JPH09504041A

JPH09504041A - 少なくとも二つの蛍光色素を含む蛍光ラテックス、その製法と応用

Info

Publication number: JPH09504041A
Application number: JP7504377A
Authority: JP
Inventors: バスラン，ソフィ; リシャール，ジョエル; テシェンヌ，ドミニク; リッキエロ，フレデリック; レルネル，ダン
Original assignee: Prolabo Ste
Current assignee: Prolabo Ste
Priority date: 1993-07-12
Filing date: 1994-07-11
Publication date: 1997-04-22
Also published as: EP0712426A1; NO308253B1; DE69403663T2; US5716855A; ES2104405T3; WO1995002635A1; CA2167072C; DK0712426T3; CA2167072A1; NO960123L; DE69403663D1; EP0712426B1; NO960123D0; FR2707658B1; FR2707658A1

Abstract

(57)【要約】少なくとも一種の疎水性蛍光色素Ａ（受容体）および少なくとも一種のカプセル封入した疎水性蛍光色素Ｄ（供与体）を含む粒子を有する蛍光ラテックスであって、ＡはＤとは異種であり、かつ光放射の露光により蛍光色素Ｄからの発光が蛍光色素Ａを励起しうる蛍光ラテックス。上記ラテックスの製造方法およびマーカー、特に生物学的マーカーとしての用途が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】少なくとも二つの蛍光色素を含む蛍光ラテックス、その製法と応用マーカー、特に生物学的マーカー本発明はラテックスの粒子が少なくとも二種のカプセル封入した疎水性蛍光色素を含む蛍光ラテックスに関する。また本発明は上記蛍光ラテックスの調製方法およびマーカー、特に生物学的マーカーとしてのその応用に関する。ラテックス類(latices)はポリマー粒子の水性分散体であり、その粒径は一般には０．０５ミクロンおよび数ミクロン(several microns)の間にある。ラテックスは粒子状外観を呈することから大きな比表面を有し、このことは多くの用途、特に紙、ペイント、磁気テープおよび録音産業ならびに生物学的分野において有利に利用されている。生物学では、標準分析技術において酵素系（ｔｙｐｅ）または放射性同位体系のマーカーを支持するためにラテックスを使用し、これにより分析すべき媒体中に存在する種の定量分析ができる。例えば放射性同位体を用いた分子マーキングによる定量技術は極めて精度が高く信頼が置ける上に、検出感度が非常に高い。しかしながら、放射能源の分散、人体への長期暴露、元素の半減期に伴う光源発光の時間的変動に伴う欠点、特に分析末期において複合化試薬から遊離試薬を分離する必要がある等、種々の欠点がある。放射性発光はこのマーカーの環境に対しては事実上全く反応を示さない。上記の理由により、これらの公知マーカーに置き代えられる最も効果的な代替技術として蛍光分析技術が確立された。蛍光マーキングは放射性マーキングに較べて多くの利点をもつ。放射能暴露の危険がない。蛍光マーキングは長期に亘り優れた安定性を有しており、特に蛍光発光の特異性に起因して、ある種の環境パラメーターに対して一層微細な応答を与える。このように蛍光マーキングを使用すると分析後の分離を必要としない。それにも係わらず、特に生物学的定量（免疫学、細胞数計測、フロー血球計算）において蛍光を実地に利用するにはなお解決すべき問題点を残している。単純な分子グラフトにより得られる蛍光は、汎用的実用的応用の見地からは感度が不充分である。媒体中に存在する種の濃度が１０^-9モル／Ｌより少ない場合は、この蛍光を検出するのは困難である。この技術の利用はこれが原因で著しく制約されている。満足のいくようにするために、蛍光の感度が放射性マーキングの感度と同程度、すなわちリットル当り１０^-12と１０^-15モル粒子との間の濃度で使用できるような蛍光感度であるべきである。その上、分析されるべき化合物が存在する媒体は蛍光色素により放射された蛍光発光（例えば水のレイリー散乱またはラマン散乱）と干渉する可能性がある。特に生物学的血清中には光放射による励起の影響下で３００乃至５００ｎｍの範囲内で発光するかなり多くの他の化合物が存在する。したがって蛍光分析シグナルとしては、励起と発光(emission)の間に可能な限り広いスペクトル間隔を伴った５００ｎｍより大きいことが望ましい。