WO2015151511A1 - 標準試料製造方法 - Google Patents

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cell
nucleic acid
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cells
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和美 橘田
令王奈 高畠
潤一 真野
剛華 郎
裕樹 中江
布藤　聡
淳治 吉井
Original Assignee
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
特定非営利活動法人バイオチップコンソーシアム
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a standard sample having the same target sequence as a DNA fragment having a target sequence having a specific copy number.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • ISO 17025 requires validation of analytical methods to manage the quality of analysis. Validation of an analytical method means to objectively evaluate the performance of the analytical method used and confirm that the standard is satisfied according to the purpose of use. Items for performance evaluation include specificity and detection limit.
  • the PCR method enables nucleic acid amplification from one molecule because of its technical characteristics, but individual analysis methods using PCR detect from one molecule depending on the composition of the reaction solution and the performance of the PCR device. However, it cannot always be said that it is possible, so it is necessary to evaluate the detection limit of PCR analysis for each analysis method.
  • nucleic acid samples obtained by diluting a plasmid nucleic acid or a genomic nucleic acid containing a target sequence to a certain concentration have been used for evaluation of the detection limit of PCR analysis.
  • the detection limit concentration is evaluated by analyzing a nucleic acid solution sample diluted to a level that theoretically contains 1 to several molecules of plasmid nucleic acid or genomic nucleic acid by PCR and examining the presence or absence of detection or the detection rate. Yes.
  • the number of target nucleic acid molecules finally added to the PCR reaction solution is not constant due to the chance of sampling and varies greatly from reaction to reaction solution. Will have. For this reason, it has been extremely difficult to accurately evaluate the detection limit concentration in PCR analysis.
  • Real-time PCR is a technology that detects fluorescence corresponding to nucleic acid amplification in a PCR process in a timely manner and enables quantitative measurement of the number of initial template nucleic acid molecules in a reaction solution. Have been used.
  • a calibration curve that associates the measurement result with the number of molecules of the target nucleic acid is created.
  • a solution sample group in which a plasmid nucleic acid or a genomic nucleic acid containing a PCR target base sequence is diluted stepwise has been used as a standard sample for preparing a calibration curve.
  • a pre-measurement process pre-analysis
  • a measurement process a measurement process
  • a post-measurement process various gene analysis techniques, including PCR, are used, but the measurement accuracy is the largest factor in the measurement process (pre-analysis) from sample collection to pretreatment of test materials. It is known to affect. For this reason, in the pre-measurement process (pre-analysis), among several issues, the physical properties, chemical properties, presence of interfering substances that are growth inhibitors, etc., especially the properties of the specimens are diverse.
  • Non-Patent Document 1 a nucleic acid solution sample in a state as close to an actual sample as possible is desired as a nucleic acid solution sample with a specified number of molecules for determining the qualitative limit and the quantitative limit.
  • nucleic acid solution sample in which the number of molecules of nucleic acid that is the target of PCR is strictly defined is necessary to accurately evaluate the detection limit in the analysis method using PCR and to create a calibration curve for real-time PCR. Has been.
  • a calibration curve is created that associates the measurement results with the number of target nucleic acid molecules.
  • a solution sample group in which a nucleic acid containing a PCR target base sequence has been diluted stepwise has been used as a standard sample for preparing a calibration curve.
  • a sample having a low molecular number of about 1 to several molecules is used. Since the number of target nucleic acid molecules finally added to the PCR reaction solution varies greatly, a calibration curve that can accurately define the number of molecules down to the low molecular number side is created stably. It was difficult.
  • nucleic acid solution sample in a state that is retained in the cell, close to the real sample, and contains various factors reflecting the chemical modification and the ratio of the number of cells to nucleic acid molecules determines the qualitative limit and quantification limit For this reason, it has been desired as a nucleic acid solution sample having a defined number of molecules. However, in the methods proposed so far, it has been practically impossible to prepare a nucleic acid solution because a synthetic nucleic acid is used.
  • An object of the present invention is to produce a standard sample having the same target sequence as a DNA fragment having a target sequence having a specific copy number.
