CN102401829B - 一种基于荧光淬灭原理的免疫反应分析方法 - Google Patents
一种基于荧光淬灭原理的免疫反应分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102401829B CN102401829B CN201010284585.6A CN201010284585A CN102401829B CN 102401829 B CN102401829 B CN 102401829B CN 201010284585 A CN201010284585 A CN 201010284585A CN 102401829 B CN102401829 B CN 102401829B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- determinand
- fluorescent material
- fluorescence
- bond
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 title abstract description 11
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 title abstract description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 55
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 claims description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 17
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 59
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 19
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 16
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 15
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- OLGONLPBKFPQNS-UHFFFAOYSA-M sodium 2-(4-phenylphenyl)butanoate Chemical compound [Na+].CCC(C([O-])=O)c1ccc(cc1)-c1ccccc1 OLGONLPBKFPQNS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000931526 Acer campestre Species 0.000 description 2
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 description 2
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfoxide Natural products CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002165 resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- YCZTUBHUGXHSKE-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-[5-(2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoyloxy]pyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCC1C2NC(=O)NC2CS1 YCZTUBHUGXHSKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LLIANSAISVOLHR-GBCQHVBFSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxidanylidene-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 LLIANSAISVOLHR-GBCQHVBFSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JGRGMDZIEXDEQT-UHFFFAOYSA-N [Cl].[Xe] Chemical compound [Cl].[Xe] JGRGMDZIEXDEQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MARDFMMXBWIRTK-UHFFFAOYSA-N [F].[Ar] Chemical compound [F].[Ar] MARDFMMXBWIRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFQHLZMKZVVGFQ-UHFFFAOYSA-N [F].[Kr] Chemical compound [F].[Kr] VFQHLZMKZVVGFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 description 1
- 229960004407 chorionic gonadotrophin Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N helium neon Chemical compound [He].[Ne] CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000010979 ruby Substances 0.000 description 1
