JP2006503300A

JP2006503300A - 複数の標的を同時に検出することのできるタンパク質チップ検出系

Info

Publication number: JP2006503300A
Application number: JP2004545675A
Authority: JP
Inventors: 廣熙胡
Original assignee: 上海数康生物科技有限公司
Priority date: 2002-10-24
Filing date: 2003-03-24
Publication date: 2006-01-26
Also published as: EP1560023A1; US20060008793A1; RU2298796C2; WO2004038413A1; AU2003227167A1; CN1492229A; RU2005115573A; CN1235047C; CA2503601A1; EP1560023A4

Abstract

この発明は、複数の標的を同時に検出することのできるタンパク質チップ検出系と、この系を製造するための方法とを提供する。この発明は、現在のタンパク質チップ系およびその製造を改良することにより、この系の安定性および感度を高める。

Description

技術分野
この発明は、生物工学に関する。より特定的に、この発明は、複数の指標の並列検出およびその調製のためのタンパク質チップ検出系に関する。

背景技術
バイオチップ技術は、１９９０年代の半ばに登場した新規の生物工学として、生体高分子（たとえば、核酸、タンパク質等）間の相互作用の大規模な並列解析に基づいている。このバイオチップ技術は、他の多くの技術、たとえばマイクロエレクトロニクス、マイクロメカニックス、化学、物理学、コンピュータサイエンス等を組み合わせて、試料の反応、検出、解析等のプロセスの直列化、統合、および小型化を行なう。バイオチップ技術は、今日最も速い速度で発展している生命科学の一技術となっている。

バイオチップは、農業、環境、食品、裁判、軍事、研究等において広く適用することができる。さらに、バイオチップを用いて、遺伝子またはタンパク質に関するいくつかの疾病を同時に検査して、遺伝子疾患、腫瘍、感染症等の診断に役立てることができるため、臨床用途において大きな価値を有する。

バイオチップは、３つの主なカテゴリ、すなわち、核酸チップ、タンパク質チップ、およびチップ分析に分類される。

タンパク質チップは、タンパク質間相互作用を検出するためのバイオチップである。現在研究下にあるタンパク質チップ技術は、主に、抗原と抗体との特異的結合の原理に基づく。タンパク質チップ技術に従い、固体基板（たとえば、特殊加工を施したスライド、有機膜、シリコンの微小球等）にいくつかのタンパク質を結合し、これらのいくつかのタンパク質と特異的に結合し得る、生物学的試料内の対応するタンパク質が検出される。

特定の内因性タンパク質の含有量の変化を検出することにより、タンパク質チップは、生理学的／病理学的変化を正確に求めることができる。タンパク質チップは、臨床診断の用途に大きな可能性を有する。

中国特許出願ＣＮ０１１０５０２３．３において、本発明者らは、タンパク質チップの複数の指標の同時検出およびその調製のための検出系を開示しており、極めて特異的であるものの体液中の含有量が低いタンパク質を臨床で同時に検出することができる。

発明の開示
この発明が解決すべき技術上の問題は、原出願ＣＮ０１１０５０２３．３に基づき、タンパク質チップ検出系を改良して、その安定性および感度を高めることである。

中国特許出願ＣＮ０１１０５０２３．３は、複数の指標を並列検出するためのタンパク質チップ検出系を開示しており、このタンパク質チップ検出系は、
（１）複数の指標を並列検出するためのタンパク質チップと、
（２）特定の濃度比で調製されかつ発光標識を有する、２つ以上のタンパク質の混合溶液、すなわち、反応性溶液と、
（３）検出されるべきタンパク質の、既知のかつ次第に上昇する濃度における一連の混合溶液、すなわち、標準試料と、
（４）タンパク質チップを洗浄するための溶液とを含む。

この発明は、検出されるべきタンパク質の標準試料溶液の配合を変更し、それによって混合後のさまざまなタンパク質の失活を防止する。その結果、試料の安定性および検出の精度がいずれも高められる。