しかし、市販の多くのレーザー類の波長は正確に３００と５００ｎｍの間にある；例えばアルゴンレーザーは４８８ｎｍで発光し、ヘリウム−カドミウムレーザーは４４０ｎｍで発光するということが知られている。したがって、ラテックスの発光が一層長波長へとシフトされるならば、例えこのことが水や他の生物学的物質の偽励起が起こる原因になるとしても、これらの波長に基ずく励起スペクトルを選択しうることが望ましい。本発明の真の目的はこれらの欠点を克服することおよび／または上記問題点を解決することにある。本発明により提供される他の有利性については、以下の記載の理解により明瞭になるであろう。まず本発明は、ラテックスの粒が少なくとも一種の疎水性蛍光色素Ａ（受容体）および少なくとも一種の疎水性蛍光色素Ｄ（供与体）を含む蛍光ラテックスであって、これらの蛍光色素はカプセル封入されており、ＡはＤとは異種であり、かつ光放射の影響下で蛍光色素Ｄの発光が蛍光色素Ａを励起させうる蛍光ラテックスに関する。この”カプセル封入”なる用語は、上記蛍光色素類(fluorochromes)が粒子の表面には殆ど完全に存在していないことを意味するものと理解されたい。これらはポリマー粒子内部中に本質的に濃縮されており、利用できるこれら粒子の外表面からは離れている。本発明の蛍光色素は発光に際して、光スペクトルの四つの主領域、すなわち青（４００−５００ｎｍ）、緑（５００−５５０ｎｍ）、黄（５５０−６００ｎｍ）および赤（６００−７５０ｎｍ）をカバーするように選択される。所要のスペクトル特性以外にも、これらの蛍光色素は次の要求性状を満足する：これらは疎水性であって、これによりラテックス粒子中へのこれらのインサート（挿入）が促進され、引き続いての放出が一切ない。これらは粒子内部に対する親和性を有し、すなわラテックス粒子を構成するポリマーと化学的に相溶性があり、適切な場合には、上記ポリマー中に存在する化学的官能基に対して化学的な相溶性を示す。この相容性は、対応する蛍光ラテックスの合成時に一つの役割を果たす。最後に、これらの生物学的用途を考慮する場合、これらの蛍光色素は化学的および光化学的に安定である。本発明に好適な蛍光色素の中では、９，１０−ジフエニル−アントラセン（９，１０ＤＰＡ）、９，１０−ビスフエニル−エチニル−アントラセン（９，１０ＢＰＥＡ）、１，８−ジクロロ−９，１０−ビス−フエニル−エチニル−アントラセン（１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡ）、５−１２ビス−フエニル−エチニル −ナフタセン（５，１２ＢＰＥＮ）、６，１３−ビス（フエニル−エチニル）ペンタセン、テトラベンゾ（de,hi,op,st）ペンタセン、クマリン１５３、ナイルレッド(Nile Red)、１，４−ジ［２（５−フエニルオキサゾリル））］−ベンゼンもしくはＰＯＰＯＰ、１，４−ジ［（２−（４−メチル−５−フエニルオキサゾリル）］−ベンゼンもしくはＤＭ−ＰＯＰＯＰ、ならびにテトラフエニルポルフィリンすなわちＴＰＰが特に挙げられる。本発明の一つの態様では、蛍光色素の二つの組合わせ（ペア）もしくは三つの組合わせ（トリオ）は、一般にラテックス粒子の使用目的および使用条件に従って選択する。簡単にいえば、電子エネルギー転換現象には、任意の形態の放射により励起状態にもたらされた供与体分子Ｄ^＊、および基底状態にある受容体分子Ａ₀が関与する。ある種の条件下で、Ｄ^＊のエネルギーレベルがＡ^＊のエネルギーレベルに等しいか、またはそれより高い場合には、供与体により初期に獲得されたエネルギーは励起種Ａ^＊を形成するために分子Ａに伝達され、この際はＡ₀ の直接的励起は生起しない。次いで供与体の代わりに受容体は、その固有波長λ（Ａ）で発光できる。この供与体の通常の発光（Ｄ^＊→Ｄ＋ｈν）は式：１）Ｄ^＊＋Ａ₀→Ｄ₀＋Ａ^＊（スピードＫtr）次いで２）Ａ^＊→Ａ₀＋ｈν［λ（Ａ）におけるＡの発光］により置換される。ここに記載の蛍光色素のペアもしくはトリオの特定の場合には、上記転移は共鳴(resonance)により生起し、供与体と受容体との接触を全然必要としない空間を通しての電磁結合のプロセスが関与する。その上、供与体−受容体ペアにとってはエネルギー水準の飛躍（基底状態と励起状体との間の）に類似性がある必要がある。このように、供与体Ｄの発光スペクトルと受容体Ａの励起スペクトル間には重複(overlap)がある。参考の為に次のような蛍光色素ペアを記載する：ＤＡ９，１０ＤＰＡ →９，１０ＢＰＥＡ１，８Ｃｌ₂ −９，１０ＢＰＥＡ→５，１２−ＢＰＥＮ１，８Ｃｌ₂ −９，１０ＢＰＥＡ→ ＴＰＰクマリン１５３ →１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡ９，１０ＤＰＡ →クマリン１５３１，８Ｃｌ₂ −９，１０ＢＰＥＡ→ナイルレッド（Ｎｉｌｅｒｅｄ）９，１０ＢＰＥＡ →ナイルレッドＰＯＰＯＰ →クマリン１５３９，１０ＢＰＥＡ →ＴＰＰ上記蛍光色素から形成されたペアは種々の観点から有利である。