CN111122859A - 基于免疫磁珠的双标记抗hiv及hcv时间分辨荧光免疫分析方法 - Google Patents

基于免疫磁珠的双标记抗hiv及hcv时间分辨荧光免疫分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒、检测方法及其制备方法，通过制备2株针对HIV患者体液中抗体的特异性重组抗原，其中一株重组抗原用于偶联磁珠(免疫磁珠①)，另一株重组抗原用铕离子标记；同时制备另外2株针对HCV患者体液中抗体的特异性重组抗原，其中一株重组抗原用于偶联磁珠(免疫磁珠②)，另一株重组抗原用钐离子标记。先通过双抗原夹心的免疫反应，形成免疫磁珠①‑HIV抗体‑铕标记抗原复合物，及免疫磁珠②‑HCV抗体‑钐标记抗原复合物，再通过磁性分离技术将吸附人HIV及HCV抗体的免疫磁珠与上清分离洗涤，最后加入增强液并通过时间分辨仪器测值。本发明检测灵敏度高、时间短、误差小且可靠性高。

Description

基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析 方法
技术领域
本发明涉及一种磁性分离技术和时间分辨荧光免疫分析技术的结合，具体是一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法及相应的试剂盒。
背景技术
艾滋病是一种由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染人免疫系统细胞并造成免疫系统缺陷，严重威胁人类健康的疾病。针对该疾病目前尚无免疫预防、无根除体内病毒的有效药物，因此具有高感染率、高病死率的特征。丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染引起的病毒性肝炎。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。由于HIV与HCV都可以通过输血、静脉吸毒、性传播、母婴垂直传播等途径传播,因而HIV和HCV共感染比较常见。有研究表明，HIV和HCV合并感染率达30％，在吸毒人群中甚至高达70％以上。大部分HIV感染者的肝脏疾病是因为混合感染HCV的结果。丙型肝炎感染引起的慢性肝脏疾病会增加HIV感染者因肝脏损伤，其引起的死亡已成为艾滋病患者死亡的主要原因之一，且共感染可加速HCV感染相关疾病的过程。因此,对HIV、HCV两者合并感染这一世界性的重要公共卫生问题的研究十分重要。
从1985年第1代HIV抗体检测试剂问世到现在，HIV血清学检测试剂已经发展到了第4代。第4代ELISA试剂的优点在于能同时检测抗原和抗体，降低血源筛查的残余危险度，在对艾滋病早期诊断的效果上明显优于第3代。但从方法学上来讲，这种基于ELISA的分析方法，灵敏度终归是有限的。相对时间分辨荧光免疫分析技术和化学发光等更先进的分析方法，它的灵敏度比较低。HCV血清学检测试剂在市场化中也存在同样的问题。由此可见，提高敏感性、特异性、缩短窗口期和简便快速是HIV及HCV检测试剂未来发展的主要趋势。时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑，已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。TRFIA以稀土离子作为标记物，具有制备简便、储存时间长、无放射性污染、重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰，并且可以对同一样品不同分析物进行标记和应用范围十分广泛等优点。然而，目前国内外厂家均采用基于微孔板TRFIA技术研制相应的试剂盒(包括PerKin Elmer公司试剂盒)，由于微孔板的固液相反应面积小，需要的免疫反应时间较久；并且微孔板是通过物理吸附包被抗原或抗体，包被量很难标准化，使得检测结果精密度较差；微孔板TRFIA技术主要为半自动检测，或前处理加上TRFIA检测仪的准全自动检测，使得样本需要积累到一定量后才能检测。
生物素-亲和素系统(biotin-avidin system，BAS)是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。自20世纪70年代，BAS开始应用于免疫化学领域以来，利用BAS可被荧光索、酶、放射性核素等材料标记的特点而发展和建立了许多新的检测方法和技术，尤其是与免疫标记技术的有机结合，极大地提高了测定的灵敏度。目前，BAS技术已在整个生物学领域中得到广泛应用，成为当今生物医学研究工作中最具使用价值和发展前途的技术之一。
