CN114384246A - 一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒 - Google Patents

一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒，该试剂盒包括：生物素标记的CEA单抗一、标准浓度的CEA抗原、链霉亲和素标记的磁珠、CdTe量子点标记的CEA单抗二、激发液。激发液由PBS及KMnO4组成。激发液中KMnO4能够氧化CdTe量子点，产生闪光型单色近红外化学发光辐射，发光时间为1秒内，最大发射波长为785纳米。该试剂盒基于CdTe量子点与KMnO4产生闪光型化学发光的原理实现CEA抗原的检测，检测速度快，发光材料及激发液稳定易储存，化学发光波段单色性较好且位于近红外区。该试剂盒在0.1ng/mL‑100ng/mL的浓度范围内表现出良好的线性关系，检测限为0.05ng/mL，具有良好的临床应用前景。

Description

一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发 光免疫分析试剂盒
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒。
背景技术
化学发光免疫分析具有灵敏度高、检测速度快、操作简单和自动化程度高等优势，正在逐渐替代传统的酶联免疫检测技术。目前，商业化的化学发光免疫分析全部基于分子化学反应类化学发光体系实施，其发光标记物主要为鲁米诺、吖啶酯、金刚烷化合物分子等，辐射波段位于可见光区。
本发明的发明人前期专利文件CN113702638A公开了一种以CuInS2@ZnS纳米晶为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒。该试剂盒以CuInS2@ZnS纳米晶作发光物，以水合肼、过氧化氢为双元激发剂实现了CEA抗原检测。CuInS2@ZnS纳米晶/水合肼-过氧化氢体系可产生近红外化学发光辐射，但单色性较差(半峰宽为158纳米)；双元激发剂中水合肼为强还原性物质，可与过氧化氢发生反应从而导致激发液不易稳定储存。
众所周知，纳米粒子具有优异的光致发光与电致化学发光性能，已在基础研究领域被广泛用于光致发光与电致化学发光生化分析的发光标记物(Chem.Rev.2014,114,11027)。尽管已有报道显示纳米粒子亦可用作化学发光生化分析的标记物，但是纳米粒子在化学发光生化分析研究领域的应用主要以催化剂和增强剂的形式出现。因此，以纳米材料为发光标记物，开发具有性能稳定的、单色近红外化学发光体系对化学发光免疫分析的发展具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，尤其是以纳米粒子为发光标记物的单色高性能化学发光体系的种类有限，以及现有化学发光试剂盒激发液不容易存储的缺陷。本发明提供一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的近红外化学发光免疫分析试剂盒，该试剂盒采用性能稳定的CdTe量子点作为发光试剂，能够被稳定储存的KMnO4溶液作为化学发光激发剂，发光波段位于近红外区且具有较好的单色性，弥补了现有技术的不足。
术语解释：
CEA：癌胚抗原，英文名为carcinoembryonic antigen，简称CEA。
EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，英文名为1-(3-Dimethylaminopropyl)-ethylcarbodiimide hydrochloride，简称EDC。
磺基-NHS：N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，英文名为Hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonicacid sodium salt，简称磺基-NHS。
BSA：牛血清白蛋白，英文名为Albumin from bovine serum，简称BSA。
PBS：磷酸缓冲盐溶液的简称，主要成分包括K2HPO4、KH2PO4。
本发明的技术方案如下：
一种基于CdTe量子点定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒，包括：
生物素标记的CEA单抗一、标准浓度的CEA抗原、链霉亲和素标记的磁珠、CdTe量子点标记的CEA单抗二、激发液；
所述的激发液包括PBS和KMnO4。
根据本发明，优选的，所述的CdTe量子点标记的CEA单抗二是通过CEA单抗二上的氨基与CdTe量子点上的羧基偶联反应得到；
进一步优选的，制备过程包括步骤如下：
