CN117054350A - 包括基于偏振各向异性的测量的分析方法、测试试剂盒和测试试剂 - Google Patents

包括基于偏振各向异性的测量的分析方法、测试试剂盒和测试试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包括基于偏振各向异性的测量的分析方法、测试试剂盒和测试试剂。提供一种试剂和测量方法，用于能够以高灵敏度和在短时间内执行基于偏振各向异性的样本测试。具体地，提供一种分析方法，其包括通过使用与目标物质结合的发光试剂来测量偏振各向异性的值(R)，该分析方法包括：包括将包含目标物质的样品与发光试剂和敏化剂混合，并使混合物进行反应以获得反应液的反应步骤；以及测量反应液的R的测量步骤，发光试剂包括发光颗粒基质和设置在发光颗粒基质的外侧的亲水层，敏化剂包含亲水性聚合物。

Description

包括基于偏振各向异性的测量的分析方法、测试试剂盒和测 试试剂
技术领域
本发明涉及一种包括基于偏振各向异性的测量的分析方法、测试试剂盒(testkit)和测试试剂(test reagent)。
背景技术
在医学和临床试验领域中，需要对来自例如血液或器官的采集部分的痕量生物组分进行高灵敏度检测或定量，以研究例如疾病的原因和存在与否。
在生物组分的测试技术中，广泛利用免疫分析。在许多免疫分析中，需要称为结合/游离(B/F)分离的洗涤步骤。作为不需要B/F分离的免疫分析，已知利用抗原-抗体反应的胶乳凝集方法。在胶乳凝集方法中，将其上各自支承例如特异地结合至目标物质的抗体的胶乳颗粒与可能包含目标物质的液体混合，并测量胶乳颗粒的凝集程度。
在胶乳凝集法中，目标物质被结合至胶乳颗粒并对目标物质特异的抗体捕获，并且多个胶乳颗粒介由捕获的目标物质而交联，结果，发生胶乳颗粒的凝集。也就是说，可以通过评价胶乳颗粒的凝集程度来量化诸如生物样品等液体样品中的目标物质的量。凝集的程度可以通过测量和评价通过液体样品透射通过或散射的光量的变化来量化。
胶乳凝集方法可以以简单且快速的方式检测/定量评价作为目标物质的抗原，但是涉及当抗原在液体样品如生物样品中的量少时，不能检测到抗原的检测限度的问题。
为了改善目标物质的检测灵敏度，需要以更高的灵敏度测量凝集程度。也就是说，可想象用利用具有更高灵敏度的发光特性的检测/定量方法来代替用于测量通过液体样品透射通过或散射的光量的变化的系统。具体地，已经提出了利用荧光消偏振测量的样本测试方法(日本专利公开No.H03-52575和日本专利No.2893772)。
在日本专利公开No.H03-52575中，提出了改进的用于荧光消偏振测量的设备以用于临床。
在荧光消偏振测量中，不需要一般荧光测量方法中所需的B/F分离。
因此，荧光消偏振测量的使用使得能够与胶乳凝集方法一样的简单样本测试。此外，可以设想，荧光消偏振测量的使用能够通过在测量过程中仅混合与目标物质特异地反应的发光物质、通过与胶乳凝集方法相同的测试系统进行测量。同时，在日本专利公开No.H03-52575中，存在使用单个分子如荧光素作为发光材料的提议，其原则上仅适用于药物、和低分子量抗原等。
日本专利No.2893772已经解决了日本专利公开No.H03-52575的问题，即荧光消偏振测量仅应用于药物、和低分子量抗原等的问题。即，在日本专利No.2893772中，为了将荧光消偏振测量应用于诸如蛋白质等大分子，提出使用通过将具有长寿命发光特性的染料吸附至胶乳颗粒而获得的材料作为发光材料。在日本专利No.2893772中，提出基于荧光消偏振测量的原理，通过使由于颗粒直径的增加而导致的液体中物质的旋转布朗运动的减少和发光寿命的长度平衡来定量高分子量物质。然而，在日本专利No.2893772中，荧光物质在颗粒合成之后被负载在胶乳颗粒上，因此吸附在颗粒等的表面附近的荧光物质之间的相互作用使得难以稳定地确定测试颗粒的偏振各向异性性质。此外，在日本专利No.2893772中，作为生物分子的牛血清白蛋白(BSA)被负载在颗粒的表面上以抑制非特异性吸附，因此存在由于宽的粒度分布和作为蛋白质的BSA而可能发生批次间变化的风险。
因此，在目标物质的浓度为μg/mL量级的情况下进行测量，这在测量灵敏度方面与胶乳法没有太大差异。
另外，当通过荧光消偏振测量进行高灵敏度测量时，需要根据目标物质的量来调节要反应的荧光试剂的量。这是因为，当与目标物质反应后包含大量未反应的荧光试剂时，观察到荧光各向异性的值的变化总体上很小。同时，目标物质和配体之间反应的结合速率有限，且凝集反应依赖于荧光试剂和抗体的扩散速率。即，当反应液中的目标物质或荧光试剂的浓度低时，反应需要时间，因此难以在一定时间段内以高灵敏度检测目标物质。
发明内容
本发明是根据这种相关技术做出的，并且本发明的目的是提供各自使用颗粒，用于使得能够在短时间内以高灵敏度进行基于偏振各向异性的样本测试的试剂和分析方法。
根据本发明的一个实施方案，提供一种分析方法，其包括通过使用与目标物质结合的发光试剂来测量偏振各向异性的值(R)，从而确定目标物质的存在或不存在以及目标物质的浓度中的至少任意一者，该分析方法包括：反应步骤，其包括将包含目标物质的样品与发光试剂和敏化剂混合，并使混合物进行反应以获得反应液；和测量步骤，其测量反应液的R，发光试剂包括发光颗粒基质和设置在发光颗粒基质的外侧的亲水层，敏化剂包含亲水性聚合物。
此外，根据本发明的一个实施方案，提供一种用于分析的测试试剂盒，所述分析包括通过使用与目标物质结合的发光试剂来测量偏振各向异性的值(R)，从而确定目标物质的存在或不存在以及目标物质的浓度中的至少任意一者，测试试剂盒包括：第一试剂，该第一试剂包括包含发光颗粒基质、和设置在发光颗粒基质的外侧的亲水层的发光试剂；和第二试剂，该第二试剂包括包含亲水性聚合物的敏化剂。
此外，根据本发明的一个实施方案，提供一种用于分析的测试试剂，所述分析包括通过使用与目标物质结合的发光试剂来测量偏振各向异性的值(R)，从而确定目标物质的存在或不存在以及目标物质的浓度中的至少任意一者，测试试剂包括：包含发光颗粒基质、和设置在发光颗粒基质的外侧的亲水层的发光试剂；和包含亲水性聚合物的敏化剂。
参考附图，从以下对示例性实施方案的描述，本发明的进一步特征将变得显而易见。
附图说明
图1是用于说明根据本发明的实施方案的分析方法的示意图。
图2是通过使用根据本发明的实施方案的分析方法的抗CRP抗原浓度的定量结果的说明图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的示例性实施方案。然而，这些实施方案并不旨在限制本发明的范围。
根据本发明的一个实施方案，提供以下分析方法：一种分析方法，其包括通过使用与目标物质结合的发光试剂来测量偏振各向异性的值(R)，从而确定目标物质的存在或不存在以及目标物质的浓度中的至少任意一者，该分析方法包括：反应步骤，其包括将包含目标物质的样品与发光试剂和敏化剂混合，并使混合物进行反应以获得反应液；和测量步骤，其测量反应液的R，所述发光试剂包括发光颗粒基质和设置在发光颗粒基质的外侧的亲水层，和所述敏化剂包含亲水性聚合物。
(偏振各向异性的值)