- 229910001750 ruby Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 229910019901 yttrium aluminum garnet Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于荧光淬灭原理的免疫反应分析方法。具体地，本发明提供了一种在荧光物质与淬灭剂相互独立且不接触情况下，进行免疫检测的方法，本发明方法的免疫反应在液溶胶均相反应体系中进行，因此反应均匀迅速、全过程无需洗涤、可调节检测灵敏度、定量准确、荧光物质可重复使用等优点。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，更具体地涉及一种基于荧光淬灭原理的免疫检测方法。
背景技术
在检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测。现有技术中，已经以“双抗夹心”为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如：放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法和荧光免疫法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定量检测从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。
这类免疫反应分析方法的通常作法是：将捕获抗体固定于固相载体，然后与抗原(目标蛋白)反应，洗涤后再与标记抗体反应，洗涤，加入底物检测光信号或直接检测荧光信号。虽然上述方法的自动化免去了人工洗涤的烦琐，但液体与固体之间非均相反应的缺陷常常导致反应不够均匀以及反应不够快速。
中国专利申请CN200510030659.2公开了一种免疫胶体金粒子荧光淬灭的测量方法，该方法包括：将目标物即被测物的抗体或抗原连接在微小颗粒或微孔上形成固相载体，加入被测样品，再加入过量胶体金标记物，样品中的目标物与固定在微颗粒或微孔板上的抗体或抗原进行免疫反应，形成抗原抗体的固相载体复合物即结合物，及未反应的胶体金标记物即游离物，分离结合物与游离的胶体金标记物，在游离物中加入荧光物质，使得荧光信号淬灭，信号淬灭的程度与体系中游离的金标记物量相关，游离物的量与目标物的量相关，从而对目标物进行定量检测。然而，该方法的荧光淬灭的机制都是共振能量转移，要求荧光基团与淬灭剂基团必须近距离(<20nm)接触且共混于一个溶液体系。此外，该方法仍然存在流程不易自动化、荧光物质无法重复使用、和成本偏高等缺点。
因此，本领域迫切需要开发一种操作简便(例如，不必洗涤)，并且反应均匀和/或快速的检测方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种在检测过程中不必人工洗涤、操作简便且反应均匀和/或快速的检测方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测待测物存在与否和/或数量的免疫分析方法，包括步骤：
(a) 提供一检测溶液和一荧光物质溶液，其中所述的检测溶液和一荧光物质溶液是相互独立的，所述检测溶液中含有标记有淬灭剂的、针对所述的待测物的第一结合物，所述的荧光物质溶液中含有在受到激发光线照射时能够产生荧光的荧光物质；
(b) 将待测物或含待测物的样品加入检测溶液，从而形成“第一结合物-待测物”二元复合物；
(c) 将针对所述的待测物的第二结合物加入步骤(b)的检测溶液中，从而形成“第一结合物-待测物-第二结合物”三元复合物，其中所述的第一结合物和第二结合物可同时结合于所述待测物；
(d) 从步骤(c)的检测溶液中捕获或分离出所述的三元复合物，从而使得所述三元复合物与检测溶液的液相分开；
(e) 用可激发荧光物质产生荧光的光线照射步骤(d)检测溶液，使得所述光线透过检测溶液并照射到与检测溶液相互独立的荧光物质溶液，从而使得荧光物质溶液产生荧光；和
(f) 检测步骤(e)产生的荧光，从而确定待测物存在与否和/或数量。
在另一优选例中，所述的待测物包括：蛋白、核酸。
在另一优选例中，所述的待测物是肿瘤标志物、病毒蛋白等。
在另一优选例中，所述肿瘤标志物选自下组：甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原 (CA242)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)。
在另一优选例中，所述的荧光物质选自下组：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或其组合。
在另一优选例中，所述的淬灭剂为胶体金。
在另一优选例中，所述的淬灭剂是平均粒径为10-70nm的胶体金颗粒。
在另一优选例中，在步骤(f)中，检测荧光物质溶液产生的且透射通过所述检测溶液的荧光。
在另一优选例中，在步骤(f)中还包括：将荧光的测量值与标准曲线或对照进行比较，从而确定待测物的数量。
在另一优选例中，所述的待测物是抗原，且所述的第一结合物和第二结合物是可同时结合于所述抗原的抗体。
在另一优选例中，所述的待测物是抗体，所述的第一结合物是可与所述抗体结合的抗原，而所述的第二结合物是针对所述检测物(抗体)的抗体，反之亦然。例如，当待测物是某种人抗体时，第一结合物是该人抗体所针对的抗原，而第二结合物是抗该人抗体的鼠源或兔源抗体。
在另一优选例中，所述的光线是激光器产生的。
在另一优选例中，在步骤(e)中，所述的可激发荧光物质产生荧光的光线，透射通过检测溶液的光程为0.1-50厘米。
在另一优选例中，所述的光程为0.5-10厘米，更佳地为1.0-5.0厘米。