免疫磁珠是免疫学和磁载体技术相结合而发展起来的一类新型材料，是一种磁珠表面包被特异性配基，可与抗原或抗体特异性结合形成磁珠-抗原/抗体复合物，然后通过外加磁场的作用，使磁珠和溶液快速分离，可以在短时间内得到浓缩，纯净的待测样品，缩短反应和检测时间，提高检测灵敏度及检测效率。目前免疫磁珠结合酶免检测方法是在免疫检测领域最主要的应用，其采用免疫磁珠配合常规ELISA方法主要用于免疫检测、细胞和微生物的分离和蛋白质、DNA、RNA以及mRNA等生物大分子纯化检测，但免疫磁珠结合双标记时间分辨应用于HIV和HCV传染病监测尚无文献报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，具有测试灵敏度高，稳定性好的特点。
本发明的上述目的通过如下技术手段实现。
提供一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，含有偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠、偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠、铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag，偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠①，偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠②。
优选的，上述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，还含有两株生物素化的HIV抗原和两株生物素化的HCV抗原；
其中一株HIV抗原用于偶联免疫磁珠①，另外一株HIV抗原用铕离子标记；
一株HCV抗原用于偶联免疫磁珠②，另外一株HCV抗原用钐离子标记。
优选的，上述的述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，检测方法是先通过双抗原夹心的免疫反应，形成免疫磁珠①-HIV-Ab-铕标记抗原复合物、免疫磁珠②-HCV-Ab-钐标记抗原复合物，再通过磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤，最后加入增强液并通过时间分辨仪器测值。
本发明的目的之二在于提供一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，利用磁分离技术并整合时间分辨免疫荧光分析法，除了拥有TRFIA技术的灵敏度高、稳定性好诸多特点外，磁珠结合应用于时间分辨与传统的微孔板时间分辨荧光免疫分析方法相比还具有以下的特点：①表面积更大，能结合更多的蛋白分子；②可以通过共价键与探针分子连接，比聚苯乙烯为材料的微孔板的物理吸附作用更牢固；③是一种小型的、流动的固相载体，使反应能更快地达到动态平衡，从而加快反应速度；④表面结合的密度高，使荧光信号更集中；⑤可以和不同的探针分子结合，使检测同一样本中不同的待测物成为可能；⑥磁珠的外观和包被过程的灵活性更大，可以根据不同的实验要求进行选择。
本发明的上述目的通过如下技术手段实现。
提供一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，具有如下步骤，
(1)链霉亲和素磁珠制备：具体经过磁珠活化、链霉亲和素与磁珠偶联、洗涤、封闭、保存步骤制备得到链霉亲和素磁珠；
(2)生物素化抗原制备：具体经过生物素与抗原连接、透析、保存步骤制备得到高特异性的生物素化的HIV和HCV抗原；
(3)铕和钐离子标记抗原制备：具体是分别选用一株HIV-Ag进行Eu3+标记，一株HCV-Ag进行Sm3+标记，制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag；其中，以体积比计，HIV-Ag与Eu3+标记物的比例为5:1，HCV-Ag与Sm3+标记物的比例为2.5:1；
(4)测定方法：
往反应管加入100μl样品，再加入用分析缓冲液以体积比为1:30稀释的步骤(1)制备的链霉亲和素磁珠50μl，然后加入用分析缓冲液以体积比为1:100稀释的步骤(2)制备的生物素化抗原各50μl，室温震荡孵育45分钟；运用磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤；最后加入用分析缓冲液以体积比为1:25稀释的步骤(3)制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag各100μl，室温震荡孵育45分钟；重复分离洗涤步骤，最后加入200μl增强液震荡孵育5min进行荧光检测。
在步骤(1)中，