在该实施方案中，偏振各向异性的值(有时称为R)如下所述定义。也就是说，R是示出关于通过用偏振光照射来激发发光物质而产生的发光、在与辐射的偏振光平行的方向上的偏振光组分的发光强度和在与辐射的偏振光垂直的方向上的偏振光组分的发光强度之间的关系的值。更具体地，R是由振动方向与给定的偏振光平行的发光组分的发光强度计算的值，该发光强度是在发光物质被偏振光激发时测定的。进一步，R是表示在通过第一偏振光束激发时振动方向与第一偏振光束的振动方向平行的发光组分的发光强度与在通过第一偏振光束激发时振动方向与第一偏振光束的振动方向正交的发光组分的发光强度之差与发光强度之和的比的值。R可以用以下来校正：在通过振动方向与第一偏振光束的振动方向正交的第二偏振光束激发时、振动方向与第一偏振光束的振动方向正交的发光组分的发光强度与在通过第二偏振光束激发时、振动方向与第二偏振光束的振动方向平行的发光组分的发光强度之间的比；和其他常数。偏振各向异性的值包括称为“偏振各向异性性质”、和“偏振度”等的值。
更具体地，例如，R可以是下式(1)中的“r”：
在式(1)中，IVV表示在通过第一偏振光束激发时振动方向与第一偏振光束的振动方向平行的发光组分的发光强度；IVH表示在通过第一偏振光束激发时振动方向与第一偏振光束的振动方向正交的发光组分的发光强度；IHV表示在通过振动方向与第一偏振光束的振动方向正交的第二偏振光束激发时振动方向与第二偏振光束的振动方向正交的发光组分的发光强度；IHH表示在通过振动方向与第一偏振光束的振动方向正交的第二偏振光束激发时振动方向与第二偏振光束的振动方向平行的发光组分的发光强度，和G表示校正值。
此外，在下式(2)中，R可以为r′。
各符号均与式(1)中的符号相同。
关于R的测量条件，例如，优选在温度为0℃以上且50℃以下的液体中进行测量，并且液体的粘度为0.5mPa·s以上且50mPa·s以下。当发光试剂是各自包含铕配合物的颗粒时，优选以发光试剂的浓度设定为0.001mg/ml以上且0.1mg/ml以下，并且激发波长优选为500nm以上且700nm以下来进行测量。
(目标物质)
目标物质的实例可以包括抗原、抗体、低分子量化合物、各种受体、酶、基质、核酸、细胞因子、激素、神经递质、递质和膜蛋白。抗原的实例包括过敏原、细菌、病毒、细胞、细胞膜构成成分、癌症标记物、各种疾病标记物、抗体、源自血液的物质、源自食品的物质、源自天然产物的物质和低分子量化合物。核酸的实例包括源自细菌、病毒或细胞的DNA、RNA或cDNA、其部分或片段、合成核酸、引物(primer)和探针。低分子量化合物的实例包括细胞因子、激素、神经递质、递质和膜蛋白及其受体。抗原的实例包括CRP抗原和HBs抗原，激素的实例是TSH抗原。
任何这样的目标物质的存在或不存在以及目标物质的浓度中的至少任意一者可以通过根据本实施方案的分析方法来确定。可以通过将目标物质的浓度与预定阈值进行比较来确定目标物质的存在或不存在。例如，当目标物质的浓度等于或高于预定阈值时，可以确定目标物质存在，和当该浓度低于预定阈值时，可以确定目标物质不存在。
(关于反应步骤)
在反应步骤中，将包含目标物质的样品、发光试剂和敏化剂混合，并使混合物进行反应。在反应步骤中，通常发生目标物质和配体之间的结合。反应液是包含发光试剂、目标物质和敏化剂的液体，并且可以进一步包含任何其他添加剂等。反应在pH为3.0以上且11.0以下的范围内且温度为20℃以上且50℃以下的范围内进行，且反应时间可以根据目标物质的检测浓度而自由决定。稍后描述目标物质和发光试剂。
(关于测量步骤)
在测量步骤中，测量反应液的R。关于测量的条件，例如，优选在温度为0℃以上且50℃以下的液体中、并且液体的粘度为0.5mPa·s以上且50mPa·s以下进行测量。优选地，在发光试剂的浓度为0.001mg/ml以上且0.1mg/ml以下的情况下进行测量，并且激发波长优选为500nm以上且700nm以下。
(敏化剂)
根据本实施方案的敏化剂包含亲水性聚合物。亲水性聚合物优选为选自由聚乙烯基吡咯烷酮；藻酸钠(sodium alginate)；藻酸钾；藻酸铵；藻酸锂；藻酸；和聚噁唑啉组成的组中的至少一种。
亲水性聚合物具有通过称为耗尽聚集(depletion aggregation)的物理现象促进颗粒聚集的效果，从而提高目标物质和配体之间的反应的反应速率。参照图1进行描述。当发光试剂6的颗粒之间的距离5大于亲水性聚合物4的线圈直径(coil diameter)时，亲水性聚合物4可以存在于颗粒之间。同时，当目标物质和配体之间的反应导致发光试剂6的颗粒彼此接近以使发光试剂的颗粒之间的距离5小于亲水性聚合物4的线圈直径时，对于亲水性聚合物4变得难以存在于发光试剂6的颗粒之间。结果，在发光试剂的颗粒和周围溶剂之间的空间中出现浓度梯度，以产生渗透压的差。渗透压的差导致力作用在使发光试剂6的颗粒聚集在一起的方向上。通过这种力的聚集称为耗尽聚集。
关于引起耗尽聚集和促进聚集反应的条件，优选的是，发光试剂6和亲水性聚合物4之间不存在相互作用。例如，在抗原-抗体反应的情况下，敏化剂优选与发光试剂6的表面一样是亲水性的。此外，亲水性聚合物4的较大分子量是有利的，因为即使当发光试剂的颗粒之间的距离5大时，也可以更容易地引起耗尽聚集。
耗尽聚集现象取决于亲水性聚合物4的分子量和浓度，以及发光试剂的尺寸。在基于其中发光试剂不是颗粒并且具有分子水平的尺寸的偏振各向异性的相关技术测量的情况下，不能引起耗尽聚集现象，并且不能促进目标物质和配体之间的反应。另外，在基于偏振各向异性的测量中，布朗旋转运动与液体的粘度成比例，因此，当亲水性聚合物4的液体粘度过高、其分子量过大或其添加量过大时，未与目标物质反应(结合)的发光试剂的R增大。
敏化剂优选是亲水性的并且不与发光试剂相互作用，并且优选为亲水性聚合物。作为亲水性聚合物，可以适当地使用聚乙烯基吡咯烷酮、藻酸盐或聚噁唑啉。此外，由于上述原因，可以适当地使用重均分子量为约10,000以上且约100,000,000以下的敏化剂。该分子量特别优选为100,000以上且5,000,000以下，更合适地为200,000以上且2,000,000以下。
过小的分子量降低敏化作用。过大的分子量不是优选的，因为即使目标物质和配体之间没有发生反应，溶液的粘度也会增加以增大R。亲水性聚合物的重均分子量基于凝胶渗透色谱法(GPC)或粘度测量来测定。亲水性聚合物和发光试剂之间的相互作用通过根据发光试剂的亲水层的组分选择亲水性聚合物来调节。为了识别敏化剂和发光试剂之间的相互作用，可以测量仅敏化剂和发光试剂的混合物的R。预计R通过由于加入敏化剂引起的粘度增加的影响而增加，但是当R增加超过粘度增加的影响时，或者R不稳定时，存在敏化剂和发光试剂本身可能彼此相互作用的风险。在这种情况下，优选改变敏化剂的种类。
本实施方案中使用的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)可以是均聚物或共聚物，只要聚乙烯基吡咯烷酮具有由化学式(I)表示的重复单元即可。共聚物的具体实例包括聚乙烯基吡咯烷酮和聚乙二醇的共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮和聚乳酸的共聚物以及聚乙烯基吡咯烷酮和聚丙烯酸的共聚物。
