容更加清楚易懂，以下结合具体实施例，对本发明的内容作进一步说明。当然本发明并不局限于该具体实施例，本领域内的技术人员所熟知的一般替换也涵盖在本发明的保护范围内。
本发明提供了一种基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，实质上包括肌钙蛋白检测溶液的制备方法以及肌钙蛋白浓度的检测方法。接下来，以具体实施例来描述本发明的上述方法。
请参阅图1，本实施例的一种肌钙蛋白检测溶液的制备方法，包括：
步骤01：将K2CO3加入金纳米颗粒溶液中混合，得到第一混合溶液；
具体的，K2CO3与金纳米颗粒混合后，调节第一混合溶液的PH值大于8。较佳的，K2CO3的摩尔质量与金纳米颗粒的摩尔质量的比为1:1；金纳米颗粒溶液的体积为2~3ml。K2CO3的摩尔质量为0.1~0.2M。
步骤02：向第一混合溶液中加入肌钙蛋白抗体，搅拌均匀，得到第二混合溶液；
具体的，肌钙蛋白抗体的浓度为10~15mg/ml，肌钙蛋白抗体的体积为1~1.5ml。
步骤03：向第二混合溶液中加入第一浓度的牛血清白蛋白溶液，搅拌均匀，得到检测溶液。
具体的，牛血清白蛋白溶液的体积为800~890μl。
此外，在步骤03之后，为了确保第二混合溶液的稳定性，还可以包括步骤04：首先，将检测溶液进行洗涤；然后，重悬于第二浓度的牛血清白蛋白溶液中。
具体的，检测溶液的洗涤过程包括：采用多次离心，每次离心将上清液倒掉的方法。较佳的，离心时，采用的温度为4~5°C，15~20min, 14000~15000 r/min。
较佳的，第二浓度小于第一浓度。为了避免第二次加入的牛血清白蛋白溶液对原有检测溶液的影像，第一浓度的牛血清白蛋白溶液中的牛血清白蛋白的质量白封闭为5~10%，而第二浓度的牛血清白蛋白溶液中的牛血清白蛋白的质量百分比为1~3%。
请参阅图2，本实施例的肌钙蛋白浓度的检测方法，包括：
步骤A1：采用上述方法制备肌钙蛋白检测溶液；
步骤A2：在肌钙蛋白检测溶液中加入不同预设浓度肌钙蛋白的血清样品；
具体的，血清样品的体积与肌钙蛋白检测溶液的体积比为1:1。还可以同时对肌钙蛋白检测溶液进行恒温加热，较佳的，肌钙蛋白检测溶液为50μL，恒温加热的温度为30~40°C，此外，恒温加热时间为20~30min。
步骤A3：在完成步骤A2的肌钙蛋白检测溶液中加入石墨烯量子点，得到具有不同预设浓度肌钙蛋白的荧光检测溶液；
具体的，还可以同时对肌钙蛋白检测溶液进行恒温加热，较佳的，加入的石墨烯量子点的浓度为0.05~0.1mg/ml，恒温加热的温度为30~40°C。此外，恒温加热时间可以为20~30min。
步骤A4：对含有不同预设浓度的肌钙蛋白的荧光检测溶液进行激发，得到不同预设浓度的肌钙蛋白所对应的标准光致发光图谱；
具体的，光致发光的检测，采用的激发光波长可以为440nm。请参阅图3，图3为本实施例的在440nm激发光波长下，得到的具有不同预设浓度肌钙蛋白的荧光检测溶液的光致发光谱。
步骤A5：根据不同预设浓度的肌钙蛋白所对应的标准光致发光图谱进行拟合得到，肌钙蛋白浓度与荧光强度的关系；
具体的，拟合得到的肌钙蛋白浓度与荧光强度的关系为：Y=932X+2444，其中，X表示lgC，C为肌钙蛋白浓度；Y表示荧光强度差，Y=(F-F0)/F0；其中，F加入肌钙蛋白血清样品的荧光强度，F0为没有加入肌钙蛋白血清样品的荧光强度。可以看到，肌钙蛋白浓度与荧光强度呈线性相关关系。请参阅图4，图4为本实施例中，根据图3拟合出的线性关系图。
步骤A6：将实际待测血清样品加入采用上述方法制备的肌钙蛋白检测溶液中；
步骤A7：在完成步骤A6的检测溶液中加入石墨烯量子点，得到实际荧光检测溶液；
步骤A8：对实际荧光检测溶液进行激发，得到实际待测血清样品的光致发光图谱；
步骤A9：根据实际待测血清样品的光致发光图谱中的荧光强度，对应步骤A5中得到的肌钙蛋白浓度与荧光强度的关系，计算出实际待测血清样品中的肌钙蛋白浓度。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然所述实施例仅为了便于说明而举例而已，并非用以限定本发明，本领域的技术人员在不脱离本发明精神和范围的前提下可作若干的更动与润饰，本发明所主张的保护范围应以权利要求书所述为准。
Claims (10)
1.一种基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，其特征在于，包括：
