CN115807059B

CN115807059B - 基于聚集诱导发光材料的核酸定量检测方法

Info

Publication number: CN115807059B
Application number: CN202211586212.3A
Authority: CN
Inventors: 汤健; 安源
Original assignee: Suzhou Yuce Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Yuce Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-10
Filing date: 2022-12-10
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2042-12-10
Also published as: CN115807059A

Abstract

本发明涉及一种基于聚集诱导发光材料的核酸定量检测方法以及包含原位信号增强粒子和磁珠(或载玻片)的用于核酸检测的试剂盒，可用于核酸的单分子级别的定量检测。本申请的检测方法通过普通荧光显微镜即可实现，成本低，并且检测灵敏度高，检测效率高。

Description

基于聚集诱导发光材料的核酸定量检测方法

技术领域

本发明属于核酸定量检测领域，具体涉及基于聚集诱导发光材料的核酸定量检测方法及相关试剂盒、应用。

背景技术

单分子检测(SMD)是以单个分子的分析为基础构建的一种方法，到目前为止，它已经在生命科学的研究中备受关注。近几年来，该方法被应用于细胞成像、蛋白质相互作用的研究以及核酸等的定量检测中。在上述提及的应用中，定量检测是以对目标物分子的一个接一个的计数来实现的，这种定量检测手段代表了检测的最终极限。传统的平均测定方法如层析、化学发光等是以信号强度和目标物浓度之间的关系来定量的。信号强度越高，被测定目标物的浓度越高。与平均测定方法所不同的是，在SMD定量方法中，对可以产生信号的分子进行计数，更具有可视性和数字性，保证了较高的重现性。由于SMD定量检测方法具有平均测定所无法比拟的优点，目前，已经有工作将SMD应用到核酸的定量分析之中(参见专利文献1～4)。

具体而言，专利文献1为本申请发明人的在先申请，涉及利用具有特定粒径的原位信号增强粒子对待测分子进行标记，使得单分子信号能够被光学成像设备捕获和识别，实现待测分子的超高灵敏度定量检测。其说明书中，对于原位信号增强粒子，提及了包含有发光材料和纳米粒子载体这两部分，对于发光材料，提及了荧光染料分子、稀土元素、稀土螯合物、荧光蛋白、量子点、上转换纳米粒子等，并教导优选为荧光素类(如异硫氰酸荧光素)、罗丹明类(如罗丹明绿、罗丹明B等)、香豆素类、量子点类(CdS、CdSe、CdTe、ZnSe)、稀土元素(如Eu、Ce)及其配合物等，未提及聚集诱导发光材料，另外，该文献关注的是原位信号增强粒子的粒径。

专利文献2为彩科(苏州)生物科技有限公司提出的申请，其涉及一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法，所述使用方法包括下述步骤：(1)将含有目标核酸分子的样品、表面标记有捕获分子的编码微球、检测分子和杂交缓冲液混合，得到复合微球和/或未与目标分子结合的微球；(2)将所述复合微球和/或未与目标分子结合的微球导入微孔板芯片中反应，而后施加外界刺激检测编码信号并分析，得到目标分子的检测结果。其原理与美国Quanterix公司的数字PCR技术类似，基于精密微孔板的微孔来实现对单个分子的分离及检测，同样未提及聚集诱导发光材料。

专利文献3为南方科技大学提出的申请，涉及一种免扩增的核酸检测方法及其应用，包括以下步骤：S1：用捕获探针捕获待检核酸，形成捕获探针-待检核酸复合物；S2：将所述捕获探针-待检核酸复合物与CRISPR反应体系混合形成反应液，将所述反应液通入微流控芯片的微孔中进行反应；所述CRISPR反应体系包括Cas蛋白、CRISPR RNA和报告探针；所述微流控芯片的微孔的体积为30～100fL；S3：对步骤S2中所述报告探针产生的荧光进行显微观察，以确定核酸检测结果。其需要使用高度精密的微流控芯片和复杂的CRISPR反应体系，成本较高，另外，未提及聚集诱导发光材料。

专利文献4为中山大学提出的申请，涉及一种基于半导体聚合物纳米材料的生物分子检测方法，包括以下步骤：(1)将修饰有第一标记分子的磁珠固定于检测容器(微流控芯片)中，加入待测样品，洗涤；(2)加入修饰有第二标记分子的半导体聚合物纳米材料，洗涤；(3)根据荧光信号的数量，对待测样品进行定性或定量；所述第一标记分子和第二标记分子均靶向待测样品。其也需要使用高度精密的微流控芯片和合成复杂度较高的半导体聚合物纳米材料，成本较高，另外，未提及聚集诱导发光材料。

自2001年唐本忠院士发现聚集诱导发光材料以来，该类材料由于克服了聚集淬灭效应而获得了广泛关注，被用于离子检测、机械响应、蛋白质检测、光电材料等，最近也被尝试用于层析快速检测中(参见专利文献5)。