在该式中，“n”表示100以上的整数。
用作敏化剂的PVP的分子量优选为100,000以上且5,000,000以下，更适宜为200,000以上且2,000,000以下。其优选的实例包括但不限于PVP-K90和PVP-130K。
本实施方案中使用的聚噁唑啉可以是均聚物或共聚物，只要聚噁唑啉具有由化学式(II)表示的重复单元即可。共聚物的具体实例包括聚噁唑啉和聚乙二醇的共聚物、聚噁唑啉和聚乳酸的共聚物以及聚噁唑啉和聚丙烯酸的共聚物。
在化学式(II)中，A各自独立地表示氢原子或者甲基、乙基或丙基。“m”表示100以上的整数。
在本实施方案中使用的藻酸或藻酸盐更优选为藻酸盐，并且可以合适地使用例如藻酸钠、藻酸钾、藻酸铵或藻酸锂。
此外，在测试试剂和目标物质之间的反应之后的R的测量时，敏化剂的浓度优选为0.01w/v％以上且2.0w/v％以下。当浓度落在此范围内时，溶液的粘度也低，因此溶液易于处理。当敏化剂的浓度过低时，难以获得足够的敏化效果。当敏化剂的浓度过高时，反应液变稠从而增大R。具体而言，溶液的粘度优选为0.5mPa·s以上且15.0mPa·s以下。当粘度落在该范围内时，即使由于增稠的影响而增大R，也可以在不饱和的情况下测量发光试剂的R。此外，当液体的粘度大于15.0mPa·s时，在测量过程中混合试剂时，气泡可能混入样品中的风险增加。因此，同样从处理试剂的角度来看，液体的粘度优选为15.0mPa·s以下。
此外，浓度的设定可以根据要测量的目标物质和不溶性载体的种类而改变。
(发光试剂)
在本实施方案中，发光试剂与目标物质结合，设置并且包括发光颗粒基质和设置在发光颗粒基质的外侧(即，发光试剂的表面)的亲水层。
发光颗粒基质包含发光分子，并且该发光分子特别优选为当用光照射时被激发而发光的分子。像发光氨这样通过化学反应发光的分子不是优选的。发光包括磷光和荧光，优选磷光。
在本实施方案中，发光颗粒基质更优选包含铕配合物。
发光试剂表面的亲水层优选包含亲水性聚合物。
发光试剂优选包括与目标物质结合的配体。“配体”是指与特定目标物质特异地结合的化合物。任何对特定物质表现出亲和性的化合物都可以用作配体。配体和目标物质、或目标物质和配体的组合的实例可以包括以下。也就是说，实例可以包括：抗原和抗体；低分子量化合物及其受体；酶和基质；以及相互补充的核酸。此外，实例可以包括抗体及其特异性的任何以下的物质：过敏原、细菌、病毒、细胞、细胞膜构成成分、癌症标记物、各种疾病标记物、抗体、源自血液的物质、源自食品的物质、源自天然产物的物质和任何低分子量化合物。此外，实例可以包括受体及其特异性的任何以下物质：低分子量化合物、细胞因子、激素、神经递质、递质和膜蛋白。此外，实例可以包括源自细菌、病毒或细胞的DNA、RNA或cDNA、其部分或片段、合成核酸、引物或探针以及与其具有互补性的核酸。除前述外，任何已知具有亲和性的组合都可以用作目标物质和配体的组合。本实施方案中配体的典型实例为抗体、抗原和核酸中的任意一者。
发光试剂在图1中示出为发光试剂6，并且包括包含铕配合物3的颗粒基质1、设置在颗粒基质的外侧的亲水层2、以及与目标物质结合的配体(未示出)。图1中的发光试剂具有颗粒形状，并且颗粒各自的直径为25nm以上且500nm以下。
优选的是，本实施方案中使用的发光试剂具有小的粒度分布，并且其颗粒的表面被亲水性地包覆。铕配合物3存在于颗粒内部。
颗粒各自的直径可以通过动态光散射法来确定。当用激光照射分散在溶液中的颗粒并且用光子型探测器观察所得到的散射光时，由于颗粒通过布朗运动不断地移动它们的位置，由散射光的干涉引起的强度分布不断地波动。
动态光散射法是用于将布朗运动的状态观察为散射光强度的波动的测量方法。散射光相对于时间的波动表示为自相关函数，并确定平移扩散系数。从确定的扩散系数确定斯托克斯直径(Stokes diameter)，并且可以导出分散在溶液中的颗粒各自的尺寸。
从保持颗粒的均匀性和单分散性的观点来看，希望发光试剂没有设置在其颗粒的表面上的任何东西。然而，为了在根据本实施方案的分析方法中使用，需要防止除目标以外的物质在颗粒上的非特异性吸附，因此发光试剂在其表面包括亲水层，以保持表面亲水性。
对于表面的亲水层，包括将BSA支承在颗粒各自的表面上的方法广泛用作用于保持亲水性的技术，但是这种方法可能会引起很多变化。鉴于此，发光试剂优选包括具有亲水性聚合物的亲水层。发光试剂在反应液中的浓度优选为0.000001质量％以上且1质量％以下，更优选为0.00001质量％以上且0.001质量％以下。
本实施方案中使用的发光试剂由于包含铕配合物，可以发出具有长寿命的磷光。当本实施方案中使用的发光试剂具有颗粒形状时，作为颗粒直径的平均值的平均粒径优选为25nm以上且500nm以下，并且平均粒径更优选为50nm以上且300nm以下。当平均粒径大于500nm时，聚集前的偏振各向异性变高，导致与聚集反应后的偏振各向异性差异小。此外，当平均粒径小于25nm时，聚集前后尺寸之间的变化变小，使得难以通过磷光发光消偏振来掌握R的变化。
通过减小发光试剂的粒度分布并引入铕配合物作为发光分子，即使当颗粒在液体中的分散状态经历轻微变化时，也可以掌握偏振发光特性的变化。具体地，即使溶液中的目标物质的浓度从大约纳克到大约皮克每毫升，当发光试剂经由目标物质聚集时，发光试剂的旋转布朗运动的变化可以被理解为偏振各向异性的变化。
“偏振发光”是指以下现象：当在跃迁矩(跃迁偶极矩)中具有各向异性性质的发光材料使用沿其跃迁矩的偏振光作为激发光时，其发光也是沿跃迁矩的偏振光。铕配合物显示出基于从配体到中心金属离子的能量转移的荧光发光，因此跃迁矩是复杂的，但是发出从最低激发态5D0到7F2的电子跃迁产生的610nm左右的红色发光作为偏振光。
偏振各向异性的原理是测量在偏振发光发生期间由于发光材料的旋转运动引起的跃迁距的移动。发光材料的旋转运动可以由式(3)表示：
Q＝3Vη/kT (3)
其中Q表示材料的旋转弛豫时间，V表示材料的体积，η表示溶剂的粘度，k表示玻尔兹曼常数，和T表示绝对温度。
材料的旋转弛豫时间是分子旋转角度θ(68.5°)所需的时间，此时cosθ＝1/e。
从式(3)中发现，发光材料的旋转弛豫时间与材料的体积成比例，即，当发光材料具有颗粒形状时，粒径的立方。同时，发光材料的发光寿命和用作偏振各向异性的值的偏振度之间的关系可以由式(4)表示：
p0/p＝1+A(τ/Q) (4)
其中p0表示材料静止(Q＝∞)时的偏振度，“p”表示偏振度，A是常数，τ表示材料的发光寿命，Q表示旋转弛豫时间。
从式(3)和式(4)中发现，偏振度受发光材料的发光寿命和旋转弛豫时间，即发光材料的体积(粒径)影响，即，受发光材料的粒径和发光寿命之间的平衡影响。
当实验地确定由式(4)表示的发光材料的偏振度时，适当的是使得偏振光进入发光材料，并且在相对于激发光的行进方向和振动方向为90°方向上检测发光。在这种情况下，适当的是，检测到的光通过将其分成相对于作为入射光的偏振光在平行和垂直方向上的偏振光组分来检测，并且例如，采用由式(5)表示的偏振各向异性性质作为偏振各向异性的值：