在另一优选例中，所述的方法还包括用已知浓度的待测物标准品进行测量，从而制作标准曲线的步骤。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测待测物存在与否和/或数量的免疫分析检测装置，所述的装置包括：
(a) 第一容器，所述的第一容器用于放置检测溶液，所述检测溶液中含有标记有淬灭剂的、针对所述的待测物的第一结合物；
(b) 第二容器，所述的第二容器用于放置荧光物质溶液，所述的荧光物质溶液中含有在受到激发光线照射时能够产生荧光的荧光物质；
(c) 用于产生激发光线的光源，所述的光源可发出透射所述第一容器并照射到所述第二容器的激发光线，从而使得所述荧光物质产生荧光；和
(d) 用于检测荧光的检测器。
在另一优选例中，所述的光源是激光器。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明方法的基本原理。
图2显示了在本发明方法中，标记了淬灭剂的抗体与目标蛋白形成“二元复合物”的步骤。
图3显示了在本发明方法中，加入适量的经标记修饰后具备捕获和分离功能的抗体，从而形成“夹心复合物”的步骤。
图4显示了在本发明方法中，采用适宜的方法将捕获抗体及含捕获抗体的“夹心复合物”分离去除后进行检测的步骤。
图5显示了本发明一个实例中得到的标准曲线，其中x轴为浓度(单位ng/ml)，y轴为F1-i/F0-i的比值(i=1～5)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种基于荧光淬灭原理的液溶胶均相免疫反应体系和检测方法。在本发明的检测方法中，荧光物质与淬灭剂不接触，完全相互独立地分开，从而使得本发明提供的免疫分析方法具有极其显著的优点，其中包括：反应在液溶胶均相反应体系中进行，因此反应均匀迅速；全过程无需洗涤；可根据实际需要方便地调节检测灵敏度，且定量准确；荧光物质重复使用，降低了试剂成本。
检测方法
本发明检测方法的基本原理如图1所示。左侧图中目标检测物的紫外可见吸收光谱与荧光物质的激发或荧光光谱重叠，则激发光和荧光被吸收，荧光被淬灭，此时的荧光强度计为Fo，该目标检测物为该荧光物质的淬灭剂；
若右侧图中淬灭剂的浓度为0或相对减少，则对荧光物质的淬灭程度降低，荧光较Fo增强，记为F1；
根据Beer-Lambert定律，在淬灭剂浓度一定的情况下，增加液层的厚度，透光率降低，则淬灭程度增加，对淬灭剂的检测灵敏度将随之提高。
接着，结合图2、3和4，进一步阐述本发明的一个定量检测目标蛋白实例的各步骤。
图2显示了标记了淬灭剂的抗体(第一抗体)与目标蛋白形成“二元复合物”的过程。具体地，在图2中，Std1～5是检测目标蛋白的标准系，Std1中没有目标蛋白，未形成“二元复合物”。随着目标蛋白的浓度逐渐增加，Std2～5中“二元复合物”的数量随之增加，但其中淬灭剂的量并未改变。
图3显示了加入适量的经标记修饰后具备捕获和分离功能的抗体(第二抗体)，形成“夹心复合物”。具体地，在加入了针对目标蛋白的、可分离的捕获抗体(第二抗体)后，在反应体系中形成“标记淬灭剂的第一抗体-目标蛋白-可分离的第二抗体”三元的“夹心复合物”。
一种特别优选的可分离的捕获抗体是与磁性微球偶联的捕获抗体。该捕获抗体可通过磁场进行分离。
另一类特别优选的可分离的捕获抗体是与生物素偶联的捕获抗体。该捕获抗体可通过生物素-亲和素的结合而进行分离。
图4显示了采用适宜的方法将捕获抗体及含捕获抗体的“夹心复合物”分离去除后进行检测。与图2进行对比，随着目标蛋白量的增加，Std2～5中标记了淬灭剂的抗体随之减少，荧光淬灭减弱，相应地荧光信号依次增强。
在另一优选例中，本发明方法中还包括制作标准曲线，并将检测结果与标准曲线进行比较，从而获得测量值。
例如，标准曲线的制作可采用以下方法：
将对应于目标蛋白标准曲线的第一个数据点的标准溶液与标记了淬灭剂的抗体混匀(形成“目标蛋白-标记淬灭剂的第一抗体”的二元复合物)，加入图2所示上方容器中(Std1)(该上方容器与下方含荧光物质溶液容器是相互独立或分离的)，并确保激发光能透过该上方容器照射到下方的荧光物质溶液，测定荧光强度，记为F0-1；
向所述上方容器的溶液中加入经标记修饰后具备捕获和分离功能的抗体(例如，连于磁性纳米颗粒的二抗)(见图3的St1)”，从而形成“标记淬灭剂的第一抗体-目标蛋白-可分离的第二抗体”三元的“夹心复合物”。在该过程中，但溶液体积保持或基本保持不变；
使“标记淬灭剂的第一抗体-目标蛋白-可分离的第二抗体”三元复合物与溶液完全分离，并使溶液返回“2.2.1”下第1步的容器中(图4 Std1)，测定荧光强度，记为F1-1；
计算F1-1/ F0-1的比值；
同样操作，分别得到目标蛋白标准系其他点F1-i/ F0-i(i=2～5)的比值，以标准系各点浓度值对F1-i/ F0-i(i=1～5)比值作图，得到标准曲线。
应理解，为了方便起见，在附图中将第一容器和第二容器的位置画为上方容器和下方容器，然而第一容器和第二容器也可以水平放置或倾斜放置。
同样操作，得到样本的F1/ F0，代入标准曲线计算得出样本中目标蛋白的含量。
荧光物质
可用于本发明的荧光物质没有特别限制，激发或发射光谱与淬灭剂(如胶体金)的可见吸收光谱全部或部分重叠的荧光物质均适用于本发明提供的检测方法。
代表性的荧光物质包括(但并不限于)：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或其组合，只要所述荧光物质的激发或发射光谱与淬灭剂的吸收光谱重叠(或部分重叠)即可。
淬灭剂
如本文所用，术语“淬灭剂”和“淬灭剂”可互换使用，都指可衰减荧光物质所发射荧光的物质。
针对待测物的结合物(如抗体)可用各种本领域已知的淬灭剂进行标记。可用于本发明的淬灭剂没有特别限制，代表性的淬灭剂包括(但并不限于)：胶体金。
一种特别优选的淬灭剂是胶体金，尤其是粒径为20-40nm的胶体金。
应理解，荧光物质与淬灭剂宜相互对应。例如，当选用藻红蛋白(PE)时，因其最大发射波长为575nm，与30nm胶体金的吸收光谱部分重叠，因此可以将藻红蛋白与30nm胶体金配对使用。
在另一优选例中，本发明优选胶体金进行标记，其中胶体金标记方法是本领域的成熟技术。
