CN112362867A - 一种使用聚集诱导发光联合免疫磁珠的检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种聚集诱导发光联合免疫磁珠的检测方法包括以下步骤：S1：分别用目的待测物X1、X2…Xn的一抗抗体标记聚集诱导荧光微球Y1、Y2…Yn；S2：分别用目的待测物X1、X2…Xn的二抗抗体包被免疫磁珠Z1、Z2…Zn；S3：将步骤S1的荧光微球、S2的免疫磁珠与检测样本共同孵育，通过采集的荧光值确定待测物的含量。本发明检测方法不仅可省略未结合抗原/抗体的清洗，减少清洗废液的环境污染，大大缩短检测时间，还能提高检测灵敏度和准确度。再加上聚集诱导发光分子，可以根据检测需求设计不同分子结构而获得不同发射光的聚集诱导发光材料，使得同一检测体系中的多标志物联合检测实现更为便利，检测效率更高，结果更准确。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种使用聚集诱导发光联合免疫磁珠的检测方法及其试剂盒。
背景技术
荧光探针在使用中普遍存在一个问题：当荧光官能团聚集时会发生荧光减弱或淬灭的现象，这个现象会导致结合到生物分子上的荧光分子的发射光信号强度大幅下降或消失。目前的做法，一是为避免荧光探针的聚集，在使用过程中必须严格控制其浓度及在生物分子上结合的探针数量，导致荧光基团浓度低，荧光强度大大下降，使得检测困难重重。二是采用其他如稀土元素离子作为荧光探针，但是需要增加清除未反应的稀土元素，且其解离增强获得较高的荧光强度也是一个难题。
聚集诱导发光(AIE)是指一类荧光生色团在溶液状态下微弱发光甚至不发光，而在固态或聚集状态下荧光显著增强的一种光物理现象，具有AIE特性的分子作为荧光探针在生物检测领域有着传统荧光探针分子不能比拟的优点：一方面可以使更多的AIE探针分子结合到生物大分子上获得高亮度的荧光，而不必担心像传统的荧光分子那样发生聚集导致的荧光猝灭，这为荧光检测提供了便利；另一方面，在聚集后发生的荧光急剧变亮的特性可以作为荧光放大检测的定量依据。虽然有报道可将AIE分子应用到生物检测中，但是多应用在生物成像和水解酶活性的检测中。而将AIE引入到磁珠免疫检测体系中尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的在于将聚集诱导发光材料作为信号单元，引入免疫检测体系中，解决了现有检测体系多指标联检困难、检测步骤繁多、清洗废液污染环境的难题。
本发明采用以下技术方案为实现上述目的，一种聚集诱导发光联合免疫磁珠的检测方法，包括以下步骤：
S1：分别用目的待测物X1、X2…Xn的一抗抗体标记聚集诱导荧光微球Y1、Y2…Yn；
S2：分别用目的待测物X1、X2…Xn的二抗抗体包被免疫磁珠Z1、Z2…Zn；
S3：将步骤S1的荧光微球、S2的免疫磁珠与检测样本共同孵育后，使用检测分析仪进行荧光采集和数据分析，所述荧光微球Y1、Y2…Yn被检测分析仪同一范围波长的激发光激发，发射出不同范围波长的发射光，采集不同波长的荧光值，通过获得的相对应待测物X1、X2…Xn的荧光值确定待测物在检测样本中的含量；
其中，n＝除“0”之外的自然数，所述荧光微球Y1、Y2…Yn由不同的聚集诱导发光材料制备而成；所述待测物X1、X2…Xn是同一检测样本中的单一目的待测物或多种混合目的待测物。
本发明检测方法利用聚集诱导发光微球在分散态时荧光弱、聚集态时荧光增强的这一特性，结合易于富集的纳米免疫磁珠，建立聚集诱导发光磁珠免疫检测方法。由于聚集诱导发光微球结合到生物大分子上的分子数目远比传统荧光探针多，因此相应的荧光强度也会相应增强。该方法相对目前的化学发光和时间分辨检测技术，可以做到免冲洗检测，不仅可省略未结合抗原/抗体繁杂的洗涤步骤，减少清洗废液的环境污染，大大缩短检测时间，还能提高检测灵敏度和准确度。
本发明的检测方法所基于的总体技术路线是：采用聚集诱导发微球标记待测蛋白的一抗抗体，与预先包被好二抗的免疫磁珠及待测抗原发生免疫反应，形成连接有聚集诱导发光分子的双抗体夹心复合物，进行磁珠聚集，所述复合物经相应波长的激发光激发，发射出一定波长的发射光，通过酶标仪或其他检测分析仪识别，并根据荧光信号强度与待测物浓度的比例关系，将待测物浓度与荧光信号值拟合出剂量-反应曲线，即可按此荧光信号值得到未知样本中待测物的浓度，达到定量分析。