R(t)＝(I∥(t)-GI⊥(t))/(I∥(t)+2GI⊥(t)) … (5)
其中R(t)表示时间“t”时的偏振各向异性性质，I∥(t)表示平行于时间“t”时的激发光的发光组分的发光强度，I⊥(t)表示垂直于时间“t”时的激发光的发光组分的发光强度，以及G表示校正值，用振动方向与用于样品测量的激发光相差90°的激发光测量的比I⊥/I∥。
也就是说，当颗粒尺寸和发光寿命落在适当的范围内时，由于例如与目标物质的反应而导致的发光材料尺寸的变化可以被灵敏地读取为偏振各向异性性质的变化。即，观察到未聚集的发光材料的r(t)低，并且观察到聚集的发光材料的r(t)高。这就是偏振各向异性的原理。
偏振各向异性的值可以用G和2G来校正，或者可以是没有G和2G的值。
(颗粒基质1)
图1是具有颗粒形状(球形)的发光试剂6的实例的图示，并且发光试剂6包括颗粒基质1。在图1中，示出了发光试剂6和颗粒基质1二者均具有球形形状的实例，但是本实施方案中的发光试剂6和颗粒基质1的形状不受限制。对颗粒基质1没有特别地规定，只要颗粒基质1是能够稳定地引入铕配合物的材料即可，但是优选为包含苯乙烯单元和有机硅烷单元的聚合物。特别地，例如，通过使包含苯乙烯作为主要组分和自由基聚合性有机硅烷的组合物聚合而获得的聚合物是适合使用的。当组合物包含苯乙烯作为主要组分时，可以通过稍后描述的乳化聚合方法生产具有极其均匀的粒度分布的颗粒。另外，当采用包含有机硅烷单元的聚合物时，在水系溶剂中在聚合物中产生硅烷醇基团(Si-OH)，并且颗粒基质表面彼此形成硅氧烷键(Si-O-Si)，通过该键可以提供稍后描述的亲水层或配体。根据本实施方案的颗粒各自优选具有能够将配体结合至颗粒基质的外侧的配体结合官能团。
(亲水层2)
亲水层2可以通过在颗粒基质1的外侧引入亲水性聚合物或亲水性分子来形成。亲水性聚合物或亲水性分子是包含亲水性基团的聚合物或分子，且亲水性基团的具体实例包括各自具有羟基、醚、吡咯烷酮或甜菜碱(betaine)结构的分子或聚合物。亲水性聚合物的具体实例包括聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、磺基甜菜碱的聚合物、磷酸酯甜菜碱的聚合物和分子具有通过使缩水甘油基开环而被羟基改性的端部的聚缩水甘油甲基丙烯酸酯，并且这些亲水性聚合物可以各自用作亲水层2的主要组分。可选地，亲水层2可以通过借助使用硅烷偶联剂等在颗粒基质1的表面上直接设置具有亲水性基团的单个分子来形成。亲水层2的厚度不受限制，但不需要设定为大到超过可以表现出亲水性的厚度。当亲水层2过厚时，存在亲水层可能变成水凝胶状并且受溶剂中离子的影响而水合从而使其厚度不稳定的风险。亲水层2的厚度适当地为1nm以上且15nm以下。
(铕配合物3)
铕配合物3具有其发光的波长和强度几乎不受周围环境影响的特征，因此发光具有长寿命。铕配合物3由铕元素和配体构成。考虑到发光寿命、和可见发光波长区域等，发光染料优选为铕配合物。铕的发光寿命通常为0.1ms以上且1.0ms以下。发光寿命和由式(1)获得的旋转弛豫时间需要适当调整。在水分散液中铕的情况下，当发光试剂的直径为50nm以上且300nm以下时，R在聚集前后显著变化。
铕配合物3的至少一种构成配体是具有光收集功能的配体。“光收集功能”是指在特定波长下被激发、以通过能量转移激发配合物的中心金属的作用。此外，优选的是，铕配合物3的构成配体优选包括如β-二酮等配体，以防止水分子的配位。与铕离子配位的如β-二酮等配体由于能量转移到溶剂分子等而抑制失活过程，从而提供强发光。
铕配合物3可以是多核配合物。
另外，铕配合物的具体实例包括[三(2-噻吩甲酰基三氟丙酮)(双(三苯基氧化膦))铕(III)]、[三(2-噻吩甲酰基三氟丙酮)(三苯基氧化膦)(二苄基亚砜)铕(III)]和[三(2-噻吩甲酰基三氟丙酮)(菲咯啉)铕(III)]。
在铕配合物3的布朗旋转运动在介质中可以被认为是静止的状态下，希望由式(3)表示的偏振各向异性性质为0.08以上。布朗旋转运动可以被视为静止的状态是指颗粒的旋转弛豫时间充分长于铕配合物3的发光寿命的状态。
优选将铕配合物3以更大的量引入到颗粒基质1中，因为每个颗粒的发光强度变得更强。同时，当铕配合物3在颗粒基质1中聚集时，配体之间的相互作用影响铕配合物3等的激发效率，使得难以在保持再现性的同时测量偏振各向异性性质。铕配合物3是否在颗粒基质1中表现出非聚集发光行为，可以从样品的激发光谱来判断。
具有强发光的颗粒不仅能够进行高灵敏度的测量，而且能够提高生化反应速率，因为即使当它们的颗粒直径减小时也能保持发光。随着颗粒直径变得越小，液体中布朗运动的扩散系数变得越大，因此可以在越短的时间内检测到反应。
(发光试剂的生产方法)
接下来，描述本实施方案中使用的发光试剂的生产方法的实例。
发光试剂的生产方法包括将至少包括苯乙烯和自由基聚合性有机硅烷的自由基聚合性单体、自由基引发剂、偏振的发光性铕配合物和亲水性聚合物与水系介质混合以制备乳液的步骤(第一步骤)。
此外，发光试剂的生产方法包括加热乳液以使自由基聚合性单体聚合的步骤(第二步骤)。
发光试剂的生产方法可以包括在发光试剂的表面上设置稍后描述的配体结合官能团的步骤(第三步骤)。这里，配体结合官能团是指能够结合配体的官能团。具体地，可以使用羧基、氨基、硫醇基、环氧基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基或烷氧基甲硅烷基(硅醇盐结构)中的任意一者。
(自由基聚合性单体)
发光试剂的生产通过使自由基聚合性单体聚合来进行，并且自由基聚合性单体至少包括苯乙烯和自由基聚合性有机硅烷。自由基聚合性单体还可以包括选自由丙烯酸酯系单体；和甲基丙烯酸酯系单体组成的组中的至少一种单体。单体的实例可以包括丁二烯、乙酸乙烯酯、氯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯腈、丙烯酸甲酯、及其混合物。也就是说，除了苯乙烯和自由基聚合性有机硅烷之外，可以使用一种或多种这些单体。另外，每个分子具有两个以上的双键的单体，例如二乙烯基苯，可以用作交联剂。
在自由基聚合性单体中包含自由基聚合性有机硅烷在颗粒基质1上提供了硅氧烷键。自由基聚合性有机硅烷的实例可以包括乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、对苯乙烯基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷、3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、及其组合。使用自由基聚合性有机硅烷用于在颗粒基质1中形成无机氧化物的骨架，以提高发光试剂的物理和化学稳定性。此外，自由基聚合性有机硅烷的使用增强了颗粒基质1与各亲水层2和配体结合官能团之间的亲和性。
此外，在自由基聚合性单体中包含自由基聚合性有机硅烷在颗粒基质1的表面上提供硅烷醇基团。硅烷醇基团和亲水性聚合物如PVP形成氢键。因此，如PVP等亲水性聚合物更强地吸附至颗粒基质1的表面。
(自由基引发剂)