将1mL CdTe原液离心三次后复溶于1mL pH为6.0的0.1mol/L PBS溶液中，加入24μL100mg/mL EDC、64μL 100mg/mL磺基-NHS，活化羧基15-40分钟；离心后重新分散至0.9mL去离子水中；加入0.1mL 10μg/mL的CEA单抗二，混匀37℃下反应2小时，利用CEA单抗二上的氨基与CdTe量子点上的羧基偶联；加入0.02mL 1％的BSA封闭羧基活化位点20-40分钟，离心1-2次以除去未反应的CEA单抗二，重新分散于1mL PBS于4℃下保存备用。
根据本发明，优选的，激发液中：PBS浓度为0.05-0.2mol/L，最优选0.1mol/L，KMnO4浓度为0.005-0.4mol/L，最优选为0.01mol/L，激发液pH为3.0-10.0，最优选为6.0。
根据本发明，优选的，所述的激发液配制方法如下：称取1.199g KH2PO4和0.283gK2HPO4溶于100mL去离子水中配制成pH＝6.0的0.1mol/L PBS缓冲液，取10mL PBS缓冲液溶解0.0158g KMnO4。
根据本发明，优选的，生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CdTe量子点标记的CEA单抗二的质量比为1：10：1。
根据本发明，所述的CdTe量子点可按照现有技术制备得到，可参考CN101870459A。
根据本发明，生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CEA单抗二、CEA抗原为常规市购产品，北京科跃中楷生物技术有限公司有售。
根据本发明，利用以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒进行生物样品定量检测的方法，包括步骤如下：
(1)将生物素标记的CEA单抗一、标准浓度的抗原、CdTe量子点标记的CEA单抗二混合反应形成免疫复合物，加入链霉亲和素化的磁珠，依靠链霉亲和素与生物素之间的快速反应使磁珠与免疫复合物结合，将复合物置于磁场中磁分离，加入激发液采集化学发光信号，绘制化学发光信号和抗原浓度的标准曲线；
(2)以待检测抗原生物样品替代标准浓度抗原，重复步骤(1)的操作，得到化学发光信号，根据标准曲线，得到待检测抗原浓度。
根据本发明，优选的，步骤(1)中标准曲线的绘制，包括步骤如下：
将200μL 1μg/mL的生物素标记的CEA单抗一、50μL标准浓度的抗原、200μL 1μg/mLCdTe量子点标记的CEA单抗二在37℃下混合反应30-40分钟，形成免疫复合物，加入20μL100μg/mL链霉亲和素化的磁珠，依靠链霉亲和素与生物素之间的快速反应使磁珠与免疫复合物结合，将复合物置于磁场中磁分离，洗涤1-2次后将复合物转移至样品池内，将0.5mL激发液注入到样品池中，采集化学发光信号，将所得信号绘制成标准曲线。
根据本发明，激发液注入到样品池瞬间即可与标记的CdTe量子点反应产生化学发光。发光时间一般为1秒内，属于闪光型化学发光体系，化学发光辐射波段位于近红外区，785nm左右；
根据本发明，步骤(2)优选的方法，包括步骤如下：
将200μL 1μg/mL生物素标记的CEA单抗一、50μL生物样本、200μL 1μg/mL CdTe量子点标记的CEA单抗二在37℃下混合反应30-40分钟，形成免疫复合物，加入20μL 100μg/mL链霉亲和素化的磁珠，依靠链霉亲和素与生物素之间的快速反应使磁珠与免疫复合物结合，将复合物置于磁场中磁分离，洗涤1-2次后将复合物转移至样品池内，将0.5mL激发液注入到样品池中，采集化学发光信号，根据标准曲线，得到生物样本抗原浓度。
本发明的有益效果如下：
1.与传统闪光型化学发光物质吖啶酯类、鲁米诺类等分子型化合物相比，本发明的发光物质CdTe属于纳米材料类，具有合成方法简单，条件温和，制备成功率高等优点，且抗漂白能力强，见光不分解，易储存。
2.传统分子反应类化学发光体系的辐射波段通常位于可见光区且相互重叠，本发明中CdTe量子点/KMnO4体系的辐射波段位于近红外区，与传统分子反应类化学发光体系的辐射波段不重叠，波段识别与选择性好。
3.本发明中CdTe量子点/KMnO4体系的化学发光单色性(半峰宽94纳米)优于CuInS2@ZnS纳米晶/水合肼-过氧化氢体系(半峰宽158纳米)，且本发明的激发液为KMnO4，稳定易储存。
4.本发明的化学发光免疫检测试剂盒，发光强度强，发光时间短，发光时间为1秒内，属于闪光型强化学发光免疫分析试剂盒。
5.本发明的化学发光免疫检测试剂盒检测速度快，灵敏度高，稳定性好，在0.1ng/mL-100ng/mL的浓度范围内表现出良好的线性关系，检测限为0.05ng/mL，具有极好的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1中CEA抗原校准品标准曲线图。
图2为实施例1中CEA抗原浓度为1ng/mL时的化学发光光强曲线。
图3为实施例1中CEA抗原浓度为1ng/mL时的化学发光光谱曲线。
图4为不同pH的激发液对发光强度的影响图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
