CN103983640A

CN103983640A - 一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法

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Publication number: CN103983640A
Application number: CN201410234522.8A
Authority: CN
Inventors: 邱实; 刘箐
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2014-08-13

Abstract

本发明一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，包括一个配置点样缓冲液的步骤，所述的点样缓冲液由丽春红、甘油、Na₂CO₃、NaHCO₃和去离子水组成；还包括一个制造蛋白质芯片的步骤，采用上述的点样缓冲液稀释待点样物质至工作浓度后在固相基片上进行点样，制得蛋白质芯片；还包括一个图像分析的步骤，采用图像软件或者肉眼观察分析点样后样点的圆润及均匀程度。本发明将丽春红染色剂加入到点样缓冲液中，使得该缓冲液呈现红色，并用该缓冲液稀释待点样物质，于固相基片上点样，使得蛋白质芯片上的样点在芯片使用前即可通过图像软件或目视观察分析。本发明可作为蛋白质芯片批量化生产的一种质量控制的方法。

Description

一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种蛋白质芯片，具体来说是一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法。

背景技术：

生物芯片技术是上世纪90年代初发展起来的一种高通量、大规模并行分析检测技术,曾被Science杂志两度评为年度十大科技突破之一，它是利用分子间特异相互作用的原理，将多种技术(如生物化学、微加工、微电子、计算机等)融为一体的一项分析检测技术。与传统分析检测方法所不同的是，它形成的微阵列使生化分析反应过程高度集成于某一载体之上，高通量地分析检测成百上千种DNA、RNA、多肽、蛋白质等分子。目前常见的生物芯片有：基因芯片、蛋白质芯片、糖芯片以及其他小分子生物芯片。

在基因组学的研究背景下，为了满足人类对数以万计基因功能的大规模研究，基因芯片应运而生。基因芯片是依据碱基互补配对原则，将大量已知序列的核酸探针高密度有序固定于某一载体表面，从而对待检样品中大量核酸成分进行分析检测的技术，其高通量、快速、简便等优点满足了人们对基因的大规模分析检测的需求。目前，基因芯片主要应用于基因表达检测、杂交测序、疾病预测和诊断等领域。但是，基因水平上的研究只能初步了解基因表达产物的变化，而作为直接影响生命活动变化的蛋白质则需要经过转录、翻译、加工等多个调控步骤才能形成，所以对其功能和结构的研究将具有重大的科学意义。随着蛋白组学研究的兴起，如同起初对基因组学的研究一样，在利用传统方法对蛋白质组功能进行分析研究时，同样遇到了现有技术耗时、繁琐、通量低等一系列问题。在弥补这些研究方法缺陷时，人们自然而然地模仿了基因芯片的原理，从而研制出了蛋白质芯片。

蛋白质芯片是将各种蛋白质(如抗原、抗体)、多肽以及受体、配体等有序固定于某一载体(如滤膜、凝胶、玻片、纳米微珠和微孔板)之上，以分析检测样品中能与之特异相互作用的成分。虽然蛋白质芯片是在蛋白质组学的研究背景下产生的，但其应用不仅仅只局限于蛋白质组学。凡是有关抗体—抗原、蛋白质—蛋白质、蛋白质—核酸、蛋白质—脂类、蛋白质—小分子以及酶与底物相互作用的研究中，蛋白质芯片技术均有其独特的用途。目前主要应用于蛋白质组学、食品检验、疾病诊断、药物筛选、农林畜牧业、司法鉴定等领域。

虽然，蛋白质芯片经过20多年的发展，但目前所遇到的问题及技术难点仍较多，其中一难点即是，固相蛋白质芯片上样点的质量控制问题。因当前在蛋白质芯片的实际应用中，所使用的点样缓冲液多为无色的碳酸盐或磷酸盐缓冲液，使得芯片在点样后样点仍成无色状态，导致芯片在使用前无法对其样点的形态进行预判，样点是否呈现圆润的状态，是否会在检测显色后呈现“咖啡环”现象，从而严重影响定量检测信号值的读取，甚至点样物质是否已经点在基片上，这些都无从知晓，而现今并没有一种方法可以解决上述蛋白质芯片质量控制的问题。

丽春红(Ponceau S)，是煤焦油提炼出来的原料合成的偶氮染料，作为一种生物染色剂使用，可用于硝酸纤维素膜、PVDF膜和醋酸纤维素膜上蛋白质的检测。丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白质的非极性区域相结合，从而在膜上形成红色的斑点或条带。丽春红对蛋白质的染色是可逆的，染色后可以用PBST，蒸馏水或其它适当溶液洗去。