  • One aspect of the present invention is a method for producing a standard sample, which is a method for producing a standard sample having the same target sequence as a DNA fragment having a target sequence having a specific copy number, and having a specific copy number.
  • the method includes an introduction step of introducing a DNA fragment having a target sequence into a cell, a culture step of culturing the cell, and an isolation step of isolating the cultured cell.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram of a standard sample manufacturing method in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram of transgene copy number confirmation in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of the synchronization confirmation in the G0 / G1 period in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of a method for collecting one cell by a manipulator in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram for confirming the standard sample produced in one embodiment of the present invention.
  • the standard sample production method of the present invention is a method for producing a standard sample having the same target sequence as a DNA fragment having a specific copy number of a target sequence, and introducing a DNA fragment having a specific copy number of the target sequence into a cell.
  • budding yeast is used as a cell, and a DNA fragment is introduced into the chromosome of budding yeast by homologous recombination using an artificially synthesized gene. Synchronized culture is performed in synchronization with the G0 / G1 phase, and isolation is performed by fixing the budding yeast in the G1 phase in the isolation step.
  • One cell of the isolated budding yeast contains one copy of the target sequence. May be.
  • the gene YER053C may be used as a target for homologous recombination.
  • one cell in the isolation step, one cell may be sorted per well using a capillary whose tip angle is set within an angle range of 20 degrees to 30 degrees.
  • the standard sample is a nucleic acid
  • the nucleic acid may contain DNA or RNA.
  • a standard sample having the same target sequence as a DNA fragment having a target sequence having a specific copy number can be produced.
  • the standard sample manufacturing method of the present embodiment is used for genetic testing to detect nucleic acids such as DNA and RNA, and is used for food testing, medical diagnosis, and the like.
  • the standard sample manufacturing method of embodiment of this invention is realizable with the following structures and methods, it is not restricted only to the structure and method shown here.
  • a standard sample reflecting cell modifications and cell contents can be produced by combining introduction of a target gene into cells and cell sorting.
  • a standard sample is prepared by introducing a DNA fragment having a gene sequence having a predetermined copy number into a cell.
  • the cells to be used may be any cells as long as they can be cultured and introduced by gene and can control the cell cycle.
  • the target molecule is usually a diploid at a minimum. Therefore, in order to obtain a target of one molecule, the time of the haploid is in the stage that can be synchronized in the cell cycle. Some cells need to be used.
  • the cells can be selected according to the purpose of use of the standard sample, such as those close to the biological species of the real specimen or cells such as yeast that are easy to handle.
  • the culture medium for culturing cells a medium suitable for the growth of the target cells can be selected.
  • the detection target for constituting the standard sample can be selected according to the use of the standard sample.
  • the gene sequence to be treated as a target need not be single, and a nucleic acid fragment in which a plurality of gene sequences are linked in tandem can be used.
  • a target sequence for homologous recombination needs to be linked in tandem, and a population-synthesizing gene composed of these elements can be used.
  • these may be those obtained by amplifying gene sequences existing in nature using the PCR method, or by cutting and purifying them using restriction enzymes.
  • the target of homologous recombination affects the copy number and growth in the genome for the production of recombinant cells by homologous recombination using the target gene and nucleic acid having the target gene sequence for homologous recombination It is desirable to select in consideration of Introduction of the nucleic acid into cells, that is, transformation can be performed using a commercially available reagent. In some cases, an electrical method such as an electroporation method may be used.
  • the synchronization that aligns the cell cycle can be selected to suit the cell.
  • a low serum culture method a double thymidine synchronization method, and synchronization with a tubulin polymerization inhibitor can be considered.
  • a method specific to the cell can be used.
  • a sex hormone pheromone
  • Cell sorting can be performed with a single cell sorter (for example, PERFLOW (registered trademark) Sort: Furukawa Electric) or a micromanipulator.