これらには市販品がある。これらは水に不溶性で化学的および光化学的に安定である。これらはラテックスポリマーと相溶性があるので、それらに導入した場合でも従来のマーカーに較べて著しく高性能の、予想外の感度を示すマーカーに誘導される。上記蛍光色素を含有するラテックス粒子は、通常はエチレン性不飽和モノマーの重合により得られるポリマーからなる。かかるポリマーはビニル芳香族モノマーもしくはエチレン性モノマー、または任意に官能化されたアルカン酸またはエチレン性酸類(acids)もしくはエステル類(esters)から誘導される単位を含むホモポリマーまたは共重合体である。この種のポリマー［ｓｉｃ］は当業者には公知なので、以下に数例のそのようなポリマー［ｓｉｃ］のみを記載するが、これらのみに限定されるものではない。これらの例中には： −イソプレン、１，３−ブタジエン、ビニリデンクロライドまたはアクリロニトリル系（ｔｙｐｅ）エチレン性モノマー類(monomers)、 − スチレン、ブロモスチレン、α−メチルスチレン、エチルスチレン［ｓｉｃ］、ビニルトルエン、クロロスチレンまたはクロロメチルスチレンまたはビニルナフタレン、 − アクリル酸、メタクリル酸、アルキル基の炭素数が３乃至１０のアルキルアクリレートおよびアルキルメタクリレート、ヒドロキシアルキルアクリレート、アクリルアミド、炭素数４もしくは５のエチレン性酸エステル等のアルカン酸、エステルもしくは無水物、および − ジビニルベンゼンもしくは２，２−ジメチル−１，３−プロピレンジアクリレートおよび／または他の水不溶性共重合性モノマー等の二官能性モノマー、などが包含される。上記モノマー類はサルフエート、スルホネート、ホスホネートまたは第４級アンモニウム系のアニオンもしくはカチオン基を有していてもよい。またそれらは例えばタンパクおよび酵素等の生物学的分子に由来するアミン系官能基と直接、間接的に反応しうるものであってもよい。これらの官能基の代表的例中には、ハロゲン、カルボキシル、アミン、イソシアネート、アジリジン、アルデヒドおよびスルホニル基およびエポキシおよびクロロメチル官能基が包含される。本発明に特に具体的に使用されるモノマー類としては、アリーレンおよび／またはアルキレン系に属するものである。これらは好ましくは、スチレン、α−メチルスチレン、エチルスチレン、ｔｅｒｔ．−ブチルスチレン、およびビニルトルエン等のビニル芳香族化合物である。これらのモノマーは一種もしくは二種以上のハロゲン、アミン、アルコキシ、カルボキシル、および／またはスルホニルのタイプで置換されているものが好ましい。これらのモノマーは単独もしくは任意比率の相互混合物として使用され、または別法として上記から選択したもう一つの共重合性モノマーと混合して使用される。上記ポリマー粒子は、従来の乳化重合、マイクロエマルション重合、懸濁もしくはマイクロサスペンション重合、または適切な場合には有機媒体中での重合等の重合技術を用いて得られる。これらの技術は当業者にとり周知であり、ここでは記述を改めることはしない。本発明による蛍光ラテックスを含有する粒子は疎水性であり、粒子径は一般に０．０１および２０ミクロンの間、一層好ましくは５ミクロンより小さいことが好ましい。これらは寸法規制された(calibrated)単分散系であり、ラテックスにラテックス全重量基準で０．０５％および１０％の間、好ましくは０．１％および１％の間の範囲の割合で存在する。第１の有利な態様によれば、上記蛍光ラテックスの特徴は、蛍光色素Ｄの発光が蛍光色素Ａを直接励起させることが可能なことにあり、蛍光色素Ｄの発光スペクトルが蛍光色素Ａの励起スペクトルと部分的に重複していることである。粒子の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０重量％は、Ａ：Ｄモル比が［ｓｉｃ］が好ましくは１より大きい、有利には１．２より大きい［ｓｉｃ］である。上記Ａ：Ｄ比は１より大きいことが有利であり、好ましくは１．２より大きい。かかる比率を有するラテックスは発光シグナルの強度の増幅現象を導くことを意外にも見い出した。他のもう一つの態様によれば、記蛍光ラテックスの特徴は、蛍光色素Ｄの発光が蛍光色素Ａを間接的に励起させうることにあり、この場合のラテックス粒子は少なくとも一種の中間体蛍光色素Ｉを含み、その励起スペクトルはＤの発光スペクトルと部分的に重複し、かつその発光スペクトルはＡの励起スペクトルと部分的に重複している。Ａ：ＩおよびＩ：Ｄモル比［ｓｉｃ］は常に１より大きいことが好ましく、好ましくは≧１．２である。このような比率を示すラテックス粒子はまた、発光シグナルの強度の増幅を導く。