发明内容：

针对上述现有蛋白质芯片制备技术中存在的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，所述的这种蛋白质芯片样点质控及示踪方法要解决现有技术中的蛋白质芯片的质量不能有效控制的技术问题。

本发明提供了一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，包括一个配置点样缓冲液的步骤，所述的点样缓冲液由丽春红、Na₂CO₃、NaHCO₃、甘油和去离子水组成，所述的甘油和去离子水的体积比为3:1～1:20，在所述的点样缓冲液中，所述的Na₂CO₃的质量百分比浓度为0.05％～1％，所述的NaHCO₃的质量百分比浓度为0.05％～2％，所述的丽春红的质量百分比浓度为0.01％～50％；还包括一个制造芯片的步骤，采用上述的点样缓冲液稀释待点样物质至工作浓度后在固相基片上进行点样，制得蛋白质芯片；还包括一个图像分析的步骤，在所述的图像分析的步骤中，采用图像软件分析蛋白质芯片点样后使用前样点的变异系数或者肉眼观察分析样点的圆润及均匀程度。

进一步的，在点样的过程中，在55％的相对湿度下进行点样。

进一步的，在点样的过程中，点样的环境温度控制在19～21℃。

进一步的，在制造芯片的过程中，还包括一个点样物质固定的过程，在所述的点样物质固定的过程中，采用37℃2小时的方式对点样物质进行固定。

进一步的，对图像分析后对芯片进行封闭，在封闭的过程中，样点中的丽春红成分被PBST缓冲液洗脱至无色，然后再进行杂交、显色。

进一步的，所述的待点样物质可为抗体、抗原、多肽、受体、配体中的任意一种。

进一步的，所述的固相基片中可以采用包括硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、PVDF膜、玻片、硅片、凝胶、微孔板等固相基片中的任意一种。

进一步的，所述的点样缓冲液的pH为7～11。

进一步的，以1L来计算，在所述的点样缓冲液中，Na₂CO₃为1.59g，NaHCO₃为2.93g，丽春红为10g，甘油为100mL，余量为去离子水。

具体的，采用图像软件分析蛋白质芯片点样后使用前样点的变异系数或者肉眼观察分析样点的圆润及均匀程度，从而对蛋白质芯片在显色后的样点起一个预判、示踪的作用，并对整个蛋白质芯片起到一个质量控制的作用。

本发明将丽春红染色剂直接加入到蛋白质芯片的点样缓冲液中，使得该点样缓冲液呈现红色，并用该点样缓冲液稀释待点样物质，于固相基片上点样，可在点样处形成一个红色的样点，通过成像并用图像软件或肉眼观察分析样点，即可在蛋白质芯片使用前就能分析预判样点的圆润及均匀程度，而在蛋白质芯片完成封闭或杂交步骤后样点中的丽春红即可被洗脱至无色，并不影响后续的显色效果。本发明可作为蛋白质芯片批量化生产的一种质量控制的方法。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明通过在点样缓冲液中添加丽春红染色剂的方法，使得点样物质在点样后，即可通过丽春红染色的作用，在蛋白质芯片点样后使用前对蛋白质芯片检测样点的圆润及均匀程度作一预判，从而达到蛋白质芯片批量化生产质量控制的作用。

附图说明：

图1单检蛋白质芯片点样后使用前实物图。

图2单检蛋白质芯片检测显色后实物图。

图3多检蛋白质芯片点样后使用前实物图。

图4多检蛋白质芯片检测显色后实物图。

具体实施方式：

本发明提供了一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，包括一个配置点样缓冲液的步骤；还包括一个制备蛋白质芯片的步骤；还包括一个样点图像分析的步骤。就当前通用技术而言，在蛋白质芯片的点样环节中，所使用的点样缓冲液均为无色的碳酸盐或磷酸盐缓冲液。本发明采用添加丽春红的有色点样缓冲液，使得蛋白质芯片在点样完成后即可使样点呈现红色，并在后续的封闭或杂交过程中，有色的丽春红即被洗脱至无色，不会影响后续检测的显色效果。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1 一种食源性致病菌单检蛋白质芯片的质量控制

如图1所示，一种食源性致病菌单检蛋白质芯片点样后使用前的实物图，其中包括3个平行的检测样点、3个平行的阴性对照点、3个平行的阳性对照点。点样完成后即对该蛋白质芯片进行成像处理，并用图像软件分析该蛋白质芯片有色样点的变异系数或用肉眼观察分析样点的圆润及均匀程度，以确保该变异系数、圆润及均匀程度在一个可接受的范围内，不会对后续定量或定性检测造成较大的影响。图2为该蛋白质芯片检测显色后实物图。