磁珠活化过程为：取1ml重悬后的磁珠,重复洗涤3次，加入25μl 10mg/ml的EDC和40μl 10mg/ml的NHS，用样本旋转混合仪，室温旋转30min；
洗涤过程中使用的洗涤液的为：将25mM的Tris-HCl、0.15M NaCl加入1ml体积百分比为0.05％的Tween 20，用浓盐酸调节PH值得到pH 7.2的缓冲液；
封闭过程中使用的封闭液为：以重量份计，含有15％的蔗糖、10％的小牛血清、75％的去离子水，用浓盐酸调节PH值得到的pH 7.0的缓冲液；
磁珠保存过程中使用的保存液为：25mM的Tris-HCl、0.15M的NaCl加入1ml体积百分比为0.05％的Tween 20，用浓盐酸调节PH值得到的得到的pH 7.2的缓冲液。
在步骤(2)中，
Eu3+和Sm3+标记抗原稀释所用分析缓冲液的成分为：50mM的Tris-HCl、质量浓度1.5％的PEG 6000、质量浓度0.2％的BSA、体积浓度0.1％的Proclin 300、质量浓度0.02％的牛IgG、体积浓度0.1％的Tween 20、质量浓度0.84％的NaCl，分析缓冲液的pH值为7.8。
在步骤(4)中，
洗涤采用25×洗涤液进行，25×洗涤液的成分为：1.25mM Tris-HCl、体积浓度2.5％Tween20、质量浓度21％NaCl，洗涤液的pH为7.8。
在步骤(3)中，
增强液的成分为：质量浓度0.1％β2二酮体、质量浓度1％三辛基氧化磷、体积浓度0.1％Triton 200、体积浓度1.5％醋酸和质量浓度0.1％邻苯二甲酸氢钾，增强液的pH值为2.0～3.2。
本发明检测方法的基础是双抗原夹心的免疫反应：通过链霉亲和素磁珠与生物素抗原形成复合物，即免疫磁珠，用铕和钐标记抗原。免疫磁珠、铕标记抗原及待测抗体在反应管中经过震荡孵育后形成免疫磁珠-抗体-铕标抗原免疫复合物。加入增强液震荡反应后，在紫外光的激发下发射出很强的荧光，用时间分辨仪器测定其荧光强度。以加入定标品的检测值绘制标准曲线，以加入待检测样品的检测值从标准曲线计算被测样品的含量，其荧光强度与样品中的抗体浓度成正比，对照标准曲线即可确定样品中抗体的量。
本发明的目的之三在于提供一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，依次包括，
(1)链霉亲和素磁珠制备：具体经过磁珠活化、链霉亲和素与磁珠偶联、洗涤、封闭、保存步骤制备得到链霉亲和素磁珠；
(2)生物素化抗原制备：具体经过生物素与抗原连接、透析、保存步骤制备得到高特异性的生物素化的HIV和HCV抗原；
(3)铕和钐离子标记抗原制备：具体是分别选用一株HIV-Ag进行Eu3+标记，一株HCV-Ag进行Sm3+标记，制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag；其中，以体积比计，HIV-Ag与Eu3+标记物的比例为5:1，HCV-Ag与Sm3+标记物的比例为2.5:1；
(4)洗液、分析缓冲液和增强液的配置。
具体的，分析缓冲液的配方为：
Figure BDA0002341119700000051
配制完成后，混匀，使用浓盐酸调pH值至7.8，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中；
洗液为25x洗液，配方为：
Figure BDA0002341119700000052
配制完成后，混匀，使用浓盐酸调pH值至7.8，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中；
增强液配方为：
Figure BDA0002341119700000053
Figure BDA0002341119700000061
配制完成后，混匀，放置30分钟后观察无晶体或沉淀析出，应采用电子pH计进行检测pH应控制在2.0-3.2之间，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中。
综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行筛选试验和质量检定，包括偶联磁珠和铕(钐)标记抗原的活性、标记物和抗原的比例、标记物的稀释度等通过反复探索和试验比对最终找到了简便、效率高、成本低、质量可靠的连接和标记方法。
本发明公开了基于上述探索试验得到的各种试剂配方，包括：洗液配方、分析缓冲液配方、增强液配方，进一步公开了铕标记抗原及免疫磁珠的制备过程。
本发明公开该技术具有无放射性污染，样本量低，灵敏度高，反应快速，背景荧光低，性质稳定，便于操作，易于微型化自动化，价格低廉等优点。通过对人体血清中HIV抗体及HCV抗体含量的检测，与国外酶联免疫法试剂盒同时测定，测定的结果相关性较高，预示着未来能运用于临床的美好前景。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1。