具体而言，专利文献5为上海市皮肤病医院提出的申请，涉及一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统及方法，所述方法包括：步骤1，一定体积的样本滴加到层析反应系统上，层析反应后，在光学成像系统上获取层析反应系统的反应膜上检测区域的显微图像，通过图像处理系统对检测区的示踪纳米颗粒进行计数；步骤2，通过校准品浓度与示踪纳米颗粒数量间的拟合关系曲线，计算得到样本中待测分析物的浓度。其在实施例中使用基于量子点纳米球的快速免疫层析试纸条对HIV p24(属于一种抗原)进行检测，虽然在从属权利要求和说明书中作为荧光纳米颗粒泛泛提及了聚集诱导荧光，但并未提及将聚集诱导荧光材料与多孔材料联合使用而制成多孔原位信号增强粒子，也未实际对核酸进行定量检测。

现有技术文献

专利文献1：CN111771126A；

专利文献2：CN111218498A；

专利文献3：CN114540547A；

专利文献4：CN114034856A；

专利文献5：CN112014369A

发明内容

发明所要解决的课题

专利文献1开创性地提出了基于粒径的核酸定量检测策略，使用的发光材料为荧光素、量子点、荧光蛋白，获得了较高的检测灵敏度，但仍存在进一步提高的余地，另外，为了应对临床需要，在检测效率方面也要求进一步的改善。

聚集诱导发光材料因其溶液态不发光而聚集后荧光增强的独特性质，近来年被尝试应用于多种领域，但仅就聚集态(固态)的荧光量子产率而言，其并不优于荧光素、量子点，基本是劣于已商业化的荧光素等，这一性质限制了其在商业上的利用。

鉴于上述现有技术的状况，本申请的目的在于提供一种兼具优异的检测灵敏度和较高的检测效率的核酸定量检测方法。

用于解决课题的手段

申请人最初将聚集诱导发光材料如四苯基乙烯应用于以计数为特征的核酸定量检测时，考虑到聚集诱导发光材料越聚集越发光的性质，尝试以专利文献1那样将发光材料整体包覆在纳米粒子载体中的方式制造原位信号增强粒子(聚集发光材料聚集在一起)，发现检测下限高于使用常用的荧光素、量子点的情况，也即，检测灵敏度未达到足够理想的程度。申请人又尝试制备多孔结构的包含聚集诱导发光材料和多孔载体的原位信号增强粒子，并将其用于核酸定量检测中，结果惊讶地发现检测灵敏度明显提高，而且能够以更短的孵育时间(检测效率)实现检测。也即，与一般认识不同地，本申请发明人意外地发现通过聚集诱导发光材料与多孔结构这两个手段的组合使用，在核酸定量检测中获得了非常优异的效果。需要说明，虽然专利文献1在说明书部分泛泛提及了多孔载体，但完全没有意识到将聚集诱导发光材料和多孔载体制备成多孔原位信号增强材料，更未意识到由此带来的优异效果。

本申请的一个技术方案如下。

一种基于聚集诱导发光材料的核酸定量检测方法，其包括以下步骤：

(1)将能够与靶标分子结合的捕获探针固定到磁珠或载玻片上，之后加入待测样品，使捕获探针与待测样品中的靶标分子的第一序列互补，将待测样品中的靶标分子捕获；

(2)加入能够与靶标分子的第二序列互补的检测探针，形成捕获探针-靶标分子-检测探针的三链杂交结构，然后加入能够直接或间接与检测探针结合的原位信号增强粒子；或者先将检测探针与原位信号增强粒子结合而形成复合材料，再将该复合材料加入；

其中，上述原位信号增强粒子为多孔结构，含有聚集诱导发光材料和多孔载体；

(3)用光学成像设备将上述原位信号增强粒子发出的光学信号成像；

(4)对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中靶标分子的浓度。

本申请的技术方案中，不使用微流控芯片，也不使用全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备，也不使用体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔，也不需要将核酸扩增，检测成本较低。

另一个技术方案如下。

一种基于聚集诱导发光材料的核酸定量检测方法，其包括下述步骤：

(1)使检测探针与待测样品中的靶标分子的第二序列互补，然后加入能够直接或间接与检测探针结合的原位信号增强粒子；或者预先使原位信号增强粒子与检测探针结合而形成复合材料，然后使该复合材料与待测样品中的靶标分子的第二序列互补；

(2)将能够与靶标分子结合的捕获探针固定到磁珠或载玻片上，之后加入至步骤(1)的体系中，使上述捕获探针与上述靶标分子的第一序列互补，将靶标分子捕获；

(3)用光学成像设备将从上述原位信号增强粒子发出的光学信号成像；

优选地，上述两个技术方案中，上述原位信号增强粒子的比表面积为50～600cm²/g，优选为100～400cm²/g，更优选为200～300cm²/g。本申请的发明人发现原位信号增强粒子的比表面积在上述范围内时能够获得较优异的检测灵敏度。

优选地，在上述原位信号增强粒子中，上述聚集诱导发光材料进入多孔载体的孔隙内，上述多孔载体为多孔二氧化硅、多孔聚苯乙烯、多孔聚丙烯酸酯或多孔聚丙烯酰胺。

优选地，上述聚集诱导发光材料选自可被取代的1，1，2，3，4，5-六苯基噻咯、可被取代的四苯基乙烯、可被取代的9，1-二苯基乙烯基蒽、可被取代的三苯胺、氰基取代的二芳基乙烯衍生物中的一种或多种。