  • PERFLOW registered trademark
  • Sort Furukawa Electric
  • the sample prepared in this way is a living cell, and the detection target of the desired number of molecules is included therein, and cells from one molecule to the desired number of molecules are subjected to a gene-related test.
  • the sample can be collected and provided in a form close to that of the specimen.
  • one copy is introduced into a cell, and after confirming that it is one copy, the cell cycle is determined. Stop, take a desired number of cells, and create a standard sample using a technique that simultaneously defines the number of molecules by defining the number of cells. Therefore, it is possible to stably supply a standard substance containing a very small amount of nucleic acid close to the state of a real sample, which has been impossible until now. If such a single molecule standard substance is put into practical use, it becomes possible to evaluate the detection ability of a commercially available PCR apparatus using a specimen. Moreover, in the PCR test, an absolute evaluation of the lower limit of detection and the lower limit of quantification in an environment close to the case where an actual sample is used can be performed.
  • Saccharomyces cerevisiae w303-1a (MATa, ade2-1 ura3-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100) was used as a carrier cell for one copy of the target DNA sequence for the production of recombinants (See FIG. 1).
  • YDP medium 1% (w / w) bacto yeast extract, 2% (w / w) bactopeptone, 2% (w / w) glucose was used.
  • An artificial gene was constructed as a model to be detected.
  • the target sequence was created by Over lapping PCR so that the homologous regions of zeocin resistance gene, GFP gene and YER053C were arranged in tandem, and an artificial gene for homologous recombination was synthesized (see FIG. 1).
  • YER053C Mitochondrial phosphate-transporter-like protein
  • ⁇ -factor Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA
  • yeast synchronized with the G0 / G1 phase was suspended in 1/15 M PBS (pH 7.0) and ultrasonically dispersed for 10 seconds. After washing twice with 1/15 M PBS, it was centrifuged at 4000 g for 5 minutes, and suspended in 5 mL of 5 ⁇ g / ml ⁇ -factor / 1/15 M PBS. The cell suspension was poured into a petri dish (50 ⁇ 9 mm BD Falcon Petri dishes, BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA), and the tip of the capillary (M205 FA, Leica) was observed by a manipulator under observation with a stereomicroscope (M205 FA, Leica).
  • the standard sample was confirmed by amplifying the target sequence from one cell by real-time PCR.
  • 620 ng Zymolase T100 (105 kU / g, Nakalai Tesque, Kyoto, Japan) was added per well and incubated at 35 ° C. for 90 minutes to decompose the cell wall.
  • Universal Master Mix (ABI)
  • 16.7 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ mol primer and 6.5 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ mol FAM / TAMRA TaqMan probe were added, and PCR was performed with an ABI PRISM 7900HT real-time PCR system.
  • PCR conditions are 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 30 seconds for one cycle, 95 ° C. for 30 seconds, and 59 ° C.
  • PCR was performed using a standard plasmid pTRPWRKY diluted with a 5 ng / ⁇ l ColE1 (Nippon Gene Co., Tokyo, Japan) solution as a template, and used to prepare a calibration curve. Thereby, a calibration curve could be created and the requirements as a standard sample were confirmed (see FIG. 5).