本发明根据基于不同分子结构的聚集诱导发光材料具有不同的吸收波长，建立了一种可在同一检测体系或同一样品中同时检测不同目的检测物(抗原或抗体)的检测方法。本发明通过以下技术手段实现：一方面，将不同目的待测物的一抗与不同的聚集诱导发光材料结合，获得被不同聚集诱导发光材料标记的一抗；另一方面，通过包被有不同待测物的二抗免疫磁珠富集相应目的待测物，将所述一抗、待测样品与所述二抗共同孵育，使得被聚集诱导发光材料标记的一抗、待测样品与被二抗包被的磁珠形成双抗体夹心复合物(磁珠上的二抗对目的检测物进行富集，富集的目的检测物通过一抗将聚集诱导发光材料进行聚集，使得发光材料在聚集态时增强荧光信号)，然后所述复合物经一定范围波长的激发光激发。由于不同分子结构的聚集诱导发光材料所发射出不同波长的发射光，通过酶标仪或其他检测分析仪识别不同吸收波长的荧光，就能实现同一检测体系能同时检测多种不同的目的检测物。
优选地，所述待测物包括抗体或抗原；本发明方法可检测所有目标蛋白，适用范围较广。
优选地，所述步骤S1中的荧光微球为聚集诱导发光材料制备的荧光微球。
优选地，所述聚集诱导发光材料包括TPE-COOH、TPE-CHO、TPE-2SO3Na+或/和TPE(COOH)4。分子结构分别如下：
当R1＝R2＝R3＝H,R4＝COOH时，为TPE-COOH；
当R1＝R2＝R3＝H,R4＝CHO时，为TPE-CHO；
当R1＝R2＝H,R3＝R4＝2SO3Na+时，为TPE-2SO3Na+；
当R1＝R2＝R3＝R4＝COOH时，为TPE(COOH)4。
基于本发明的发明构思，同一检测体系中不同聚集诱导发光材料需要同时被激发光激发，且又能发出不同波长的发射光。因此，本发明选择TPE-COOH、TPE-CHO、TPE-2SO3Na+或/和TPE(COOH)4作为优选地的聚集诱导发光材料。这几种材料均能在的350-370nm波长范围内被激发，同时发出不同波长的发射光，TPE-CHO、TPE-COOH、TPE-2SO3Na+、TPE-(COOH)4、分别在490nm、550nm、490nm、490nm有吸收光。因此，在同一检测体系中分别了结合TPE-CHO、TPE-COOH、TPE-2SO3Na+、TPE(COOH)4的不同目的待测物，可分别在490nm、550nm、490nm、490nm检测其含量。
优选地，在所述步骤S2二抗抗体包被免疫磁珠之前还包括对抗体的预处理。
优选地，所述抗体的预处理具体操作为：将抗体加入超滤离心管中，4℃10000r/min离心9min～10min，用结合缓冲液重复洗涤3～5次，并浓缩至一定浓度。
优选地，所述步骤S3中共同孵育条件为37℃孵育5-16min。
本发明还提供了一种聚集诱导发光联合免疫磁珠的试剂盒，包括：聚集诱导荧光微球和免疫磁珠。
优选地，所述聚集诱导荧光微球包被待测物相对应的一抗抗体，所述免疫磁珠包被待测物相对应的二抗抗体。
本发明还提供了本发明所述的试剂盒在时间免疫检测中的应用。
本发明的有益效果为：
与现有技术相比，本发明检测方法不仅可省略未结合抗原/抗体的清洗，减少清洗废液的环境污染，大大缩短检测时间，还能提高检测灵敏度和准确度。再加上聚集诱导发光分子，可以根据检测需求设计不同分子结构而获得不同发射光的聚集诱导发光材料，使得同一检测体系中的多标志物联合检测实现更为便利，检测效率更高，结果更准确。
本发明的检测方法可以根据检测需求设计不同分子结构而获得不同发射光的聚集诱导发光材料，实现同一检测体系中的多标志物联合检测。根据免疫学检验原理，根据检测试剂所使用的抗体的抗原表位不同，有针对性的分别标记上具有不同发射光波长的不同分子结构的聚集诱导发光材料，两个或多个标记物上具有不同发射光波长聚集诱导发光材料的抗体，一起与检测样本进行反应，分别检测各自发射波长下的荧光强度或通过颜色的辨别，即可实现一个体系中同一个样本实现多个标志物的定量或定性检测。
附图说明
图1为本发明检测方法的流程示意图。
图2为定量检测CRP剂量-反应曲线双对数Spline曲线。
图3为定量检测PCT剂量-反应曲线双对数Spline曲线。
图4为双标记定量检测CRP剂量-反应曲线双对数Spline曲线。