优选地，上述取代四苯基乙烯为四个苯基的4号位均被C1～C6烷氧基取代的四苯基乙烯，尤其优选被C2～C4烷氧基取代。

上述靶标分子分子为DNA或RNA，可以为microRNA、长链非编码RNA、环状RNA、mRNA、肿瘤循环DNA、循环胎儿DNA等。

本申请还涉及包含原位信号增强粒子和磁珠(或载玻片)的用于核酸检测的试剂盒，上述原位信号增强粒子为多孔结构，含有聚集诱导发光材料和多孔载体。其中，原位信号增强粒子的比表面积可以为50～600cm²/g，优选为100～400cm²/g，更优选为200～300cm²/g。

比表面积是指单位质量物料所具有的总面积，单位是m²/g或cm²/g。对于多孔材料而言，通常利用气体吸附的方法来确定材料的比表面积。根据采用的模型假设不同，可以用来计算材料的比表面积的方法主要有：Langmuir法、BET法、B点法、经验作图法、BJH法、DR法和NLDFT法等。其中，Langmuir法和BET法是主要的方法，本申请中采用BET法来测定原位信号增强粒子的比表面积，故本申请中所述的比表面积也可以称为BET比表面积。

本申请的效果

根据本发明，能够提供一种兼具优异的检测灵敏度和较高的检测效率的核酸定量检测方法。

附图说明

图1示出包含4-C3O-TPE和多孔聚苯乙烯载体的多孔原位信号增强粒子的扫描电子显微镜(SEM)图像。

图2示出包含4-C3O-TPE和多孔二氧化硅载体的多孔原位信号增强粒子的扫描电子显微镜图像。

图3示出实施例1中得到的标准曲线(纵坐标即CPN(copy number)为单分子信号数)。

图4示出实施例2中得到的标准曲线。

具体实施方式

<第一实施方式>

本申请的第一实施方式为基于聚集诱导发光材料的核酸定量检测方法，其包括以下步骤：

聚集诱导发光(aggregation-induced emission，AIE)是指在溶液中不发光或者发光微弱的分子聚集后发光逐渐增强的现象，聚集诱导发光材料即为能够产生这一现象的发光材料。近些年来，已被关注的AIE材料主要有以下的化学结构式所示的几类。

其中，X选自由O、S、Se和Te组成的组中，优选为O或S。

其中，各R、R’、R”、R”’和R””独立地选自由H、F、Cl、Br、C1～C6烷基、C2～C6烯基、C3～C6环烷基、C6～C12芳基、羟基、羧基、氨基、磺酸基、C1～C6烷硫基、和C1～C6烷氧基组成的组中。

其中，n为0～3的整数，优选为0或1。

具体而言，所述AIE材料可以为可被取代的1，1，2，3，4，5-六苯基噻咯、可被取代的四苯基乙烯、可被取代的9，10-二苯基乙烯基蒽、可被取代的三苯胺、氰基取代的二芳基乙烯衍生物中的一种或多种。更优选地，上述取代四苯基乙烯为四个苯基的4号位均被C1～C6烷氧基取代的四苯基乙烯，尤其优选被C2～C4烷氧基取代。

所述检测试剂包括磁珠(或载玻片)、捕获探针、检测探针以及原位信号增强粒子。其中，所述磁珠(或载玻片)用于检测样品与试剂的分离和清洗。所述捕获探针通过化学修饰而固定在磁珠或载玻片表面，可与待测分子的一部分进行杂交结合，使其从样品中分离。所述检测探针可与待测分子的另一部分进行杂交结合，检测探针的远离杂交位置的一端通过化学共价键与原位信号增强粒子相连接。所述原位信号增强粒子能够发出足够强的光学信号，在所述光学成像设备上形成独立可辨别的图像信号

本申请中，所述磁珠或载玻片的表面修饰有能够与探针共价偶联的活性官能团，包括羟基、羧基、氨基、巯基、烯基、炔基、琥珀酰亚胺酯基团及其衍生基团中的一种或多种。

本申请中，所述捕获探针可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸，其序列与待测分子的一段序列彼此互补，能够形成双链杂交。

本申请中，所述捕获探针的一端修饰有羧基、氨基、巯基以及琥珀酰亚胺酯中的一种或几种，能够与磁珠或载玻片的表面发生共价结合，从而稳定地结合在磁珠或载玻片的表面。

本申请中，所述检测探针可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸，其序列与待测分子的另一段序列(不同于与捕获探针互补的序列)互补，能够形成双链杂交，从而形成捕获探针-靶标分子-检测探针三链杂交结构。

本申请中，所述检测探针的一端修饰有羧基、氨基、巯基以及琥珀酰亚胺酯中的一种或几种，能够与原位信号增强粒子共价偶联，从而稳定结合于原位信号增强粒子的表面。

所述原位信号增强粒子是指在原位(in-situ)将发光信号增强至能够被常规光学成像设备(如荧光显微镜)检测到的水平的材料，其必须含有聚集诱导发光材料和多孔载体这两部分，且需为多孔结构。

所述原位信号增强粒子中，多孔载体发挥非常重要的作用，例如，可以结合更多的发光材料，使得发光信号更强；为官能化修饰提供位点，能够结合大量抗体，提高反应活性。所述多孔载体按照材料分类，可以为多孔二氧化硅、多孔聚苯乙烯、多孔聚丙烯酰胺、多孔聚(甲基)丙烯酸甲酯、及多孔无机金属化合物中的一种或多种。其中，从使发光材料均匀分布、提高检测灵敏度的观点考虑，多孔载体优选为多孔二氧化硅、多孔聚丙烯酰胺、多孔聚苯乙烯，尤其优选多孔二氧化硅和多孔聚苯乙烯。