  • the method for producing a standard sample according to the present invention has an effect that a standard sample having the same target sequence as a DNA fragment having a target sequence having a specific copy number can be manufactured, for food inspection and medical diagnosis. It is useful for genetic testing of

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Abstract

　特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料の製造方法を提供する。特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片を細胞に導入した後、細胞を培養し、培養した細胞を単離する。このようにして、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料が作製される。

Description

標準試料製造方法
　本発明は、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料の製造方法に関する。
　ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、臨床診断や法医学検査、食品分析など幅広い分野において核酸分析技術として利用されている。近年、ＰＣＲ検査を含めた様々な分析について、分析結果の信頼性を保証することが求められており、ＩＳＯ１７０２５をはじめとする国際規格が作成されている。国際的な商業活動においては、こうした国際規格を満たした分析により商品の品質管理が行われていることが取引の可否につながる場合もあり、分析の信頼性保証に関連する技術は産業的にも重要性が高まっている。
　ＩＳＯ１７０２５では、分析の質の管理のために、分析法の妥当性確認が要求されている。分析法の妥当性確認とは、使用する分析法の性能を客観的に評価し、使用する目的に応じて基準を満たしていることを確認することである。性能評価を行う項目としては、特異性や検出限界などが挙げられる。ＰＣＲ法は、その技術的特性から１分子からの核酸増幅が可能とされているが、ＰＣＲを用いた個別の分析法は、反応液の組成やＰＣＲ装置の性能に応じて１分子からの検出が可能とは必ずしもいうことができないため、分析法毎にＰＣＲ分析の検出限界の評価が必要となっている。ＰＣＲ分析の検出限界の評価には、従来、標的配列を含むプラスミド核酸やゲノム核酸を一定濃度に希釈した核酸試料が用いられてきた。具体的には、プラスミド核酸やゲノム核酸が理論的に１～数分子含まれる程度まで希釈した核酸溶液試料をＰＣＲで分析し、検出の有無もしくは検出率を調べることで検出限界濃度が評価されている。しかし、１～数分子のレベルまで希釈された試料を用いる場合、最終的にＰＣＲの反応液中に添加される標的核酸の分子数はサンプリングの偶然性により一定ではなく、反応液ごとに大きなばらつきを持つことになる。このため、ＰＣＲ分析における検出限界濃度を正確に評価することはこれまで非常に困難となっていた。
　リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲの過程で核酸増幅に対応した蛍光を適時検出する技術で、反応液中の初発鋳型核酸分子数の定量測定が可能なことから、ウィルスや微生物、遺伝子組換え農産物の定量検査などに用いられてきている。リアルタイムＰＣＲによる定量的な分析においては、測定結果と標的核酸の分子数を関連付ける検量線が作成される。従来、この検量線作成にはＰＣＲの標的塩基配列を含むプラスミド核酸もしくはゲノム核酸を段階的に希釈した溶液試料群が標準試料として用いられてきた。しかし、１～数分子程度と低分子数の試料を用いる場合には、最終的にＰＣＲの反応液中に添加される標的核酸の分子数は大きなばらつきを持つことになる。このため、低分子数側まで正確に分子数を規定することが可能な検量線を安定的に作成することは困難であった。
　またＰＣＲ法が使われる、遺伝子の塩基配列等を標的として検出する遺伝子関連検査の工程には、測定前のプロセス（プレアナリシス）、測定プロセス、測定後プロセスの３つのプロセスがある。また、遺伝子関連の測定プロセスでは、ＰＣＲ法を含め、多様な遺伝子解析技術が用いられるが、その測定精度は検体採取から検査材料の前処理までの測定プロセス（プレアナリシス）における作業要因に最も大きく影響することが知られている。このため、測定前のプロセス（プレアナリシス）では、いくつかの課題のうち、物理的性状、化学的性状、増殖阻害因子となる干渉物質の存在等、特に検体の性状が多様であるにも関わらず、客観的に評価する方法がないことが、測定の前の核酸抽出工程に影響し、測定精度低下となっていることが知られている（非特許文献１）。そこで、できるだけ、実検体に近い状態の核酸溶液試料が、定性限界、定量限界を決めるための、分子数を規定した核酸溶液試料として望まれている。