具体方法为：

(一)配制点样缓冲液

将适宜量的丽春红加入到碳酸盐缓冲液中，配制成点样缓冲液。以1L来计算，在所述的点样缓冲液中，Na₂CO₃为1.59g，NaHCO₃为2.93g，丽春红为10g，甘油为100mL，余量为去离子水。

(二)制备蛋白质芯片

用上述配制好的点样缓冲液稀释该种致病菌的抗体至工作浓度，用蛋白质芯片点样仪进行点样。其中阴性对照为上述配制好的点样缓冲液，阳性对照为用上述点样缓冲液稀释至工作浓度的阳性质控蛋白。

(三)样点图像分析

对制备好的蛋白质芯片进行成像，用图像软件分析该蛋白质芯片样点的变异系数或用肉眼观察分析样点的圆润及均匀程度，以确保该变异系数、圆润及均匀程度在一个可接受的范围内，不会对后续定量或定性检测造成较大的影响。具体地说，该变异系数一般在0～5％之间，如若超过5％，则会对后续定量或定性检测造成较大影响，应判定该蛋白质芯片为不合格产品。

实施例2 一种食源性致病菌多检蛋白质芯片的质量控制

如图3所示，一种食源性致病菌多检蛋白质芯片点样后使用前的实物图，其中包括3组3个平行的检测样点、3个平行的阴性对照点、3个平行的阳性对照点。点样完成后即对该蛋白质芯片进行成像处理，并用图像软件分析该蛋白质芯片有色样点的变异系数或用肉眼观察分析样点的圆润及均匀程度，以确保该变异系数、圆润及均匀程度在一个可接受的范围内，不会对后续定量或定性检测造成较大的影响。图4为该蛋白质芯片检测显色后实物图。

具体方法为：

(一)配制点样缓冲液

(二)制备蛋白质芯片

用上述配制好的点样缓冲液稀释该3种致病菌的抗体至工作浓度，用蛋白质芯片点样仪进行点样。其中阴性对照为上述配制好的点样缓冲液，阳性对照为用上述点样缓冲液稀释至工作浓度的阳性质控蛋白。

(三)样点图像分析

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，包括一个配置点样缓冲液的步骤，其特征在于：所述的点样缓冲液由丽春红、Na₂CO₃、NaHCO₃、甘油和去离子水组成，所述的甘油和去离子水的体积比为3:1～1:20，在所述的点样缓冲液中，所述的Na₂CO₃的质量百分比浓度为0.05％～1％，所述的NaHCO₃的质量百分比浓度为0.05％～2％，所述的丽春红的质量百分比浓度为0.01％～50％；还包括一个制造芯片的步骤，采用上述的点样缓冲液稀释待点样物质至工作浓度后在固相基片上进行点样，制得蛋白质芯片；还包括一个图像分析的步骤，在所述的图像分析的步骤中，采用图像软件分析蛋白质芯片点样后使用前样点的变异系数或者肉眼观察分析样点的圆润及均匀程度。

2.如权利要求1所述的一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，其特征在于：在点样的过程中，在55％的相对湿度下进行点样。

3.如权利要求1所述的一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，其特征在于：在点样的过程中，点样的环境温度控制在19～21℃。

4.如权利要求1所述的一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，其特征在于：在制造芯片的过程中，还包括一个点样物质固定的过程，在所述的点样物质固定的过程中，采用37℃2小时的方式对点样物质进行固定。

5.如权利要求1所述的一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，其特征在于：对图像分析后对芯片进行封闭，在封闭的过程中，样点中的丽春红成分被PBST缓冲液洗脱至无色，然后再进行杂交、显色。

6.如权利要求1所述的一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，其特征在于：所述的待点样物质可为抗体、抗原、多肽、受体、配体中的任意一种。

7.如权利要求1所述的一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，其特征在于：所述的固相基片中可以采用包括硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、PVDF膜、玻片、硅片、凝胶、微孔板等固相基片中的任意一种。

8.如权利要求1所述的一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，其特征在于：所述的点样缓冲液的pH为7～11。

9.如权利要求1所述的一种蛋白质芯片样点质控及示踪方法，其特征在于：以1L来计算，在所述的点样缓冲液中，Na₂CO₃为1.59g，NaHCO₃为2.93g，丽春红为10g，甘油为100mL，余量为去离子水。