多孔载体可以按照本领域已知的制备方法制造，没有特别限制。例如，关于多孔聚苯乙烯，例如可以按照下述步骤制备：步骤1，将聚苯乙烯种子微球溶液超声分散于十二烷基硫酸钠溶液中得到第一混合液，将环己烷超声分散于十二烷基硫酸钠溶液中得到第二混合液，将第二混合液逐滴滴加到第一混合液中，并搅拌、溶胀而得到第一溶胀液；步骤2，将过氧化二苯甲酰、甲苯和苯乙烯混合得到第二溶胀液；步骤3，将第二溶胀液加入到第一溶胀液中，所得混合液分散于十二烷基硫酸钠水溶液中于室温条件下溶胀而得到混合反应体系，向所述混合反应体系中加入表面活性剂和阻聚剂，升温进行聚合反应即得。关于多孔二氧化硅，例如可以按照下述方法制备：将模板结构与经辐照后制得的全硫化硅橡胶乳液混合，喷雾干燥、烧灼后制备多孔二氧化硅微球。关于多孔聚丙烯酰胺，例如可按照以下步骤制备：步骤(1)，将丙烯酰胺放入反应釜中，然后用氢氧化钠调节pH值至7，再加入致孔剂、亚硫酸氢钠、过硫酸铵、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、去离子水，充分搅拌后得到混合溶液；将混合溶液置于去离子水中充氮后密封，得到混合反应物；步骤(2)，将上述步骤(1)得到的混合反应物置于恒温水浴中反应，得到透明凝胶状聚合物；透明凝胶状聚合物经过洗涤，过滤得到最终产物。

本申请中，原位信号增强粒子优选为聚集诱导发光材料进入多孔聚苯乙烯的孔隙而成的荧光粒子、聚集诱导发光材料进入多孔二氧化硅的孔隙而成的荧光粒子、聚集诱导发光材料进入多孔聚丙烯酰胺的孔隙而成的荧光粒子等。该原位信号增强粒子的制备方法可以是：将多孔载体如多孔聚苯乙烯微球分散于溶剂(如氯仿与异丙醇的混合溶液)中，并加入聚集诱导发光材料的溶液。

需要说明的是，上文所述的具体聚集诱导发光材料与多孔载体可以进行各种组合。

本申请中，所述原位信号增强粒子的表面修饰有能够与探针共价偶联的活性官能团，包括羟基、羧基、氨基、巯基、烯基、炔基、琥珀酰亚胺酯基团及其衍生基团中的一种或多种。

本申请中，所述原位信号增强粒子的表面可以修饰有一定长度的连接臂，所述连接臂包括多碳直链、多碳支链、聚合物链、肽链、蛋白质。所述连接臂的长度优选为1～100nm，进一步优选为2～20nm，最优选为5～10nm。

本申请的步骤(1)中，样品与捕获探针的孵育温度为10～50℃，优选为20～40℃，尤其优选为37℃，孵育时间为1min～60min，优选为3min～30min，尤其优选为10min～30min。本申请的步骤(2)中，检测探针(或结合有检测探针的原位信号增强粒子)与样品的孵育温度为10～50℃，优选为20～40℃，尤其优选为37℃，孵育时间为1min～60min，优选为2min～30min，尤其优选为15min～25min。

本申请中，所述光学成像设备主要包括以下部件：激发光源、物镜、滤光片、感光元件、数据采集模块、数据处理模块以及二向色镜(若为正置显微镜，则也可以没有二向色镜)。其中，所述激发光源是用于将反应后的样品激发出光学信号的光学发射装置。所述物镜用于待测样品的信号采集和放大。所述二向色镜用于激发光路的反射和样品光学信号的采集。所述滤光片用于激发光波段的过滤和样品发射光信号的过滤。所述感光元件用于样品光学信号的采集。所述数据采集模块配置为接收感光元件捕获的光学信号，并转换为数字信号。所述数据处理模块配置为数字信号的转换以及光学图像的形成和处理。

在该设备的一些实施方式中，所述激发光源包括气体激光器、固体激光器、半导体激光器、液体激光器以及自由电子激光器中的一种或几种。在该设备的一些实施方式中，所述物镜按照倍率分类，包括1X、2X、4X、5X、10X、20X、40X、50X以及100X中的一种或几种；所述物镜按照场曲校正分类，包括平面物镜或曲面物镜。在该设备的一些实施方式中，所述感光元件包CCD(Charge Coupled Device，电荷耦合装置)或CMOS(Complementary Metal-OxideSemiconductor，互补金属氧化物半导体)中的一种或两种。

本申请通过采用特定的检测体系，从而使得对光学成像设备的要求低，为常规的光学成像设备(即未突破光学衍射极限的光学成像设备)即可，无需全内反射荧光显微镜、落射荧光显微镜、扫描近场光学显微镜、共聚焦荧光显微镜等昂贵的、突破了光学衍射极限的成像设备。