捕获抗体和固相载体
本领域通常是将捕获抗体固定于固相载体，从而使该捕获抗体具备分离“夹心复合物”的功能，常用的固相载体有玻片、膜片、酶标板和各种微球。
也可将捕获抗体用生物素(biotin)标记，形成“夹心复合物”后再与链亲和素(Streptavidin)包被的固相载体结合，从而具备分离的功能。
在本发明中，优选的固相载体是纳米级或亚纳米级的微球或微颗粒。通常，其平均粒径小于200nm，较佳地小于150nm，更佳地小于150nm。
代表性的微球或颗粒包括(但并不限于)：磁性微球、聚丙烯酰胺微球、聚苯乙烯微球、玻璃微球、聚丙烯微球、硅橡胶微球、纤维素微球、交联葡聚糖微球、或其组合。
光源
在本发明方法中，光源用于提供某一发射波长的光线，从而激发荧光物质发出荧光。
在本发明中，可选用任何可以提供合适波长的光源。一种优选的光源是激光光源。激光光源可用本领域常规的方法和设备(如激光器)产生。代表性的激光器例子包括(但并不限于)：光纤激光器等。半导体激光器、氦氖激光器、氩离子激光器、光纤激光器。还包括波长可选的激光器、多波长激光器和双波长激光器等。
在优选例中，光源提供的光线宜包含荧光物质的激发波长，或者与荧光物质的激发波长相同或几乎重叠。激光器产生的激光波长与激光介质有关，常见的激光波长见下表：
| 激光种类 | 波长(纳米) |
| 氩氟激光(紫外光) | 193 |
| 氪氟激光(紫外光) | 248 |
| 氙氯激光(紫外光) | 308 |
| 氮激光(紫外光) | 337 |
| 氩激光(蓝光) | 488 |
| 氩激光(绿光) | 514 |
| 氦氖激光(绿光) | 543 |
| 氦氖激光(红光) | 633 |
| 罗丹明6G染料(可调光) | 570-650 |
| 红宝石(CrAlO3)(红光) | 694 |
| 钕-钇铝石榴石(近红外光) | 1064 |
本发明检测方法的主要优点包括：
(a) 溶液中抗原抗体等的物理大小均≤100nm,故反应在液溶胶均相反应体系中进行，反应均匀迅速；
(b) 检测全过程无需洗涤；
(c) 检测中使用的荧光物质可重复循环使用，降低了试剂成本；
(d) 可方便地调节检测灵敏度，且定量准确。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则重量份和百分比按重量计。
试剂和设备：
针对AFP的成对抗体G4/C2购自上海第二医科大学；
AFP抗原购自Biodesign；
fluidMAG-CMX纳米磁性微球(粒径为100nm)购自德国Chemicell公司；
30nm的胶体金，市售品；
藻红蛋白(PE)购自Invitrogen公司；
检测器：USB4000-FL(美国海洋光学公司)
光源：532nm激光光源。
实施例1：血清中甲胎蛋白(AFP)的检测
在本实施例中，对于图2、4中上方容器中的反应溶液的液层厚度为1cm。
1、金标抗体的制备
1.1 胶体金-抗体保存液
| 四硼酸钠 | 0.1g |
| 小牛血清白蛋白(BSA) | 0.25g |
| NaN3 | 0.025g |
加水溶解后用6N HCL 调pH至7.4，补水至250ml，用0.45μm滤膜过滤后，4～8℃保存。
1.2 工作液
| Na2HPO4·12H2O | 6.1g |
| NaCl | 8.5g |
| PVP40 | 5.0g |
| 硼酸 | 2.1g |
| PEG | 1.0g |
| 10%BSA | 50ml |
| NaN3 | 0.2g |
加水溶解后用6N HCL 调pH至7.0～7.5补水至1000ml，用0.45μm滤膜过滤后，4～8℃保存。
1.3 金标抗体的制备
1.3.1 取20～30nm颗粒胶体金液20ml，在磁力搅拌下缓慢加入已纯化的G4抗体1.0ml(0.6mg/ml)，在室温下搅拌30min；
1.3.2 加10%的BSA 0.8ml(终浓度0.4%)，室温搅拌5min；
1.3.3 加10%的PEG 0.4ml(终浓度0.2%)，室温搅拌5min；
1.3.4 12000～1500r/min离心60～40min，小心吸离心上清，沉淀溶于2ml保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用；
1.3.5 将上述金标抗体溶液用工作液稀释至在532nm处的O.D值为1.5，得到金标抗体工作溶液，每毫升金标抗体溶液约相当于30μg G4抗体。
2、标记C2抗体使具有捕获功能
将抗体C2固定于-COOH修饰的fluidMAG-CMX纳米磁性微球(简称微球)步骤如下：
2.1 取微球混悬液0.34ml，13000转离心5min，弃上清；
2.2
称取EDC [N-ethyl-N'(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide]10.25mg，加入灭菌水0.15ml，混匀后加入微球中，轻轻振荡；
2.3 室温避光反应10min；
2.4 加入1ml纯水清洗2次(13000转离心5min)，弃上清；
2.5 加入0.25ml纯水重悬；
2.6 加入C2抗体4.6μl(11mg/ml，约50.6μg)，混匀；
2.7 室温避光反应2小时；
2.8 磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)洗涤3次，每次1ml；
2.9 弃去上清，沉淀用500μl PBS重悬，每微升微球悬液相当于0.1μg C2抗体。
3、荧光物质溶液的配制
藻红蛋白(PE，Invitrogen公司)的次大激发波长为532nm，与30nm胶体金的最大吸收波长几乎重叠，PE的最大发射波长为575nm，与30nm胶体金的吸收光谱部分重叠，故在本实施例中选用PE作为检测中的荧光物质。用PBS(pH7.4)稀释PE至1μg/ml。
4、标准曲线的绘制
4.1 AFP标准溶液的配制
用PBS(pH7.4)将AFP抗原稀释成标准系列，浓度为：0 ng/ml (Std1)、5 ng/ml (Std2)、9 ng/ml (Std3)、100 ng/ml (Std4)、500 ng/ml (Std5)；