　以上の通り、ＰＣＲの標的となる核酸の分子数を厳密に規定した核酸溶液試料は、ＰＣＲを用いた分析法における検出限界の評価やリアルタイムＰＣＲの検量線作成を正確に実施するために必要とされている。
　そこで、これまでに、１分子という低濃度から、分子数を厳密に規定した核酸溶液試料の作製方法、装置については、いくつかの例が知られている。例えば、限界希釈法により、１分子の標準物質を作成できることが知られている。限界希釈法では、ほとんどのサンプルには核酸が含まれず、わずかに確率的に１分子の核酸が含まれる溶液ができるような条件で希釈し後から１分子の核酸を含む溶液を選択する方法である。また、ゲーティングナノポアデバイスを用いる方法も発明者を含むグループによって開発されている。
　しかしながら、いずれも合成核酸を希釈、あるいは分子数測定により分注する手法を用いており、通常検査に用いる核酸のように、もともと細胞（特に核内）に保持されており、細胞の分裂や代謝の継続過程における、生物学的な修飾を受けた、所望の分子数の分子（もし細胞内の１分子であれば、１分子）を取り囲む細胞の内容物を含んだ核酸サンプルを作製することは不可能であった。
　このような背景から、細胞内に保持されている状態に近い状態であり、かつ分子数を厳密に規定した標準試料を製造する方法が切望されていた。
　反応液中の初発鋳型核酸分子数の定量測定が可能なリアルタイムＰＣＲによる定量的な分析においては、測定結果と標的核酸の分子数を関連付ける検量線が作成される。従来、この検量線作成にはＰＣＲの標的塩基配列を含む核酸を段階的に希釈した溶液試料群が標準試料として用いられてきたが、１～数分子程度と低分子数の試料を用いる場合には、最終的にＰＣＲの反応液中に添加される標的核酸の分子数は大きなばらつきを持つため、低分子数側まで正確に分子数を規定することが可能な検量線を安定的に作成することは困難であった。また、測定精度に大きく影響する測定プロセス（プレアナリシス）を含めた精度管理を実施するために必要な標準試料の要件としては、物理的性状、化学的性状、増殖阻害因子となる干渉物質の存在等が、実検体に近い、細胞の中に保持され、化学的修飾や、細胞と核酸分子の数の比を反映した様々な因子を含む状態の核酸溶液試料が、定性限界、定量限界を決めるための、分子数を規定した核酸溶液試料として望まれていたが、これまで提案されてきた方法では、合成核酸を用いていたために、作製することは事実上不可能であった。
遺伝子関連検査　検体品質管理マニュアル（承認文書）　特定非営利活動法人ＪＣＣＬＳ日本臨床検査標準協議会
　本発明は、上記背景の下でなされたものである。本発明の目的は、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料を製造することにある。
　本発明の一の態様は、標準試料製造方法であり、この方法は、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料の製造方法であって、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片を細胞に導入する導入ステップと、細胞を培養する培養ステップと、培養した細胞を単離する単離ステップと、を備えている。
　以下に説明するように、本発明には他の態様が存在する。したがって、この発明の開示は、本発明の一部の態様の提供を意図しており、ここで記述され請求される発明の範囲を制限することは意図していない。
図１は、本発明の一実施例における標準試料製造方法の説明図である。 図２は、本発明の一実施例における導入遺伝子のコピー数確認の説明図である。 図３は、本発明の一実施例におけるＧ０／Ｇ１期の同調確認の説明図である。 図４は、本発明の一実施例におけるマニピュレータによる１細胞の採取法の説明図である。 図５は、本発明の一実施例において作製された標準試料の確認の説明図である。
　以下に本発明の詳細な説明を述べる。ただし、以下の詳細な説明と添付の図面は発明を限定するものではない。
　本発明の標準試料製造方法は、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料の製造方法であって、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片を細胞に導入する導入ステップと、細胞を培養する培養ステップと、培養した細胞を単離する単離ステップと、を備えている。