本发明实施例所用生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CEA单抗二、CEA抗原均购自北京科跃中楷生物技术有限公司。
实施例中发光曲线由西安瑞迈检测仪器有限公司生产的多功能化学发光检测仪采集获得。
实施例中CdTe量子点，参考CN101870459A公开的方法制备得到。包括步骤如下：
在100mL圆底三口烧瓶中加入0.8mL 0.2mol/L的CdCl2溶液，50mL超纯水，搅拌条件下加入0.2936g六偏磷酸钠，5分钟后加入0.0346mL巯基丙酸，用1mol/L NaOH溶液将pH调到8.0，缓慢加入1.2mL 0.02mol/L的Na2TeO3溶液，100℃回流10分钟；加入2.4mL水合肼，继续加热回流25小时。
实施例1
一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒，包括：
生物素标记的CEA单抗一、标准浓度的CEA抗原，链霉亲和素标记的磁珠、CdTe量子点标记的CEA单抗二、激发液；
所述的激发液包含0.1mol/L PBS及0.01mol/L KMnO4。
CdTe量子点标记的CEA单抗二，按如下方法制备得到：
将1mL CdTe原液离心三次后复溶于1mL pH为6.0的0.1mol/L PBS溶液中，加入24μL100mg/mL EDC、64μL 100mg/mL磺基-NHS，活化羧基15-40分钟；离心后重新分散至0.9mL去离子水中；加入0.1mL 10μg/mL的CEA单抗二，混匀37℃下反应2小时，利用CEA单抗二上的氨基与CdTe量子点上的羧基偶联；加入0.02mL 1％的BSA封闭羧基活化位点20-40分钟，离心1-2次以除去未反应的CEA单抗二，重新分散于1mL PBS于4℃下保存备用。
上述所述的激发液配制方法如下：称取1.199g KH2PO4和0.283g K2HPO4溶于100mL去离子水中配制成pH＝6.0的0.1mol/L PBS缓冲液，取10mL PBS缓冲液溶解0.0158gKMnO4。
上述所述的一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒的标准曲线的绘制，包括步骤如下：
将200μL21μg/mL的生物素标记的CEA单抗一、50μL标准浓度的抗原、200μL 1μg/mLCdTe量子点标记的CEA单抗二在37℃下混合反应30-40分钟，形成免疫复合物，加入20μL100μg/mL链霉亲和素化的磁珠，依靠链霉亲和素与生物素之间的快速反应使磁珠与免疫复合物结合，将复合物置于磁场中磁分离，洗涤1-2次后将复合物转移至样品池内，将0.5mL激发液注入到样品池中，采集化学发光信号。将所得信号绘制成标准曲线。
CEA抗原标准溶液按如下方法配置：
将购置的CEA抗原按0ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL的比例制备模拟血清中CEA标准品，具体操作为：
以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制0.1mol/L pH为6.0的标准品缓冲液，以标准品缓冲液制备浓度梯度为0ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL的11个标准品浓度。
检测得到的标准曲线图如图1所示。由图1可知，该化学发光检测试剂盒在抗原浓度为0.1-100ng/mL的范围内表现出良好的线性关系，满足临床上的CEA抗原检测范围，信噪比和灵敏度高，检测限为0.05ng/mL，表现出优异的传感性能。
上述以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒，以此进行样品检测，包括步骤如下：
将200μL 1μg/mL生物素标记的CEA单抗一、50μL生物样本、200μL 1μg/mL CdTe量子点标记的CEA单抗二在37℃下混合反应30-40分钟，形成免疫复合物，加入20μL 100μg/mL链霉亲和素化的磁珠，依靠链霉亲和素与生物素之间的快速反应使磁珠与免疫复合物结合，将复合物置于磁场中磁分离，洗涤1-2次后将复合物转移至样品池内，将0.5mL激发液注入到样品池中，采集化学发光信号，根据标准曲线，得到生物样本抗原浓度。
本实施例中，CEA抗原浓度为1ng/mL时的化学发光光强曲线如图2所示，CEA抗原浓度为1ng/mL时的化学发光光谱曲线如图3所示。由图2、3可知，本发明的激发液注入到样品池瞬间即可与标记的CdTe量子点反应产生化学发光。发光时间为1秒内，属于闪光型化学发光体系，化学发光辐射波段位于近红外区，785nm左右。
实施例2
如实施例1所述，不同的是：
激发液的pH＝3、4、5、7、8、9、10。
不同pH的激发液对发光强度的影响图，如图4所示。由图4可知，pH＝3～10的激发液均能产生一定强度的化学发光信号，pH＝6的激发液产生的化学发光信号强度最强。