图5为双标记定量检测SAA剂量-反应曲线双对数Spline曲线。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
实施例1定量检测C反应蛋白(CRP)
本实施例以采用TPE-COOH聚集诱导荧光微球为例，具体操作如下：
将C反应蛋白标准品稀释为0ng/ml、0.52ng/ml、1.42ng/ml、2.84ng/ml、35.7ng/ml、188.35ng/ml、339.5ng/ml。
待测样品标示值22.35ng/ml。
1.聚集诱导荧光微球标记抗原或抗体，获得荧光标记物
1.1标记抗体/抗原预处理：取C反应蛋白一抗抗体加入30KD的超滤离心管中，4℃10000r/min离心9min～10min。再用结合缓冲液重复洗涤3～5次，并浓缩至一定浓度(如1mg/ml)。结合缓冲液为pH8.0～9.0，0.05M的Tris-HCl缓冲液。
1.2聚集诱导荧光微球标记抗原或抗体：用MES清洗液洗涤聚集诱导荧光微球3-5次，用MES复溶荧光微球，加入适量的EDC和NHS，室温震荡30min，离心去除上清，用MES清洗3-5次。加入步骤1.1中预处理过的CRP抗体，室温震荡24h，离心去除上清。用Tris-Hcl清洗3-5次，并用Tris-Hcl复溶，复溶浓度为5mg/ml。4℃保存备用。
2.纳米磁珠包被抗原/抗体
2.1包被抗体/抗原预处理：取C反应蛋白二抗抗体加入30KD的超滤离心管中，4℃10000r/min离心9min～10min。再用结合缓冲液重复洗涤3～5次，并浓缩至一定浓度(如1mg/ml)。结合缓冲液为pH8.0～9.0，0.05M的Tris-HCl缓冲液。
2.2纳米磁珠的洗涤：吸取纳米磁珠到1.5ml离心管中，将离心管放置在磁力架中，利用磁力架进行磁珠和缓冲液的分离，用0.1M pH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)洗涤磁珠3～5次。
2.3纳米磁珠的活化：将步骤2.2中洗涤好的纳米磁珠中加入0.1M pH6.0的MES，加入50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液(EDC)和50mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温震荡反应0.5～1小时。
2.3纳米磁珠与抗原/抗体的结合：按照纳米磁珠与抗体质量比为10：1，将步骤2.1中预处理过的C反应蛋白抗体，与步骤2.3中活化后的纳米磁珠通过共价键耦合，室温反应18-24小时。然后用含有5％(w/v)BSA的Tris-Hcl缓冲液进行清洗、封闭，封闭0.5～1h；然后使用保存液反复清洗并定容，浓度为5mg/ml定容，2～8℃冰箱直立保存备用。
3.检测反应体系：分别依次加入30ul稀释10-50倍的步骤2所述的包被抗体的纳米磁珠工作液、30ul不同浓度的标准品/待测样品、100ul稀释100-300倍的步骤1所述的标记抗体的荧光微球工作液，37℃孵育16min，磁力架吸磁后，用TPE-COOH激发光扫描检测反应体系，通过荧光采集TPE-COOH发射光强度，然后进行数据分析。
检测结果如表1所示：
根据表1结果将标准品浓度与荧光信号值拟合出剂量-反应双对数Spline曲线(见图2)，当待测样品荧光值为619983，代入Spline曲线，得出反馈浓度为22.4351ng/ml。与待测样品标示值22.35ng/ml的偏差为0.38％，该数值远远小于国家医药行业标准YY/T1588-2018降钙素原测定试剂盒中准确度相对偏差小于15％的规定。
本实施例中，实际的操作步骤及相关标准曲线参数，已事先拷贝至配套的RFID卡内，实验操作过程只需要按试剂准备过程准备好后，将RFID卡与全自动设备适配即可完成从信息读取、加样到检测的全过程。
实施例2定量检测降钙素原(PCT)
本实施例以采用TPE-CHO聚集诱导荧光微球为例，具体操作如下：
将降钙素原标准品稀释为0ng/ml、0.02ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。
待测样品标示值0.452ng/ml。
1.聚集诱导荧光微球标记抗体，获得荧光标记物