一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，含有偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠、偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠、铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag，偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠①，偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠②。
该基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，还含有两株生物素化的HIV抗原和两株生物素化的HCV抗原；其中一株HIV抗原用于偶联免疫磁珠①，另外一株HIV抗原用铕离子标记；一株HCV抗原用于偶联免疫磁珠②，另外一株HCV抗原用钐离子标记。
检测方法是先通过双抗原夹心的免疫反应，形成免疫磁珠①-HIV-Ab-铕标记抗原复合物、免疫磁珠②-HCV-Ab-钐标记抗原复合物，再通过磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤，最后加入增强液并通过时间分辨仪器测值。
本实施例的试剂盒可以简便、高效、低成本、质量可靠地进行标记，具有无放射性污染，样本量低，灵敏度高，反应快速，背景荧光低，性质稳定，便于操作，易于微型化自动化，价格低廉等优点。通过对人体血清中HIV抗体及HCV抗体含量的检测，测定的结果相关性较高。
实施例2。
一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，通过如下步骤进行。
(1)链霉亲和素磁珠制备：具体经过磁珠活化、链霉亲和素与磁珠偶联、洗涤、封闭、保存步骤制备得到链霉亲和素磁珠。
在步骤(1)中，
磁珠的活化：用涡旋混合器充分混匀悬浮磁珠，取1ml(10mg)悬浮液于离心管中，并置于磁分离器上1min(或更长时间)，小心移去上清。加入1ml Binding Buffer，用涡旋混合器充分混匀悬浮磁珠，并置于磁分离器上1min(或更长时间)小心移去上清，重复该步骤2次后加入25μl EDC(10mg/ml)和40μl NHS(10mg/ml)，用样本旋转混合器，室温旋转30min。加入1ml Binding Buffer，用涡旋混合器充分混匀悬浮磁珠，并置于磁分离器上1min(或更长时间)小心移去上清，重复该步骤2次。
Binding Buffer为含有MES(0.1M)、pH 5.0的缓冲液。EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，NHS为N-羟基硫代琥珀酰亚胺。
链霉亲和素与磁珠偶联：在第一步去除上清的磁珠中加入150μg链霉亲和素，用涡旋混合器充分混匀悬浮磁珠，用样本旋转混合器，室温旋转3h或4℃过夜。
洗涤：将第二步中的离心管置于磁分离器上1min(或更长时间)，小心移去上清，加入1ml洗涤液，用涡旋混合器充分混匀悬浮磁珠，并置于磁分离器上1min(或更长时间)小心移去上清，重复该步骤2次。洗涤过程中使用的洗涤液的为：将25mM的Tris-HCl、0.15M NaCl加入1ml体积百分比为0.05％的Tween 20，用浓盐酸调节PH值得到pH 7.2的缓冲液。
封闭：在清洗后的磁珠中加入3mL封闭液，用样本旋转混合器，室温旋转3h离心管置于磁分离器上1min(或更长时间)，小心移去上清，加入1ml保存液，用涡旋混合器充分混匀悬浮磁珠，并置于磁分离器上1min(或更长时间)小心移去上清。最后在磁珠中加入1ml保存液，2-8℃保存。封闭过程中使用的封闭液为：以重量份计，含有15％的蔗糖、10％的小牛血清、75％的去离子水，用浓盐酸调节PH值得到的pH 7.0的缓冲液。磁珠保存过程中使用的保存液为：25mM的Tris-HCl、0.15M的NaCl加入1ml体积百分比为0.05％的Tween 20，用浓盐酸调节PH值得到的得到的pH 7.2的缓冲液。
(2)生物素化抗原制备：具体经过生物素与抗原连接、透析、保存步骤制备得到高特异性的生物素化的HIV和HCV抗原。
步骤(2)中，
抗原纯化和浓缩：将1mg抗原加入到Millipore公司带有滤膜的离心管中,以9000r/min离心8min，每次用200μL缓冲液，重复洗涤6次后收集抗原，调整抗原浓度为20mg/mL。
生物素与抗原连接：在抗原溶液中加入2μL 22mg/mL生物素(用DMSO配制，现配现用)，室温振动孵育4h。
