CN108587610A - 一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球,所述编码微球包括聚合物、聚集诱导发光材料和磁性纳米颗粒,所述编码微球粒径为0.3μm~20μm,变异系数CV<10%;还公开了一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球的制备方法;并公开了一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球的应用,可用于一种或多种目标物的检测。本发明提供了高荧光强度、高稳定性、荧光信号均一性好、编码能力强、编码数量多的荧光编码微球,解决了传统的有机荧光染料稳定性差,抗荧光漂白能力差和聚集诱导淬灭等现象,以及量子点在编码过程中存在不同量子点荧光信号之间的重吸收和高浓度情况下自淬灭的问题,在液相生物芯片检测技术中有着非常重要的意义和广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微纳米材料制备与应用领域,尤其涉及一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球、制备方法及其应用。
背景技术
近年来发展起来的基于编码微球的液相生物芯片技术是基于xMAP(flexiblemulti-analyte profiling)技术,以编码微球作为液相反应的载体,根据蛋白质-蛋白质、核酸-核酸等相互作用规律,以快速高通量的流式细胞术作为分析手段,对蛋白、核酸等进行快速高通量的多元定量检测,其技术核心是带有编码信号的聚合物微球。合适的编码微球应具有如下性能:编码信号稳定性好、均一性好,编码数量多,解码方便。
目前常用的编码信号有光谱信号编码、图形(图像)编码、化学信号编码、物理信号编码等。其中光谱信号编码由于编码灵活、解码快速且方便而运用最为广泛。光谱信号编码目前常用的编码元素包括有机荧光染料、量子点等。传统的有机荧光染料稳定性差,抗荧光漂白能力差,严重影响编码微球的稳定性。此外这些有机荧光染料还具有严重的聚集诱导淬灭(aggregation-caused quenching,ACQ)现象,严重限制了其编码数量。量子点虽然具有优异的光学性能(宽而连续的吸收光谱、窄而对称的发射光谱、高量子效率、高稳定性),但是量子点在编码过程中存在不同量子点荧光信号之间的重吸收以及高浓度情况下自淬灭的问题,这也是量子点编码最大的一个挑战。
近年来唐本忠院士团队发现了一种新型的荧光材料,这些荧光材料在溶解状态下几乎没有发射光或者具有很弱的发射光,但是当聚集后发射出强烈的荧光,并将这种反常的光物理现象定义为聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)。聚集诱导发光材料在聚集状态下荧光强度高、抗光漂白性好、稳定性好,近年来引发世界各地科学家的广泛关注,目前聚集诱导发光材料已经覆盖整个可见光范围。聚集诱导发光材料是一种性能优异的编码材料,但是尚未见到将其应用于制备荧光编码微球的报道。
因此,本领域的技术人员致力于开发一种稳定性好、荧光强度高、荧光信号均一性好、编码能力强、编码数量多的荧光编码微球,以便获得高稳定性、高重复性和高灵敏度的液相生物芯片检测技术,为疾病的诊断提供强有力的工具。
发明内容
为实现上述目的,根据本发明的一方面,提供了一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球,包括聚合物、聚集诱导发光材料和磁性纳米颗粒,所述编码微球的粒径为0.3μm~20μm,变异系数CV<10%;所述聚集诱导发光材料的发射波长为450nm~900nm。
进一步地,所述聚集诱导发光材料选自1,1,2,3,4,5-六苯基噻咯(HPS)、四苯乙烯(TPE)、9,10-二苯基乙烯基蒽(DSA)、三苯胺、四苯基乙烯-苝酰亚胺衍生物(PBI-TPE,PBI-2TPE)、三苯胺-富马酸腈化合物(BDABFN)、TPE-TPA-DCM、氰基取代的二芳基乙烯衍生物以及硼系、硅系AIE分子及其衍生物等中的一种或多种。
进一步地,所述聚集诱导发光材料的浓度为0~50mg/mL;所述聚合物选自苯乙烯-马来酸酐共聚物,苯乙烯-丙烯酸共聚物,聚苯乙烯等中的一种。
进一步地,所述编码微球经表面改性修饰官能团,所述表面改性选自水解、磺化、化学接枝中的一种或几种。
根据本发明的另一方面,还提供了一种如上所述聚集诱导发光磁性荧光编码微球的制备方法,包括SPG膜乳化-乳液溶剂挥发制备方法、微流控制备方法等。
进一步地,所述制备方法包括连续相的制备和分散相的制备。
进一步地,所述连续相的表面活性剂为十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇等。
进一步地,所述分散相的有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、甲苯等。
根据本发明的又一方面,还提供了一种如上所述聚集诱导发光磁性荧光编码微球的应用,所述编码微球可用于一种或多种目标物的检测。
进一步地,所述目标物包括蛋白和核酸等。
