CN102942935B

CN102942935B - 一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子点的方法

Info

Publication number: CN102942935B
Application number: CN 201210370603
Authority: CN
Inventors: 何治柯; 张翠玲; 许婧; 方旸
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2032-09-28
Also published as: CN102942935A

Abstract

本发明属于纳米材料和生物医学分析化学领域，具体涉及一种一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子点的方法。该量子点探针是将硫代磷酸化的DNA通过硫与镉的配位作用连接到量子点表面，量子点表面可连1-2个DNA片段。其制备方法是在量子点合成过程中，加入硫代磷酸化的DNA，通过一步反应得到DNA功能化的量子点探针，该探针作为一种双功能纳米材料，荧光量子产率高，生物相容性及分散性好，可用于检测DNA片段、蛋白，还可用于细胞识别及肿瘤靶向等。与传统DNA标记量子点方法相比，本发明的制备方法简单，成本低，不需要昂贵的制备设施，一般化学实验室均可完成，可广泛应用于生物检测、细胞成像、靶向示踪及疾病诊断等领域。

Description

一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子点的方法

技术领域

本发明涉及纳米材料和生物医学分析化学技术领域，具体涉及一种一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子点的方法。

背景技术

量子点，又称半导体纳米晶体，是直径为1~10nm的零维纳米材料。量子点由于自身的量子效应，使其具有尺寸效应、表面效应、量子隧道效应和介电限域效应。正是由于其特殊的物理效应，使得量子点与常用的荧光染料相比，具有无可比拟的荧光性质：激发光谱宽且连续分布、稳定性好、发光效率高、抗光漂白能力强等。近年来，量子点由于其独特的光学性质，在分析化学、生物检测、细胞成像、活体示踪和临床诊断等方面的研究越来越多。

制备DNA功能化的量子点探针是量子点应用的前提和基础。目前，常用的DNA功能化的量子点的制备方法有：一、将DNA生物素化，然后与亲和素化的量子点通过生物素亲和素的特异性相互作用制备DNA功能化的量子点（E.Oh,et al,J.Am.Chem.Soc.2005,127,3270–3271）。但亲和素化的量子点的粒径较大，不利于某些荧光共振能量转移体系研究；由于蛋白的非特性吸附，也不利于生物应用；另外，该法成本较高。二、将氨基化的DNA与带有羧基的量子点通过共价偶联制备DNA功能化的量子点（S.P.Wang,et al,Nano Lett.2002,2,817–822）。该法得到的量子点发光效率严重下降。三、将巯基化的DNA与量子点通过硫与量子点中的金属元素强烈的键合作用制备DNA功能化的量子点(D.J.Zhou,et al,Chem.Commun.2005,38,4807–4809.)。该方法避免了上述缺点，但是其过程稍显复杂。已有文献报道，将硫代磷酸化的DNA在合成量子点的过程加入，可一步合成出DNA功能化的量子点(N.Ma,et al,Nat.Nanotechnol.2009,4,121–125)。但是，该法合成的量子点探针量子点产率较低（15%）、且毒性大、产物少，不利于生物医学应用。

发明内容

本实验室已成功合成出了一种高质量的低毒Zn掺杂CdTe量子点（专利申请号：201110070290.3），在此基础上，针对背景技术中所指出的现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子点的方法，该方法在合成Zn掺杂CdTe量子点的过程中加入硫代磷酸化的单链DNA，一步合成出了DNA功能化的Zn掺杂CdTe量子点，并能调控量子点上所连DNA的数量。所制得的量子点具有量子产率高、毒性小、产量大、稳定性好、具有靶向性等优点。

为了实现上述目的，本发明的一种一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子点CdTe:Zn²⁺的方法的步骤如下：

（1）制备HTe^-溶液：取NaBH₄或KBH₄与Te粉以2~5：1的摩尔比例在纯水中0~50°C下反应1~5h，得到NaHTe或KHTe溶液；

（2）制备含有CdCl₂、ZnCl₂、N-乙酰L-半胱氨酸（NAC）的混合前驱体水溶液4mL，用NaOH溶液调节混合前驱体水溶液的pH值为7~11，通氩气除氧后依次加入步骤（1）中制备的HTe^-溶液和40~150nmol DNA片段，混匀后转入反应釜，加热到160~200°C反应25~50min，得到DNA功能化的锌掺杂CdTe量子点溶液；

所述混合前驱体水溶液中的CdCl₂、ZnCl₂、N-乙酰L-半胱氨酸与所加入的HTe^—的摩尔比为1：(1~4)：（2~5）：（0.2~0.7），其中，所述混合前驱体水溶液中的CdCl₂浓度为0.001~0.0625mol/L；

所述混合前驱体水溶液中N-乙酰L-半胱氨酸的量需严格控制在其物质的量等于CdCl₂和ZnCl₂二者总物质的量；

所述DNA片段为人工合成，由发明人设计好以后交由上海生工生物工程技术服务有限公司（简称“上海生工”）合成，设计原则：6-12个硫代磷酸化的碱基+4-10个连接臂+靶向序列。

（3）将所得量子点溶液用超滤管离心纯化，用纯水洗涤3次后，得产物，置于4°C下保存。

本发明的优点和有益效果在于：

本发明是在CdTe:Zn²⁺量子点的合成过程中，将硫代磷酸化的DNA加入，首次用一步法制备出DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点，并且可以调控连在量子点上DNA的数量。这种量子点探针是一种双功能材料，既有优越的荧光性能又有生物靶向性。可用于检测DNA片段和蛋白，还可用于细胞识别，肿瘤靶向等领域。本发明首次将该量子点用于活体肿瘤靶向实验，并取得了满意的效果。与传统的DNA标记量子点方法相比，这种量子点探针的制备方法简单，成本较低，不需要昂贵的制备设施，在一般的化学实验室均可完成，可广泛推广应用于生物检测、细胞成像、靶向示踪及疾病诊断等领域。

附图说明

图1为实施例1制备得到的DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点与CdTe:Zn²⁺量子点（除不加DNA外制备方法均与实施例1相同）的紫外-可见吸收光谱图。由图可知本发明成功地将DNA与CdTe:Zn²⁺量子点进行共价偶联（260nm处有DNA的吸收峰）。

图2为实施例1制备得到的DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点与CdTe:Zn²⁺量子点（除不加DNA外制备方法均与实施例1相同）的荧光光谱图。从图中可知DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点的最大发射峰有所蓝移，表明量子点的表面缺陷由于连上DNA后变少，这也是与CdTe:Zn²⁺量子点相比，DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点量子产率提高的原因。

图1，2中的定性结果在四个实施例均可实现，实施例2-4不再附效果图。

图3为实施例2制备得到的DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点的紫外-可见吸收光谱图；

其中a~d是实施例2中得到的具有不同发射波长的DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点的紫外-可见吸收光谱图。

图4为实施例2制备得到的DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点的荧光光谱图；

其中a~d是实施例2中得到的具有不同发射波长的DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点的荧光光谱图。

图5是实施例2制备得到的DNA功能化的CdTe:Zn²⁺-DNA量子点（最终得到的浓缩的量子点溶液b）、CdTe:Zn²⁺量子点（除不加DNA外与实施例2的浓缩的量子点溶液b制备方法相同）和CdTe量子点（除不加ZnCl₂、NAC的摩尔用量改为0.025mmol及不加DNA外与实施例2的浓缩的量子点溶液b制备方法相同）三者的细胞毒性实验（MTT）图，从图中可知，相同量子点浓度下，CdTe:Zn²⁺-DNA量子点的细胞存活率最高，说明该毒性最小。

图6是实施例2中最终得到的浓缩的量子点溶液b的TEM图，从图中可知，该量子点的分散性好，粒径均一。

图7是实施例2中浓缩的量子点溶液b与CdTe量子点（除不加ZnCl₂、NAC的摩尔用量改为0.025mmol及不加DNA外与实施例2的浓缩的量子点溶液b制备方法相同）的荧光稳定性实验，150W氙灯照射1小时，实验结果可知前者的稳定性远远超过了后者。

图8是对实施例1所得到的量子点的靶向DNA序列是否可以与乙肝病毒（HBV）序列结合的验证性实验结果。CdTe:Zn²⁺-DNA量子点中加入SYBR green 1（插入到双链DNA中荧光显著增强，与单链DNA作用则无荧光）前后的荧光光谱图。(a)CdTe:Zn²⁺-DNA;(b)CdTe:Zn²⁺-DNA+SYBR green 1+HBV DNA;(c)CdTe:Zn²⁺-DNA+SYBR green 1+（b）中HBV DNA量的2倍;(d)SYBR green 1+（b）中HBV DNA量的2倍。从图中可知，连接在量子点表面的靶向序列是可以特异性的与其互补的HBV DNA序列通过碱基互补配对结合的，说明该DNA功能化的量子点的靶向序列是可用的。

图9是发明人首次用实施例2制得的浓缩的量子点溶液c进行的肿瘤靶向实验，CdTe:Zn²⁺-DNA量子点（左图）、CdTe:Zn²⁺量子点（右图，除不加DNA外与实施例2浓缩的量子点溶液c制备方法相同）分别注射到有上皮肿瘤的老鼠体内，只有CdTe:Zn²⁺-DNA量子点表现出明显的靶向作用，即肿瘤部位有强烈的荧光信号，而CdTe:Zn²⁺量子点则没有靶向作用，即肿瘤部位几乎没有荧光信号。该实验只有本发明合成的量子点比较适合做，因为本发明合成的量子点的粒径小，毒性小，而且还具有靶向作用。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明方法做进一步的详细说明，应理解，这些实施例仅是一些优选方案，权利要求书请求保护的范围并不局限于实施例。

实施例1

一种一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子点的方法，步骤如下：

1.将0.8mmol NaBH₄固体和0.2mmol Te粉放入5mL烧瓶中，加入1mL超纯水，于0°C下搅拌反应5h，得到NaHTe溶液，备用；

2.将0.025mmol CdCl₂、0.025mmol ZnCl₂和0.05mmol NAC置于10ml离心管中，加入4mL超纯水溶解，然后用1mol/L的NaOH溶液调节pH=8，通氩气1min除去水中的氧气，用注射器注入60微升的步骤1所得的NaHTe溶液，加入40nmol DNA片段，震荡混匀后转入水热反应釜中升温至200°C反应25min，得到DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点溶液；

所述的DNA片段由发明人设计后交由上海生工合成，序列为5′-AAT ACC ACA TCATCC ATA TAA AAA TCG GGC GGA-3′，3′末端9个碱基硫代磷酸化修饰；靶向序列为乙肝病毒片段的互补序列；

3.用截留分子量为30kD的超滤管纯化量子点溶液，离心力8000g，离心15min，并用纯水洗三遍，得到浓缩的量子点溶液，置于4°C下保存，使用时再将其稀释成所需浓度的水溶液。该浓缩的量子点溶液放置6个月后，量子点的荧光强度基本上没有变化。

实施例2

一种一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子点的方法，步骤如下：

1.将0.6mmol NaBH₄固体和0.3mmol Te粉放入5mL烧瓶中，加入1mL超纯水，于25°C下搅拌反应2h，得到NaHTe溶液，备用；

2.将0.025mmol CdCl₂、0.05mmol ZnCl₂和0.075mol NAC置于10ml离心管中，加入4mL超纯水溶解，用1mol/L的NaOH溶液调节pH=9，通氩气1min，用注射器注入50微升的步骤1所得NaHTe溶液，加入120nmol DNA片段，震荡混匀后转入水热反应釜中升温至180°C反应30min，得到DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点溶液a；

所述的DNA片段由发明人设计后交由上海生工合成，序列为5′-GAAGTGAAAATGACAGAACACAACAAAAA TCG GGC-3′，3′末端6个碱基硫代磷酸化修饰,靶向序列为识别上皮肿瘤细胞（A549细胞）表面的适配体；

其余条件都相同，仅反应时间改为35min，则得到量子点溶液b；

其余条件都相同，仅反应时间改为40min，则得到量子点溶液c；

其余条件都相同，仅反应时间改为45min，则得到量子点溶液d。

3.用截留分子量为30kD的超滤管纯化量子点溶液，离心力8000g，离心15min，并用纯水洗三遍，得到浓缩的量子点溶液a-d，置于4°C下保存，使用时再将其稀释成所需浓度的水溶液。所得浓缩的量子点溶液a-d放置6个月后，量子点的荧光强度基本上没有变化。

由实施例1知，该DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点的靶向序列是完整可用的，并将b溶液所得产物用于活体成像靶向肿瘤部位。

实施例3

一种一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子点的方法，步骤如下：

1.将1mmol KBH₄固体和0.2mmol Te粉放入5mL烧瓶中，加入1mL超纯水，于35°C下搅拌反应1.5h，得到KHTe溶液，备用；

2.将0.025mmol CdCl₂、0.075mmol ZnCl₂和0.1mmol NAC置于10ml离心管中，加入4mL超纯水溶解，用1mol/L的NaOH溶液调节pH=10，通氩气1min，用注射器注入30微升的步骤1所得KHTe溶液，加入80nmol DNA片段，震荡混匀后转入水热反应釜中升温至160°C反应35min，得到DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点溶液；

所述的DNA片段由发明人设计后交由上海生工合成，序列为5′-GGTTGGTGTGGTTGGAAAAAAAATCG GGCGG-3′，3′末端8个碱基硫代磷酸化修饰；靶向序列为凝血酶的适配体；

3.用截留分子量为30kD的超滤管纯化量子点溶液，离心力8000g，离心15min，并用纯水洗三遍，得到浓缩的量子点溶液，置于4°C下保存，使用时再将其稀释成所需浓度的水溶液。

该浓缩的量子点溶液放置6个月后，量子点的荧光强度基本上没有变化。

由实施例1知，该DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点的靶向序列是完整可用的，预测其可以用于凝血酶的识别和检测。

实施例4

一种一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子点的方法，步骤如下：

1.将2mmol NaBH₄固体和0.6mmol Te粉放入5mL烧瓶中，加入1mL超纯水，于50°C下搅拌反应1h，得到NaHTe溶液，备用；

2.将0.025mmol CdCl₂，0.1mmol ZnCl₂和0.125mmol NAC置于10ml离心管中，加入4mL超纯水溶解，然后用1mol/L的NaOH溶液调节pH=11，通氩气1min，用注射器注入15微升的步骤1所得的NaHTe溶液，加入150nmol DNA片段，震荡混匀后转入水热反应釜中升温至200°C反应25min，得到DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点溶液；

所述的DNA片段由发明人设计后交由上海生工合成，序列为5′-CTT ACG GTG GGGTTAAAAT GGCGGATGCAC-3′，3′末端12个碱基硫代磷酸化修饰；靶向序列为朊病毒的适配体；

由实施例1知，该DNA功能化的CdTe:Zn²⁺量子点的靶向序列是完整可用的，预测其可以用于朊病毒的识别和检测。

对实施例1-4制备得到的产品（实施例2是对量子点溶液a最后得到的产品进行检测）的光学特性进行检测（量子产率用相对法测定，以量子产率为95%的罗丹明6G为参照），结果见表1。

表1

对实施例2制得的浓缩的量子点溶液（a-d）的光学特性进行检测（DNA的数目是由CdTe:Zn²⁺-DNA量子点与CdTe:Zn²⁺量子点（除不加DNA外与实施例2的浓缩的量子点溶液a-d制备方法相同）的紫外吸收值，根据朗伯比尔定律计算得到），结果见表2。

表2

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子化的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(33)

<400> 1

AAT ACC ACA TCA TCC ATA TAA AAA TCG GGC GGA

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(35)

<400> 2

GAAGTGAAAATGACAGAACACAACA AA AA TCG GGC

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(31)

<400> 3

GGTTGGTGTGGTTGGA AA AAA AATCG GGCGG

210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(30)

<400> 4

CTT ACG GTG GGG TTA AAA TGG CGG ATG CAC

Claims

1.一种一步合成DNA功能化Zn掺杂CdTe量子点CdTe: Zn²⁺的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）制备HTe^-溶液：取NaBH₄或KBH₄与Te粉以2~5：1的摩尔比例在纯水中0~50oC下反应1~5h，得到NaHTe或KHTe溶液；

（2）制备含有CdCl₂、ZnCl₂、N-乙酰L-半胱氨酸的混合前驱体水溶液4mL，调节混合前驱体水溶液的pH值为7~11，通氩气除氧后依次加入步骤（1）中制备的HTe^-溶液和40~150nmol DNA片段，混匀后转入反应釜，加热到160~200oC反应25~50min，得到DNA功能化的锌掺杂CdTe量子点溶液；

所述混合前驱体水溶液中CdCl₂、ZnCl₂、N-乙酰L-半胱氨酸与所加入的HTe^—的摩尔比为1：(1 ~ 4)：（2 ~5）：（0.2 ~ 0.7），其中，所述混合前驱体水溶液中CdCl₂浓度为0.001 ~ 0.0625mol/L；

所述混合前驱体水溶液中N-乙酰L-半胱氨酸的量控制在其物质的量等于CdCl₂和ZnCl₂二者总物质的量；

所述DNA片段的设计原则：6-12个硫代磷酸化的碱基 + 4-10个连接臂 + 靶向序列；

（3）将步骤（2）所得量子点溶液用超滤管离心纯化，用纯水洗涤3次后，得产物，置于4oC下保存。