本申请中，靶标分子浓度的计算方式有单分子计数模式和荧光强度积分模式这两种。其中，就所述单分子计数模式而言，直接对生成的图像中的由原位信号增强粒子形成的亮斑个数进行分析和统计，通过亮斑个数直接或间接换算为靶标分子在样品中的浓度。所谓″直接换算为靶标分子在样品中的浓度″，是指绝对定量，也即，无需标准曲线校正即可换算为浓度。所谓″间接换算为靶标分子在样品中的浓度″，是指通过亮斑个数和标准曲线(或校正参数)换算为浓度。就所述荧光强度积分模式而言，对生成的图像中的由原位信号增强粒子形成的亮斑面积进行统计和积分，通过将积分结果除以特定参数，例如平均每个原位信号粒子所形成的平均亮斑面积或亮斑面积相关变量(例如幂方、开方以及多项式等)，从而换算得到原位信号增强粒子的近似个数，再将该数值换算为靶标分子在样品中的浓度。其中，平均亮斑面积是通过在较低浓度下对单个分子的亮斑面积进行统计并取平均值而得到的。从获得更大的检测动态范围的方面考虑，重要的是，在低浓度区间使用单分子计数模式、并在高浓度区间使用荧光强度积分模式，然后将这两种模式下绘制的标准曲线合并，从而绘制完整的标准曲线。需要说明，上述低浓度与高浓度的分界线一般为一个磁珠表面上结合有超过一个的待测分子时的浓度，也可以根据标准曲线拟合结果优选为一个磁珠表面上平均结合有0.5个待测分子时的浓度或2个待测分子时的浓度。

<第二实施方式>

本申请的第二实施方式如下。

第二实施方式与第一实施方式相比，仅在步骤的实施顺序上存在区别，其他条件如原位信号增强粒子、多孔载体、聚集诱导发光材料等均相同。

本申请还涉及包含上述原位信号增强粒子和磁珠(或载玻片)的用于核酸检测的试剂盒，上述原位信号增强粒子为多孔结构，含有上述聚集诱导发光材料和多孔载体。原位信号增强粒子的比表面积可以为50～600cm²/g。优选的聚集诱导发光材料和多孔载体如前文所述。

本申请中具体采用氮气吸附BET法来测定BET比表面积，其中，氮气作为被吸附分子吸附在吸附剂(本申请的情况下为原位信号增强粒子)上并从所述吸附剂上解吸附，从而测量吸附等温线，并且测量的数据按照由式(1)表示的BET式来分析。因此，根据该氮气吸附BET法可以计算比表面积。

具体地，当根据上述氮气吸附BET法计算比表面积的值时，首先氮气作为被吸附分子吸附在吸附剂(原位信号增强粒子)上，并从所述吸附剂上解吸附，从而测量吸附等温线。并且，从所得的吸附等温线，根据式(1)或由式(1)变换成的式(1’)来计算[p/{V_a(p₀-p)}]，并相对于平衡相对压力(p/p₀)作图。此外，由此作出的[p/{V_a(p₀-p)}]以直线表示，斜率s(＝[(C-1/(C·V_m)])、截距i(＝[1/(C·V_m)])按照最小二乘法来计算。并且，V_m和C二者根据式(2-1)和(2-2)、由所得的斜率s和截距i来计算。比表面积a_sBET根据式(3)、由V_m计算。

V_a(V_m·C·p)/[(p₀-p){1+(C-1)(p/p₀)}]…(1)

其中，V_a是吸附量，V_m是单分子层中的吸附量，p是氮气的平衡相中的压力，而p₀是氮气的饱和蒸汽压。

[p/{V_a(p₀-p)}]＝[(C-1)/(C·V_m)](p/p₀)+[1/(C·V_m)]…(1’)

V_m＝1/(s+i)....(2-1)

C＝(s/i)+1....(2-2)

a_sBET＝(V_m·L·σ)/22414....(3)

其中，L是阿伏伽德罗数，而σ是氮气的吸附横截面积。

实施例

以下，举出实施例和比较例进一步详细地说明本申请，但本申请并不限定于此。

1、比表面积测定

用全自动化比表面积分析仪(Micrometritics ASAP 2020M+C)、按照上述氮气吸附BET测定法对原位信号增强粒子进行比表面积测定。

2、单分子成像

使用常规荧光显微镜例如尼康Eclipse Ti-U荧光显微镜进行单分子成像，此外，也可采用尼康Eclipse Ti系列的其他荧光显微镜、莱卡DMi8荧光显微镜等。

3、标准曲线绘制方法

本申请中，联合使用单分子计数模式与荧光强度积分模式，具体实施方法如下：

在待测分子的浓度较低时，磁珠数量多于与磁珠结合的待测分子数量，因此使用单分子计数模式对不同浓度的待测分子样本进行标准曲线绘制；

当待测分子的浓度超过一定阈值时，一个磁珠表面可能结合有1个以上的待测分子，单分子信号容易叠加，导致检测结果出现偏差，因此更适合使用荧光强度积分模式。

具体而言，当一张成像图片中的单分子数量不超过设定的阈值时，使用单分子计数模式进行标准曲线的绘制；当一张成像图片中的单分子数量超过设定的阈值时，使用荧光强度积分模式，并将总荧光强度面积除以每个分子的平均荧光强度面积，换算为″近似单分子数量″，从而进行标准曲线绘制。

