CN113030479B - 一种蛋白质芯片的点样溶液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛋白质芯片的点样溶液，该点样溶液由1w/v％‑5w/v％的甘油水溶液、1w/v％～5w/v％的山梨醇水溶液、0.01v/v％～0.05v/v％的曲拉通水溶液、DMSO及PBS溶液按照体积比为5～20：15～25：0.1～0.5：10～50:100混合，该PBS溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成，pH范围为6.6～6.8的磷酸盐缓冲液。本发明的点样溶液能使点样更稳定，蛋白质样品点形状更规整，固着更稳定，避免蛋白质溢出或显色不均匀或明显大小点的现象，且能适用于不同蛋白的检测。

Description

一种蛋白质芯片的点样溶液
技术领域
本发明涉及一种蛋白质芯片的点样溶液，属于生物技术领域。
背景技术
蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达分析，研究蛋白质之间的相互作用，在疾病筛查，早期诊断以及筛选药物作用的蛋白靶点方面有突出的优势。蛋白质芯片技术的研究对象是蛋白质，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，使其表面具有一定的功能性，再将一种蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列、体内表达水平生物学功能、与其他分子(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供有力的技术支持。根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列、体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供有力的技术支持。
蛋白质微阵列是蛋白质芯片的其中一类，其原理是通过点样机械装置在基底上面进行设计点样，将点样针吸取纯化后的蛋白质溶液，然后移至基材上方，通过接触或非接触式的喷射，将蛋白质溶液固定在基材表面，后续处理后形成蛋白质芯片。
但是，在蛋白质芯片制备的过程中，点样是造成批间差异化的主要原因之一，蛋白质溶媒影响点样状态，影响样品点形状，影响蛋白质后续反应形态，但本领域对于点样仪及点样针或蛋白质芯片的基材研究成果比较多，鲜有对点样溶媒进行深入研究的。
“低密度cDNA芯片技术的优化”公开了以50％DMSO为点样溶液，但是其易造成蛋白质固着不稳定，蛋白质溢出以及样品呈现明显大小点或显色不均匀的状态。
因此，现有技术中需要一种能使蛋白质稳定固着，避免蛋白质溢出或显色不均匀或明显大小点的点样溶液。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于优化一种蛋白质芯片中点样溶媒的方法，通过优化点样溶媒以后，点样更稳定，蛋白质样品点形状更规整，固着更稳定，避免蛋白质溢出或显色不均匀或明显大小点的现象。
为此，本发明提供了一种蛋白质芯片的点样溶液，其中，所述点样溶液由1w/v％～5w/v％的甘油水溶液、1w/v％～5w/v％的山梨醇水溶液、0.01v/v％-0.05v/v％的曲拉通水溶液、DMSO及PBS溶液按照体积比为5～20：15～25：0.1～0.5：10～50:100混合，所述的PBS溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成，pH范围为6.6～6.8的磷酸盐缓冲液。本发明在常用的点样液PBS或者有机溶剂的基础上加入一定量的甘油溶液、山梨醇溶液和曲拉通溶液，其能通过调配液体蒸发速率，扩散速率以及抑制溶液的结晶速率来达到使蛋白质以更佳的方式固着在芯片的表面。
本发明提供的点样溶液，其为甘油溶液、山梨醇溶液、曲拉通溶液、DMSO溶液及PBS溶液组成的混合溶液，通过调配其中的比例，即可达到不同蛋白的点样需求，因此本领域技术人员可以通过具体配比的变化实现不同蛋白的点样要求。
甘油水溶液含量可以选自1w/v％、1.1w/v％、1.2w/v％、1.3w/v％、1.4w/v％、1.5w/v％、1.6w/v％、1.7w/v％、1.8w/v％、1.9w/v％、2.0w/v％、2.1w/v％、2.2w/v％、2.3w/v％、2.4w/v％、2.5w/v％、2.6w/v％、2.7w/v％、2.8w/v％、2.9w/v％、3.0w/v％、3.1w/v％、3.2w/v％、3.3w/v％、3.4w/v％、3.5w/v％、3.6w/v％、3.7w/v％、3.8w/v％、3.9w/v％、4.0w/v％、4.1w/v％、4.2w/v％、4.3w/v％、4.4w/v％、4.5w/v％、4.6w/v％、4.7w/v％、4.8w/v％、4.9w/v％、5w/v％。