検出されるべきタンパク質（または簡潔に標的タンパク質Ａと呼ぶ）の、既知のかつ次第に上昇する濃度における上述の標準試料溶液の配合は、４０％〜６０％のウシ胎仔血清＋さまざまな高濃縮精製抗原＋０．０２〜０．１‰のＮａＮ₃、または、ｐＨ７．０〜７．８、０．０５ＭのＰＢ（ＫＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄）＋２〜３０％のＢＳＡ＋１．５〜２．５％のショ糖＋０．０２〜０．１‰のＮａＮ₃＋さまざまな高濃縮精製抗原である。既知のかつ次第に上昇する濃度で標的タンパク質Ａを含む、上述のように調製された一連の混合溶液は、凍結乾燥して保存する。

この発明が解決すべき別の技術上の問題は、上述の検出系におけるタンパク質チップの調製方法を改良することである。

この発明で説明するタンパク質チップは、複数の指標を並列検出するために、固相担体と、その担体上に固定化されたタンパク質とを含む。タンパク質チップは、自動チップスポッティングシステムを用いて、特定のアレイ内の固相担体上に、物理的な吸着または共有結合によりさまざまなタンパク質を固定化する。次に、ブロッキング溶液を用いて、固相担体上に試料がスポットされていない位置をブロックし、結果的に得られた生成物を乾燥して保存する。タンパク質は、抗原、抗体、レセプタ、リガンド等であり得る。タンパク質はさらに、内因性の疾患マーカータンパク質、特に腫瘍マーカータンパク質に特異的に結合し得るタンパク質を含む。

上述の固相担体は、無機基板または有機化合物基板であり得る。無機基板には、半導体シリコン基板、ガラス基板、微孔性のシリコン基板、微孔性のガラス基板等が含まれ、ガラス基板が好ましい。有機基板には、酢酸セルロース膜、硝酸セルロース膜、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等が含まれる。

タンパク質チップは、以下の技術的な手法により得られる。

１．検出されるべきさまざまなタンパク質（簡潔に標的タンパク質Ａと呼ぶ）と、Ａに特異的な抗原、抗体、またはレセプタ等（簡潔にＢと呼ぶ）、たとえば内因性疾患マーカータンパク質およびそれらに結合し得るタンパク質とを決定する。

２．上述のＢ、すなわち、さまざまなタンパク質プローブを、特定の濃度でコーティング溶液に溶解した後に、自動チップスポッティングシステムにより、固相担体上にスポットする。ここで、スポッティング密度は２５〜２００スポット／ｃｍ²であり、スポッティング量は０．１〜１０ｎｇ／スポットである。

３．結果的に得られた生成物を４℃で一晩置く。

４．ブロッキング溶液でタンパク質チップをブロックする。

５．タンパク質チップを乾燥させて４℃で保存する。

一連の反応後に、チップ上にスポットされたさまざまなタンパク質により生成された光シグナルを、強度が近い数字のオーダー（最も強力なスポット／最も微弱なスポット＜１００）に置くために、チップ上のタンパク質の濃度を前もって調節し、検出機器による簡便な検出が行なえるようにする（最適のスポッティング濃度を得るため）。

この発明が提供するコーティング溶液の配合は、ＰＢ（ＫＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄）、ｐＨ７．０〜８．０である。

この発明が提供するブロッキング溶液の配合は、１〜９％のＢＳＡ、１〜９％のショ糖、および０．０１〜１‰のＮａＮ₃を含有するＰＢ（ＫＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄）であり、その利点は、ＢＳＡがブロッキング機能を有すること、ショ糖が空気を分離するのに十分な程度まで不活性であること、ならびに、ＢＳＡおよびショ糖が基質を支持し得ることである。ブロッキング溶液の役割は、固相担体上の他の位置がタンパク質と結合することを防止することであり、それによって実験データの精度を保証することができる。