トリオを使用すると、ラテックスの発光波長をさらにシフトでき、その結果、一層確実に全ての干渉を回避でき、さらに発光スペクトルＡが励起スペクトルＤと重複するのを回避でき、それによってなお一層正確な定量が可能になる。本発明に利用できるトリオの中で、次の組合わせを手引きとして記載する：本発明のラテックスを使用すると、次に記載の蛍光測定条件下でリットル（Ｌ）当り１０^-12モル粒子より遥かに低い検出しきい値に到達することが可能になる。このように、リットル当り１０^-14乃至１０^-17モル粒子の範囲の検出しきい値を得ることができる。本発明の蛍光ラテックスは（ペイント等の）当業者に周知のラテックスの従来の用途の全てに使用できる。一層具体的には本発明の蛍光ラテックスは、直接または間接的に関連する生物学的分析に用いることを意図したものである。それらは例えば免疫試験用試薬として、シンチレーターとして、フロー・サイト蛍光測定における較正標準(calib ration standards)として、または例えば細胞マーカー類として使用できる。後者の場合、蛍光ラテックス粒子の食作用は検査すべき細胞により影響を受ける。このように本発明の目的は、生物学的分野における蛍光ラテックス類の応用にある。通常、これらの応用に際しては、ラテックスへの免疫反応性種の事前結合が必要である。本発明の目的は結局のところ、少なくとも一つの免疫反応性種により官能化された蛍光ラテックスにあるといえる。蛍光ラテックスを、これらの粒子表面に存在する一種または二種以上の反応性官能基を介して免疫反応性種と結合させる。この種の結合を実施するための標準手法としては、単純な化学反応により上記免疫反応性種に対する共有結合の形成が挙げられる。粒子表面に存在する化学基は、遊離スルフヒドリルもしくはアミノ官能基を有する免疫反応性化合物と直接反応させるか、または活性化後に間接的に反応させるかの何れかにより反応させることができる。特筆の官能基は、カルボキシル、ハロアルキル、アルキルスルホニル、およびビニルスルホニル基である。アルデヒドおよびエポキシ基の場合には、免疫反応性種に対して一層高い活性を有する官能基に誘導するために、前以て化学的に活性化してもよい。 ”免疫反応性種”なる用語は、所謂受容体と呼称されるもう一つの特定の分子と複合体を形成しうる少なくとも一つの部位（ｓｉｔｅ）を有する化学的もしくは生物学的化合物を意味する。記載される免疫反応性種の例としては、１級アミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク、リポタンパク、または例えばウイルスもしくはバクテリア等の微生物が挙げられる。それは抗体または酵素であってもよい。この免疫反応性種は単純な生物学的親和性によるか、または化学反応の何れかによりもう一つの種と反応して、その官能基の一つを介して定量すべき種の受容体部位と複合体を形成するという極めて重要な使命を有している。これらの免疫反応性種は公知の反応を用いた標準方法（詳細は省略）により蛍光ラテックス粒子中に添加される。上記官能化蛍光ラテックスは免疫学的分析の分野で用途を見い出している。特定抗体で官能化した上記ラテックスは血液や尿等の生物学的流体中に存在する相補的抗原を認識する能力がある。診断は、この抗原の認識または非認識に依存する。この結果は抗原濃度に依存するシグナルの強度により定量化できる。蛍光ラテックスは細胞マーキングにおいても用途が見い出されている。この場合、蛍光ラテックス上にグラフトした免疫反応性種は細胞表面の一種または二種以上の抗原と反応して、その存在が蛍光により検出できる。例えば、ＥＧＦ（上皮増殖因子）受容体の数の増加を導く癌細胞の検出が記載される。この技術は核酸濃度の増加または細胞容積の増加の検出をも可能とする。本発明のラテックスはフロー・サイト蛍光測定法にも好都合な応用を見出し、これによれば多数の細胞に対する定量を可能にするが、この場合の細胞は個別的に分析される。各細胞について、その容積、サイズ、および特定の蛍光マーカーが存在する際にはその中のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度、ならびに例えば膜抗原もしくは他の受容体の存在を測定することができる。ユーザーにより予め決められたパラメーターに基ずく細胞副次集団の物理的および選択的分離をこの技術の分析能力と組み合わせれば、この技術の価値が増幅される。本発明は上記蛍光ラテックスの調製方法にも関する。この製法は次の工程の一つおよび／または他の工程を遂行するのが特徴である： −ラテックス粒子を構成させるモノマー（類）の重合の間に、このモノマーの画分中またはモノマー類の一つの画分中に懸濁させた蛍光色素Ｄ、Ａおよび任意のＩの一種または二種以上を導入する工程、 −非水性溶剤中に安定化した上記蛍光色素Ｄ、Ａおよび任意のＩの一種または二種以上をラテックス粒子の水性分散体と共に撹拌する工程。