　また、本発明の標準試料製造方法では、導入ステップで、細胞として出芽酵母を用いて、人工合成遺伝子を用いた相同組替えによりＤＮＡ断片を出芽酵母の染色体に導入し、培養ステップで、出芽酵母をＧ０／Ｇ１期に同調して同調培養を行い、単離ステップで、出芽酵母をＧ１期で固定して単離を行い、単離した出芽酵母の１細胞には１コピーの対象配列が含まれてもよい。
　また、本発明の標準試料製造方法では、相同組替えのターゲットとしてＹＥＲ０５３Ｃの遺伝子を用いてもよい。
　また、本発明の標準試料製造方法では、単離ステップでは、先端角度が２０度から３０度の角度範囲内に設定されたキャピラリーを用いて、１ウェルに１細胞ずつ分取してもよい。
　また、本発明の標準試料製造方法では、標準試料は、核酸であり、核酸には、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれてもよい。
　本発明によれば、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料を製造することができる。
（実施の形態）
　以下、本発明の実施の形態の標準試料製造方法について、図面を用いて説明する。本実施の形態の標準試料製造方法は、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を検出する遺伝子検査に用いられ、食品検査や医療分野の診断等に利用される。なお、本発明の実施の形態の標準試料製造方法は、以下の構成及び方法によって実現できるが、ここに示す構成および方法だけに限るものではない。
　本実施の形態によれば、細胞への対象遺伝子の導入と細胞の分取を組み合わせることによって、細胞における修飾や細胞の内容物を反映した標準試料を製造することができる。この場合、所定のコピー数の遺伝子配列をもつＤＮＡ断片を細胞に導入することにより、標準試料が作製される。使用する細胞は、培養、遺伝導入が可能で、細胞周期を制御できる細胞であれば如何なるものでも良い。ただし、通常２倍体の場合には、対象分子は、最小で２倍体となるため、１分子の対象を得るためには、細胞周期上、同調できるステージの中に１倍体の時期がある細胞を用いる必要がある。細胞の選択は、実検体の生物種に近いものや、取り扱いが簡易な酵母のような細胞など、標準試料の利用目的に合わせて選択することが可能である。細胞を培養する培養液についても、対象となる細胞が増殖するのに適した培地を選択することができる。
　本実施の形態において、標準試料を構成するための検出対象は、標準試料の用途に合わせて選択することが可能である。対象として扱う遺伝子配列は、単一である必要はなく、複数の遺伝子配列をタンデムに連結した核酸断片を用いることができる。また、細胞のゲノムへの導入を考慮して、相同組換えのターゲットとなる配列も、タンデムに連結することが必要であり、これらの要素からなる人口合成遺伝子を用いることができる。さらに、これらは、自然界に存在する遺伝子配列をＰＣＲ法を用いて増幅したものや、制限酵素などを用いて切り出し、精製したものを用いてもよい。
　対象遺伝子および相同組換えのターゲット遺伝子配列を持つ核酸を用いた相同組換えによる組換え細胞の作製には、相同組換えのターゲットを、ゲノム内でのコピー数ならびに、生育に影響を与えるかどうかを考慮して選択することが望ましい。当該核酸の細胞内への導入、すなわち形質転換は、市販の試薬を用いて実施することができる。また、場合にはよっては、エレクトロポーレーション法など、電気的な手法を用いることも可能である。
　細胞周期をそろえる同調は、細胞に適したものを選択することができる。例えば、低血清培養法や、二重チミジン同調法、チューブリン重合阻害剤による同調などが考えられる。また、細胞によってはその細胞に特異的な手法を用いることが可能である。例えば、出芽酵母の場合、α－ファクターと呼ばれる性ホルモン（フェロモン）によって、同調させることが可能である。
　１細胞の分取は、シングルセルソーター（例えば、PERFLOW（登録商標）Sort：古河電工）や、マイクロマニピュレータによって行うことが可能である。酵母であれば、実体顕微鏡を用い、キャピラリーの先端（ＩＤ＝１０－２０μｍ）に吸引し、予めスライドガラス上に滴下した同調培養用の培養液の中に吐出、マイクロピペットで１細胞の酵母とともに当該液滴をマイクロプレートのウェルに移動することで実施することが可能である。
　このようにして作成した試料は、生きた細胞であり、その中に所望の分子数の検出対象が含まれており、１分子から所望の数の分子数までの細胞を、遺伝子関連検査の実検体と近い形で分取し、提供することが可能となる。