最后，将利用单分子计数模式得到的标准曲线与利用荧光强度积分模式得到的标准曲线合并，并利用拟合公式进行曲线拟合，绘制完整的标准曲线。

4、多孔结构的原位信号增强粒子的制备

(1)以多孔聚苯乙烯为载体的原位信号增强粒子的制备为例，步骤如下。

(A)多孔聚苯乙烯的制备

步骤1：取质量百分比为4.6％的聚苯乙烯种子微球溶液2.4mL超声分散于18mL质量百分比为0.23％的十二烷基硫酸钠水溶液中，得到第一混合液；取100μL丙酮超声乳化分散于23mL质量百分比为0.21％的十二烷基硫酸钠水溶液中，得到第二混合液，将第二混合液逐滴加入到第一混合液中，并于25℃进行搅拌、溶胀6h得到第一溶胀液；

步骤2：取0.12g过氧化苯甲酰和9g苯乙烯，依次加入4g甲基丙烯酸、11g甲苯，混合均匀后得到第二溶胀液；

步骤3：将第二溶胀液添加到第一溶胀液中，混合后再分散于75mL质量百分比为0.24％的十二烷基硫酸钠水溶液中，并于25℃条件下继续溶胀；将2.2g聚乙烯吡咯烷酮、400μL质量百分比为1％的次甲基蓝水溶液和80mL超纯水混合后，加入到混合反应体系中，升温至80℃，聚合反应一整夜。

将反应所得产物采用600mL乙醇在超声频率为65w条件下超声12min进行分散；然后，采用体积百分比为95％的乙醇溶液对上述产物进行离心洗涤；之后，采用体积百分比为15％的乙醇溶液对上述产物重力筛选5次，得到杂质少、尺寸均一的多孔聚苯乙烯微球，且表面修饰有羧基。

(B)原位信号增强粒子的制备

将制备得到的多孔聚苯乙烯微球分散于氯仿与异丙醇的混合溶液中，并加入聚集诱导发光材料的溶液，于适合的温度干燥一整夜后即得。此处的聚集诱导发光材料具体使用了：四个苯基的4号位(相对于与乙烯连接的位点而言，以下相同)均被丙氧基取代的四苯基乙烯(以下简记为4-C3O-TPE)、四个苯基的3号位(即间位)均被丙氧基取代的四苯基乙烯(以下简记为3-C3O-TPE)、四个苯基的4号位均被羧基取代的四苯基乙烯(以下简记为4-COOH-TPE)、四个苯基的4号位均被羟基取代的四苯基乙烯(以下简记为4-OH-TPE)、四个苯基的4号位均被氯取代的四苯基乙烯(以下简记为4-Cl-TPE)、1，1，2，3，4，5-六苯基噻咯(HPS)、各苯基的4号位被丙氧基取代的1，1，2，3，4，5-六苯基噻咯(以下简记为4-C3O-HPS)、二苯基乙烯基蒽(以下简记为DSA)、三苯胺(以下简记为TPA)、三个苯基的4号位均被丙氧基取代的三苯胺(以下简记为4-C3O-TPA)、三个苯基的3号位(即间位)均被丙氧基取代的三苯胺(以下简记为3-C3O-TPA)、三个苯基的4号位均被羧基取代的三苯胺(4-COOH-TPA)。由此也分别得到包含各聚集诱导发光材料和多孔聚苯乙烯载体的多孔原位信号增强粒子，图1示出包含4-C3O-TPE和多孔聚苯乙烯载体的多孔原位信号增强粒子的扫描电子显微镜(SEM)图像，利用BET法测定其表面积，为230cm²/g。另外，通过调节各原料的质量比，还分别制备了表面积在100～600cm²/g范围内的基于多孔聚苯乙烯载体的数种多孔原位信号增强粒子，在此省略详细说明。

(2)以多孔二氧化硅为载体的原位信号增强粒子的制备为例，步骤如下。

将380克超细全硫化硅橡胶乳液与200克全硫化丁腈橡胶乳液(北京化工研究院，固含量43％)经机械搅拌共混，制得稳定的共混乳液。然后利用喷雾干燥方法，制备100克超细全硫化硅橡胶与全硫化丁腈橡胶微米级复合微球。

称取上文制备的微米级复合微球18克于坩埚中，放于马弗炉内，在空气条件下，于400℃，烧蚀300分钟。得到3.0克多孔二氧化硅微球。

将上述得到的多孔二氧化硅微球与乙酸铵在乙醇中混合进行回流反应，得到氨基修饰的多孔二氧化硅微粒。称取聚集诱导发光材料与氨基修饰的多孔二氧化硅微粒，充分溶解并分散于溶解有三光气的无水甲苯溶液中；惰性气氛吹若干次后，加热至115～125℃，通过分水器除水，随后保持回流10～14小时；最后过滤，收集滤渣，洗涤数次后，真空干燥，即得到一种包含多孔二氧化硅和聚集诱导发光材料的原位信号增强粒子。此处的聚集诱导发光材料具体使用了：4-C3O-TPE、3-C3O-TPE、4-COOH-TPE、4-OH-TPE、4-C1-TPE、HPS、4-C3O-HPS、DSA、TPA、4-C3O-TPA、3-C3O-TPA、4-COOH-TPA。图2示出包含4-C3O-TPE和多孔二氧化硅载体的多孔原位信号增强粒子的扫描电子显微镜图像，利用BET法测定其表面积，为260cm²/g。另外，通过调节各原料的质量比，还分别制备了表面积在80～560cm²/g范围内的基于多孔二氧化硅载体的数种多孔原位信号增强粒子，在此省略详细说明。