先行の発明に比べ、この発明に従った調製方法で用いられる、変更された配合の緩衝溶液により、非特異的な吸着を減らしてバックグラウンドシグナル値を下げることが容易になり、タンパク質チップの安定性および検出の感度も高まる。

具体的な実施形態
この発明で用いられる際に、固体材料（ＢＳＡ、ショ糖、チロシン、およびＮａＮ₃等）の量は重量パーセントで示され、溶液（トゥイーン（Tween）２０、ウシ胎仔血清、およびプロクリン（Proclin）溶液等）の量は体積パーセントで表わされる。

実施例１変更された緩衝溶液（ブロッキング溶液およびコーティング溶液を含む）を含む配合で調製された、腫瘍検出用のタンパク質チップと、先行の緩衝溶液を含む配合で調製されたタンパク質チップとの間での、バックグラウンド値とシグナル値との比較
１．変更された緩衝溶液を含む配合を用いたタンパク質チップＥの調製
１．１６つの腫瘍マーカー、すなわち、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、遊離型ＰＳＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３の対応する抗体（抗体Ｉ）を、特定の濃度でコーティング溶液に溶解した後、自動チップスポッティングシステムを用いて、これらのタンパク質を固相担体上にスポットした。ここで、スポッティング濃度は４８スポット／ｃｍ²であり、スポッティング量は０．５ｎｇ／スポットであり、抗体Ｉ内の各抗体は４つの並列スポットに対応した。

１．２結果的に得られた生成物を４℃で一晩置いた。

１．３ブロッキング溶液でタンパク質チップを１時間処理した。

１．４タンパク質チップを２時間乾燥させて、今後の使用に備えて４℃で保存した。

上で用いたコーティング溶液の配合は、ＰＢ（ＫＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄）、ｐＨ７．０〜８．０であった。

上で用いたブロッキング溶液の配合は、３％のＢＳＡ、５％のショ糖、および０．５‰のＮａＮ₃を含有するＰＢ（ＫＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄）であった。

２．タンパク質チップを調製するための先行の方法を用いたタンパク質チップＦの調製
ここで用いたコーティング溶液の配合は、ＣＢＳ（ＮａＨＣＯ₃−Ｎａ₂ＣＯ₃）、ｐＨ９．６であった。

ここで用いたブロッキング溶液の配合は、０．２％のトゥイーン２０、０．１％のチロシン、５％のＢＳＡ、４％のショ糖、および０．５％のプロクリンを含有するＴＢＳであった。

上述のタンパク質チップＥおよびＦを、既知の濃度の、対応する反応溶液、洗浄溶液、および血清試料と反応させた（残りの血清試料は、次回の実験で用いるために取っておく）。結果的に得られた生成物をバイオチップ検出機器で撮影し、得られたデータを解析した。シグナル値を表１に示す。

上述のチップを４℃で６ヵ月間保存した後に、上述の実験と同じバッチからの反応溶液および洗浄溶液、ならびに上述の残りの血清試料と反応させた。シグナル値を表２に示す。

この発明に従った緩衝溶液の配合を用いて調製されたタンパク質チップＥは、タンパク質チップＦに比べ、明らかに良好な安定性を有する。

さらに、バイオチップの写真から得られたタンパク質チップＥのシグナルを図１に示し、タンパク質チップＦのシグナルを図２に示す。これらの２つの図面から、図１のバックグラウンドが図２のバックグラウンドよりもはるかに低いことが認識できる。

実施例２変更された配合の緩衝溶液を用いて調製された標準試料と、先行の標準試料との安定性の比較
１．標準試料用の緩衝溶液を、以下の配合、すなわち、６０％のウシ胎仔血清＋さまざまな高濃縮精製抗原＋０．０５‰のＮａＮ₃に従って調製した。高濃縮精製抗原ＡＦＰ、ＣＥＡ、およびＮＳＥ６０μｌをさらに追加して、標準試料溶液Ａを得た。