选自例如偶氮化合物和有机过氧化物的大范围的化合物各自均可用作自由基引发剂。其具体实例可以包括2,2’-偶氮二(异丁腈)、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)、2,2’-偶氮二(2-甲基丁腈)、4,4’-偶氮二(4-氰基戊酸)、2,2’-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸二甲酯)、叔丁基氢过氧化物、过氧化苯甲酰、过硫酸铵(APS)、过硫酸钠(NPS)和过硫酸钾(KPS)。
(亲水性聚合物)
发光试剂可以包括亲水性聚合物作为亲水层。亲水性聚合物优选抑制非特异性吸附。亲水性聚合物的实例包括各自包含具有醚、甜菜碱或吡咯烷酮环的单元的亲水性聚合物。优选的是，亲水层包含在合成的发光试剂中，并且主要存在于颗粒基质的外侧的颗粒表面上。这里，具有吡咯烷酮环的聚合物有时缩写为“PVP”。当在合成发光试剂时供给PVP时，可以同时为发光试剂提供非特异性吸附抑制能力和配体结合能力。在合成时要供给的PVP具有比自由基聚合性单体更高的亲水性，因此，存在于合成时溶剂和正在聚合的颗粒基质之间的界面处。颗粒基质1通过在聚合时包括PVP的一部分，或者通过诸如吡咯烷酮环和苯乙烯(自由基聚合性单体)之间的相互作用等物理/化学吸附，将PVP吸附至其外侧。
PVP的分子量优选为10,000以上且100,000以下，更合适地为40,000以上且70,000以下。当分子量小于10,000时，发光试剂的表面的亲水性弱，因此容易发生非特异性吸附。当分子量大于100,000时，亲水层变得如此厚以至于凝胶化，从而变得难以处理。
除了PVP之外，在合成颗粒基质时可以加入其它亲水性聚合物作为保护性胶体。
此外，发光试剂优选满足A2-A1≤0.1。
A1和A2如下所述定义。也就是说，对于通过将30μL 0.1wt％的发光试剂分散液加入到混合有16μL稀释15倍的人血清的60μL缓冲溶液中获得的混合物，加入后即刻的混合物的吸光度由A1表示，加入后在37℃下静置5分钟后的混合物的吸光度由A2表示。在10mm的光路和572nm的波长下测量吸光度。
显示A2-A1为0.1以下的颗粒对血清中的杂质几乎没有非特异性吸附，因此是优选的。
(水系介质)
用于上述发光试剂的生产方法的水系介质(水溶液)优选在介质中包含80wt％以上且100wt％以下的水。水系溶剂优选为水或水溶性有机溶剂，其实例包括各自通过将水与甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮混合而获得的溶液。当水以外的有机溶剂以超过20wt％引入时，存在在生产颗粒时可能发生聚合性单体的溶解的风险。
此外，优选将水系介质的pH预先调节到6以上且9以下。当pH的值小于6或大于9时，存在自由基聚合性有机硅烷的醇盐基或硅烷醇基在形成聚合物之前可能经历缩聚或与其它官能团的反应，导致待获得的颗粒聚集的风险。在本实施方案中，在聚合之前，醇盐不会有意地进行缩聚。
上述pH优选使用pH缓冲液调节，但也可以用酸或碱调节。
除了前述之外，可以通过以相对于水系介质为10％以下的比例添加来使用表面活性剂、消泡剂、盐、和增稠剂等。
在发光试剂的生产中，优选的是，首先，将PVP溶解在pH调节至6以上且9以下的水系介质中。PVP的含量相对于水系介质优选为0.01wt％以上且10wt％以下，更优选为0.03wt％以上且5wt％以下。当含量小于0.01wt％时，吸附至颗粒基质的量小，并且其效果难以表现出来。另外，当含量大于10wt％时，存在可能增大水系介质的粘度从而妨碍充分搅拌的风险。
随后，将包括苯乙烯(A)和自由基聚合性有机硅烷(B)的自由基聚合性单体加入到上述水系介质中，以制备乳液。苯乙烯(A)和自由基聚合性有机硅烷(B)之间的重量比为6:4至100:1。此外，将制备的乳液与铕配合物混合。此时，当铕配合物的溶解度低时，可以加入水不溶性有机溶剂。铕配合物和自由基聚合性单体之间的重量比为1:1,000至1:10。
当苯乙烯(A)和自由基聚合性有机硅烷(B)之间的重量比小于6:4时，存在颗粒整体的比重可能增加、导致颗粒显著沉降的风险。另外，为了增加PVP和发光颗粒之间的密合性，期望苯乙烯(A)和自由基聚合性有机硅烷(B)之间的重量比设定为100:1以上。
水系介质的重量与自由基聚合性单体的总量之间的重量比优选为5:5至9.5:0.5。当水系介质的重量与自由基聚合性单体的总量之间的重量比小于5:5时，存在可能发生要生产的颗粒显著聚集的风险。此外，当水系介质的重量与自由基聚合性单体的总量之间的重量比大于9.5:0.5时，尽管颗粒的生产没有问题，但存在其生产量可能减少的风险。
自由基引发剂通过溶解在水、或缓冲液等中来使用。相对于苯乙烯(A)和自由基聚合性有机硅烷(B)的总重量，在乳液中自由基引发剂可以使用0.5质量％以上且10质量％以下。
在上述加热乳液的步骤中，只需要均匀加热整个乳液。加热温度可以任意设定在50℃以上且80℃以下之间，且加热时间可以任意设定在2小时以上且24小时以下之间。通过加热乳液，使自由基聚合性单体聚合。
发光试剂可以在其表面上具有配体结合官能团。配体结合官能团没有特别限制，只要官能团可以结合抗体、抗原、或酶等，但是例如可以为羧基、氨基、硫醇基、环氧基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、或硅醇盐基等，或者包含这些官能团中的任意者。例如，具有配体结合官能团的硅烷偶联剂和合成的颗粒可以混合以在颗粒表面上提供官能团。具体地，可以制备具有羧基的硅烷偶联剂的水溶液，并与合成颗粒的分散液混合，以在颗粒表面上提供羧基。此时，可以向反应溶液中加入分散剂如Tween 20。反应温度可以任意设定在0℃以上且80℃以下之间，且反应时间可以任意设定在1小时以上且24小时以下之间。为了抑制硅烷偶联剂的突然缩合反应，适宜的是，将温度设定为等于或低于约25℃的室温，并且将反应时间设定为3小时以上且14小时以下。根据配体结合官能团，可以通过添加酸或碱催化剂来促进与颗粒表面的反应。
发光试剂可以通过结合配体如各种抗体中的任意者来用作样本测试的颗粒。只需要选择通过利用亲水层2上存在的官能团来结合目标抗体等的最佳技术。
(配体的引入)
迄今为止已知的方法可以应用于用于使配体结合官能团和配体化学结合的化学反应，以可以达到本发明的目的的程度。另外，当配体是酰胺结合的时，可以适当地使用如1-[3-(二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺]等的催化剂。
本实施方案中使用的发光试剂可以优选地应用于在临床试验、和生化研究等领域中广泛使用的胶乳免疫凝集测量方法。
(测试试剂)
根据本发明的另一个实施方案，提供用于分析的测试试剂，该分析包括通过使用与目标物质结合的发光试剂来测量偏振各向异性的值(R)，从而确定目标物质的存在或不存在以及目标物质的浓度中的至少任意一者，测试试剂包括：包含发光颗粒基质、和设置在发光颗粒基质的外侧的亲水层的发光试剂；和包含亲水性聚合物的敏化剂。