实施例1：缓冲液中DNA分子的定量检测(包含多孔二氧化硅和4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子：比表面积为260cm²/g)。

1、实验组分

低吸附载玻片(Thermo)、捕获探针(上海生工合成，序列见下文)、检测探针(上海生工合成，序列见下文)、DNA模板(上海生工合成，序列见下文)、硅烷偶联剂(APTES)、氨水、正硅酸乙酯(TEOS)、前文制备的包含多孔二氧化硅和4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子(比表面积260cm²/g)、丁二酸酐、双端羧基化聚乙二醇以及PBS缓冲液、超纯水、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、Buffer D(0.01％NaCl，0.5％BSA溶于10mM的PBS，pH＝7.4)、Buffer E(0.0088％NaCl，0.1％BSA溶于10mM的PBS，pH＝7.4)

捕获探针序列：

NH₂-TTTTTTTTTTTGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACAT

检测探针序列：

TCTGATATAATCTTGTACAGTGTGTTTTTTTTTT-NH₂

DNA模板序列：

CACACTGTACAAGATTATATCAGAATGTGACTATATTAGAACATGTCACAC

2.1、载玻片表面活化和捕获探针的修饰

(1)取一低吸附载玻片(Thermo)，在超纯水中超声1小时，在无尘条件下于70℃烘干12小时。使用等离子体清洗机清洗载玻片表面，在载玻片表面产生具有高活性的羟基。

(2)将活化后的载玻片浸渍于浓度为1％的APTES中，于37℃反应2小时，使得载玻片表面氨基化，用超纯水对载玻片的表面清洗5次，于37℃烘干待用。

(3)配置0.5％的双端羧基化聚乙二醇，加入5倍量的EDC和10倍量的NHS，活化10分钟后将(2)中得到的载玻片浸渍于已活化的聚乙二醇溶液中。反应15分钟后，用超纯水对载玻片的表面清洗5次，然后用氮气吹干。

(4)在载玻片的表面上滴加300μL的1μM的捕获探针，室温下反应1h，使用超纯水清洗5次，除去未反应的捕获探针。

(5)将结合有捕获探针的载玻片浸渍于Buffer D中，于37℃孵育2h，使用超纯水清洗5次，用氮气吹干，于50℃过夜烘干，待用。

2.2、检测探针与包含多孔二氧化硅和4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子的共价偶联

(1)取10μL上述多孔原位信号增强粒子，加入40μL的PBS缓冲液超声1min。

(2)取0.01g的EDC，溶于50μL的PBS缓冲液，另取0.025g的NHS溶于150μL的PBS缓冲液。

(3)以12000rpm的速度将上述多孔原位信号增强粒子离心，去除上清液，加入50μL的PBS缓冲液重悬，超声1min后加入2.5μL的EDC溶液，超声1min后再加入7.5μL的NHS溶液，混匀后于37℃旋转混匀反应15min，以12000rpm的转速离心15min，去除上清液，使用50μL的PBS缓冲液将增强粒子重悬。

(4)加入10μL的10μM检测探针，于37℃旋转混匀反应1.5h。

(5)加入25μL的Buffer D，于37℃封闭反应1h后，以12000rpm离心15min，使用100μL的Buffer E重悬保存。

3、实验方法

标准曲线的制作

(1)使用样品稀释液将DNA模板分子的浓度稀释为0、30、91、274、823、2469、7407、22222、66666及20000fM。

(2)将50μL样品滴加至载玻片的反应区域内，常温下反应30min。

(3)加入50μL的结合有检测探针的多孔原位信号增强粒子，常温下孵育30min，使用清洗缓冲液洗4次，洗去残余的多孔原位信号增强粒子，去除上清液。

(4)使用荧光显微镜(尼康Eclipse Ti-U)进行单分子成像，利用单分子计数模式与荧光强度积分模式的联用来完成后续单分子计数统计与分析。

(5)完成一系列浓度检测，每个浓度点重复6次，根据检测结果绘制标准曲线，计算每个点的CV％值。

4、实验结果

检测结果如图3所示，可知本实施例中，DNA模板分子的检测下限为30fM，远优于PCR检测灵敏度。

实施例2：磁珠法用于缓冲液中DNA分子的定量检测(包含多孔二氧化硅和4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子：比表面积为260cm²/g)。

在实施例2中，以EDC和NHS为活化剂，将25nmol氨基封端的捕获探针与0.1mmol活化的羧基功能化的M280磁珠混合反应2h，得到的产物置于磁力架上约1min，进行磁力分离并离心纯化，除去未反应的捕获探针，得到磁珠修饰的捕获探针。除上述操作以外，与实施例1同样地操作(稀释的浓度相应变化)。