２．標準試料用の緩衝溶液を、以下の配合、すなわち、ｐＨ７．８、０．０５ＭのＰＢ（ＫＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄）＋１５％のＢＳＡ＋２．５％のショ糖＋０．０５‰のＮａＮ₃に従って調製した。高濃縮精製抗原ＡＦＰ、ＣＥＡ、およびＮＳＥ６０μＬをさらに追加して、標準試料溶液Ｂを得た。

３．先行の配合に従って標準試料用の緩衝溶液を調製し、高濃縮精製抗原ＡＦＰ、ＣＥＡ、およびＮＳＥ６０μｌをさらに追加して、標準試料溶液Ｃを得た。

注：溶液Ａ、Ｂ、およびＣにおけるＡＦＰ、ＣＥＡ、およびＮＳＥの最終的な濃度は一致した。

上述の、標準試料の３つの溶液を凍結乾燥させ（標準試料ａ、ｂ、およびｃ）、化学ルミネセンスの自動解析器で測定した。測定した濃度を表３に示す。

標準試料ａ、ｂ、およびｃを、４℃で３ヶ月間保存した後に、化学ルミネセンスの同じ自動解析器で再び測定した。測定した濃度を表４に示す。

標準試料ａおよびｂの濃度は、先行の緩衝系を用いて調製した標準試料ｃの濃度に比べて安定性を有し、したがって、標準試料ａおよびｂは、活性を失わずにより長時間保存され得る。

この発明に従った、変更された緩衝溶液の配合を用いた方法により調製されたタンパク質チップによって生成されたシグナルを示す図である。先行の発明に従った方法で調製されたタンパク質チップによって生成されたシグナルを示す図である。

Claims

複数の指標を並列検出するためのタンパク質チップ検出系であって、
複数の指標を並列検出するためのタンパク質チップと、
特定の濃度比で調製されかつ発光標識を有する、２つ以上のタンパク質の混合溶液、すなわち、反応性溶液と、
検出されるべきタンパク質の、既知のかつ次第に上昇する濃度における一連の混合溶液、すなわち、標準試料溶液と、
タンパク質チップを洗浄するための溶液とを含み、
前記標準試料溶液の配合は、
４０％〜６０％のウシ胎仔血清、さまざまな高濃縮精製抗原、および０．０２〜０．１‰のＮａＮ₃、または
ｐＨ７．０〜７．８、０．０５ＭのＰＢ（ＫＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄）、２〜３０％のＢＳＡ、１．５〜２．５％のショ糖、０．０２〜０．１‰のＮａＮ₃、およびさまざまな高濃縮精製抗原である、タンパク質チップ検出系。
請求項１に記載のタンパク質チップ検出系を調製するための方法であって、タンパク質チップは、
１）検出されるべきさまざまなタンパク質（簡潔に標的タンパク質Ａと呼ぶ）、ならびに、Ａに特異的な抗原、抗体、またはレセプタ等（簡潔にＢと呼ぶ）、たとえば内因性疾患マーカータンパク質およびそれらに特異的に結合し得るタンパク質を決定するステップと、
２）上述のＢ、すなわち、さまざまなタンパク質プローブを、特定の濃度でコーティング溶液に溶解した後に、自動チップスポッティングシステムにより、スポッティング密度が２５〜２００スポット／ｃｍ²でありかつスポッティング量が０．１〜１０ｎｇ／スポットである態様で固相担体上にスポットするステップと、
３）結果的に得られた生成物を４℃で一晩置くステップと、
４）ブロッキング溶液でタンパク質チップをブロックするステップと、
５）タンパク質チップを乾燥させて４℃で保存するステップとによって得られ、
前記コーティング溶液の配合は、ＰＢ（ＫＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄）、ｐＨ７．０〜８．０である、方法。
前記ブロッキング溶液の配合は、１〜９％のＢＳＡ、１〜９％のショ糖、および０．０１〜１‰のＮａＮ₃を含有するＰＢ（ＫＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄）である、請求項２に記載の、タンパク質チップ検出系を調製するための方法。