1.1标记抗体预处理：取降钙素原一抗抗体加入30KD的超滤离心管中，4℃10000r/min离心9min～10min。再用结合缓冲液重复洗涤3～5次，并浓缩至一定浓度(如1mg/ml)。结合缓冲液为pH8.0～9.0，0.05M的Tris-HCl缓冲液。
1.2聚集诱导荧光微球标记抗体：用MES清洗液洗涤聚集诱导荧光微球3-5次，用MES复溶荧光微球，加入适量的EDC和NHS，室温震荡30min，离心去除上清，用MES清洗3-5次。加入步骤1.1中预处理过的降钙素原抗体，室温震荡24h，离心去除上清。用Tris-Hcl清洗3-5次，并用Tris-Hcl复溶，复溶浓度为5mg/ml。4℃保存备用。
2.纳米磁珠包被抗原/抗体
2.1包被抗体预处理：取降钙素原二抗抗体加入30KD的超滤离心管中，4℃10000r/min离心9min～10min。再用结合缓冲液重复洗涤3～5次，并浓缩至一定浓度(如1mg/ml)。结合缓冲液为pH8.0～9.0，0.05M的Tris-HCl缓冲液。
2.2纳米磁珠的洗涤：吸取纳米磁珠到1.5ml离心管中，将离心管放置在磁力架中，利用磁力架进行磁珠和缓冲液的分离，用0.1M pH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)洗涤磁珠3～5次。
2.3纳米磁珠的活化：将步骤2.2中洗涤好的纳米磁珠中加入0.1M pH6.0的MES，加入50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液(EDC)和50mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温震荡反应0.5～1小时。
2.3纳米磁珠与抗体的结合：按照纳米磁珠与降钙素原抗体质量比为10：1，将步骤2.1中预处理过的降钙素原抗体，与步骤2.3中活化后的纳米磁珠通过共价键耦合，室温反应18-24小时。然后用含有5％(w/v)BSA的Tris-Hcl缓冲液进行清洗、封闭，封闭0.5～1h；然后使用保存液反复清洗并定容，浓度为5mg/ml定容，2～8℃冰箱直立保存备用。
3.检测反应体系：分别依次加入30ul稀释10-50倍的步骤2所述的包被抗体的纳米磁珠工作液、30ul不同浓度的标准品/待测样品、100ul稀释100-300倍的步骤1所述的标记抗体的荧光微球工作液，37℃孵育5min，磁力架吸磁后，用TPE-CHO激发光扫描检测反应体系，通过荧光采集TPE-CHO发射光强度，然后进行数据分析。
检测结果如表2所示：
待测样品荧光值为16305，根据标准品浓度与荧光信号值拟合出剂量-反应曲线双对数Spline曲线(见图3)，得出反馈浓度为0.4365ng/ml。与待测样品标示值0.452ng/ml的偏差为3.43％。，该数值远远小于国家医药行业标准YY/T1588-2018降钙素原测定试剂盒中准确度相对偏差小于15％的规定。
本实施例中，实际的操作步骤及相关标准曲线参数，已事先拷贝至配套的RFID卡内，实验操作过程只需要按试剂准备过程准备好后，将RFID卡与全自动设备适配即可完成从信息读取、加样到检测的全过程
实施例3双标记定量检测C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)
为达到检测目的，本实施例以采用聚集诱导荧光材料的激发光波长相近、发射光波长的不同的TPE-2SO3Na+和TPE-COOH两种聚集诱导荧光微球为例分别对C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)进行标记，具体操作如下：
将C反应蛋白标准品稀释为0ng/ml、0.52ng/ml、1.42ng/ml、2.84ng/ml、35.7ng/ml、188.35ng/ml、339.5ng/ml。
将血清淀粉样蛋白标准品稀释为0ng/ml、0.93ng/ml、3.57ng/ml、15.45ng/ml、73.39ng/ml、140.19ng/ml、282.82ng/ml。
待测样品中同时含有C反应蛋白和血清淀粉样蛋白，且C反应蛋白标示值为10.05ng/ml，血清淀粉样蛋白标示值为16.33ng/ml。
1.聚集诱导荧光微球标记抗原或抗体，获得荧光标记物