山梨醇水溶液含量可以选自1w/v％、1.1w/v％、1.2w/v％、1.3w/v％、1.4w/v％、1.5w/v％、1.6w/v％、1.7w/v％、1.8w/v％、1.9w/v％、2.0w/v％、2.1w/v％、2.2w/v％、2.3w/v％、2.4w/v％、2.5w/v％、2.6w/v％、2.7w/v％、2.8w/v％、2.9w/v％、3.0w/v％、3.1w/v％、3.2w/v％、3.3w/v％、3.4w/v％、3.5w/v％、3.6w/v％、3.7w/v％、3.8w/v％、3.9w/v％、4.0w/v％、4.1w/v％、4.2w/v％、4.3w/v％、4.4w/v％、4.5w/v％、4.6w/v％、4.7w/v％、4.8w/v％、4.9w/v％、5w/v％。
曲拉通水溶液含量可以选自0.01v/v％、0.02v/v％、0.03v/v％、0.04v/v％、0.05v/v％。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白质芯片的点样溶液中，所述甘油水溶液为1w/v％-5w/v％的甘油水溶液，所述山梨醇水溶液为1w/v％-5w/v％的山梨醇水溶液，所述曲拉通水溶液为0.01v/v％-0.05v/v％的曲拉通水溶液，所述的PBS溶液为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，按照49.5:51的体积比进行混合。
本发明所提供的蛋白质溶液，用于点样过程中，能够明显改善因蒸发速率或者扩散速率而影响的蛋白质与基底结合不充分的情况，并且能够明显改善蛋白质的反应性，使得最终结果的识读时，靶标蛋白质的发光区域或者显色区域能够更均匀的呈现，避免溢出或者咖啡斑现象出现。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白质芯片的点样溶液中，所述甘油水溶液为5w/v％的甘油水溶液，所述山梨醇水溶液为5w/v％的山梨醇水溶液，所述曲拉通水溶液为0.05v/v％的曲拉通水溶液。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白质芯片的点样溶液中，所述点样溶液由5w/v％的甘油水溶液、5w/v％的山梨醇水溶液、0.05v/v％的曲拉通水溶液、DMSO及PBS溶液或有机溶剂按照体积比为10：15：0.1：50:100混合，所述的PBS溶液为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，按照49.5:51的体积比进行混合，pH值为6.8的PBS溶液；所述蛋白质为伪狂犬gD蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白质芯片的点样溶液中，所述点样溶液由5w/v％的甘油水溶液、5w/v％的山梨醇水溶液、0.05v/v％的曲拉通水溶液、DMSO及PBS溶液或有机溶剂按照体积比为10：15：0.5：20：100混合，所述的PBS溶液为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，按照49.5:51的体积比进行混合，pH值为6.8的PBS溶液；所述蛋白质为霉菌毒素抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白质芯片的点样溶液中，所述点样溶液由5w/v％的甘油水溶液、5w/v％的山梨醇水溶液、0.05v/v％的曲拉通水溶液、DMSO及PBS溶液或有机溶剂按照体积比为20：20：0.3：10：100混合，所述的PBS溶液为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，按照49.5:51的体积比进行混合，pH值为6.8的PBS溶液；所述蛋白质为禽用抗生素抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白质芯片的点样溶液中，所述点样溶液由5w/v％的甘油水溶液、5w/v％的山梨醇水溶液、0.05v/v％的曲拉通水溶液、DMSO及PBS溶液或有机溶剂按照体积比为10：25：0.5：10：100混合，所述的PBS溶液为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，按照49.5:51的体积比进行混合，pH值为6.8的PBS溶液；所述蛋白质为轮状病毒抗体。
本发明还提供一种上述点样溶液的制备方法，将甘油溶液、山梨醇溶液、曲拉通溶液、DMSO及PBS溶液按照体积比为5～20：15～25：0.1～0.5：10～50:100混合，充分溶解并搅匀后，即得到本发明的可适用于多种蛋白点样，并能优化实验性能的点样溶液。