在本实施方案的测试试剂中，亲水性聚合物优选为选自由聚乙烯基吡咯烷酮；藻酸钠；藻酸钾；藻酸铵；藻酸锂；藻酸和聚噁唑啉组成的组中的至少一种。此外，亲水性聚合物的分子量为200,000以上且2,000,000以下。优选的是，发光分子为铕配合物。发光试剂优选包括与目标物质结合的配体。此外，优选的是，R0≥0.001，其中R0表示针对与目标物质未反应的发光试剂测量的R。
本实施方案中的测试试剂用于体外诊断中样品中的目标物质的分析。
测试试剂可以包括发光试剂、敏化剂以及分散介质。根据本实施方案的发光试剂在测试试剂中的量优选为0.000001质量％以上且20质量％以下，更优选为0.0001质量％以上且1质量％以下。在本实施方案的测试试剂中，根据本实施方案的亲水性聚合物敏化剂的量优选为0.01w/v％以上且2.0w/v％以下。除了根据本实施方案的发光试剂之外，根据本实施方案的测试试剂可以包括第三物质，例如添加剂或封闭剂(blocking agent)，以达到可以实现本发明的目的的程度。测试试剂可以包括两种以上的例如添加剂和封闭剂等第三物质的组合。在本实施方案中使用的分散介质的实例包括各种缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、Good缓冲溶液、Tris缓冲溶液和氨缓冲溶液，但是在本实施方案中包括测试试剂的分散介质不限于此。本实施方案中的测试试剂可以作为其中各组分各自独立地存在的测试试剂储存。可以在测量时混合其中各成分各自独立存在的测试试剂，以制备包含样本测试所需组分的测试试剂。
当本实施方案中的测试试剂用于检测样本中的抗原或抗体时，抗体或抗原可以用作配体。
(测试试剂盒)
根据本发明的另一个实施方案，提供用于分析的测试试剂盒，该分析包括通过使用与目标物质结合的发光试剂来测量偏振各向异性的值(R)，从而确定目标物质的存在或不存在以及目标物质的浓度中的至少任意一者，该测试试剂盒包括：第一试剂，该第一试剂包括包含发光颗粒基质、和设置在发光颗粒基质的外侧的亲水层；和第二试剂，该第二试剂包括包含亲水性聚合物的敏化剂。
在本实施方案的测试试剂盒中，亲水性聚合物优选为选自由聚乙烯基吡咯烷酮；藻酸钠；藻酸钾；藻酸铵；藻酸锂；藻酸；和聚噁唑啉组成的组中的至少一种。此外，亲水性聚合物的分子量为200,000以上且2,000,000以下。优选的是，发光分子为铕配合物。发光试剂优选包括与目标物质结合的配体。此外，优选的是，R0≥0.001，其中R0表示针对与目标物质未反应的发光试剂测量的R。
本实施方案中的测试试剂盒用于体外诊断中样品中的目标物质的分析。
第一试剂和第二试剂可以各自包括分散介质。除了根据本实施方案的发光试剂之外，根据本实施方案的测试试剂可以包括第三物质，例如添加剂或封闭剂，以达到可以实现本发明的目的的程度。测试试剂可以包括两种以上的例如添加剂和封闭剂等第三物质的组合。在本实施方案中使用的分散介质的实例包括各种缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、Good缓冲溶液、Tris缓冲溶液和氨缓冲溶液，但是引入至本实施方案的测试试剂中的分散介质不限于此。
将第一试剂和第二试剂与包含目标物质的样品混合，以用于包括测量偏振各向异性的值(R)、从而确定目标物质的存在或不存在以及目标物质的浓度中的至少任意一者的分析。混合的顺序不受限制，该试剂盒的第二试剂可以与第一试剂混合使用，或者可以与包含目标物质的样品混合使用，或者在包含目标物质的样品与第一试剂混合后再混合使用第二试剂。
优选调节第一试剂的浓度，使得混合液体中发光试剂的量为0.000001质量％以上且20质量％以下，更优选为0.0001质量％以上且1质量％以下。此外，优选调节第二试剂的浓度，使得混合液体中的敏化剂的量为0.01w/v％以上且2.0w/v％以下。
测试试剂盒可以进一步包括容纳第一试剂或第二试剂的容器，以及包围容器的壳体。第一试剂和第二试剂可以各自适当地稀释。此外，测试试剂盒可以进一步包括阳性对照、阴性对照、或稀释剂等。作为阳性对照或阴性对照的介质，可以使用不含可测量目标物质、生理盐水或溶剂的血清。
[实施例]
下面通过实施例具体描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。
(1)发光颗粒的生产
将聚乙烯基吡咯烷酮(PVP-K 30：由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制)溶解在pH为7的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制)中，以制备溶剂A。将用作铕配合物的[三(2-噻吩甲酰基三氟丙酮)(双(三苯基氧化膦))铕(III)](由Central Techno Corporation制，以下简称为“Eu(TTA)3(TPPO)2”)、苯乙烯单体(由KishidaChemical Co.,Ltd.制)、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(由Tokyo ChemicalIndustry Co.,Ltd制，以下简称为“MPS”)混合，以制备反应液B。将反应液B加入到容纳有溶剂A的四颈烧瓶中，且用设定为300rpm的机械搅拌器搅拌混合物。在氮气流动条件下搅拌15分钟后，将已制备的油浴的温度设定为70℃，并再进行氮气流动15分钟。将混合液加热和搅拌后，向反应溶液中加入溶解有过硫酸钾(以下简称为“KPS”)(由Sigma-Aldrich制造)的水溶液，且进行乳化聚合20小时。聚合反应后，通过使用截留分子量为100K的超滤膜，用约4L离子交换水对所得悬浮液进行超滤，以洗涤产物，从而提供发光颗粒的分散液。
取通过乳化聚合获得的发光颗粒的分散液的试样，并将其加入到其中溶解有1质量％的Tween 20(由Kishida Chemical Co.，Ltd.制造)的水溶液中。搅拌10分钟后，添加硅烷偶联剂X12-1135(由Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.制造)，并将混合物搅拌过夜。搅拌后，离心分离分散液，除去上清液，并且用纯水再分散沉淀物。离心分离和再分散操作进行3次以上以洗涤产物。洗涤后的沉淀物在纯水中再分散。因此，配体结合官能团引入至颗粒1至8中。装载的颗粒、纯水和X12-1135之间的质量比设定为1:300:2。
(具有抗CRP抗体的发光试剂的生产)
取对应于合成的发光颗粒的1.2wt％的0.25mL颗粒分散液的试样，并且用1.6mLpH为6.0的MES缓冲溶液代替溶剂。向颗粒MES缓冲溶液中，加入0.5wt％的1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠(N-hydroxysulfosuccinimidesodium)，并将混合物在25℃下进行反应1小时。反应后，用pH为5.0的MES缓冲溶液洗涤分散液，以100μg/mL加入抗CRP抗体，并在25℃下、2小时将抗CRP抗体结合至颗粒。结合后，用pH为8的Tris缓冲溶液洗涤颗粒。反应后，用磷酸盐缓冲溶液洗涤颗粒，以提供浓度为0.3wt％的抗CRP抗体改性的发光试剂(有时称为“亲和颗粒”)。