1.1标记抗体预处理：分别取C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)抗体分别加入30KD的超滤离心管中，4℃10000r/min离心9min～10min。再分别用结合缓冲液重复洗涤3～5次，并分别浓缩至一定浓度(如1mg/ml)。结合缓冲液为pH8.0～9.0，0.05M的Tris-HCl缓冲液。
1.2聚集诱导荧光微球标记抗原或抗体：用MES缓冲液分别清洗TPE-2SO3Na+和TPE-COOH洗涤聚集诱导荧光微球3-5次，用MES缓冲液复溶荧光微球，加入适量的EDC((1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，室温震荡30min，离心去除上清，用MES清洗3-5次。分别加入步骤1.1中预处理过的C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)抗体，室温震荡24h，离心去除上清。用Tris-Hcl清洗3-5次，并用Tris-Hcl复溶，复溶浓度为5mg/ml。4℃保存备用。
2.纳米磁珠包被抗体
2.1包被抗体预处理：分别取C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)抗体加入30KD的超滤离心管中，4℃10000r/min离心9min～10min。再分别用结合缓冲液重复洗涤3～5次，并分别浓缩至一定浓度(如1mg/ml)。结合缓冲液为pH8.0～9.0，0.05M的Tris-HCl缓冲液。
2.2纳米磁珠的洗涤：吸取纳米磁珠到1.5ml离心管中，将离心管放置在磁力架中，利用磁力架进行磁珠和缓冲液的分离，用0.1M pH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)洗涤磁珠3～5次。
2.3纳米磁珠的活化：将步骤2.2中洗涤好的纳米磁珠中加入0.1M pH6.0的MES，加入50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液(EDC)和50mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温震荡反应0.5～1小时。
2.3纳米磁珠与抗原/抗体的结合：分别按照纳米磁珠与C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)抗体质量比为10：1，将步骤2.1中预处理过的C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)抗体，分别与步骤2.3中活化后的纳米磁珠通过共价键耦合，室温反应18-24小时。然后分别用含有5％(w/v)BSA的Tris-Hcl缓冲液进行清洗、封闭，封闭0.5～1h；然后分别使用保存液反复清洗并定容，浓度为5mg/ml定容，2～8℃冰箱直立保存备用。
3.检测反应体系：分别依次加入30ul稀释10-50倍的步骤2所述的包被抗体的纳米磁珠工作液、30ul不同浓度的标准品或待测样品、100ul稀释100-300倍的步骤1所述的标记抗体的荧光微球工作液，37℃孵育16min，磁力架吸磁后，分别用350-370nm激发光扫描检测反应体系，分别采集490nm和550nm波长处TPE-2SO3Na+和TPE-COOH荧光强度，然后进行数据分析。
检测结果如表3所示：
测得待测样品中CRP荧光值为10058，SAA荧光值181331，根据待测物浓度与荧光信号值拟合出剂量-反应曲线双对数Spline曲线(图4、5)，分别得出反馈浓度为10.013ng/ml、16.342ng/ml。与待测样品标示值的偏差分别为-0.37％、0.07％。该数值远小于国家医药行业标准YY/T1588-2018降钙素原测定试剂盒中准确度相对偏差小于15％的规定。
本实施例中，实际的操作步骤及相关标准曲线参数，已事先拷贝至配套的RFID卡内，实验操作过程只需要按试剂准备过程准备好后，将RFID卡与全自动设备适配即可完成从信息读取、加样到检测的全过程。
对比例1：常规磁微粒时间分辨荧光定量分析降钙素原(PCT)
本对比例采用稀土元素螯合物DTPA-Eu代替本发明中的聚集诱导荧光微球标记降钙素原抗体一，纳米磁珠包被降钙素原抗体二步骤与实施例2步骤一致。
对比例2：磁珠化学发光法定量检测降钙素原(PCT)