Claims (10)

1.一种基于CdTe量子点定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
生物素标记的CEA单抗一、标准浓度的CEA抗原、链霉亲和素标记的磁珠、CdTe量子点标记的CEA单抗二、激发液；
所述的激发液包括PBS和KMnO4。
2.根据权利要求1所述的基于CdTe量子点定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的CdTe量子点标记的CEA单抗二是通过CEA单抗二上的氨基与CdTe量子点上的羧基偶联反应得到。
3.根据权利要求2所述的基于CdTe量子点定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的CdTe量子点标记的CEA单抗二的制备过程，包括步骤如下：
将1mL CdTe原液离心三次后复溶于1mL pH为6.0的0.1mol/L PBS溶液中，加入24μL100mg/mL EDC、64μL 100mg/mL磺基-NHS，活化羧基15-40分钟；离心后重新分散至0.9mL去离子水中；加入0.1mL 10μg/mL的CEA单抗二，混匀37℃下反应2小时，利用CEA单抗二上的氨基与CdTe量子点上的羧基偶联；加入0.02mL 1％的BSA封闭羧基活化位点20-40分钟，离心1-2次以除去未反应的CEA单抗二，重新分散于1mL PBS于4℃下保存备用。
4.根据权利要求1所述的基于CdTe量子点定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，激发液中：PBS浓度为0.05-0.2mol/L，KMnO4浓度为0.005-0.4mol/L。
5.根据权利要求1所述的基于CdTe量子点定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，激发液pH为3.0-10.0。
6.根据权利要求1所述的基于CdTe量子点定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的激发液配制方法如下：称取1.199g KH2PO4和0.283g K2HPO4溶于100mL去离子水中配制成pH＝6.0的0.1mol/L PBS缓冲液，取10mL PBS缓冲液溶解0.0158gKMnO4。
7.根据权利要求1所述的基于CdTe量子点定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CdTe量子点标记的CEA单抗二的质量比为1：10：1。
8.一种利用以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒进行生物样品定量检测的方法，包括步骤如下：
(1)将生物素标记的CEA单抗一、标准浓度的抗原、CdTe量子点标记的CEA单抗二混合反应形成免疫复合物，加入链霉亲和素化的磁珠，依靠链霉亲和素与生物素之间的快速反应使磁珠与免疫复合物结合，将复合物置于磁场中磁分离，加入激发液采集化学发光信号，绘制化学发光信号和抗原浓度的标准曲线；
(2)以待检测抗原生物样品替代标准浓度抗原，重复步骤(1)的操作，得到化学发光信号，根据标准曲线，得到待检测抗原浓度。
9.根据权利要求8所述的利用以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒进行生物样品定量检测的方法，其特征在于，步骤(1)中标准曲线的绘制，包括步骤如下：
将200μL 1μg/mL的生物素标记的CEA单抗一、50μL标准浓度的抗原、200μL 1μg/mLCdTe量子点标记的CEA单抗二在37℃下混合反应30-40分钟，形成免疫复合物，加入20μL100μg/mL链霉亲和素化的磁珠，依靠链霉亲和素与生物素之间的快速反应使磁珠与免疫复合物结合，将复合物置于磁场中磁分离，洗涤1-2次后将复合物转移至样品池内，将0.5mL激发液注入到样品池中，采集化学发光信号，将所得信号绘制成标准曲线。
10.根据权利要求8所述的利用以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒进行生物样品定量检测的方法，其特征在于，步骤(2)的方法如下：
将200μL 1μg/mL生物素标记的CEA单抗一、50μL生物样本、200μL 1μg/mL CdTe量子点标记的CEA单抗二在37℃下混合反应30-40分钟，形成免疫复合物，加入20μL 100μg/mL链霉亲和素化的磁珠，依靠链霉亲和素与生物素之间的快速反应使磁珠与免疫复合物结合，将复合物置于磁场中磁分离，洗涤1-2次后将复合物转移至样品池内，将0.5mL激发液注入到样品池中，采集化学发光信号，根据标准曲线，得到生物样本抗原浓度。
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