透析：利用PBS 4℃透析24h，每6h换液一次，收集透析袋中液体，将其抗原浓度调整为0.5mg/mL。
缓冲液为Na2CO3/NaHCO3(0.1M),pH 9.5的缓冲液，PBS为NaCl(8mg/mL)、KCl(0.2mg/mL)、Na2HPO4(1.44mg/mL)、KH2PO4(0.24mg/mL)、Tween 20(0.05％)，pH 7.4的缓冲液。
(3)铕和钐离子标记抗原制备：具体是分别选用一株HIV-Ag进行Eu3+标记，一株HCV-Ag进行Sm3+标记，制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag；其中，以体积比计，HIV-Ag与Eu3+标记物的比例为5:1，HCV-Ag与Sm3+标记物的比例为2.5:1。
步骤(3)中提到的以铕标记HIV抗原及钐标记HCV抗原,其制备步骤分别为：
1)抗原纯化和浓缩：将1mg HIV-Ag(HCV-Ag)加入0.5ml标记缓冲液，混匀后，用Millipore公司带有滤膜的G-50离心管10000rpm离心5min，再重复洗涤6次，倒转离心收集抗体，体积控制在200μl左右。
2)抗原标记：将纯化的HIV-Ag加入0.2mg Eu3+标记试剂，将纯化的HCV-Ag抗体加入0.4mg Sm3+充分混匀，25℃振荡过夜。
3)上样与洗脱：用Sephadex G-50层析柱(1x30cm)分离纯化,洗脱液洗脱，同时收集流出液(1ml/管)，逐管测量吸光度(A280nm),合并峰管，测蛋白含量并计算标记率。
4)确定稀释度：并管后的铕标记物，进行稀释度摸索，选择线性较好，灵敏度较高的稀释度；分装铕标记物：用连续加样枪分装，体积为1.0ml/瓶，真空冷冻干燥。
5)保存：冻干后2℃-8℃。
步骤(3)中标记缓冲液为,Na2CO3(50mM),pH 9.0的缓冲液。洗脱液为NaCl(0.9％)、Tris-HCl(50mM)，pH 7.8的缓冲液。标记抗原稀释所用分析缓冲液为Tris-HCl(50mM)、PEG6000(1.5％)、BSA(0.2％)、Proclin 300(0.1％)、牛IgG(0.02％)、Tween 20(0.1％)、NaCl(0.84％)，pH 7.8的缓冲液。
根据本实施例，HIV-Ag进行Eu3+标记，抗体原与Eu3+标记物的比例为5:1为较佳比例；HCV-Ag进行Sm3+标记，抗原与Eu3+标记物的比例为2.5:1为较佳比例,标记率太高，影响被标记抗原的免疫活性；标记率太低，信号强度不够，降低检测灵敏度。
(4)测定方法：
往反应管加入100μl样品，再加入用分析缓冲液以体积比为1:30稀释的步骤(1)制备的链霉亲和素磁珠50μl，然后加入用分析缓冲液以体积比为1:100稀释的步骤(2)制备的生物素化抗原各50μl，室温震荡孵育45分钟；运用磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤；最后加入用分析缓冲液以体积比为1:25稀释的步骤(3)制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag各100μl，室温震荡孵育45分钟；重复分离洗涤步骤，最后加入200μl增强液震荡孵育5min进行荧光检测。
增强液的成分为：质量浓度0.1％β2二酮体、质量浓度1％三辛基氧化磷、体积浓度0.1％Triton 200、体积浓度1.5％醋酸和质量浓度0.1％邻苯二甲酸氢钾，增强液的pH值为2.0～3.2。
本实施例通过链霉亲和素磁珠与生物素抗原形成复合物，即免疫磁珠，用铕和钐标记抗原。免疫磁珠、铕标记抗原及待测抗体在反应管中经过震荡孵育后形成免疫磁珠-抗体-铕标抗原免疫复合物。加入增强液震荡反应后，在紫外光的激发下发射出很强的荧光，用时间分辨仪器测定其荧光强度。以加入定标品的检测值绘制标准曲线，以加入待检测样品的检测值从标准曲线计算被测样品的含量，其荧光强度与样品中的抗体浓度成正比，对照标准曲线即可确定样品中抗体的量。
本实施例可以简单、方便地进行标记，具有灵敏度高，结果准确的特点。
实施例3。
如实施例1或2中的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，依次包括，
(1)链霉亲和素磁珠制备：具体经过磁珠活化、链霉亲和素与磁珠偶联、洗涤、封闭、保存步骤制备得到链霉亲和素磁珠；
(2)生物素化抗原制备：具体经过生物素与抗原连接、透析、保存步骤制备得到高特异性的生物素化的HIV和HCV抗原；
(3)铕和钐离子标记抗原制备：具体是分别选用一株HIV-Ag进行Eu3+标记，一株HCV-Ag进行Sm3+标记，制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag；其中，以体积比计，HIV-Ag与Eu3+标记物的比例为5:1，HCV-Ag与Sm3+标记物的比例为2.5:1；