所述的甘油溶液为1w/v％-5w/v％的甘油水溶液；
所述的山梨醇溶液为1w/v％-5w/v％的山梨醇水溶液；
所述的曲拉通溶液为0.01v/v％-0.05v/v％的曲拉通水溶液；
所述的PBS溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠按照一定比例混合配制而成的磷酸盐缓冲液，pH范围为6.6-6.8。
本发明还提供一种优化蛋白质芯片中点样溶媒的方法，通过优化点样溶媒以后，点样更稳定，蛋白质样品点形状更规整，固着更稳定，避免蛋白质溢出或显色不均匀或明显大小点的现象。
附图说明
图1为以50％DMSO为点样溶液的gD蛋白点样图片；
图2为以实施例1制备的gD蛋白的点样液的点样图片；
图3为以50％DMSO为点样溶液的霉菌毒素抗原点样图片；
图4为以实施例2制备的霉菌毒素抗原的点样溶液的点样图片；
图5为以50％DMSO为点样溶液的禽用抗生素抗原点样图片；
图6为以实施例3制备的禽用抗生素抗原的点样溶液的点样图片；
图7为以50％DMSO为点样溶液的轮状病毒抗体点样图片；
图8为以实施例4制备的轮状病毒抗体的点样溶液的点样图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1配制适用于伪狂犬gD蛋白抗原的点样溶液
1.1试剂：
甘油、山梨醇、曲拉通、DMSO、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、纯化水。
1.2配制方法：
5％甘油溶液的配制：精密称定5.00g甘油置100ml容量瓶中，加少量纯化水轻轻旋转使其溶解充分，避免产生过多气泡，再加纯化水置刻度线；上下翻转振摇10次，备用；
5％山梨醇溶液的配制：精密称定5.00g山梨醇置250ml烧杯中，加适量纯化水并搅拌使其完全溶解，再完全转移至100ml容量瓶中，加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用；
0.05％曲拉通溶液的配制：用移液枪量取50μl曲拉通置100ml容量瓶中，加适量纯化水使其完全溶解，再加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用；
DMSO溶液：直接采用DMSO试剂即可；
PBS溶液配制：先配置0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，再将两者按照49.5:51的体积比进行混合，得到pH值为6.8的磷酸盐缓冲液；
将上述溶液按照10：15：0.1：50：100的比例混合均匀后，成为适用于伪狂犬gD蛋白的点样液，标为gD蛋白点样液。
1.3对比试验
常用的50％DMSO为点样溶液，与上述gD蛋白的点样液进行点样对比，如图1～2所示，图1是以50％DMSO为点样溶液，图2是以gD蛋白的点样液为点样溶液。
结果显示，图1中，以50％的DMSO为点样液，样品点边缘颜色明显偏重，中心发白；且部分样品点边缘不清晰，样品点扩散；这种俗称为“咖啡斑现象”，且这种现象的产生易造成数据读取偏差较大，影响结果判定。而在图2中，改进点样溶媒后，以gD蛋白的专用点样液进行点样后，样品点形状规整，显色均匀，无咖啡斑现象，说明调整溶媒后，蛋白的反应趋势整体稳定。
实施例2配制适用于霉菌毒素抗原的点样液
2.1试剂：
同1.1。
2.2配制方法：
五种溶液配制同1.2。
将上述五种溶液按照10：15：0.5：20：100的比例混合均匀后，成为适用于霉菌毒素抗原的点样液，标为霉菌毒素抗原点样液。
2.3对比试验
常用的50％DMSO为点样溶液，与上述霉菌毒素抗原点样液进行点样对比，如图3～4所示，图3是以50％DMSO为点样溶液，图4是以霉菌毒素抗原点样液为点样溶液。
结果显示，图3中，以50％的DMSO作为霉菌毒素抗原点样液，样品点甩尾严重，边缘模糊，且显色区域混乱，无法进行精准读数和结果判定，严重影响芯片的精密性。而在图4中，改进点样溶媒后，以霉菌毒素抗原的专用点样液进行点样后，样品点矩阵规整，显色均匀，边缘清晰，无甩尾现象，说明调整溶媒后，蛋白的反应趋势整体稳定，点样溶媒对于蛋白在基材表面的固着方式有显著影响。
实施例3配制适用于禽用抗生素抗原的点样溶液
3.1试剂：
同1.1。
3.2配制方法：
五种溶液配制同1.2。
将上述五种溶液按照20：20：0.3：10：100的比例混合均匀后，成为适用于禽用抗生素抗原的点样溶液，标为禽用抗生素抗原点样液。
1.3对比试验
常用的50％DMSO为点样溶液与上述禽用抗生素抗原点样液进行点样对比，如图5～6所示，图5是以50％DMSO为点样溶液，图6是以禽用抗生素抗原点样液为点样溶液。