检测结果如图4所示，可知实施例2中，DNA模板分子的检测下限为15fM，远优于PCR检测灵敏度。

参考例1

将原位信号增强粒子替换为专利文献1的实施例22记载的非多孔二氧化硅负载异硫氰酸荧光素粒子而成的微球(异硫氰酸荧光素整体被二氧化硅包裹，非多孔结构)，各反应时间、干燥时间与该实施例22相同(以便尽可能与专利文献1的实施例22的条件相同)，除此以外，与本申请的上述实施例1同样地操作，DNA模板分子的检测下限为0.5pM，在检测灵敏度方面虽然也优异，但劣于本申请的实施例1。

比较例1

除了将原位信号增强粒子替换为多孔二氧化硅负载异硫氰酸荧光素粒子而成的微球(异硫氰酸荧光素进入孔隙内，多孔结构)外，与本申请的上述实施例1同样地操作，DNA模板分子的检测下限为1pM，明显劣于本申请的实施例1。

比较例2

除了原位信号增强粒子替换为无孔二氧化硅负载4-C3O-TPE而成的微球(4-C3O-TPE整体被二氧化硅包裹，非多孔结构，制备方法与专利文献1的实施例1中的类似)外，与本申请的上述实施例1同样地操作，DNA模板分子的检测下限为2pM，明显劣于本申请的实施例1。

实施例3～6(不同比表面积的实验)

除了将原位信号增强粒子分别替换为比表面积为90cm²/g、200cm²/g、350cm²/g、560cm²/g的包含多孔二氧化硅和4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子以外，与上述实施例1同样地操作，得到各实施例的检测下限，示于下述表1中。

表1

	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
					灵敏度	45fM	40fM	45fM	50fM

实施例7～11(不同比表面积的以多孔聚苯乙烯为载体的实验)

除了将原位信号增强粒子分别替换为比表面积为80cm²/g、230cm²/g、340cm²/g、400cm²/g、520cm²/g的包含多孔聚苯乙烯和4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子以外，与实施例1同样地操作，得到各实施例的检测下限，示于下述表2中。

表2

	实施例7	实施例8	实施例9	实施例10	实施例11
						灵敏度	75fM	50fM	60fM	65fM	80fM

实施例12～17(不同AIE荧光分子的实验)

除了将原位信号增强粒子替换为分别包含4-COOH-TPE、4-OH-TPE、4-Cl-TPE、4-C3O-HPS、DSA、4-C3O-TPA的多孔原位信号增强粒子(比表面积均为260cm²/g，多孔载体均为多孔二氧化硅)以外，与实施例2同样地操作，得到各实施例的检测下限，示于下述表3中。

表3

实施例12

实施例13

实施例14

实施例15

实施例16

实施例17

灵敏度

25fM

35fM

45fM

55fM

45fM

Claims

1.一种核酸定量检测方法，包括下述步骤：

（1）将能够与靶标分子结合的捕获探针固定到磁珠或载玻片上，之后加入待测样品，使捕获探针与待测样品中的靶标分子的第一序列互补，将待测样品中的靶标分子捕获；

（2）加入能够与靶标分子的第二序列互补的检测探针，形成捕获探针—靶标分子—检测探针的三链杂交结构，然后加入能够直接或间接与检测探针结合的原位信号增强粒子；或者先将检测探针与原位信号增强粒子结合而形成复合材料，再将该复合材料加入；

其中，所述原位信号增强粒子为多孔结构，含有聚集诱导发光材料和多孔载体；

（3）用光学成像设备将所述原位信号增强粒子发出的光学信号成像；

（4）对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中靶标分子的浓度，

其中，所述聚集诱导发光材料为四个苯基的4号位均被C2~C4烷氧基取代的四苯基乙烯。

2.一种核酸定量检测方法，包括下述步骤：

（1）使检测探针与待测样品中的靶标分子的第二序列互补，然后加入能够直接或间接与检测探针结合的原位信号增强粒子；或者预先使原位信号增强粒子与检测探针结合而形成复合材料，然后使该复合材料与待测样品中的靶标分子的第二序列互补；

（2）将能够与靶标分子结合的捕获探针固定到磁珠或载玻片上，之后加入至步骤（1）的体系中，使所述捕获探针与所述靶标分子的第一序列互补，将靶标分子捕获；

（3）用光学成像设备将从所述原位信号增强粒子发出的光学信号成像；

3.如权利要求1或2所述的核酸定量检测方法，其中，所述原位信号增强粒子的比表面积为50~600cm²/g。

4.如权利要求1或2所述的核酸定量检测方法，其中，在所述原位信号增强粒子中，所述聚集诱导发光材料进入多孔载体的孔隙内，所述多孔载体为多孔二氧化硅、多孔聚苯乙烯、多孔聚丙烯酸酯或多孔聚丙烯酰胺。

5.如权利要求1或2所述的核酸定量检测方法，其中，所述靶标分子为DNA或RNA。

6.用于核酸检测的试剂盒，其包含原位信号增强粒子、和磁珠或载玻片，其特征在于，所述原位信号增强粒子为多孔结构，含有聚集诱导发光材料和多孔载体，

其中，所述聚集诱导发光材料为四个苯基的4号位均被C2~C4烷氧基取代的四苯基乙烯，

所述原位信号增强粒子的比表面积为50~600cm²/g。

7.权利要求6所述的试剂盒在核酸定量检测中的应用。