選択方法の如何によっては、上記二工程の一つによっては各種の蛍光色素をラテックス粒子中に含有させることができない場合があり、この場合には上記二工程を続けて行う。従って、重合の間に蛍光色素の一種だけを導入する場合には、その他の蛍光色素の非水性溶媒を、重合の後に得られるラテックス粒子の水性分散体と第二の工程において混合することが必要になる。もう一つの場合には、ラテックスの混合（または膨潤）の工程に各種の蛍光色素を導入することができる。一般に、第一の工程はオーバーポリメリゼーション工程と呼称し、第二の工程は溶媒膨潤工程と呼称される。公知方法では、これら二方法の一つおよび／または他の方法の後に得られた蛍光ラテックスを、次いで、蛍光色素含有濃度、上澄み液中の残留蛍光および蛍光発光の検出感度の観点で特徴付けする。このラテックス粒子中の疎水性蛍光色素の最高含有量は、蛍光色素の性質、採用したインサート技術、粒子を構成するポリマーの性質および粒子サイズに左右されることは明らかである。したがってこの含有量はかなり変化し、ラテックス粒子当りの蛍光色素分子は数１００万(several million)の値に達する。参考として、直径０．３μｍの粒子では、上記含有量の範囲は１０，０００から４００，０００、好ましくは６０，０００と３５０，０００との間（ラテックス粒子当りの蛍光色素分子）にある。上記二技術の一つおよび／または他のもの［ｓｉｃ］に従って粒子中に蛍光色素を導入することは、次の二つの観点から有利である：分析中に蛍光色素剤が放出される現象を全くないようにすることができる。上澄み液中に所謂残留蛍光が認められる現象がない。この結果、分析技術の信頼性が向上する。ラテックス粒子の外表面は、化学的または生物学的結合のために、利用できるように残されている。ＵＶ−可視［ｌａｃｕｎａ］または放射性発光等の他の技術に較べて蛍光技術の重要な利点の一つは、阻害性化合物を分析することをさらに可能にすることである。この特徴により、重金属、酸素等の痕跡量の定量等の実地の応用が本発明の蛍光ラテックスにはさらに提供される。この技術は免疫学における応用という主題が既に形成されている。一層具体的にはこれは逆免疫蛍光の方法に関するものである。本発明の他の有利性と特徴とを説明するために、以下に実施例を記載するが、本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例の主題を形成する蛍光ラテックス類は蛍光発光検出しきい値で特徴付けられ、個々の粒子それ自体については次の方法に従った蛍光色素含有量により特徴付けされた：Ａ−蛍光検出しきい値の測定これはシグナル／ノイズ比（＞１０）に関して許容しうる条件下で、媒体の脱酸素なしに通常の蛍光光度計により検出可能な粒子の最少濃度を測定することにある。この通常の蛍光光度計は多色光源（１５０Ｗキセノンランプ）、格子(gra ting)モノクロメーター、標準検出器および誘導光電流の読み取りおよび／または記録の装置を含んでいる。特定の追加的シグナル処理装置は包含されていない。この最少の検出可能な濃度は分析条件に大きく左右されることは明らかである。結論的には、標準条件下で決めた次の実施例に示す値は、分析した蛍光ラテックスの最少性能レベルの指標であると考えるべきである。これを行うために、出発ラテックスの希釈の関数としての発光強度についての研究を、正確な励起波長と発光波長において、さらに事前決定およびプリセットした蛍光測定法の光学的パラメーターもしくは電子的パラメーターに関して研究を行った。最少濃度の値は、対応する強度／濃度曲線の読みから推定する。Ｂ−粒子の蛍光色素含有量の決定［ｓｉｃ］この含有量は、乾燥ラテックスの一定量を上記ポリマーと上記蛍光色素との共通溶剤中に溶解して決定することができる。一般的にこの溶剤はトルエンである。次いで蛍光色素濃度をＵＶ−可視吸収により決定する。粒子濃度は乾燥ポリマーの重量、粒子サイズおよびポリマーの密度を基に計算して推定する。上記含有量ηｐは次式：により与えられる。実施例１９，１０ＤＰＡおよび９，１０ＢＰＥＡを用いてマークした蛍光ラテックスの調製次の試薬を用いて膨潤法に従ってこの蛍光ラテックスを調製する：直径０．３μｍのカルボキシル化ポリスチレンラテックス（固形分含量８．１３質量％のもの１２３ｇ）トルエン１５ｇアセトン１９６ｇカリウムラウレート０．１ｇ９，１０ＤＰＡ０．０２８ｇ９，１０ＢＰＥＡ０．０３２ｇ２０％ＮＨ₄ＯＨ（ｐＨ＝１０までの必要量）上記９，１０ＤＰＡをトルエン７．５ｇ中に溶解し、次いでアセトン（９８ｇ）を添加する。ラテックスのｐＨをＮＨ₄ＯＨを用いて１０の値に調整する。上記カリウムラウレート(potassium Iaurate)をラテックス中に加え、混合物を数分間(a few minutes)撹拌して均一にする。