本发明提供了一种高稳定、高亮度聚集诱导发光磁性荧光编码微球、制备方法及其应用,将不同种类、不同含量的聚集诱导发光材料以及一定量的磁性纳米颗粒掺入聚合物微球,制备出高荧光强度、高稳定性、荧光信号均一性好、编码能力强、编码数量多的荧光编码微球。解决了传统的有机荧光染料稳定性差,抗荧光漂白能力差和聚集诱导淬灭等现象,以及量子点在编码过程中存在不同量子点荧光信号之间的重吸收以及高浓度情况下自淬灭的问题。利用这种高稳定高亮度聚集诱导发光磁性荧光编码微球作为载体,对蛋白、核酸等进行快速高通量的多元定量检测,在液相生物芯片检测技术中有着非常重要的意义和广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明一个较佳实施例中得到的聚集诱导发光磁性荧光编码微球的SEM图片;
图2是本发明一个较佳实施例中得到的聚集诱导发光磁性荧光编码微球的激光共聚焦图片;
图3是本发明一个较佳实施例中得到的聚集诱导发光磁性荧光编码微球的编码库;
图4是本发明一个较佳实施例中得到的聚集诱导发光磁性荧光编码微球在温度、pH、缓冲液、时间的稳定性;
图5是以一个较佳实施例中得到的聚集诱导发光磁性荧光编码微球为载体对肝癌肿瘤标志物AFP的免疫检测标准曲线;
图6是以一个较佳实施例中得到的聚集诱导发光磁性荧光编码微球为载体对乙肝病毒目标DNA检测的标准曲线。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1
图1是本发明所提供的一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球制备方法的一个较佳实施例,本实施例所制备的聚集诱导发光磁性荧光编码微球是HPS/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球,其中聚集诱导发光材料为1,1,2,3,4,5-六苯基噻咯(HPS),聚合物为苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA),制备方法为SPG膜乳化-乳液溶剂挥发法,具体制备步骤为:
将0.01mg的1,1,2,3,4,5-六苯基噻咯(HPS)和0.25g的苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)溶于4mL甲苯中,形成分散相;
将1g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶于200mL的超纯水中,形成连续相;
采用孔径为5μm的SPG膜,在3KPa的氮气压力下,在连续相的剪切力作用下,制备得到均一、稳定的水包油乳液;
室温下,将所得到的乳液磁力搅拌、过夜,使得溶剂挥发、编码微球固化,对固化后的编码微球用超纯水和无水乙醇分别清洗3遍,然后将固化清洗后的编码微球冻干;
加入一定量的盐酸,对干燥后的编码微球进行表面羧基化改性,得到表面带有羧基基团的HPS/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球。
实施例2
本发明所提供的一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球制备方法的一个较佳实施例,本实施例所制备的聚集诱导发光磁性荧光编码微球是HPS/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球,其中聚集诱导发光材料为1,1,2,3,4,5-六苯基噻咯(HPS),聚合物为苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA),制备方法为SPG膜乳化-乳液溶剂挥发法,具体制备步骤为:
将0.003mg的1,1,2,3,4,5-六苯基噻咯(HPS)和0.25g的苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)溶于4mL甲苯中,形成分散相;
将1g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶于200mL的超纯水中,形成连续相;
采用孔径为3μm的SPG膜,在5KPa的氮气压力下,在连续相的剪切力作用下,制备得到均一、稳定的水包油乳液;
室温下,将所得到的乳液磁力搅拌、过夜,使得溶剂挥发、编码微球固化,对固化后的编码微球用超纯水和无水乙醇分别清洗3遍,然后将固化清洗后的编码微球冻干;
加入一定量的盐酸,对干燥后的编码微球进行表面羧基化改性,得到表面带有羧基基团的HPS/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球。
实施例3
图2是本发明所提供的一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球制备方法的一个较佳实施例,本实施例所制备的聚集诱导发光磁性荧光编码微球是TPE/Fe3O4/MOTAS磁性荧光编码微球,其中聚集诱导发光材料为四苯乙烯(TPE),聚合物为苯乙烯-丙烯酸共聚物(MOTAS),制备方法为SPG膜乳化-乳液溶剂挥发法,具体制备步骤为:
将0.5mg的四苯乙烯(TPE)和0.25g的苯乙烯-丙烯酸共聚物(MOTAS)溶于4mL甲苯中,形成分散相;
将1g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶于200mL的超纯水中,形成连续相;
采用孔径为5μm的SPG膜,在3KPa的氮气压力下,在连续相的剪切力作用下,制备得到均一、稳定的水包油乳液;
室温下,将所得到的乳液磁力搅拌、过夜,使得溶剂挥发、编码微球固化,对固化后的编码微球用超纯水和无水乙醇分别清洗3遍,然后将固化清洗后的编码微球冻干;
加入一定量的盐酸,对干燥后的编码微球进行表面羧基化改性,得到表面带有羧基基团的TPE/Fe3O4/MOTAS磁性荧光编码微球。
实施例4
图3是本发明所提供的一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球制备方法的一个较佳实施例,本实施例所制备的聚集诱导发光磁性荧光编码微球是DSA/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球,其中聚集诱导发光材料为9,10-二苯基乙烯基蒽(DSA),聚合物为苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA),制备方法为微流控法,具体制备步骤为:
将10mg的9,10-二苯基乙烯基蒽(DSA)和0.25g的苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)溶于4mL三氯甲烷中,形成分散相;
将1g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶于200mL的超纯水中,形成连续相;
采用孔道直径为5μm的小液滴微流控装置,其中连续相流速为12nL/min,分散相相流速为8nL/min,连续相和分散相在T型接口处汇合、乳化,制备得到均一、稳定的水包油乳液;
室温下,将所得到的乳液磁力搅拌、过夜,使得溶剂挥发、编码微球固化,对固化后的编码微球用超纯水和无水乙醇分别清洗3遍,然后将固化清洗后的编码微球冻干;
加入一定量的盐酸,对干燥后的编码微球进行表面羧基化改性,得到表面带有羧基基团的DSA/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球。
实施例5
图4是本发明所提供的一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球制备方法的一个较佳实施例,本实施例所制备的聚集诱导发光磁性荧光编码微球是BDABFN/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球,其中聚集诱导发光材料为三苯胺-富马酸腈化合物(BDABFN),聚合物为苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA),制备方法为微流控法,具体制备步骤为:
将0.005mg的三苯胺-富马酸腈化合物(BDABFN)和0.25g的苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)溶于4mL三氯甲烷中,形成分散相;
将1g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶于200mL的超纯水中,形成连续相;
采用孔道直径为5μm的小液滴微流控装置,其中连续相流速为12nL/min,分散相相流速为8nL/min,连续相和分散相在T型接口处汇合、乳化,制备得到均一、稳定的水包油乳液;
室温下,将所得到的乳液磁力搅拌、过夜,使得溶剂挥发、编码微球固化,对固化后的编码微球用超纯水和无水乙醇分别清洗3遍,然后将固化清洗后的编码微球冻干;
加入一定量的盐酸,对干燥后的编码微球进行表面羧基化改性,得到表面带有羧基基团的BDABFN/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球。
实施例6
图5是本发明所提供的一中聚集诱导发光磁性荧光编码微球用于目标物检测的一个较佳实施例,本实施例是将实施例1中制备的HPS/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球和实施例5中制备的BDABFN/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球作为载体,利用液相芯片检测技术,实现对肝癌肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)的定量检测。具体步骤为:
将实施例1中制备的HPS/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球和实施例5中制备的BDABFN/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球通过EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)活化其表面的羧基,分别在编码微球表面包被CEA、AFP包被抗体;
