CN101363062A - 荧光定量型生物条形码检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光定量型生物条形码检测方法及其应用。该检测方法是在普通生物条形码检测方法的基础上，用实时荧光定量PCR技术代替普通PCR检测和芯片检测对条形码DNA链进行定性、定量检测的荧光定量型生物条形码检测方法。本发明的检测方法与常规的生物条形码检测方法相比，能对条形码DNA链进行精确定量，从而对被检物进行精确定量，并且消除了常规生物条形码检测方法的阴阳性界限不清等问题，具有准确度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，在蓝舌病等的诊断及进出口检验检疫领域(特别是微量物质的检测领域)中有具有较大的实际意义，应用前景广阔。

Description

荧光定量型生物条形码检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的检测方法及其应用，特别是涉及一种新型的荧光定量型生物条形码检测方法及其在生物检测中的应用。

背景技术

生物条形码检测技术(bio-bar codes assay，BCA)是美国西北大学Mirkin教授领导的课题组于2003年首次报道的一种新型标记免疫测定技术，其突出特点是具有极高的灵敏度，可达常规ELISA方法的10⁶倍(Nam JM，Thaxton CS，Mirkin CA.Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins.Science，2003，301(5641)：1884-1886)。

BCA技术的基本原理是利用被检物单抗标记的磁性微球探针(magneticmicroparticles，MMPs)和被检物多抗及特异DNA双链标记的金纳米颗粒探针(nanoparticle，NP)，通过形成MMP-被检物-NP三明治复合物后再利用去杂交将NP探针上标记的特异DNA链释放出来，再通过常规PCR方法或芯片检测方法(金标银染法)鉴定这些释放的DNA链就可确定被检物的存在。

利用生物条形码技术检测PSA的方法为：纳米颗粒探针(nanoparticle探针，NP)即是金纳米颗粒包被有双链DNA和抗PSA的多克隆抗体，双链DNA的其中一条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码DNA，每一个直径为30nm的胶体金上大约标记有400条左右的条形码DNA链(Hurst SJ，Lytton-Jean AR，Mirkin CA.Maximizing DNA loading on a range of gold nanoparticle sizes.Anal.Chem.2006，78：8313-8318)，磁性微球探针(magnetic microparticle探针，MMP)即是对应于分选磁场的直径约为1μm的磁珠微球，其表面上包被有抗PSA的单克隆抗体。

从BCA技术的检测程序可以看出，其基本原理几乎等同于ELISA检测中双抗体夹心法高度特异地捕获抗原(被检物)，通过检测条形码DNA而实现对被检物的间接检测，由于PCR反应和芯片检测的放大效应，使检测灵敏度得到极大提高。

1.生物条形码的检测过程可以分为条形码DNA的获取和条形码DNA的检测两大方面。条形码DNA的获取过程包括三步，第一步：抗原抗体作用先用抗被检物的单抗功能化的MMP探针特异性地结合标本中可能的被检物，加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连结的被检物和不相关的杂质；第二步：洗脱和去杂交加入被双链DNA和抗被检物的多抗修饰的NP探针，将被检物夹在中间，形成一个三明治结构，接着加上磁场，用磁铁固定MMP探针的同时，反复冲洗，除去未连接的NP探针；第三步：DNA分离此步是一个去杂交步骤，三明治结构被磁场固定，在高温低盐条件下，NP探针上结合的数以百计的条形码DNA释放到溶液中，接着对条形码DNA链进行定量，从而间接检测被检物。条形码DNA链的检测现在有两种方式：一是对获取的条形码DNA链作普通的PCR扩增，然后凝胶电泳检测；二是通过芯片检测，芯片检测系统需要三种不同作用的核酸：1)与固相支持物(玻片等)连接的捕获探针(捕获DNA修饰的玻片)；2)产生信号的检测探针(DNA修饰的胶体金)；3)靶核酸(条形码DNA)，靶核酸在这个体系中起连接捕获探针和信号检测探针的作用。如体系中存在上述三种成分，靶核酸能与上述两种核苷酸杂交，洗脱去除杂质后能得到一个清晰的检测信号，如果靶核酸不与上述两种探针杂交，则信号探针无法连接在固相物上，洗脱后固相物上无信号应答，得到的信号可以用普通的平板扫描仪进行分析(Georganopoulou DG，Chang L，Nam JM，et al.Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluidof a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer’s disease.Proc Natl Acad Sci，2005，102(7)：2273-2276)。

迄今为止，BCA技术已在某些病原标志物的检测上取得了很好的进展。Nam等人首先利用BCA技术对前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)进行了检测，利用BCA技术检测PSA的检测下限可达3amol/L，检测下限比现有的传统ELISA方法低6个数量级(Nam JM，Thaxton CS，Mirkin CA.Nanoparticle-based bio-bar codes forthe ultrasensitive detection of proteins.Science，2003，301(5641)：1884-1886)；Georganopoulou等人利用BCA技术对β-淀粉样蛋白源性播散性配基(amyloid β-derived diffusible ligands，ADDL)进行了检测，其检测极限能在15μL脑脊液中检测到50个ADDL分子(Georganopoulou DG，Chang L，Nam JM，et al.Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a solublepathogenic biomarker for Alzheimer’s disease.Proc Natl Acad Sci，2005，102(7)：2273-2276)；Stoeva等人利用BCA技术对血清中的三种肿瘤标志物PSA、人体绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)和α胎儿球蛋白(α-fetoprotein，AFP)进行了联合检测，检测结果显示检测限度可达170f mol/L(Stoeva SI，Lee JS，Smith JE，et al.Multiplexed detection of protein cancermarkers with biobarcoded nanoparticle probes.Am Chem Soc，2006，128(26)：8378-8379)。