次いでこのラテックス中に蛍光色素溶液を徐徐に添加する。生成した懸濁物を４０℃において３時間撹拌する。次いで蒸留により有機溶剤をできるだけゆっくりと留去する。蒸留中に脱イオン水を加えて固形分含量約５％に調整する。上記９，１０ＢＰＥＡを残部トルエン中に溶解し、次いでアセトン（９８ｇ［ｓｉｃ］）を加える。ラテックスのｐＨをＮＨ₄ＯＨを用いて１０の値に調整する。上記蛍光色素溶液をラテックス中に徐々に加える。生成する懸濁物を４０℃ で３時間撹拌する。上記に準じて有機溶剤を留去する。重量基準による最終固形分含量（ＳＣ）は５％に近い。得られた蛍光ラテックスを限外濾過により洗浄する。得られたラテックスは次のような特性を有する：９，１０ＤＰＡ（供与体）：８４，０００ラベル／粒子、すなわち０．２５重量％ポリマー、インサート収率：８３％９，１０ＢＰＥＡ（受容体）：１２３，０００ラベル／粒子、すなわち０．３重量％ポリマー、インサート収率：１００％受容体／供与体マーキング比は１．５である。次いで、多色光源（１５０Ｗキセノンランプ）、格子モノクロメーター、標準検出器およびシグナルの読み出しおよび／または記録の装置を含む実験装置を用いて光誘導蛍光を測定する。３６０ｎｍ（９，１０ＤＰＡの吸収が９，１０ＢＰＥＡの吸収より８倍大きい領域）で励起したところ、ラテックスの発光スペクトルは９，１０ＢＰＥＡの発光（最高：４８０および５１０ｎｍ）へと事実上減少する。９，１０ＤＰＡの発光（最高：４１０および４３０ｎｍ）は事実上存在しない（９，１０ＢＰＥＡの場合の１／２０）。５５０ｎｍにおける発光（ここでは９，１０ＤＰＡの蛍光は無視できる）を記録した。このスペクトルは９，１０ＤＰＡの励起のピーク特性に相当する明瞭な肩を示している。次いで、異なった三種のラテックス（９，１０ＢＰＥＡ単独、個々に９，１０ＢＰＥＡと９，１０ＤＰＡ、および同一粒子における９，１０ＢＰＥＡと９，１０ＤＰＡ）について、５１５ｎｍ（この場合９，１０ＢＰＥＡの発光が大半）における発光強度Ｉの比を４４０ｎｍ（９，１０ＢＰＥＡ単独の励起）および３６０ｎｍおよび３７５ｎｍ（９，１０ＤＰＡと９，１０ＢＰＥＡの同時励起）における励起において評価する。これらの条件下で、９，１０ＤＰＡから９，１０ＢＰＥＡへのネルギー伝達(transfer)はＩ（３６０）／Ｉ（４４０）比およびＩ（３７５）／Ｉ（４４０）比の実質的増加に反映されるべきである。次の結果が観察される：ａ）９，１０ＢＰＥＡのラテックス単独：Ｉ（３６０）／Ｉ（４４０）＝０．０６Ｉ（３７５）／Ｉ（４４０）＝０．１２ｂ）個々の粒子における９，１０ＢＰＥＡおよび９，１０ＤＰＡ（ラテックス混合物）：Ｉ（３６０）／Ｉ（４４０）＝０．０７Ｉ（３７５）／Ｉ（４４０）＝０．１３これらの結果はａ）に匹敵する。９，１０ＤＰＡと９，１０ＢＰＥＡとの間には相互作用は観察されない。ｃ）同一粒子における９，１０ＢＰＥＡおよび９，１０ＤＰＡ：Ｉ（３６０）／Ｉ（４４０）＝０．２２Ｉ（３７５）／Ｉ（４４０）＝０．３６従って、後者の場合では二種のラベルが同一の粒子中に位置する場合には９，１０ＤＰＡの吸収領域中で励起した９，１０ＢＰＥＡの発光が実に３倍に増加する。このことは９，１０ＤＰＡから９，１０ＢＰＥＡへのエネルギー伝達の有効な証明である。これらの条件下（３７５ｎｍにおける励起および４８０ｎｍにおける発光）で、試料の蛍光検出しきい値はリットル当り５１０^-15モル粒子に等しい。実施例２１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡおよび５，１２−ＢＰＥＮを用いてマークした蛍光ラテックスの調製この蛍光ラテックスは次の試薬を用いて実施例１に準拠して調製する：実施例１によるラテックス１，８Ｃｌ₂ −９，１０ＢＰＥＡ０．０２８ｇ５，１２−ＢＰＥＮ０．０３２ｇトルエン１０．２５ｇアセトン１９６ｇカリウムラウレート０．１ｇ２０％ＮＨ₄ＯＨ（ｐＨ＝１０にする必要量）得られたラテックスは次のような特徴と有する：１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡ７７，０００ラベル／粒子、すなわちポリマーの０．２９重量％５，１２−ＢＰＥＮ８８，０００ラベル／粒子、すなわちポリマーの０．３２重量％受容体／供与体マーキング比は１．１５である。４７０ｎｍおよび５１５ｎｍの間の励起のオーダー［ｓｉｃ］の長さには無関係に、このラテックスの発光は上記ＢＰＥＮ（５７０ｎｍ）の発光へと減少するだけである。次いで６２０ｎｍ（ＢＰＥＮの発光）における発光強度の比を次の励起において算出する：５５０ｎｍ（ＢＰＥＮ単独の吸収）４７０ｎｍ（５，１２−ＢＰＥＮおよび１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡの同時吸収）４４０ｎｍ（１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡ単独の優勢吸収）次の強度比が得られる：Ｉ（４７０）／Ｉ（５５０）＝１．