CN100400677C - 荧光量子点标记的dna生物探针的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光量子点标记的DNA生物探针及其制备方法，荧光量子点标记的DNA探针是在巯基化的DNA末端连接了荧光纳米量子点，荧光量子点表面可以连接一个或一个以上DNA片段。其制备方法是先制得巯基乙酸修饰的量子点，再通过竞争替代方法使巯基化的DNA探针替代量子点表面的巯基乙酸小分子，将荧光量子点连接到巯基化DNA探针上，即得到既有优异荧光特性又具有生物活性，且分散性好、特异性强，可应用于与DNA相关研究领域的双功能纳米材料。该制备方法简单易行，成本较低，在一般化学实验室均可完成，可广泛推广应用于生物及医学检测与分析领域。

Description

荧光量子点标记的DNA生物探针的制备方法
技术领域
本发明涉及一种荧光量子点标记的DNA生物探针的制备方法，属于分析化学、纳米材料学和生物分析化学领域。
背景技术
半导体纳米晶粒-量子点，特别是壳/核型量子点，由于其量子尺寸效应而具有奇特的性质，包括荧光发射波长可控、激发光谱宽而连续、荧光强、光稳定性好、耐光漂白、能实现一元激发多元发射的同时多色标记等独特性能，可弥补现有有机荧光染料的不足，甚至在某些情况下可替代有机荧光染料。量子点的独特性能将有利于其在医学实验和临床检测上的应用，相比传统荧光试剂在生物分析方面有着巨大的优势。
目前，根据相关报导已有在核/壳型量子点外壳上连接上巯基乙酸，然后通过酰氨键与目的蛋白质相连，实现量子点的生物功能化的方法。
其制备巯基乙酸修饰荧光量子点的具体过程如下：
1、制备荧光量子点；
2、油溶性荧光量子点溶解在氯仿里，并与约1mL的巯基乙酸反应两小时；
3、以1∶1的比例加入pH7.4的0.1mol/L PBS作为溶剂，进行萃取；
4、激烈震荡后，离心。去除含有未反应的油溶性量子点的氯仿溶液层；
5、重复上述过程，去除多余的巯基乙酸。
但还未出现类似我们将荧光量子点和巯基化DNA构建成具有生物功能的双功能材料的方法。巯基化的DNA片段可以针对不同的靶DNA设计使荧光量子点标记DNA探针可用于细胞DNA，包括各种病原菌DNA的研究工作。
发明内容
为进一步拓展荧光量子点在生物分析方面的应用，本发明提供了一种荧光量子点标记的具有生物活性的DNA探针及其制备方法，该方法将量子点有效地连接到巯基化DNA探针上，得到了既有优异荧光特性又具有生物活性，可应用于与DNA相关的研究领域的双功能纳米材料。
本发明的荧光量子点标记DNA探针是在巯基化的DNA末端连接有荧光纳米量子点，荧光量子点表面可以连接一个或一个以上DNA片段。该数目可以通过控制巯基化DNA和量子点的比例进行调整。
其中的荧光量子点至少为CdTe、CdSe、InP、InAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdTe/ZnS之一。荧光量子点为水溶性的，所用DNA片段可以为不同序列的DNA片段，可以是单链或双链的DNA。
本发明提供的荧光量子点标记DNA探针的制备方法具体步骤如下：
①、制备荧光纳米量子点；
②、根据需要取适量荧光量子点的己烷溶液，先用无水甲醇反复洗涤以除去其表面的有机分子，然后用氮气吹干成固体；
③、在固体中加入与N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)，在超声条件下将量子点完全均匀地分散于其中，再加入过量的巯基乙酸，激烈震荡反应后将反应物离心并除去沉淀物；
④、取出上层清液，在其中加入四氢呋喃和氢氧化四甲基铵溶液或氢氧化钠溶液，混合均匀后离心得到的沉淀即巯基乙酸修饰的荧光量子点。
⑤、将沉淀溶解在磷酸缓冲液(PBS)或者水溶液中，形成水溶性的巯基乙酸修饰的量子点；
⑥、在取出的巯基乙酸修饰量子点的PBS溶液中加入所需的物质的量的巯基化的DNA探针，量子点与DNA的摩尔比例根据需要确定，以形成一个量子点表面有一个或者一个以上DNA片段的产物，其中DNA片段可以是单链或者双链的；
⑦、将溶液在室温下缓慢摇动，充分反应；
⑧、离心以去除可能形成的沉淀，所得的上清即为量子点标记的DNA生物活性探针。
其中所用荧光量子点为水溶性的，所用具有生物活性的DNA片段可以根据需要为不同碱基序列，可以是单链或双链。
本发明是在现有制备巯基乙酸修饰的量子点方法的启发下，首次成功地将荧光纳米材料和巯基化DNA构建成具有生物功能的双功能材料，这种材料既有优异荧光特性又具有生物活性，且分散性好、特异性强，是可应用于与DNA相关研究领域的双功能纳米材料。其制备方法是先制得巯基乙酸修饰的量子点，再通过竞争替代方法即将得到的水溶性量子点加入到巯基化的DNA探针粉末或者PBS溶液中，轻轻吹匀，室温反应过夜，使巯基化的DNA探针替代量子点表面的巯基乙酸小分子，将荧光量子点连接到巯基化DNA探针上，该制备方法简单易行，重复性高，成本较低，在一般化学实验室均可完成，可广泛推广应用于生物及医学检测与分析领域。
附图说明
图1为荧光量子点标记DNA探针的原子力显微镜照片。
图2为荧光量子点标记DNA探针的荧光倒置显微镜照片。
图3为荧光量子点标记DNA探针的斑点杂交照片。
图4荧光量子点标记DNA探针的大肠杆菌荧光原位杂交照片
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不限于所举的实施例。
荧光量子点标记的DNA探针是在巯基化的DNA末端连接有粒径为4nm-8nm水溶性的荧光纳米量子点，粒径为4nm-8nm的荧光量子点表面可以连接一个或一个以上DNA片段。
其中荧光纳米量子点至少为CdTe、CdSe、InP、InAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdTe/ZnS之一。DNA片段可以为不同序列的DNA片段，可以是单链或双链的DNA。
制备方法实施例：
荧光量子点采用02139152.1号发明专利所述的方法，用醋酸镉或醋酸锌作原料制备。
按如下方法处理荧光量子点：取适量的荧光量子点的己烷溶液，先用无水甲醇反复洗数次，除去表面的有机分子，然后用氮气吹干成固体。在固体沉淀中加入与荧光量子点的己烷溶液等体积的N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)，在超声条件下将量子点完全均匀地分散于其中，再加入过量的巯基乙酸，激烈震荡反应30分钟后将反应物在12000rpm条件下离心并除去沉淀物。取出上层清液，按照如下比例操作：在1mL上清液加入0.3mL质量百分比浓度为10％的氢氧化四甲基铵溶液(或1mol/L的氢氧化钠溶液)和0.7mL四氢呋喃，混合均匀后在12000rpm离心得到的沉淀即为巯基乙酸修饰的荧光量子点。
将用上述方法得到的荧光量子点溶解在pH7.5的0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)中，形成水溶性的巯基乙酸修饰的量子点；
取出适量巯基乙酸修饰量子点的PBS溶液中加入所需的物质的量的巯基化的DNA探针，量子点与DNA的摩尔比例根据需要确定，以形成一个量子点表面有一个或者一个以上DNA片段的产物，其中DNA片段可以是单链或者双链的；将溶液在室温下缓慢摇动，反应12小时；最后在5000rpm离心5分钟，以去除可能形成的沉淀，所得的上清即为量子点标记的DNA生物活性探针。
将制得的荧光量子点标记的DNA生物探针通过原子力显微镜表征(如图1)，可以直观地看到荧光量子点具有很好的单分散性。通过倒置荧光显微镜表征(如图2)，荧光标记DNA探针呈现为很好的单分散性和荧光发光特性。简易的斑点杂交(如图3)可以看到荧光量子点标记的DNA探针呈现很好的特异性。
本例的荧光标记DNA探针特别适用于生物DNA活性和分布分析。
采用本发明方法合成的荧光量子点标记的DNA生物活性探针具有以下优点：(1)优异的荧光特性。量子点，特别是壳/核型量子点，有着传统有机荧光染料无法比拟的优点，如激发光谱很宽、可实现荧光发射波长可控、激发光谱宽而连续、荧光强、光稳定性好、耐光漂白、能实现一元激发多元发射的同时多色标记等，所以它有着代替传统荧光试剂用于实时长时间在线生物分析的巨大潜力；(2)巯基化的DNA片段可以根据需要设计引物进行扩增，或者直接合成相应的探针，从而对配对的靶DNA在细胞中的活动和分布等进行研究观察；(3)在荧光标记DNA探针时，不仅操作简单，而且可以通过在表面引入不同的DNA片段或者相同的DNA片段，实现一个量子点多个DNA片段的可控器件，因而实现对不同种类的受体生物分子进行研究。整个制作方法简单易行，成本较低，在一般化学实验室均可完成，为广泛推广应用奠定了基础。我们研究组已经利用荧光量子点标记的DNA探针对大肠杆菌中pUC18的分布进行研究，通过大肠杆菌荧光原位杂交实验(如图4)说明这种修饰方法形成荧光量子点标记的DNA探针具有很好的特异性和生物活性。以上这些性质使得我们发明的荧光量子点标记DNA探针可用于细胞内DNA的研究。

Claims (3)

1.一种荧光量子点标记的DNA探针的制备方法，其特征在于采用如下具体步骤：
①、制备荧光纳米量子点；
②、取适量荧光量子点的己烷溶液，先用无水甲醇反复洗涤以除去其表面的有机分子，然后用氮气吹干成固体；
③、在固体中加入足量N，N’-二甲基甲酰胺，在超声条件下将量子点完全均匀地分散于其中，再加入过量的巯基乙酸，激烈震荡反应后将反应物离心除去沉淀物；
④、取上层清液，在其中加入适量四氢呋喃和氢氧化四甲基铵溶液或氢氧化钠溶液，混合均匀后在高速离心得到的沉淀即巯基乙酸修饰的荧光量子点；
⑤、将沉淀溶解在磷酸缓冲液或者水溶液中，形成水溶性的巯基乙酸修饰的量子点；
⑥、在取出的巯基乙酸修饰量子点的PBS溶液中加入适量的巯基化的DNA探针，以形成一个量子点表面有一个或者一个以上DNA片段的产物，
其中DNA片段为各种不同碱基序列的，为单链或者双链的；
⑦、将溶液在室温下缓慢摇动，充分反应；
⑧、离心以去除可能形成的沉淀，所得的上清即为量子点标记的DNA生物活性探针。
2.根据权利要求1所述荧光量子点标记的DNA探针的制备方法，其特征在于：荧光量子点为水溶性的量子点，反应在水溶液中进行。
3.根据权利要求1或2所述的荧光量子点标记的DNA探针的制备方法，其特征在于：荧光量子点至少为CdTe、CdSe、InP、InAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdTe/ZnS之一。
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