4.2 形成二元复合物
取1.5 O.D的金标抗体溶液10μl、Std2 140μl混匀，加入图2中所示的上方容器中，使液层厚度为1cm，测定荧光强度，记为F0-2；
4.3 形成三元复合物
预先用减压干燥的方法使另一容器壁附着固定了C2抗体的纳米磁性微球，将“4.2”溶液转移至该容器，37℃孵育30min，形成“夹心复合物”；
4.4 分离纳米磁性微球
用磁力装置分离“4.3”中的纳米磁性微球，使溶液返回“4.2”的容器中，测定荧光强度，记为F1-2；
F1-2/ F0-2=1.02
……
同样操作，得到Std1对应的F1-1/ F0-1=0.99、Std3对应的F1-3/ F0-3=1.03、 Std4对应的F1-4/ F0-4=1.07、Std5对应的F1-5/ F0-5=1.68；
以上述Std1～5 5个点的浓度C对F1-i/ F0-i(i=1～5)，得到标准曲线(图5)，图中x轴为浓度，y轴为F1-i/ F0-i(i=1～5)。该标准曲线如下：
Y = 0.0008x +1.004，R2 = 0.9971 。
5、样本检测
用血清样本替代标准系列溶液，重复4.2～4.5步骤，将F1/ F0代入标准曲线，测得6个样本的AFP值分别为：6.2、8.9、12.6、40.8、112.3、235.6ng/ml。
实施例2：血清中甲胎蛋白(AFP)的检测
重复实施例1的操作，不同点仅在于：是将图2的上方容器做适当的调整，使反应溶液的液层厚度为2cm，金标抗体溶液5μL，校准品溶液145μL。
结果，在此条件下得到的标准曲线方程为：
Y = 0.0024x +1.061，R2 = 0.9986
用血清样本替代标准系列溶液，重复4.2～4.5步骤，将F1/F0代入标准曲线，测得6个样本的AFP值分别为：5.2、9.6、10.6、40.1、121.3、246.6ng/ml。
实施例3：血清中甲胎蛋白(AFP)的检测(图2、4中的液层厚度为4cm)
重复实施例1的操作，不同点仅在于：是将图2的上方容器做适当的调整，使反应溶液的液层厚度为4cm，金标抗体溶液2.5μL，校准品溶液147.5μL。
结果，在此条件下得到的标准曲线方程为：
Y = 0.0031x +1.0611，R2 = 0.9982
用血清样本替代标准系列溶液，重复4.2～4.5步骤，将F1/ F0代入标准曲线，测得6个样本的AFP值分别为：6.8、8.6、11.8、43.8、127.3、228.6ng/ml。
随着实施例1、2和3图2中反应液层的厚度逐渐增加， 3条标准曲线的斜率相应地也逐渐增加，即检测灵敏度增加。这提示，本发明方法可根据实际需要方便地调节检测灵敏度。
实施例4：血清中癌胚抗原(CEA)的检测
在本实施例中，对于图2、4中上方容器中的反应溶液的液层厚度为2cm。
针对CEA的成对抗体A1/C9来自上海第二医科大学；
CEA抗原来自Biodesign；
Sreptavidin包被的纳米磁性微球(粒径为50nm)、分离柱、磁架均来自德国美天旎(Miltenyi)公司；
30nm的胶体金为市售品；
藻红蛋白(PE)来自Invitrogen公司；
检测器：USB4000-FL(美国海洋光学公司)
光源：532nm激光光源
1、金标抗体的制备
金标抗体的制备过程与实施例1相同，金标抗体工作溶液在532nm处的O.D值为1.5，每毫升金标抗体溶液约相当于36μg A1抗体。
2、生物素标记C9抗体
2.1 C9抗体预处理
| 抗体中含有叠氮钠、甘氨酸等含氨基的小分子和其它小分子 | 用pH7.4的1×PBS充分透析。 |
| 抗体中含有牛血清白蛋白等大分子 | Protein A柱或其它柱子纯化。 |
| 抗体浓度标定 | 分光光度计测其OD280(1OD280相当于0.7mg/ml单克隆抗体)。最终用1×PBS，pH7.4将浓度定于2mg/ml(浓缩使用Pall公司脱盐离心柱)。 |
2.2 生物素标记反应
取上述预处理的C9抗体溶液25μL，加入25μL的1mg/ml NHSS-生物素 DMSO溶液，混匀，4℃冰箱避光反应2小时。透析过夜备用。
3、荧光物质溶液的配制
藻红蛋白(PE，Invitrogen公司)的次大激发波长为532nm，与30nm胶体金的最大吸收波长几乎重叠，PE的最大发射波长为575nm，与30nm胶体金的吸收光谱部分重叠，所以本实施例中选用PE作为检测中的荧光物质。用PBS(pH7.4)稀释PE至1μg/ml。
4、标准曲线的绘制
4.1 CEA标准溶液的配制
用PBS(pH7.4)将CEA抗原稀释成标准系列，浓度为：0 ng/ml (Std1)、4.2 ng/ml (Std2)、15 ng/ml (Std3)、150 ng/ml (Std4)、622 ng/ml (Std5)；
4.2 形成夹心复合物
取1.5 O.D的金标抗体溶液10μl、Std2 140μl、生物素标记的C9抗体溶液2μl，混匀，形成有“生物素-C9—抗原—A1-胶体金”的夹心复合物，加入图2所示的容器中，使液层厚度为2cm，测定荧光强度，记为F0-2；
4.3 分离夹心复合物
预先用减压干燥的方法使另一容器(加入了200μl的链亲和素纳米磁性微球溶液)壁附着链亲和素纳米磁性微球；
将“4.2”溶液转移至该容器，并使链亲和素(Streptavidin)纳米磁性微球充分溶于溶液中，室温静置1min，通过链亲和素-生物素的连接，夹心复合物被纳米磁性微球捕获，即：“磁性微球-链亲和素—生物素-C9—抗原—A1-胶体金”
用配套的分离装置(分离柱、磁架)分离纳米磁性微球，并使溶液返回“4.2”的容器中，测定荧光强度，记为F1-2；
F1-2/ F0-2=1.05
……
同样操作，得到Std1对应的F1-1/ F0-1=0.99、Std3对应的F1-3/ F0-3=1.09、 Std4对应的F1-4/ F0-4=1.33、Std5对应的F1-5/ F0-5=1.99；
以上述Std1～5 5个点的浓度C对F1-i/ F0-i(i=1～5)作图，得到标准曲线：
Y=0.0015x + 1.0467，R2=0.9903 。
5、样本检测