４７Ｉ（４４０）／Ｉ（５５０）＝０．５２。一方、５，１２−ＢＰＥＮのみを含むラテックスでは、この強度比はそれぞれ次のようである：Ｉ（４７０）／Ｉ（５５０）＝０．３２Ｉ（４４０）／Ｉ（５５０）＝０．０８次いで検出限界［ｓｉｃ］しきい値を測定し、それは６−１０^-15Ｍ粒子／Ｌである。結果として、一つのラテックス粒子に相当する蛍光は１５８，０００モルの５，１２−ＢＰＥＮ、すなわち５，１２ＢＰＥＮを用いたラテックスの実際のマーキングの２倍に近い。５，１２−ＢＰＥＮが発光する唯一の種であるが、この相当蛍光は、含有ラベルの全数に近い。このダブルマーキングの総体的効率(overall efficiency)は０．９６であり、したがって５，１２−ＢＰＥＮまたは１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡ単独を用いたモノマーキングラテックスの効率に匹敵する。実施例３９，１０ＢＰＥＡおよび１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡを用いてマークした蛍光ラテックスの調製次の試薬を用いて実施例１に従って上記蛍光ラテックスを調製する：実施例１によるラテックス９，１０ＢＰＥＡ０．０２８ｇ１，８Ｃｌ₂ −９，１０ＢＰＥ０．０３２ｇトルエン１５ｇアセトン１９６ｇカリウムラウレート０．１ｇ２０％ＮＨ₄ＯＨ（ｐＨ＝１０にする必要量）得られたラテックスは次のような特徴と有する：９，１０ＢＰＥＡ：１０５，０００ラベル／粒子、すなわちポリマーの０．３４重量％１，８Ｃｌ₂ −９，１０ＢＰＥＡ１０７，０００ラベル／粒子、すなわちポリマーの０．４０重量％受容体／供与体マーキング比は１．０２である。４００ｎｍの励起（この波長では光が９，１０ＢＰＥＡにより実質上吸収される）下で、発光は１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡ（λmax：５６５ｎｍで５３０ｎｍ／１／２強度）へと実質的に減少する。次に６００ｎｍ（１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡの発光）における発光強度の比を次の励起において算出する：５００ｎｍ（１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡ単独の吸収）４４０ｎｍ（９，１０−ＢＰＥＡおよび１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡの同時吸収）４００ｎｍ（９，１０ＢＰＥＡの優勢吸収）次の強度比が得られる。Ｉ（４４０）／Ｉ（５００）＝１．４Ｉ（４００）／Ｉ（５００）＝０．４７一方、１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡのみを含むラテックスでは、この強度比はそれぞれ次のようである：Ｉ（４４０）／Ｉ（５００）＝０．４５Ｉ（４００）／Ｉ（５００）＝０．１１次いで検出限界［ｓｉｃ］しきい値を測定し、それは４７０ｎｍでの励起および５３０ｎｍでの発光について２−１０^-15Ｍ粒子／Ｌである。結果として、一つのラテックス粒子に相当する蛍光は２１１，０００モルの１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡ、すなわち１，８Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡを用いたラテックスの実際のマーキングの２倍である。これは、インサートしたラベルの全数に等しく、総体的蛍光効率は１．０に等しくなる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/533 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/533 33/545 0276−2Ｊ 33/545 Ａ // Ｃ０９Ｂ 67/08 9356−4ＨＣ０９Ｂ 67/08 Ｚ (72)発明者テシェンヌ，ドミニクフランス国ノワジ‐ル‐グラン、リュ、ジャン‐メルモ、２ (72)発明者リッキエロ，フレデリックフランス国モンペリエ、リュ、ジャック- ブリーブ、23 レジダンス、ル、ドミシアン、ベー．46 (72)発明者レルネル，ダンフランス国モンペリエ、リュ、デュ、フー‐ド‐マーユ‐デ‐ザベ、レジダンス、エダン、パルク、ウ

Claims