步骤A1：制备肌钙蛋白检测溶液：其中，
步骤01：将K2CO3加入金纳米颗粒溶液中混合，得到第一混合溶液；
步骤02：向第一混合溶液中加入肌钙蛋白抗体，搅拌均匀，得到第二混合溶液；
步骤03：向第二混合溶液中加入第一浓度的牛血清白蛋白溶液，搅拌均匀，得到肌钙蛋白检测溶液；
步骤A2：在所述肌钙蛋白检测溶液中加入不同预设浓度肌钙蛋白的血清样品；
步骤A3：在完成步骤A2的肌钙蛋白检测溶液中加入石墨烯量子点，得到具有不同预设浓度肌钙蛋白的荧光检测溶液；
步骤A4：对含有不同预设浓度的肌钙蛋白的所述荧光检测溶液进行激发，得到不同预设浓度的肌钙蛋白所对应的标准光致发光图谱；
步骤A5：根据不同预设浓度的肌钙蛋白所对应的标准光致发光图谱进行拟合得到，肌钙蛋白浓度与荧光强度的关系；
步骤A6：将实际待测血清样品加入采用步骤A1的方法制备的肌钙蛋白检测溶液中；
步骤A7：在完成步骤A6的检测溶液中加入石墨烯量子点，得到实际荧光检测溶液；
步骤A8：对实际荧光检测溶液进行激发，得到实际待测血清样品的光致发光图谱；
步骤A9：根据实际待测血清样品的光致发光图谱中的荧光强度，对应所述步骤A5中得到的肌钙蛋白浓度与荧光强度的关系，计算出实际待测血清样品中的肌钙蛋白浓度。
2.根据权利要求1所述的基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤03之后，还包括步骤04：首先，将检测溶液进行洗涤；然后，重悬于第二浓度的牛血清白蛋白溶液中。
3.根据权利要求2所述的基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤04中，将检测溶液进行洗涤的过程包括：采用多次离心，将上清液倒掉的方法；所述步骤04中，所述第二浓度小于所述第一浓度。
4.根据权利要求3所述的基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，其特征在于，所述第一浓度为牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白的质量百分比为5~10%；所述第二浓度为牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白的质量百分比为1~3%。
5.根据权利要求1所述的基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤01中，所述K2CO3与金纳米颗粒混合后，调节第一混合溶液的PH值大于8；所述K2CO3的摩尔质量与所述金纳米颗粒的摩尔质量的比为（1~2）:1；所述金纳米颗粒溶液的体积为2~3ml。
6.根据权利要求1所述的基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤02中，所述肌钙蛋白抗体的浓度为10~15mg/ml，所述肌钙蛋白抗体的体积为1~1.5ml；所述步骤03中，所述牛血清白蛋白溶液的体积为800~890μl。
7.根据权利要求1所述的基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤A5中，拟合得到的肌钙蛋白浓度与荧光强度的关系为：Y=932X+2444，其中，X表示lgC，C为肌钙蛋白浓度；Y表示荧光强度差，Y=(F-F0)/F0；其中，F加入肌钙蛋白血清样品的荧光强度，F0为没有加入肌钙蛋白血清样品的荧光强度。
8.根据权利要求1所述的基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤A2中，血清样品的体积与所述肌钙蛋白检测溶液的体积比为1:1；所述步骤A2中，还同时对肌钙蛋白检测溶液进行恒温加热。
9.根据权利要求8所述的基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，其特征在于，所述恒温加热的温度为30~40°C。
10.根据权利要求1所述的基于纳米金-石墨烯量子点的肌钙蛋白浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤A3中，加入的石墨烯量子点的浓度为0.05~0.1mg/ml；所述步骤A3中，还同时对肌钙蛋白检测溶液进行恒温加热。
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