(具有抗TSH抗体的发光试剂的生产)
取对应于合成的发光颗粒的1.2wt％的0.25mL颗粒分散液的试样，并且用1.6mLpH为6.0的MES缓冲溶液代替溶剂。向颗粒MES缓冲溶液中，加入0.5wt％的1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠，并将混合物在25℃下进行反应1小时。反应后，用pH为5.0的MES缓冲溶液洗涤分散液，以100μg/mL加入抗TSH抗体，并在25℃下、2小时将抗TSH抗体结合至颗粒。结合后，用pH为8的Tris缓冲溶液洗涤颗粒。反应后，用磷酸盐缓冲溶液洗涤颗粒，以提供浓度为1.0wt％的抗TSH抗体改性的发光试剂(有时称为“亲和颗粒”)。使用的抗TSH抗体是单克隆抗体，并且用两种抗TSH抗体使发光颗粒改性，以便使至少两种以上的颗粒与用作测量对象的TSH抗原反应。
通过借助BCA测定法测量添加有抗体的缓冲溶液中抗体浓度的降低量来识别抗体与颗粒的结合。
(发光试剂液体的制备)
用pH为7.4的磷酸盐(PBS)缓冲溶液稀释所得发光试剂，使其浓度为0.1mg/mL，以制备发光试剂液体。
(稀释液的制备)
将4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液和PBS缓冲溶液以体积比1:1的比例混合，并适当加入敏化剂以得到稀释液。添加的敏化剂的种类和量在后面描述的实施例中示出。
目标物质与配体之间的反应(抗原-抗体反应)
制备通过将CRP抗原混合到HEPES缓冲溶液中获得的液体，并加温至37℃的温度。将发光试剂液体加入到制备的液体中，并快速搅拌整体，随后观察混合液的偏振各向异性。在实施例1、2、3、4和比较例中的各自中，使用0.01mg/mL的发光试剂和200pM抗原浓度的CRP进行研究。在实施例5中，使用0.0025mg/mL的发光试剂和1pM抗原浓度的CRP进行研究。在实施例6中，使用0.04mg/mL的发光试剂和100pM的抗原浓度的TSH进行研究。在37℃的温度下进行观察。偏振各向异性将在后面描述。
(实施例1)
以最终浓度为0.1w/v％添加藻酸钠80-120(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)作为敏化剂，并对混合物进行抗原-抗体反应和荧光偏振测量。基于测量结果，进行CRP抗原浓度的评价。
(实施例2)
除了使用0.2w/v％的PVP-K90(由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造：分子量：360,000)作为敏化剂之外，通过与实施例1相同的方法进行CRP抗原浓度的评价。
(实施例3)
除了使用0.4w/v％的PVP-K90(由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造：分子量：360,000)作为敏化剂之外，通过与实施例1相同的方法进行CRP抗原浓度的评价。
(实施例4)
除了使用0.1w/v％的PVP 1300K(由Merck制造：分子量：1,300,000)作为敏化剂之外，通过与实施例1相同的方法进行CRP抗原浓度的评价。
(实施例5)
以最终浓度分别为0.2w/v％和0.2w/v％添加藻酸钠80-120(由FUJIFILM WakoPure Chemical Corporation制造)和聚乙二醇(以下简称PEG)(由FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制造：分子量：500,000)作为敏化剂，并对混合物进行抗原-抗体反应和荧光偏振测量。基于测量的结果，进行CRP抗原浓度的评价。
(实施例6)
以最终浓度为2.0w/v％添加聚(2-乙基-2-噁唑啉)(由Sigma-Aldrich制造：分子量：500,000)作为敏化剂，并对混合物进行抗原-抗体反应和荧光偏振测量。基于测量结果，进行TSH抗原浓度的评价。
(比较例1)
除了不使用敏化剂之外，通过与实施例1相同的方法进行CRP抗原浓度的评价。
(产物的评价)
使实施例和比较例中的产物各自进行如下所述的评价。
使用电子显微镜(由Hitachi High-Technologies Corporation制造的S5500)评价产物的形状。
使用动态光散射(由Malvern制造的Zetasizer Nano S)评价产物的平均粒径。
使用重量分析仪(由Rigaku Corporation制造的Thermo plus TG 8120)评价其中分散有产物的悬浮液的浓度。
使用以下装置进行R的测量。
准备340nm激发光的LED光源，并将偏振滤光器(由Sigmakoki Co.，Ltd.制造，NSPFU-30C)和短波通滤光器(由Edmund Optics制造，84-706)插入光路中，以设置能够照射1cm石英方形单元的光学系统。偏振滤光器(由Thorlabs，Inc.制造，PIVISC050)和带通滤光器(由Thorlabs，Inc.制造，FB610-10)设置在相对于入射光为90°的方向上。为了同时测量两个方向上作为的IVV和IVH的发光，准备其中偏振器的结构相对于入射光改变90°的方向的两组。对于偏振光的检测，使用由Ocean Optics，Inc.制造的QEPro进行光谱测定。为样品支架设定温度控制，以便能够在37℃下测量。偏振各向异性性质“r”的测量在LED光源固定在12mW的输出和累积时间设定为3秒的情况下进行。测量间隔设定为15秒。基于所得的偏振发光的发光光谱，将600nm至630nm波长范围内的发光强度代入式(1)中以获得R。将R测量2,400秒，并将时间和R的数值绘图。
为了比较实施例和比较例中的R，测定并比较通过从反应300秒后的R(R300)中减去反应后即刻即发光试剂和CRP抗原混合后即刻的R(R0)获得的ΔR300-R0。可选择地，测定通过从反应900秒后的R(R900)减去CRP抗原混合后即刻的R(R0)获得的ΔR900-R0。
如下所述进行产物的非特异性凝集抑制评价。
将60μl用缓冲溶液稀释15倍的人血清溶液加入到发光试剂分散液(3mg/mL)中，且使混合物在37℃的温度下保持5分钟。在温度保持前后测量527nm处的吸光度，并测量温度保持前后吸光度的变化量3次。表1示出3次的平均值。进行如下评价：当“吸光度×10,000”值的变化量小于1,000时，确定非特异性凝集得到抑制，当该量为1,000以上时，确定发生了非特异性凝集。
(性能评价)
合成的发光试剂的粒径为约100nm，且在340nm激发光的情况下表现出强的红色发光。
根据非特异性凝集抑制评价的结果，吸光度的变化等于或小于特定数值(“吸光度×10,000”值的变化量为1,000以下)，因此，认识到颗粒能够抑制非特异性吸附。
实施例1和比较例1的结果如图2所示。