用血清样本替代标准系列溶液，重复4.2～4.5步骤，将F1/ F0代入标准曲线，测得6个样本的CEA值分别为：8.2、3.9、32.6、20.8、103.3、211.6ng/ml。
讨论
现有技术中已报道了基于荧光淬灭原理的免疫反应分析方法。荧光淬灭的机制都是共振能量转移，要求荧光基团与淬灭剂基团必须近距离(≤20nm)接触，共混于一个溶液体系(J.Phys.Chem.B 2005, 109, 19604 19612；Anal.Chem. 2006, 78, 1104 1106；Analytica Chimica Acta 583(2007)40–44；Chem.Commun., 2009,2559–2561；Nano Letters，2009, 9，12，4558-4563；、Analytica Chimica Acta646 (2009) 119–122)。
然而，本发明方法与现有技术的显著区别在于：荧光物质与淬灭剂不接触，而是相互独立，完全分开。这使得本发明提供的免疫分析方法具有一些突出的优点，其中包括：液溶胶(溶液中抗原抗体等的物理大小均≤100nm)均相反应体系；反应均匀迅速；全过程无需洗涤；可根据实际需要方便地调节检测灵敏度；荧光物质重复使用，降低了试剂成本。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种检测待测物存在与否和/或数量的免疫分析方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一检测溶液和一荧光物质溶液，其中所述的检测溶液和一荧光物质溶液是相互独立的，所述检测溶液中含有标记有淬灭剂的、针对所述的待测物的第一结合物，所述的荧光物质溶液中含有在受到激发光线照射时能够产生荧光的荧光物质；
(b)将待测物或含待测物的样品加入检测溶液，从而形成“第一结合物-待测物”二元复合物；
(c)将针对所述的待测物的第二结合物加入步骤(b)的检测溶液中，从而形成“第一结合物-待测物-第二结合物”三元复合物，其中所述的第一结合物和第二结合物可同时结合于所述待测物；
(d)从步骤(c)的检测溶液中捕获或分离出所述的三元复合物，从而使得所述三元复合物与检测溶液的液相分开；
(e)用可激发荧光物质产生荧光的光线照射步骤(d)检测溶液，使得所述光线透过检测溶液并照射到与检测溶液相互独立的荧光物质溶液，从而使得荧光物质溶液产生荧光；
(f)检测步骤(e)产生的荧光，从而确定待测物存在与否和/或数量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测物为蛋白或核酸。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光物质选自下组：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的淬灭剂为胶体金。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(f)中，检测荧光物质溶液产生的且透射通过所述检测溶液的荧光。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(f)中还包括：将荧光的测量值与标准曲线或对照进行比较，从而确定待测物的数量。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测物是抗原，且所述的第一结合物和第二结合物是可同时结合于所述抗原的抗体。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，所述的可激发荧光物质产生荧光的光线，透射通过检测溶液的光程为0.1-50厘米。
9.一种用于检测待测物存在与否和/或数量的免疫分析检测装置，其特征在于，所述的装置包括：
(a)第一容器，所述的第一容器用于放置检测溶液，所述检测溶液中含有标记有淬灭剂的、针对所述的待测物的第一结合物；
(b)第二容器，所述的第二容器用于放置荧光物质溶液，所述的荧光物质溶液中含有在受到激发光线照射时能够产生荧光的荧光物质；
(c)用于产生激发光线的光源，所述的光源可发出透射所述第一容器并照射到所述第二容器的激发光线，从而使得所述荧光物质产生荧光；和
(d)用于检测荧光的检测器。
10.如权利要求9所述的装置，其特征在于，所述的光源是激光器。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010284585.6A CN102401829B (zh) | 2010-09-17 | 2010-09-17 | 一种基于荧光淬灭原理的免疫反应分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010284585.6A CN102401829B (zh) | 2010-09-17 | 2010-09-17 | 一种基于荧光淬灭原理的免疫反应分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102401829A CN102401829A (zh) | 2012-04-04 |
| CN102401829B true CN102401829B (zh) | 2015-04-29 |
Family
ID=45884247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201010284585.6A Expired - Fee Related CN102401829B (zh) | 2010-09-17 | 2010-09-17 | 一种基于荧光淬灭原理的免疫反应分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102401829B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013113153A1 (zh) * | 2012-01-31 | 2013-08-08 | 庞磊 | 一种荧光分析方法 |