本对比例以碱性磷酸酶作为发光底物，纳米磁珠包被降钙素原抗体二步骤与实施例2步骤一致。
效果检测试验
1、灵敏度试验：
取具有溯源性的高值校准品稀释出4个浓度样本，分别用实施例2和对比例1和对比例2，制得降钙素原(PCT)检测试剂进行阴性样本对照检测，结果如下表4所示。
表4：灵敏度测试结果
由表4检测结果可知，在样本浓度低至0.5ng/mL时，实施例2、对比例1和对比例2的信噪比分别为7.55、3.85、6.02，实施例信噪比均大于对比例，说明本发明方案检测最灵敏。另外，当样本20ng/mL时，实施例2、对比例1和对比例2的荧光检测值分别为7.55、306096、178948、246293，实施例2信噪比最高，荧光值最大。从线性相关系数数据说明，本实施例的线性也是最好的。表4中数据说明，与常规磁微粒时间分辨荧光定量试剂盒和磁珠化学发光法定量试剂盒检测降钙素原相比，本发明检测方法拥有更高的检测灵敏度、更宽的线性范围。
2、准确度试验：
取具有溯源性的高值血清样本(靶值19.34ng/mL)、中值血清样本(靶值1.99ng/mL)、低值血清样本(靶值0.049ng/mL)各一份，分别用实施例2、对比例1和对比例2制得降钙素原(PCT)检测试剂盒进行对照检测，各检测3次，计算平均值，与质控物靶值进行对照。结果如下：
由上表可知，与对比例中常规磁微粒时间分辨荧光定量试剂盒和磁珠化学发光法定量试剂盒检测降钙素原相比，本发明方案的检测结果更准确可靠。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种使用聚集诱导发光联合免疫磁珠的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：分别用目的待测物X1、X2…Xn的一抗抗体标记聚集诱导荧光微球Y1、Y2…Yn；
S2：分别用目的待测物X1、X2…Xn的二抗抗体包被免疫磁珠Z1、Z2…Zn；
S3：将步骤S1的荧光微球、S2的免疫磁珠与检测样本共同孵育后，使用检测分析仪进行荧光采集和数据分析，所述荧光微球Y1、Y2…Yn同时被检测分析仪同一范围波长的激发光激发，发射出不同范围波长的发射光，采集不同波长的荧光值，通过获得的相对应待测物X1、X2…Xn的荧光值确定待测物在检测样本中的含量；
其中，n＝除“0”之外的自然数，所述荧光微球Y1、Y2…Yn由不同的聚集诱导发光材料制备而成；所述待测物X1、X2…Xn是同一检测样本中的单一目的待测物或多种混合目的待测物。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测物包括生物大分子。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述生物大分子为抗体或抗原。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述聚集诱导发光材料包括TPE-COOH、TPE-CHO、TPE-2SO3Na+或/和TPE(COOH)4。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤S2二抗抗体包被免疫磁珠之前还包括对抗体的预处理。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述抗体的预处理具体操作为：将抗体加入超滤离心管中，4℃10000r/min离心9min～10min，用结合缓冲液重复洗涤3～5次，并浓缩至一定浓度。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中共同孵育条件为37℃孵育5-16min。
8.一种含有聚集诱导发光联合免疫磁珠的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：聚集诱导荧光微球和免疫磁珠。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述聚集诱导荧光微球包被待测物相对应的一抗抗体，所述免疫磁珠包被待测物相对应的二抗抗体。
10.如权利要求8所述的试剂盒在荧光免疫检测中的应用。
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