在96孔板的孔中加入上述分别包被有CEA、AFP包被抗体的HPS/Fe3O4/PSMA和BDABFN/Fe3O4/PSMA磁性荧光编码微球,然后加入病人血清,室温振荡孵育1h,通过磁板分离清洗,除去血清中未反应的CEA、AFP;
然后向96孔板中分别加入生物素标记的CEA、AFP检测抗体,室温振荡孵育1h,通过磁板分离清洗,除去过量的CEA、AFP检测抗体;
加入链霉亲和素标记的荧光报告分子PE,室温振荡孵育10min,通过磁板分离清洗,除去过量的SAPE;
用流式细胞仪读取数据,得到病人血清中CEA、AFP的含量。
实施例7
图6是本发明所提供的一中聚集诱导发光磁性荧光编码微球用于目标物检测的一个较佳实施例,将实施例3中制备的TPE/Fe3O4/MOTAS磁性荧光编码微球作为载体,利用液相芯片检测技术,实现对乙肝病毒DNA的定量检测。具体步骤为:
将实施例3中制备的TPE/Fe3O4/MOTAS磁性荧光编码微球通过EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)活化其表面的羧基,在编码微球表面偶联DNA包被探针;
在96孔板的孔中加入上述包被偶联DNA包被探针的TPE/Fe3O4/MOTAS磁性荧光编码微球,然后加入PCR扩增产物以及检测探针,先95℃×5min进行变性,然后45℃反应30min,通过磁板分离清洗,除去未反应的目标DNA;
然后加入链霉亲和素标记的荧光报告分子PE,室温振荡孵育10min,通过磁板分离清洗,除去过量的SAPE;
用流式细胞仪读取数据,得到DNA的含量。
本发明提供了一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球及其制备以及应用,将不同种类、不同含量的聚集诱导发光材料以及一定量的磁性纳米颗粒掺入聚合物微球,制备出高荧光强度、高稳定性、荧光信号均一性好、编码能力强、编码数量多的荧光编码微球。不仅解决了传统的有机荧光染料稳定性差,抗荧光漂白能力差和聚集诱导淬灭等现象,还解决了量子点在编码过程中存在不同量子点荧光信号之间的重吸收以及高浓度情况下自淬灭的问题。利用这种高稳定、高亮度聚集诱导发光磁性荧光编码微球作为载体,对蛋白、核酸等进行快速高通量的多元定量检测,在液相生物芯片检测技术中有着非常重要的意义和广泛的应用前景。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球,其特征在于,包括聚合物、聚集诱导发光材料和磁性纳米颗粒,所述编码微球的粒径为0.3μm~20μm,变异系数CV<10%;所述聚集诱导发光材料的发射波长为450nm~900nm。
2.如权利要求1所述的一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球,其特征在于,所述聚集诱导发光材料选自1,1,2,3,4,5-六苯基噻咯(HPS)、四苯乙烯(TPE)、9,10-二苯基乙烯基蒽(DSA)、三苯胺、四苯基乙烯-苝酰亚胺衍生物(PBI-TPE,PBI-2TPE)、三苯胺-富马酸腈化合物(BDABFN)、TPE-TPA-DCM、氰基取代的二芳基乙烯衍生物以及硼系、硅系AIE分子及其衍生物中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球,其特征在于,所述聚集诱导发光材料的浓度为0~50mg/mL;所述聚合物选自苯乙烯-马来酸酐共聚物,苯乙烯-丙烯酸共聚物,聚苯乙烯等中的一种。
4.如权利要求3所述的一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球,其特征在于,所述编码微球经表面改性修饰官能团,所述表面改性选自水解、磺化、化学接枝中的一种或几种。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的聚集诱导发光磁性荧光编码微球的制备方法,其特征在于,包括SPG膜乳化-乳液溶剂挥发制备方法、微流控制备方法等。
6.如权利要求5所述的一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括连续相的制备和分散相的制备。
7.如权利要求6所述的一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球的制备方法,其特征在于,所述连续相的表面活性剂为十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇等。
8.如权利要求6所述的一种聚集诱导发光磁性荧光编码微球的制备方法,其特征在于,所述分散相的有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、甲苯等。
9.一种如权利要求1-4任一项所述的聚集诱导发光磁性荧光编码微球的应用,其特征在于,所述编码微球可用于一种或多种目标物的检测。
10.如权利要求9所述的聚集诱导发光磁性荧光编码微球的应用,其特征在于,所述目标物包括蛋白和核酸等。
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