(4)洗液、分析缓冲液和增强液的配置。
制备链霉亲和素磁珠，生物素化抗原，制备铕和钐标记物的制备方法与实施例2中相同。
本实施例中，分析缓冲液的配方为：
Figure BDA0002341119700000101
配制完成后，混匀，使用浓盐酸调pH值至7.8，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中；
洗液为25x洗液，配方为：
Figure BDA0002341119700000102
配制完成后，混匀，使用浓盐酸调pH值至7.8，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中；
增强液配方为：
Figure BDA0002341119700000103
配制完成后，混匀，放置30分钟后观察无晶体或沉淀析出，应采用电子pH计进行检测pH应控制在2.0-3.2之间，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中。
实施例4。
以下结合具体实验例对本实施例作进一步说明。
本实施例的试剂盒的使用方法
一、样本收集
采静脉血1-2ml于凝血管中，4℃放置2小时以上，待血清析出后取100μl血清即可。血清样品在2-8℃可以保存7天，如果需要长期保存，请在-20℃保存，避免反复冻融。样品需要在含干冰的保温瓶或其它装置条件下运输。
二、试剂的准备
(1)洗涤液：将50mL浓缩洗液和1200mL去离子水混合，作为工作洗涤液。
(2)标记物工作液：使用前一小时将每瓶标记物用1mL去离子水溶解，用分析缓冲液以1:25倍稀释作为铕/钐标抗原工作液。
(3)链霉亲和素磁珠：使用前需震荡悬浮。
三、操作步骤
(1)每管加入50μl链霉亲和素磁珠，然后加入100μl定标品或样品，再加入分别偶联HIV-Ag及HCV-Ag的生物素化抗原各50μl，室温震荡孵育45分钟。
(2)将反应管置于磁力分离架上2分钟，使磁珠凝集。吸弃上清，用洗涤液冲洗3-4次，每次加入洗涤液后需静置30秒，使磁珠重新凝集。
(4)吸弃洗液，每孔加入100μl铕/钐标抗体工作液，室温震荡孵育45分钟。
(5)重复步骤2。
(6)吸弃洗液，加增强液200μl，震荡孵育5分钟。
(7)测定。
本实施例的试剂盒的方法学检定
按照本领域中常规的制造和检定规程对通过实施例1中制备成的试剂盒进行检定，结果如下：
1)cutoff值的确定
用自制试剂盒检测400份健康者血清，根据检测荧光值与阴性对照比值的分布情况确定cutoff值。测定结果如表1-1和表1-2。从表1-1可以看出，HIV检测荧光值与阴性对照比值最低为0.36，最高为2.53，平均值
Figure BDA0002341119700000111
为1.06，标准差(SD)为0.29，大多数样本的检测荧光值与阴性对照比值在1.3(88.75％)以下，据统计学方法设定单侧检验截断值为
Figure BDA0002341119700000112
得1.54。从表1-2可以看出，HCV检测荧光值与阴性对照比值最低为0.34，最高为2.63，平均值
Figure BDA0002341119700000113
为1.09，标准差(SD)为0.31，大多数样本的检测荧光值与阴性对照比值在1.3(86.75％)以下，据统计学方法设定单侧检验截断值为
Figure BDA0002341119700000114
得1.60。另综合其他人的研究及临床现行参考值，我们建议设定自制试剂盒的HIV及HCV检测cutoff值＝阴性对照荧光值×2.1(其中1788和605分别为400份健康者血清标本HIV和HCV检测荧光值的平均值)，血清标本荧光值大于cutoff为阳性，小于cutoff为阴性。
表1-1健康者血清抗-HIV检测荧光值与阴性对照比值统计表(n＝400)
Figure BDA0002341119700000121
表1-2健康者血清抗-HCV检测荧光值与阴性对照比值统计表(n＝400)
Figure BDA0002341119700000122
2)准确性及灵敏度
用自制试剂盒测定中国药品生物制品检定所抗HIV和抗HCV试剂国家标准品中的阴、阳性参考品及灵敏度参考品，重复测定5次，计算其荧光值均值及标准差。测定结果如表2-1和表2-2。
表2-1抗HIV国家标准品检测结果
Figure BDA0002341119700000131
表2-2抗HCV国家标准品检测结果
Figure BDA0002341119700000141
3)特异性分析
将含乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体抗体、类风湿因子、抗核抗体和HBsAb、HBeAb、HBcAb、HIV(1+2)抗体等阳性血清样本分别作为样品用自制抗HIV及HCV-TRFIA试剂测定,结果表明被测物与两者都无交叉反应，结果见表3-1和表3-2。