　本実施の形態によれば、従来のように合成核酸の分子数を分取し、測定するのではなく、細胞に１コピーを導入し、１コピーであることを確認したうえで、細胞周期を止め、細胞を所望の数分取し、細胞の個数を規定することによって分子数を同時に規定する手法を用いて標準試料を作成する。そのため、これまでは不可能であった、ごく微量のかつ実検体の状態に近い核酸を含む標準物質の安定供給が可能になる。このような、１分子標準物質が実用化されれば、市販されているＰＣＲ装置の、検体を用いた検出能力の評価が可能となる。また、ＰＣＲ検査においては、実検体を用いた場合に近い環境下での検知下限や定量下限の絶対的評価が可能となる。
（実施例）
　以下実施例により、詳しく本発明を説明するが、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。
　本実施例では、細胞の例として、出芽酵母を用いて、標準試料の作製を実施した。出芽酵母w303-1a (MATa, ade2-1 ura3-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100)を１コピーの標的ＤＮＡ配列のキャリア細胞として組換え体の作製に使用した（図１参照）。培地は、ＹＤＰ培地：１％（ｗ／ｗ）バクトイーストエキストラクト，２％（ｗ／ｗ）バクトペプトン，２％（ｗ／ｗ）グルコースを用いた。
　検出対象のモデルとして、人工遺伝子を構築した。標的配列はOver lapping PCRにより、ゼオシン耐性遺伝子、ＧＦＰ遺伝子およびＹＥＲ０５３Ｃの相同領域がタンデムに並ぶように作出し、相同組換え用人工遺伝子を合成した（図１参照）。
　人工合成遺伝子を用いた相同組換えによる酵母組換え体の作製には、相同組換えのターゲットとして、Mitochondrial phosphate transporter like protein（ＹＥＲ０５３Ｃ）の遺伝子を用いた。ＹＥＲ０５３Ｃは出芽酵母の中でシングルコピーであり、かつ遺伝子破壊を行っても酵母の生育に影響を与えないことが既に明らかにされている（Takabatake, R., et al. J. Biochem., 129(5): 827-33, 2001）。ＹＥＲ０５３Ｃの遺伝子座を相同組換えによる酵母染色体へ導入するターゲットとして、１コピー標的ＤＮＡ配列を酵母染色体に導入した（図２参照）。
　細胞分裂の際に、ＤＮＡが複製されるため、それを防ぐ目的で、酵母細胞の同調化を行った。一晩培養した酵母細胞をＯＤ６００＝０．１に稀釈し、２８℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３になった時点で、５μｇ／ｍｌになるようにα－ファクター（Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA）を添加し、さらに３時間培養続け、酵母はＧ０／Ｇ１期に同調された。細胞周期同調酵母の培養液に終濃度２０％になるようにグリセロールを添加し、－８０℃で保存した。
　同調細胞の細胞周期の確認は、下記の通り実施した。SYTOX Green Nucleic Acid Stain（Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR）で酵母を染色し、フローサイトメトリーで分析を行った。集菌した約５×１０６個の酵母をＭｉｌｌｉＱ水で一回洗浄し、４００μｌのＭｉｌｌｉＱ水に懸濁した後、９５０μｌのエタノールを加えた。－２０℃で一晩固定した酵母を８００μｌの５０ｍＭクエン酸 ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄し、５００μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ RNase A（Nippon Gene, Tokyo, Japan）／５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）に懸濁し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、５０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを添加し、５０℃で２時間インキュベートした。処理した酵母を１０秒間超音波分散し、６μｌの５ｍＭ SYTOX Green Nucleic Acid Stainを加えて、遮光下３０分間染色した。セルアナライザーＥＣ８００（Sony Biotechnology Inc. Tokyo, Japan)を用い、励起波長４８８ｎｍで細胞周期の分析を行い、Ｇ０／Ｇ１期に同調していることを確認した（図３参照）。