结果显示，图5中，以50％的DMSO为点样液，对于不同样品，50％的DMSO呈现出不同的点样情况，对于每个孔中间6个样品点，分别代表禽用6种抗生素抗原，有的抗原扩张明显，有的抗原紧缩明显，无法呈现均匀的显色状态，且同一抗原在不同孔内大小不均匀。如若点样液与抗原无法均匀混合，或点样液与基材表面结合不佳，影响结果判定。而在图6中，改进点样溶媒后，以禽用抗生素抗原的专用点样液进行点样，且调整点样矩阵后，样品点形状规整，个孔样品点直径均一，显色均匀，无咖啡斑现象，能够根据实验设计呈现梯度显色和准确的实验结果。说明调整溶媒后，蛋白的反应趋势整体稳定。
实施例4配制适用于轮状病毒抗体的点样溶液
4.1试剂：
同1.1。
4.2配制方法：
五种溶液配制同1.2。
将上述五种溶液按照10：25：0.5：10：100的比例混合均匀后，成为适用于轮状病毒抗体的点样溶液，标为轮状病毒抗体点样液。
1.3对比试验
常用的50％DMSO为点样溶液，与上述轮状病毒抗体点样液进行点样对比，如图7～8所示，图7是以50％DMSO为点样溶液，图8是以轮状病毒抗体点样液为点样溶液。
结果显示，图7中，以50％的DMSO为点样液，对于不同样品，50％的DMSO依然呈现样品点中心脱色严重，边缘颜色明显偏重的“咖啡斑现象”，这种现象的产生易造成数据读取偏差较大，影响结果判定。这还是说明DMSO点样液没有将蛋白以最佳的方式固定在基材表面。而在图8中，改进点样溶媒后，以轮状病毒抗体点样液进行点样，且调整点样矩阵后，样品点形状规整，个孔样品点直径均一，显色均匀，无咖啡斑现象，能够根据实验设计呈现梯度显色和准确的实验结果。说明调整溶媒后，蛋白的反应趋势整体稳定。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种蛋白质芯片的点样溶液，其中，所述点样溶液由5w/v％的甘油水溶液、5w/v％的山梨醇水溶液、0.05v/v％的曲拉通水溶液、DMSO及PBS溶液按照体积比为5～20：15～25：0.1～0.5：10～50:100混合，所述的PBS溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成，pH范围为6.6～6.8的磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的蛋白质芯片的点样溶液，其中，所述的PBS溶液为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，按照49.5:51的体积比进行混合。
3.根据权利要求1所述的蛋白质芯片的点样溶液，其中，所述点样溶液由5w/v％的甘油水溶液、5w/v％的山梨醇水溶液、0.05v/v％的曲拉通水溶液、DMSO及PBS溶液或有机溶剂按照体积比为10：15：0.1：50:100混合，所述的PBS溶液为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，按照49.5:51的体积比进行混合，pH值为6.8的PBS溶液；所述蛋白质为伪狂犬gD蛋白。
4.根据权利要求1所述的蛋白质芯片的点样溶液，其中，所述点样溶液由5w/v％的甘油水溶液、5w/v％的山梨醇水溶液、0.05v/v％的曲拉通水溶液、DMSO及PBS溶液或有机溶剂按照体积比为10：15：0.5：20：100混合，所述的PBS溶液为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，按照49.5:51的体积比进行混合，pH值为6.8的PBS溶液；所述蛋白质为霉菌毒素抗原。
5.根据权利要求1所述的蛋白质芯片的点样溶液，其中，所述点样溶液由5w/v％的甘油水溶液、5w/v％的山梨醇水溶液、0.05v/v％的曲拉通水溶液、DMSO及PBS溶液或有机溶剂按照体积比为20：20：0.3：10：100混合，所述的PBS溶液为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，按照49.5:51的体积比进行混合，pH值为6.8的PBS溶液；所述蛋白质为禽用抗生素抗原。
6.根据权利要求1所述的蛋白质芯片的点样溶液，其中，所述点样溶液由5w/v％的甘油水溶液、5w/v％的山梨醇水溶液、0.05v/v％的曲拉通水溶液、DMSO及PBS溶液或有机溶剂按照体积比为10：25：0.5：10：100混合，所述的PBS溶液为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，按照49.5:51的体积比进行混合，pH值为6.8的PBS溶液；所述蛋白质为轮状病毒抗体。
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