表3-1抗HIV-TRFIA试剂特异性检测结果
Figure BDA0002341119700000151
表3-2抗HCV-TRFIA试剂特异性检测结果
Figure BDA0002341119700000152
4)精密度试验
采用中国药品生物制品检定所的抗HIV和抗HCV试剂国家标准品中提供的精密度参考品进行检测，各设8个复孔，计算各参考品检测值的均数、标准差及CV值。抗HIV分析内变异系数为4.8％-8.0％,分析间变异系数为3.5％；抗HCV分析内变异系数为5.8％-9.3％,分析间变异系数为5.5％，符合试剂盒的检定要求。结果见表4。
表4抗HIV和抗HCV国家标准品分析内精密度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002341119700000161
5)稳定性
37℃放置7天或者(2～8)℃放置12个月，测定结果应符合上述1)～4)项要求。
本实施例的试剂盒同酶联免疫法试剂盒临床血样测值比较
用自制的抗HIV及HCV-TRFIA和国外酶联免疫法试剂盒同时对400份血清标本进行检测(结果见表5-1和5-2)。在表5-1中10份酶免法检测为阴性，TRFIA检测为阳性的样品，用GENELABS公司研制生产的HIV抗体免疫印记试剂盒进行复核检测，结果均为阳性；在表5-2中11份酶免法检测为阴性，TRFIA检测为阳性的样品，用FQ-PCR(HCV-RNA)试剂盒进行复核检测，结果均为阳性,结果见表5-1、5-2所示。
表5-1抗HIV实验结果分析评价
Figure BDA0002341119700000162
表5-2抗HCV实验结果分析评价
Figure BDA0002341119700000163
抗HIV和抗HCV两者经配对计数资料的χ2检验分别得P＝0.012，P＝0.022(双侧)，差异显著，可见自制的抗HIV及HCV-TRFIA试剂盒优于酶免法并且灵敏度更高。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：含有偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠、偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠、铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag，偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠①，偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠②。
2.根据权利要求1所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：还含有两株生物素化的HIV抗原和两株生物素化的HCV抗原；
其中一株HIV抗原用于偶联免疫磁珠①，另外一株HIV抗原用铕离子标记；
一株HCV抗原用于偶联免疫磁珠②，另外一株HCV抗原用钐离子标记。
3.根据权利要求2所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：检测方法是先通过双抗原夹心的免疫反应，形成免疫磁珠①-HIV-Ab-铕标记抗原复合物、免疫磁珠②-HCV-Ab-钐标记抗原复合物，再通过磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤，最后加入增强液并通过时间分辨仪器测值。
4.一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：具有如下步骤，
(1)链霉亲和素磁珠制备：具体经过磁珠活化、链霉亲和素与磁珠偶联、洗涤、封闭、保存步骤制备得到链霉亲和素磁珠；
(2)生物素化抗原制备：具体经过生物素与抗原连接、透析、保存步骤制备得到高特异性的生物素化的HIV和HCV抗原；
(3)铕和钐离子标记抗原制备：具体是分别选用一株HIV-Ag进行Eu3+标记，一株HCV-Ag进行Sm3+标记，制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag；其中，以体积比计，HIV-Ag与Eu3+标记物的比例为5:1，HCV-Ag与Sm3+标记物的比例为2.5:1；
(4)测定方法：