图2是通过在横轴上绘制反应时间和在纵轴上绘制R(偏振各向异性性质“r”)而获得的曲线图。在图2中用圆圈绘制的实施例1中，反应后即刻的R为0.065，并且在经过1,000秒时发现急剧增加至0.1。同时，在图2中用“×”标记绘制的比较例1中，反应后即刻的R为0.056，但1,000秒后的R为约0.064，因此，尽管R随着反应时间而增加，但是差异小。另外，当实施例1的样品静置过夜、然后再次进行测量时，R为约0.015。该数值与发光试剂在凝胶中的R值相同，表明偏振各向异性性质饱和。从图2显然的是，实施例1的R在2,400秒后增加到0.113，揭示了反应被促进直到R在大约40分钟的反应中充分饱和。
实施例1～6和比较例1的结果示于表1中。
在所有实施例和比较例中，PVP-K30作为亲水性聚合物存在于发光试剂的表面。当比较所有实施例和比较例1的偏振各向异性性质的初始值R0时，实施例的偏振各向异性性质的初始值R0高于比较例1的为0.05676的初始值R0。这反映了由于敏化剂的加入而导致的液体粘度的增加。然而，与R的饱和值(约0.150)相比，各实施例中R0的增加很小，因此，落在可以充分进行评价的范围内。另外，测得实施例1的液体粘度为2.3mPa·s。当基于表1在从300秒后的偏振各向异性性质的值R300减去R0而获得的ΔR300-R0的方面进行比较时，实施例1、2和3以及比较例1的ΔR300-R0分别为0.0143、0.0087、0.0073、0.007和0.00138，因此，能够识别实施例中敏化剂的效果。此外，当基于表1在从900秒后的偏振各向异性性质的值R900减去R0而获得的ΔR900-R0的方面进行比较时，实施例1、2和3以及比较例1的ΔR900-R0分别为0.0377、0.0225、0.00136、0.0198和0.00594，因此，能够认识到实施例和比较例之间的差异进一步增大。特别地，在使用藻酸钠作为敏化剂的实施例1的情况下，ΔR300-R0的数值是比较例的ΔR900-R0的2倍以上，表明敏化剂可以将测量中的反应时间减少到三分之一以下。
在实施例5中，显示出当使用多种亲水性聚合物作为敏化剂时，可以在300秒内充分检测到浓度仅为1pM的CRP抗原(ΔR300-R0＝0.00601)。在实施例6中，显示出敏化剂在TSH抗原-抗体反应代替CRP的情况下也具有效果。此外，还显示出使用聚噁唑啉作为亲水性聚合物也有效果(ΔR300-R0＝0.0046)。另外，当通过从实施例6的研究中省略聚噁唑啉来进行研究时，几乎不能观察到偏振各向异性性质的任何变化。
表1
因此，显示出根据该实施方案的分析方法能够以高灵敏度和在短时间内测量用作目标物质的CRP抗原。
根据本实施方案的分析方法的使用能够在短时间内以高灵敏度测量目标物质。可以设想，根据本实施方案的分析方法的使用可以实现用于在如在短时间内执行质量测试的样本测试的应用中执行高灵敏度测量的设备。
根据本发明的分析方法，可以相当于颗粒的凝集/分散行为以高灵敏度检测偏振发光的各向异性性质的变化，并且进一步，由于敏化剂的作用，可以在短时间内进行分析。
尽管已经参照示例性实施方案描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于所公开的示例性实施方案。所附权利要求的范围应符合最宽泛的解释，以涵盖所有的此类修改以及等同的结构和功能。

Claims (15)

1.一种分析方法，其特征在于，其包括通过使用与目标物质结合的发光试剂来测量偏振各向异性的值R，
从而确定所述目标物质的存在或不存在以及所述目标物质的浓度中的至少任意一者，
所述分析方法包括：
反应步骤，其包括将包含所述目标物质的样品与所述发光试剂和敏化剂混合，并且使混合物进行反应以获得反应液；和
测量步骤，其测量所述反应液的R，
所述发光试剂包括发光颗粒基质和设置在所述发光颗粒基质的外侧的亲水层，
所述敏化剂包含亲水性聚合物。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述亲水性聚合物为选自由聚乙烯基吡咯烷酮；藻酸钠；藻酸钾；藻酸铵；藻酸锂；藻酸；和聚噁唑啉组成的组中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述亲水性聚合物的分子量为200,000以上且2,000,000以下。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述发光颗粒基质包含铕配合物。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述发光试剂包括与所述目标物质结合的配体。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其中，R0≥0.001，R0表示针对与所述目标物质未反应的所述发光试剂测量的R。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述R定义为下式(1)中的“r”：
在式(1)中，
IVV表示在通过第一偏振光束激发时振动方向与所述第一偏振光束的振动方向平行的发光组分的发光强度，
IVH表示在通过所述第一偏振光束激发时振动方向与所述第一偏振光束的振动方向正交的发光组分的发光强度，
IHV表示在通过振动方向与所述第一偏振光束的振动方向正交的第二偏振光束激发时振动方向与所述第二偏振光束的振动方向正交的发光组分的发光强度，
IHH表示在通过振动方向与所述第一偏振光束的振动方向正交的第二偏振光束激发时振动方向与所述第二偏振光束的振动方向平行的发光组分的发光强度，和
G表示校正值。
8.一种用于分析的测试试剂盒，其特征在于，所述分析包括通过使用与目标物质结合的发光试剂来测量偏振各向异性的值R，
从而确定所述目标物质的存在或不存在以及所述目标物质的浓度中的至少任意一者，
所述测试试剂盒包括：
第一试剂，其包括包含发光颗粒基质；和设置在所述发光颗粒基质的外侧的亲水层的发光试剂；和
第二试剂，其包括包含亲水性聚合物的敏化剂。
9.根据权利要求8所述的测试试剂盒，其中所述亲水性聚合物为选自由聚乙烯基吡咯烷酮；藻酸钠；藻酸钾；藻酸铵；藻酸锂；藻酸；和聚噁唑啉组成的组中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的测试试剂盒，其中所述发光颗粒基质包含铕配合物。
11.根据权利要求8所述的测试试剂盒，其中所述发光试剂包括与所述目标物质结合的配体。
12.一种用于分析的测试试剂，其特征在于，所述分析包括通过使用与目标物质结合的发光试剂来测量偏振各向异性的值R，
从而确定所述目标物质的存在或不存在以及所述目标物质的浓度中的至少任意一者，
所述测试试剂包括：
发光试剂，其包括：发光颗粒基质，和设置在所述发光颗粒基质的外侧的亲水层；和
敏化剂，其包含亲水性聚合物。
13.根据权利要求12所述的测试试剂，其中所述亲水性聚合物为选自由聚乙烯基吡咯烷酮；藻酸钠；藻酸钾；藻酸铵；藻酸锂；藻酸；和聚噁唑啉组成的组中的至少一种。
14.根据权利要求12所述的测试试剂，其中所述发光颗粒基质包含铕配合物。
15.根据权利要求12所述的测试试剂，其中所述发光试剂包含与所述目标物质结合的配体。
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