| CN103713126B (zh) * | 2012-09-29 | 2017-07-28 | 上海鑫谱生物科技有限公司 | 一种荧光分析方法和装置 |
| CN103712963B (zh) * | 2012-09-29 | 2018-03-30 | 上海鑫谱生物科技有限公司 | 一种荧光分析方法和装置 |
| CN102967708B (zh) * | 2012-10-31 | 2014-11-12 | 武汉大学 | 一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法 |
| CN105181956B (zh) * | 2015-09-30 | 2017-10-10 | 华东理工大学 | 基于金属离子特异响应的荧光检测法在免疫检测中的应用 |
| CN106885900A (zh) * | 2017-04-17 | 2017-06-23 | 新疆医科大学 | 基于背景荧光猝灭‑免疫层析测定牛奶中卡那霉素的方法 |
| CN109633159B (zh) * | 2018-12-28 | 2022-02-18 | 北京维德维康生物技术有限公司 | 一种用于检测三聚氰胺含量的方法及其专用胶体金试纸 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0476545A1 (en) * | 1990-09-14 | 1992-03-25 | Tosoh Corporation | Method of and kit for immunoassay |
| CN1294678A (zh) * | 1999-02-15 | 2001-05-09 | 弗劳恩农场主协会应用研究开发E.V. | 差分光测量法 |
| CN1563951A (zh) * | 2004-03-19 | 2005-01-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 胶体金和半导体荧光纳米粒子双标记快速免疫检测试纸 |
| CN1773281A (zh) * | 2005-10-20 | 2006-05-17 | 上海交通大学 | 免疫胶体金粒子荧光淬灭的测量方法 |
| CN101315371A (zh) * | 2008-06-23 | 2008-12-03 | 江南大学 | 一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法 |
| CN101709327A (zh) * | 2009-12-02 | 2010-05-19 | 浙江大学 | 一种基于纳米金棒荧光猝灭效应的微流芯片核酸传感方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7179658B2 (en) * | 2001-09-06 | 2007-02-20 | Beckman Coulter, Inc. | Particle based homogeneous assays using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection |
-
2010
- 2010-09-17 CN CN201010284585.6A patent/CN102401829B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0476545A1 (en) * | 1990-09-14 | 1992-03-25 | Tosoh Corporation | Method of and kit for immunoassay |
| CN1294678A (zh) * | 1999-02-15 | 2001-05-09 | 弗劳恩农场主协会应用研究开发E.V. | 差分光测量法 |
| CN1563951A (zh) * | 2004-03-19 | 2005-01-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 胶体金和半导体荧光纳米粒子双标记快速免疫检测试纸 |
| CN1773281A (zh) * | 2005-10-20 | 2006-05-17 | 上海交通大学 | 免疫胶体金粒子荧光淬灭的测量方法 |
| CN101315371A (zh) * | 2008-06-23 | 2008-12-03 | 江南大学 | 一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法 |
| CN101709327A (zh) * | 2009-12-02 | 2010-05-19 | 浙江大学 | 一种基于纳米金棒荧光猝灭效应的微流芯片核酸传感方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A novel immunoassay based on the dissociation of immunocomplex and fluorescence quenching by gold nanoparticles;Zhaofeng Peng et al.,;《ANALYTICAL CHIMICA ACTA》;20061007;第583卷;第40-44页 * |
| Fluoroimmunoassay for antigen based on fluorescence quenching signal of gold nanoparticles;Limei Ao et al.,;《Anal. Chem.》;20060215;第78卷(第4期);第1104-1106页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102401829A (zh) | 2012-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102401829B (zh) | 一种基于荧光淬灭原理的免疫反应分析方法 | |