往反应管加入100μl样品，再加入用分析缓冲液以体积比为1:30稀释的步骤(1)制备的链霉亲和素磁珠50μl，然后加入用分析缓冲液以体积比为1:100稀释的步骤(2)制备的生物素化抗原各50μl，室温震荡孵育45分钟；运用磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤；最后加入用分析缓冲液以体积比为1:25稀释的步骤(3)制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag各100μl，室温震荡孵育45分钟；重复分离洗涤步骤，最后加入200μl增强液震荡孵育5min进行荧光检测。
5.根据权利要求4所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：在步骤(1)中，
磁珠活化过程为：取1ml重悬后的磁珠,重复洗涤3次，加入25μl 10mg/ml的EDC和40μl10mg/ml的NHS，用样本旋转混合仪，室温旋转30min；
洗涤过程中使用的洗涤液的为：将25mM的Tris-HCl、0.15M NaCl加入1ml体积百分比为0.05％的Tween 20，用浓盐酸调节PH值得到pH 7.2的缓冲液；
封闭过程中使用的封闭液为：以重量份计，含有15％的蔗糖、10％的小牛血清、75％的去离子水，用浓盐酸调节PH值得到的pH 7.0的缓冲液；
磁珠保存过程中使用的保存液为：25mM的Tris-HCl、0.15M的NaCl加入1ml体积百分比为0.05％的Tween 20，用浓盐酸调节PH值得到的得到的pH 7.2的缓冲液。
6.根据权利要求4所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：在步骤(2)中，
Eu3+和Sm3+标记抗原稀释所用分析缓冲液的成分为：50mM的Tris-HCl、质量浓度1.5％的PEG 6000、质量浓度0.2％的BSA、体积浓度0.1％的Proclin 300、质量浓度0.02％的牛IgG、体积浓度0.1％的Tween 20、质量浓度0.84％的NaCl，分析缓冲液的pH值为7.8。
7.根据权利要求4所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：在步骤(4)中，
洗涤采用25×洗涤液进行，25×洗涤液的成分为：1.25mM Tris-HCl、体积浓度2.5％Tween 20、质量浓度21％NaCl，洗涤液的pH为7.8。
8.根据权利要求4所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：在步骤(3)中，
增强液的成分为：质量浓度0.1％β2二酮体、质量浓度1％三辛基氧化磷、体积浓度0.1％Triton 200、体积浓度1.5％醋酸和质量浓度0.1％邻苯二甲酸氢钾，增强液的pH值为2.0～3.2。
9.如权利要求1至3中任意一项所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于：依次包括，
(1)链霉亲和素磁珠制备：具体经过磁珠活化、链霉亲和素与磁珠偶联、洗涤、封闭、保存步骤制备得到链霉亲和素磁珠；
(2)生物素化抗原制备：具体经过生物素与抗原连接、透析、保存步骤制备得到高特异性的生物素化的HIV和HCV抗原；
(3)铕和钐离子标记抗原制备：具体是分别选用一株HIV-Ag进行Eu3+标记，一株HCV-Ag进行Sm3+标记，制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag；其中，以体积比计，HIV-Ag与Eu3+标记物的比例为5:1，HCV-Ag与Sm3+标记物的比例为2.5:1；
(4)洗液、分析缓冲液和增强液的配置。
10.根据权利要求8所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于：
分析缓冲液的配方为：
Figure FDA0002341119690000031
配制完成后，混匀，使用浓盐酸调pH值至7.8，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中；
洗液为25x洗液，配方为：
Figure FDA0002341119690000032
配制完成后，混匀，使用浓盐酸调pH值至7.8，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中；增强液配方为：
Figure FDA0002341119690000033
配制完成后，混匀，放置30分钟后观察无晶体或沉淀析出，应采用电子pH计进行检测pH应控制在2.0-3.2之间，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中。
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