综上所述，BCA技术与现代标记免疫检测技术的金标准—ELISA技术相比，具有非常显著的优点，具体表现在以下几个方面：1)BCA技术显示了比常规的ELISA方法高出六个数量级(100万倍)的敏感性；2)针对不同的被检物设计不同长度和序列的条形码DNA，可分析复杂样本中的多种物质；3)具有较高的特异性，其特异性决定于检测系统使用的单克隆抗体的特异性，只要使用高特异的抗目标检物的单克隆抗体就能保证检测系统的高特异性；4)检测范围广，只要被检物具有单抗和多抗，就可对其进行检测，这使得它在检测一些不适宜用PCR技术检测的微量物质方面具有很大的优势。

但是，从BCA技术检测的过程和显示体系可以看出，这种技术存在着明显的缺陷，主要体现在对条形码DNA的检测上，具体有：1)传统的PCR检测是应用终点PCR来定量样品中模板的量，通常用凝胶电泳分离，并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物。但在PCR反应中，由于模板、试剂、焦磷酸盐分子的聚集等因素影响聚合酶反应，最终导致PCR反应不再以指数形式进行而进入“平台期”，一些反应的终产物比另一些要多，因此终点PCR反应方法定量不准确；其次，终点PCR容易交叉污染，产生假阳性；2)条形码DNA的芯片检测由于银染试剂自身的缺点而易产生假阳性，阴阳性不易界定，染色结果因时间、环境因素变化很大；3)PCR检测体系和芯片检测体系都不能对被检物进行有效定量，这与现今免疫检测技术的发展要求及发展方向—不但能定性，而且能定量相比是落伍的，因此对常规BCA技术进行改进，使之能克服上述缺点并能对被检物确切定量就显得极为重要。

蓝舌病病毒是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的代表成员。在环状病毒属14个群中，蓝舌病病毒群与鹿流行性出血热病毒群(Epizootichemorrhagic disease virus，EHDV)的亲缘关系最为密切，有较强的交叉反应性。此外，蓝舌病病毒的血清型众多，目前国际公认至少存在24个血清型。

VP7是蓝舌病病毒核心蛋白的主要构成组份，约占核心蛋白总量的36％，是病毒可溶性群特异性抗原。Lewis等通过病毒核心的表面碘化作用进行的研究结果表明，VP7是病毒核心颗粒上的主要暴露蛋白，VP7至少有两个表位暴露于病毒表面，提示VP7可作为利用抗体检测蓝舌病病毒的理想靶位(Lewis SA，Grubman MJ.Bluetonguevirus：surface exposure of VP7.Virus Research，1990，16(1)：17-26)。

发明内容

本发明提供了一种灵敏度较高的—荧光定量型生物条形码检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种荧光定量型生物条形码检测方法，是在普通生物条形码检测方法的基础上，用实时荧光定量PCR技术代替普通PCR检测和芯片检测对条形码DNA链进行定性、定量检测的荧光定量型生物条形码检测方法。

具体来讲，所述荧光定量型生物条形码检测方法可包括以下步骤：

1)NP探针的制备：利用金纳米颗粒、抗待测物的多克隆抗体、上述互补探针NP链和条形码DNA链制备NP探针；

2)MMP探针的制备：用磁性微球和抗待测物的单克隆抗体制备MMP探针；

3)荧光定量型生物条形码检测：利用NP探针、MMP探针和待测物通过抗原、抗体作用制备三明治复合物，然后在高温低盐条件下，释放条形码DNA链，最后对获得的条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测，以对待测物进行定性、定量检测。

在上述荧光定量型生物条形码检测方法中，步骤1)中可利用柠檬酸三钠还原法制备金纳米颗粒，金纳米颗粒的直径可为20-40nm，优选为30nm；优选的用于荧光定量型生物条形码检测的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列。

步骤2)中磁性微球的直径为0.5-1.5μm，优选为1μm。

步骤3)中优选的用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ ID No：3的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No：4的核苷酸序列。