| Goryacheva et al. | Nanosized labels for rapid immunotests | |
| Bauch et al. | Plasmon-enhanced fluorescence biosensors: a review | |
| Seydack | Nanoparticle labels in immunosensing using optical detection methods | |
| Lakowicz | Radiative decay engineering 3. Surface plasmon-coupled directional emission | |
| JP5652393B2 (ja) | Ｓｐｆｓ−ｌｐｆｓ系による測定方法に供するプラズモン励起センサおよびアッセイ法 | |
| JP5720248B2 (ja) | 表面プラズモンおよび蛍光共鳴エネルギー転移を利用した免疫アッセイ | |
| JP5994890B2 (ja) | アナライト検出プローブ | |
| JP3890019B2 (ja) | 生物分析的アッセイ | |
| US20140170674A1 (en) | Membraine-Based Assay Devices Utilizing Time-Resolved Up-Converting Luminescence | |
| JPH10307141A (ja) | プラズモン共鳴および蛍光検出を用いた生体分子相互作用の同時検出法 | |
| Jin et al. | Enhanced detection sensitivity of pegylated CdSe/ZnS quantum dots-based prostate cancer biomarkers by surface plasmon-coupled emission | |
| JP5428322B2 (ja) | プラズモン励起センサを用いたアッセイ法 | |
| Chen et al. | Near-infrared surface plasmon resonance sensor with a graphene-gold surface architecture for ultra-sensitive biodetection | |
| US20090017477A1 (en) | Method for determination of concentration, charge or unit size of a substance | |
| Calucho et al. | Nanoparticle-based lateral flow assays | |
| Chen et al. | Gold nanoparticle-functionalized diatom biosilica as label-free biosensor for biomolecule detection | |
| JP5660035B2 (ja) | 融合タンパク質含有集合体、その製造方法及び該集合体を用いたアッセイ法 | |
| JP5821852B2 (ja) | 非特異吸着の精製機構を備えたｓｐｆｓ用センサ | |
| Shi et al. | A multicolor nano-immunosensor for the detection of multiple targets | |
| WO2013113153A1 (zh) | 一种荧光分析方法 | |
| CN103712963A (zh) | 一种荧光分析方法和装置 | |
| Zhao et al. | A novel optical immunosensing system based on measuring surface enhanced light scattering signals of solid supports | |
| CN103293303A (zh) | 一种荧光分析方法和装置 | |
| JP5298877B2 (ja) | プラズモン励起センサを用いたアッセイ法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHANGHAI XINPU BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: LI JIUTONG Effective date: 20150318 Free format text: FORMER OWNER: PANG LEI Effective date: 20150318 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 200051 CHANGNING, SHANGHAI TO: 201100 MINHANG, SHANGHAI |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20150318 Address after: 201100, room 2, building 518, 103 Xin Xin Lu, Minhang District, Shanghai Applicant after: SHANGHAI XINPU BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 200051, room 4, No. 158, Lane 1102, Anshun Road, Shanghai, Changning District Applicant before: Li Jiutong Applicant before: Pang Lei |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150429 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |