CN110567928B - 一种基于量子点荧光纳米球的多元检测方法 - Google Patents

一种基于量子点荧光纳米球的多元检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于量子点荧光纳米球的多元检测方法，包含步骤：将不同发射波长的量子点分别包进聚合物制备量子点荧光纳米球；利用所述量子点荧光纳米球作荧光报告分子来标记检测目标物，提供定量检测信号；在聚苯乙烯板上包被所述检测目标物对应的捕获分子；形成三明治夹心结构，结合荧光免疫吸附检测技术来进行多元定量检测。本发明解决了传统的有机荧光染料稳定性差，抗荧光漂白能力差，发射光谱拖尾的现象，同时从空间上分开不同的量子点，有效避免多色发光材料之间普遍存在的荧光共振能量转移效应，结合荧光免疫吸附检测技术进行蛋白、核酸的多元定量检测，在生物多元检测技术中有着非常重要的意义和广泛的应用前景。

Description

一种基于量子点荧光纳米球的多元检测方法
技术领域
本发明涉及微纳米材料制备与应用技术领域，尤其涉及一种基于量子点荧光纳米球的多元检测方法。
背景技术
目前关于探针设计的研究主要集中于检测单个分析物，但许多生物学问题与多种因素的相互作用有关，特别是在医学诊断领域，单元检测可能导致假阳性结果，因此需要进行多元检测来确保诊断的正确性。多元检测的一个关键问题是，可以在一次运行中获得几种独特的信号。电信号，光信号，质谱，或粒子的尺寸都可用作区分信号，以进行多变量检测。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前最常用的检测肿瘤标志物的方法，其操作简单，但一个孔中只能检测一种分析物。ELISA是通过酶与底物的显色反应来检测分析物。如果将荧光报告分子与抗体结合，免疫分析也可以通过测量荧光强度来进行，这被称为荧光连接免疫吸附试验(FLISA)。最初使用有机染料如荧光素类、罗丹明类(RBITC)和Cy系列菁染料(Cy3，Cy5或Cy7)等做荧光报告分子，由于其光漂白性，低量子效率和光谱拖尾等特点，不利于多元检测。
随着纳米粒子的发展，量子点(QDs)作为新型荧光报告分子越来越多地被用于生物检测。量子点是特征尺寸通常在1-10nm范围内并具有光致发光特性的半导体。与传统的有机荧光团相比，量子点表现出高量子效率和强的光稳定性。此外，量子点的发射光谱较窄且可以通过控制粒子尺寸来调整，因此降低了发射串扰的影响；吸收光谱较宽又提供了用同一波长的光激发不同波长的量子点发光从而实现多元检测的可能。但是在测定过程中如果将不同量子点直接混合，供体和受体之间的空间距离在10-100埃之内，并且供体的发射光谱和受体的吸收光谱存在有效重叠时，可能会发生荧光共振能量转移(FRET)现象，这将影响多元检测的准确性。
根据
Figure BDA0002223414920000013
理论，
Figure BDA0002223414920000011
(其中E是能量转移效率，R0是与重叠积分J相关的
Figure BDA0002223414920000012
距离，R是供体和受体之间的距离)。因此，通过降低R0或增加R可以降低能量转移效率。通过采用SPG膜乳化-乳液溶剂挥发法将量子点包进聚合物中形成量子点荧光纳米球，从空间上分开不同的量子点，来避免荧光共振能量转移效应。同时聚合物还起到保护层的作用，既减小了外界环境对量子点的影响，也可防止重金属离子泄漏。目前还没有将量子点荧光纳米球直接结合荧光免疫吸附技术进行多元检测的应用报道。
本领域的技术人员致力于开发一种基于量子点荧光纳米球的多元检测方法，分别将具有不同发射波长的量子点掺入聚合物纳米球，解决了传统的有机荧光染料稳定性差，抗荧光漂白能力差，发射光谱拖尾的现象，同时从空间上分开不同的量子点，有效避免多色发光材料之间普遍存在的荧光共振能量转移效应。利用制备的量子点荧光纳米球标记检测蛋白或核酸分子，结合荧光免疫吸附检测技术进行蛋白、核酸的多元定量检测，在生物多元检测技术中有着非常重要的意义和广泛的应用前景。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何解决传统的有机荧光染料稳定性差，抗荧光漂白能力差，发射光谱拖尾的现象，有效避免多色发光材料之间普遍存在的荧光共振能量转移效应。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于量子点荧光纳米球的多元检测方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：
步骤1、将不同发射波长的量子点分别包进聚合物制备量子点荧光纳米球；
步骤2、利用所述量子点荧光纳米球作荧光报告分子来标记检测目标物，提供定量检测信号；
步骤3、在聚苯乙烯板上包被所述检测目标物对应的捕获分子；
步骤4、形成三明治夹心结构，结合荧光免疫吸附检测技术来进行多元定量检测。
进一步地，所述量子点荧光纳米球由所述量子点和聚合物组成，粒径为100nm～1000nm，变异系数CV＜9％，所述量子点在所述荧光纳米球内分布均匀。
进一步地，所述步骤1中的所述量子点选自CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、ZnTe、ZnO、HgSe、HgS、HgTe、CaAs、PbSe、InP、InCaAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/Cd(OH)2、CdTe/ZnS、CdTe/CdS、CdSe/ZnSe、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CuSe、CdSeTe、CdSeTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CdS:Mn、ZnS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb和ZnS:Tb中的一种或多种。
进一步地，所述步骤1中的所述聚合物选自聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙酯、苯乙烯丙烯酸共聚物、聚苯乙烯甲基丙烯酸共聚物和马来酸酐-1-十八烯共聚物中的一种或多种。
进一步地，所述步骤1中的所述制备量子点荧光纳米球方法为SPG膜乳化-乳液溶剂挥发法、溶胀法和微流控法中的一种。
进一步地，所述步骤2还包括将所述量子点荧光纳米球直接与所述检测目标物相连，或将所述量子点荧光纳米球通过链霉亲和素与生物素化的所述检测目标物相连。
进一步地，所述步骤3中的所述包被所述检测目标物对应的捕获分子包括在所述聚苯乙烯板上包被一种或同时包被多种所述检测目标物对应的捕获分子。
进一步地，所述步骤4中的所述多元定量检测为用同一波长激发不同发射波长的所述量子点荧光纳米球来测量相应的荧光强度，从而定量检测与之对应的所述检测目标物的浓度。
进一步地，所述步骤4中的所述多元定量检测为定量检测一种或同时定量检测多种所述检测目标物。
进一步地，所述检测目标物包括蛋白、核酸分子中的一种或多种。
本发明的有益效果在于，提供一种利用量子点荧光纳米球来进行多元检测的方法。分别将具有不同发射波长的量子点掺入聚合物纳米球，解决了传统的有机荧光染料稳定性差，抗荧光漂白能力差，发射光谱拖尾的现象，同时从空间上分开不同的量子点，有效避免多色发光材料之间普遍存在的荧光共振能量转移效应。利用制备的量子点荧光纳米球标记检测蛋白或核酸分子，结合荧光免疫吸附检测技术进行蛋白、核酸的多元定量检测。在生物多元检测技术中有着非常重要的意义和广泛的应用前景。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明一个较佳实施例中得到的量子点荧光纳米球的SEM图片；
图2是本发明一个较佳实施例中得到的量子点荧光纳米球的TEM图片；
图3a是本发明较佳实施例中得到的量子点及量子点荧光纳米球混合前的荧光谱图；
图3b是本发明较佳实施例中得到的量子点及量子点荧光纳米球混合后的荧光谱图；
图4是本发明较佳实施例中得到的基于量子点荧光纳米球标记检测抗体的总体示意图；
图5是本发明一个较佳实施例中得到的基于量子点荧光纳米球结合荧光免疫吸附检测平台检测肿瘤标志物SCCA/CYFRA21-1/CEA的标准曲线；
图6是本发明一个较佳实施例中得到的基于量子点荧光纳米球结合荧光免疫吸附检测平台检测肿瘤标志物SCCA/CYFRA21-1/CEA的总体示意图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1：
本实施例所制备的量子点荧光纳米球是CdSe/ZnS荧光纳米球，其中量子点为发射波长为525nm的CdSe/ZnS量子点，聚合物为苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)，制备方法为SPG膜乳化-乳液溶剂挥发法，具体制备步骤为：
将50mg发射波长为525nm的CdSe/ZnS量子点和1g的苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)溶于48mL甲苯中，形成分散相；
将8g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶于1600mL的超纯水中，配成质量分数为0.5wt％的SDS溶液作为连续相；
调节氮气压力，使得分散相在120kPa的压力作用下通过孔径为0.3μm的SPG膜分散到连续相中，形成微乳液；
搅拌24小时后，使甲苯挥发，液滴固化成球，通过洗涤和离心收集纳米球并冻干储存；
将一定量的纳米球溶解在0.1mol/L HCL溶液中水解以使表面羧化；
通过洗涤和离心收集羧化的发射波长为525nm纳米球，然后溶解在洗涤缓冲液中以制备成悬浮液。
得到的量子点荧光纳米球的扫描电子显微镜(SEM)图片、透射电子显微镜(TEM)图片分别如图1和图2所示。
实施例2：
本实施例所制备的量子点荧光纳米球是CdSe/ZnS荧光纳米球，其中量子点为发射波长为570nm的CdSe/ZnS量子点，聚合物为苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)，制备方法为SPG膜乳化-乳液溶剂挥发法，具体制备步骤为：
将50mg发射波长为570nm的CdSe/ZnS量子点和1g的苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)溶于48mL甲苯中，形成分散相；
将8g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶于1600mL的超纯水中，配成质量分数为0.5wt％的SDS溶液作为连续相；
调节氮气压力，使得分散相在120kPa的压力作用下通过孔径为0.3μm的SPG膜分散到连续相中，形成微乳液；
搅拌24小时后，使甲苯挥发，液滴固化成球，通过洗涤和离心收集纳米球并冻干储存；
将一定量的纳米球溶解在0.1mol/L HCL溶液中水解以使表面羧化；
通过洗涤和离心收集羧化的发射波长为570nm纳米球，然后溶解在洗涤缓冲液中以制备成悬浮液。
实施例3：
本实施例所制备的量子点荧光纳米球是CdSe/ZnS荧光纳米球，其中量子点为发射波长为620nm的CdSe/ZnS量子点，聚合物为苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)，制备方法为SPG膜乳化-乳液溶剂挥发法，具体制备步骤为：
将50mg发射波长为620nm的CdSe/ZnS量子点和1g的苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)溶于48mL甲苯中，形成分散相；
将8g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶于1600mL的超纯水中，配成质量分数为0.5wt％的SDS溶液作为连续相；
调节氮气压力，使得分散相在120kPa的压力作用下通过孔径为0.3μm的SPG膜分散到连续相中，形成微乳液；
搅拌24小时后，使甲苯挥发，液滴固化成球，通过洗涤和离心收集纳米球并冻干储存；
将一定量的纳米球溶解在0.1mol/L HCL溶液中水解以使表面羧化；
通过洗涤和离心收集羧化的发射波长为620nm纳米球，然后溶解在洗涤缓冲液中以制备成悬浮液。
实施例1-3中得到的量子点及量子点荧光纳米球混合前后的荧光谱图分别如图3a和图3b所示。
实施例4：
本实施例是用实施例1中制备的发射波长为525nm的荧光纳米球标记鳞状细胞癌抗原SCCA检测抗体。具体步骤为：
如图4所示，吸取实施例1中制备的发射波长为525nm的荧光纳米球1悬浮液至1.5mL离心管中，用微球洗涤液(Washing buffer)洗涤后，加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES Buffer)进行超声和振荡使微球充分分散。然后，分别快速加入新鲜配制的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)溶液，在室温环境中避光孵育20min以活化纳米球表面的羧基，使其形成N-羟基琥珀酰亚胺酯。孵育后，用MES Buffer洗涤样品以除去未反应的EDC和S-NHS，然后将活化后的纳米球经超声和振荡充分分散悬浮于MES Buffer内。随后，加入链霉亲和素2(SA)，于室温环境中振荡避光孵育30min，之后放10℃摇床振荡孵育12h，从而使SA与量子点荧光纳米球相连。孵育后，用Washing buffer洗涤以除去未偶联的SA，加入分析液(Assay buffer)避光反应30min以封闭微球表面的活性酯基，离心后再加入Assay buffer振荡分散均匀，同时将一定量生物素化的SCCA检测抗体3加入发射波长为525nm的量子点荧光纳米球溶液中，于室温环境中避光孵育2h，之后用Washing buffer洗涤后重悬于Assay buffer中并确定浓度。
实施例5：
本实施例是用实施例2中制备的发射波长为570nm的荧光纳米球标记细胞角蛋白19CYFRA21-1检测抗体。具体步骤为：
如图4所示，吸取实施例2中制备的发射波长为570nm的荧光纳米球1悬浮液至1.5mL离心管中，用微球洗涤液(Washing buffer)洗涤后，加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES Buffer)进行超声和振荡使微球充分分散。然后，分别快速加入新鲜配制的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)溶液，在室温环境中避光孵育20min以活化纳米球表面的羧基，使其形成N-羟基琥珀酰亚胺酯。孵育后，用MES Buffer洗涤样品以除去未反应的EDC和S-NHS，然后将活化后的纳米球经超声和振荡充分分散悬浮于MES Buffer内。随后，加入链霉亲和素2(SA)，于室温环境中振荡避光孵育30min，之后放10℃摇床振荡孵育12h，从而使SA与量子点荧光纳米球相连。孵育后，用Washing buffer洗涤以除去未偶联的SA，加入分析液(Assay buffer)避光反应30min以封闭微球表面的活性酯基，离心后再加入Assay buffer振荡分散均匀，同时将一定量生物素化的CYFRA21-1检测抗体3加入发射波长为570nm的量子点荧光纳米球溶液中，于室温环境中避光孵育2h，之后用Washing buffer洗涤后重悬于Assay buffer中并确定浓度。
实施例6：
本实施例是用实施例3中制备的发射波长为620nm的荧光纳米球标记癌胚抗原CEA检测抗体。具体步骤为：
如图4所示，吸取实施例3中制备的发射波长为620nm的荧光纳米球1悬浮液至1.5mL离心管中，用微球洗涤液(Washing buffer)洗涤后，加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES Buffer)进行超声和振荡使微球充分分散。然后，分别快速加入新鲜配制的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)溶液，在室温环境中避光孵育20min以活化纳米球表面的羧基，使其形成N-羟基琥珀酰亚胺酯。孵育后，用MES Buffer洗涤样品以除去未反应的EDC和S-NHS，然后将活化后的纳米球经超声和振荡充分分散悬浮于MES Buffer内。随后，加入链霉亲和素2(SA)，于室温环境中振荡避光孵育30min，之后放10℃摇床振荡孵育12h，从而使SA与量子点荧光纳米球相连。孵育后，用Washing buffer洗涤以除去未偶联的SA，加入分析液(Assay buffer)避光反应30min以封闭微球表面的活性酯基，离心后再加入Assay buffer振荡分散均匀，同时将一定量生物素化的CEA检测抗体3加入发射波长为620nm的量子点荧光纳米球溶液中，于室温环境中避光孵育2h，之后用Washing buffer洗涤后重悬于Assay buffer中并确定浓度。
实施例7：
本实施例是将实施例4-6中制备的525nm的荧光纳米球标记SCCA检测抗体，570nm的荧光纳米球标记CYFRA21-1检测抗体和620nm的荧光纳米球标记CEA检测抗体混合，结合荧光免疫吸附检测平台，实现同时对SCCA，CYFRA21-1和CEA的三种肺癌标志物的定量检测。其标准曲线如图5所示。具体步骤为：
如图6所示，在黑色96孔板4中加入SCCA/CYFRA21-1/CEA包被抗体5(Coating Ab)溶液，放在4℃冰箱孵育15h，用Washing buffer洗板后往每孔中分别加入牛血清白蛋白(BSA)溶液进行封闭，于37℃环境下孵育2h；洗板后再往每孔中分别加入具有一系列浓度梯度的SCCA，CYFRA21-1和CEA抗原6溶液，于37℃环境下孵育1h；洗板后再向每孔加入实施例4-6中制备的525nm的荧光纳米球标记SCCA检测抗体，570nm的荧光纳米球标记CYFRA21-1检测抗体和620nm的荧光纳米球标记CEA检测抗体7混合液，于37℃环境下孵育1h；用Washingbuffer洗涤除去未反应的量子点荧光纳米球标记的抗体，将黑色96孔板4送至多功能酶标仪内测量相应激发波长下的荧光值，得到SCCA/CYFRA21-1/CEA的含量。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种基于量子点荧光纳米球的多元检测方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：
步骤1、将不同发射波长的量子点分别包进聚合物制备量子点荧光纳米球；所述量子点荧光纳米球由所述量子点和所述聚合物组成，粒径为100nm～1000nm，变异系数CV＜9％，所述量子点在所述量子点荧光纳米球内分布均匀；所述量子点选自CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、ZnTe、ZnO、HgSe、HgS、HgTe、CaAs、PbSe、InP、InCaAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/Cd(OH)2、CdTe/ZnS、CdTe/CdS、CdSe/ZnSe、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CuSe、CdSeTe、CdSeTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CdS:Mn、ZnS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb和ZnS:Tb中的一种或多种；所述聚合物选自聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙酯、苯乙烯丙烯酸共聚物、聚苯乙烯甲基丙烯酸共聚物和马来酸酐-1-十八烯共聚物中的一种或多种；
步骤2、将所述量子点荧光纳米球直接与检测目标物相连，或将所述量子点荧光纳米球通过链霉亲和素与生物素化的所述检测目标物相连；利用所述量子点荧光纳米球作荧光报告分子来标记所述检测目标物，提供定量检测信号；
步骤3、在聚苯乙烯板上包被所述检测目标物对应的捕获分子；
步骤4、形成三明治夹心结构，结合荧光免疫吸附检测技术来进行多元定量检测；所述多元定量检测为用同一波长激发不同发射波长的所述量子点荧光纳米球来测量相应的荧光强度，从而定量检测与之对应的所述检测目标物的浓度。
2.如权利要求1所述的基于量子点荧光纳米球的多元检测方法，其特征在于，所述步骤1中的所述制备量子点荧光纳米球方法为SPG膜乳化-乳液溶剂挥发法、溶胀法和微流控法中的一种。
3.如权利要求1所述的基于量子点荧光纳米球的多元检测方法，其特征在于，所述步骤3中的所述包被所述检测目标物对应的捕获分子包括在所述聚苯乙烯板上包被一种或同时包被多种所述检测目标物对应的捕获分子。
4.如权利要求1所述的基于量子点荧光纳米球的多元检测方法，其特征在于，所述步骤4中的所述多元定量检测为定量检测一种或同时定量检测多种所述检测目标物。
5.如权利要求1至4中任一项权利要求所述的基于量子点荧光纳米球的多元检测方法，其特征在于，所述检测目标物包括蛋白、核酸分子中的一种或多种。
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