　酵母細胞を１細胞分取するには、以下の方法を用いた。すなわち、Ｇ０／Ｇ１期に同調された酵母を１／１５ Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に懸濁し、１０秒間超音波分散した。１／１５ Ｍ ＰＢＳで二度洗浄した後、４０００ｇで５分間遠心し、５ｍＬの５μｇ／ｍｌα－ファクター／１／１５ Ｍ ＰＢＳに懸濁した。細胞懸濁液をシャーレ（５０×９ｍｍ BD Falcon Petri dishes、BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA)）に注ぎ、実体顕微鏡（M205 FA, Leica）での観察下、マニピュレータ操作により、キャピラリーの先端（ＩＤ＝１５μｍ）に吸引し、予めスライドガラス上に滴下した１８μｌの５μｇ／ｍｌα－ファクター／Ｈ2０に吐出し、マイクロピペットで１細胞の酵母とともに当該液滴をマイクロプレートのウェルに移動した。この場合、キャピラリーの先端角度は、２０度から３０度の角度範囲内に設定されていることが望ましい（図４参照）。このマイクロプレートが、標準試料となる。
　標準試料の確認は、一細胞からリアルタイムＰＣＲによって標的配列を増幅して実施した。１ウェル当たりに６２０ｎｇ Zymolase T100（105 kU/g, Nakalai Tesque, Kyoto, Japan）を添加し、３５℃で９０分間インキュベートし、細胞壁を分解した。Universal Master Mix（ABI）を用い、１６．７×１０-6μｍｏｌプライマーと６．５×１０-6μｍｏｌ FAM/TAMRA TaqManプローブを加え、ABI PRISM 7900HTリアルタイムＰＣＲシステムで、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、５０℃ ２分、９５℃ ３０秒を１サイクル、９５℃３０秒、５９℃ ６０秒を５０サイクルである。５ｎｇ／μｌ ColE1（Nippon Gene Co.,Tokyo, Japan）溶液で稀釈した標準プラスミドpTRPWRKYを鋳型としてＰＣＲを行い、検量線の作成に用いた。これにより、検量線を作成でき、標準試料としての要件が確認された（図５参照）。
　　以上詳述したように、この構成を使うことによって、１分子から所望の数の分子数までの分子数を、遺伝子関連検査の実検体と近い形で分取し、提供することが可能な標準試料が実現可能であることが示された。
　以上、本発明の実施の形態を例示により説明したが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではなく、請求項に記載された範囲内において目的に応じて変更・変形することが可能である。
　以上に現時点で考えられる本発明の好適な実施の形態を説明したが、本実施の形態に対して多様な変形が可能なことが理解され、そして、本発明の真実の精神と範囲内にあるそのようなすべての変形を添付の請求の範囲が含むことが意図されている。
　以上のように、本発明にかかる標準試料製造方法は、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料を製造できるという効果を有し、食品検査や医療診断のための遺伝子検査等に用いられ、有用である。
　１　ターゲット配列を導入した細胞（酵母）
　２　酵母染色体
　３　ターゲット配列を導入した領域
　４　培養容器（シャーレ）
　５　培地
　６　マニピュレータ（キャピラリー）
　７　回収容器（マイクロチューブ）
　８　溶液

Claims (5)

  1. 　特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料の製造方法であって、
    　前記特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片を細胞に導入する導入ステップと、
    　前記細胞を培養する培養ステップと、
    　前記培養した細胞を単離する単離ステップと、
    を備えることを特徴とする標準試料製造方法。
  2. 　前記導入ステップでは、前記細胞として出芽酵母を用いて、人工合成遺伝子を用いた相同組替えにより前記ＤＮＡ断片を前記出芽酵母の染色体に導入し、
    　前記培養ステップでは、前記出芽酵母をＧ０／Ｇ１期に同調して同調培養を行い、
    　前記単離ステップでは、前記出芽酵母をＧ１期で固定して単離を行い、単離した前記出芽酵母の１細胞には１コピーの対象配列が含まれている、請求項１に記載の標準試料製造方法。
  3. 　前記相同組替えのターゲットとしてＹＥＲ０５３Ｃの遺伝子を用いる、請求項２に記載の標準試料製造方法。
  4. 　前記単離ステップでは、先端角度が２０度から３０度の角度範囲内に設定されたキャピラリーを用いて、１ウェルに１細胞ずつ分取する、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の標準試料製造方法。
  5. 　前記標準試料は、核酸であり、前記核酸には、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の標準試料製造方法。
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