【特許請求の範囲】１．ラテックスの粒子が少なくとも一種の疎水性蛍光色素Ａ（受容体）および少なくとも一種の疎水性蛍光色素Ｄ（供与体）を含む蛍光ラテックスであって、これらの蛍光色素はカプセル封入されて成り、ＡはＤとは異種であり、かつ光放射の影響下で蛍光色素Ｄの発光が蛍光色素Ａを励起しうる蛍光ラテックス。２．蛍光色素Ｄの発光が蛍光色素Ａを直接に励起することが可能であり、蛍光色素Ｄの発光スペクトルが蛍光色素Ａの励起スペクトルと部分的に重複することを特徴とする、請求項１に記載の蛍光ラテックス。３．粒子の少なくとも１０重量％に対して、上記Ａ：Ｄモル比が１より大きいことを特徴とする、請求項２に記載の蛍光ラテックス。４．上記Ａ：Ｄのモル比が１より大きい、好ましくは１．２より大きいことを特徴とする、請求項３に記載の蛍光ラテックス。５．蛍光色素ＡおよびＤが、任意に置換された縮合されたポリ芳香族化合物類、テトラフエニルポルフィン［ｓｉｃ］および／またはこれらの有機金属複合体から選択されることを特徴とする、請求項２乃至４の何れか一つに記載の蛍光ラテックス。６．蛍光色素ＡおよびＤが、９，１０ジフエニル−アントラセン（９，１０ＤＰＡ）、９，１０ビス−フエニル−エチニル−アントラセン（９，１０ＢＰＥＡ）、１，８−ジクロロ−９，１０−ビス−フエニル−エチニル−アントラセン（１，８−Ｃｌ₂−９，１０ＢＰＥＡ）、５，１２ビス−フエニル−エチニル −ナフタセン（５，１２ＢＰＥＮ）、６，１３−ビス（フエニル−エチニル）ペンタセン、テトラベンゾ（ｄｅ，ｈｉ，ｏｐ，ｓｔ）ペンタセン、クマリン１５３、ナイルレッド（Ｎｉｌｅｒｅｄ）、１，４−ジ［２（５−フエニルオキサゾリル）］−ベンゼンもしくはＰＯＰＯＰ、１，４−ジ［（２−（４−メチル −５−フエニルオキサゾリル）］−ベンゼンもしくはＤＭ−ＰＯＰＯＰ，およびテトラフエニルポルフイリンすなわちＴＰＰから選択されることを特徴とする、請求項５に記載の蛍光ラテックス。７．蛍光色素ＡおよびＤが次のペアから選択されることを特徴とする、請求項６に記載の蛍光ラテックス。ＤＡ９，１０ＤＰＡ９，１０ＢＰＥＡ１，８Ｃｌ₂ −９，１０ＢＰＥＡ５，１２−ＢＰＥＮ１，８Ｃｌ₂ −９，１０ＢＰＥＡＴＰＰクマリン１５３ 1,8 Cl₂ -9,10 BPEA ９，１０ＤＰＡクマリン１５３１，８Ｃｌ₂ −９，１０ＢＰＥＡナイルレッド９，１０ＢＰＥＡナイルレッドＰＯＰＯＰクマリン１５３９，１０ＢＰＥＡＴＰＰ８．蛍光色素Ｄの発光が蛍光色素Ａを間接的に励起することが可能であり、このラテックスの粒子が少なくとも一種の中間体蛍光色素Ｉを含み、この励起スペクトルが部分的にＤの発光スペクトルと重複し、かつその発光スペクトルがＡの励起スペクトルと部分的に重複することを特徴とする、請求項１に記載の蛍光ラテックス。９．モル濃度比Ａ：ＩおよびＩ：Ｄが１以上、好ましくは１．２以上である、請求項８に記載の蛍光ラテックス。１０．蛍光色素が次のトリオ：から選択されることを特徴とする、請求項８または９に記載の蛍光ラテックス。１１．光放射を用いた励起に付したとき、その粒子の発光スペクトルが上記粒子の励起スペクトルと重複しないことを特徴とする、請求項８乃至１０の何れか一つに記載の蛍光ラテックス。１２．光放射に付したとき、その粒子の検出しきい値が１０^-12未満または１０^-12モル粒子／Ｌに等しいことを特徴とする、請求項１乃至１１の何れか一つに記載の蛍光ラテックス。１３．粒子のサイズが０．０１ミクロンおよび２０ミクロンの間にある、請求項１乃至１２の何れか一つに記載の蛍光ラテックス。１４．粒子がその重量の０．０５および１０％の間を構成することを特徴とする、請求項１乃至１３の何れか一つに記載の蛍光ラテックス。１５．その粒子を構成するポリマーが、ビニル芳香族化合物もしくはエチレン性モノマー由来の単位または任意に官能化されたアルカン酸もしくはエチレン性酸もしくはエステル由来の単位を含むホモポリマーもしくは共重合体であることを特徴とする、請求項１乃至１４の何れか一つに記載の蛍光ラテックス。１６．少なくとも一種の免疫反応性種により官能化されて成ることを特徴とする、請求項１乃至１５の何れか一つに記載の蛍光ラテックス。１７．免疫学的試験用試薬、逆免疫蛍光用試薬、シンチレーター、フロー・サイト蛍光測定における較正標準、および／または細胞マーカーとしての、請求項１６に記載の蛍光ラテックスの応用。１８．次の工程の一つおよび／または他の工程により特徴付けられる、請求項１乃至１７の何れか一つに記載のラテックスの調製方法。 −ラテックス粒子を構成させるモノマー（類）の重合化の間に、モノマーの画分またはモノマー類の一つの画分中に懸濁させた蛍光色素Ｄ、Ａおよび任意のＩの一種または二種以上を導入する工程、および −非水性溶剤中に安定化された上記蛍光色素Ｄ、Ａおよび任意のＩの一種または二種以上をラテックス粒子の水性分散体と共に撹拌する工程。