为获得更好的检测效果，所述步骤1)和步骤2)中还包括对NP探针和MMP探针进行纯化的步骤。

所述荧光定量型生物条形码检测方法的检测范围较广阔，对蓝舌病病毒等各种病原均可进行检测。

当待测物为蓝舌病病毒时，可以用蓝舌病病毒的VP7蛋白作为检测对象进行荧光定量型生物条形码检测。

所述检测方法中使用的MMP探针包被有抗VP7蛋白的单克隆抗体，NP探针包被有抗VP7蛋白的多克隆抗体。

所述抗VP7蛋白的单克隆抗体和抗VP7蛋白的多克隆抗体均可采用生物技术领域中的常规方法制备，如可利用蓝舌病病毒全病毒免疫新西兰大白兔制备抗VP7蛋白的多克隆抗体，可通过将蓝舌病病毒杂交瘤细胞株免疫BALB/c小鼠的方法制备抗VP7蛋白的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是提供一种荧光定量型生物条形码检测试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，可包括包被有抗待测物单克隆抗体的MMP探针，包被有抗待测物多克隆抗体的NP探针，以及用于实时荧光定量PCR检测的引物和条形码DNA链。

优选的与NP探针联结的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列。

优选的用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ ID No：3的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No：4的核苷酸序列。

本发明提供了一种荧光定量型生物条形码检测方法。该新型的生物条形码检测方法是用实时荧光定量PCR检测技术对条形码DNA链进行检测，通过对条形码DNA链的定量间接对被检物进行精确定量。本发明的检测方法与常规的生物条形码检测方法相比，能对条形码DNA链进行精确定量，从而对被检物进行精确定量，并且消除了常规生物条形码检测方法的阴阳性界限不清等问题，具有准确度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，在蓝舌病等的诊断及进出口检验检疫领域(特别是微量物质的检测领域)中有具有较大的实际意义，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

说明书附图

图1为VP7蛋白的普通PCR检测结果

图2为蓝舌病病毒的普通PCR检测结果

图3为VP7蛋白的芯片检测结果

图4为蓝舌病病毒的芯片检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物及核苷酸序列均由北京三博远志公司合成。

实施例1、蓝舌病病毒的荧光定量型生物条形码检测

用本发明的荧光定量型生物条形码检测方法对蓝舌病病毒进行定性、定量检测，具体方法包括以下步骤：

1、寡核苷酸链的合成

设计并合成本发明蓝舌病病毒荧光定量型生物条形码检测方法中所用的寡核苷酸链，序列如下：

条形码DNA链：

5’-CGCATTCAGGATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTA-3’(序列表中SEQ ID No：1)

互补探针NP链：

5’-TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGAGGCAACATGCAATCCTGAATGCGA₁₀-(CH₂)₆-SH-3’(序列表中SEQ ID No：2)

2、金纳米颗粒的制备

用柠檬酸钠还原法制备直径为30nm(20-40nm均可)的金纳米颗粒，具体方法为：取500mL 0.01％(质量百分浓度)的氯金酸(HAuCl₄)溶液，在搅动的情况下加热至沸腾后迅速准确加入7.5mL的1％(质量百分浓度)的柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，继续加热煮沸15min，整个过程始终用磁力搅拌器进行搅拌，当溶液的颜色渐渐加深，最后为深紫红色，停止加热，最好将制备好的纳米金用0.45μm的尼龙膜过滤，冷却至室温，4℃避光保存。

蓝舌病病毒多抗的制备

3、抗VP7蛋白的多克隆抗体的制备

利用蓝舌病病毒免疫新西兰大白兔制备抗VP7蛋白的多克隆抗体，具体方法包括以下：每只雄性新西兰大白兔免疫前，都由耳缘静脉取血2mL，静置分离血清，-20℃保存，以待作为阴性对照用；免疫方案：首次免疫，每只家兔注射2mL的乳化抗原，于足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、领下、耳后等处皮下多点注射，对照兔子注射等量生理盐水，2周后以同样的剂量(含等体积弗氏不完全佐剂)加强免疫，背部多点注射，2周后再次加强免疫，10天后进行第3次加强免疫，约10天以后进行末次免疫，直接用2mL乳化抗原静脉注射。每次加强免疫后7-10天从兔耳缘静脉采血2-3mL，用间接ELISA法检测抗体效价。结果末次免疫后抗体效价达10⁴，符合要求，末次免疫后7天即用颈动脉放血法采血，4℃静置过夜(10-12小时)，次日4000rpm离心10min，收集上清，分装后-20℃保存。

4、金纳米颗粒-蓝舌病病毒多抗复合物的制备

分别取1mL步骤2制备的金纳米颗粒和1mL(0.1mg)抗VP7蛋白的多克隆抗体，用0.1mol/L K₂CO₃调节至pH 9.0，然后在搅拌条件下将金纳米颗粒和抗VP7蛋白的多克隆抗体混合，10min后再加入稳定剂(5％ BSA)，使其最终浓度为1％(或加入1％聚乙二醇(PEG，分子量20kD)至标记物总量的1/10)，以防止抗体蛋白和金纳米颗粒的聚合和发生沉淀。

5、NP探针的制备、纯化

用下述方法制备NP探针：将互补探针NP链(终浓度为2μmol/L)加入被抗VP7蛋白的多克隆抗体修饰的金纳米颗粒(浓度为4.5nmol/L)中，室温放置16小时；再用磷酸盐缓冲液调整pH值至7.0，增强离子浓度至0.1mol/L NaCl，室温放置40小时，然后10,000rpm离心30min，得到互补探针NP链修饰的金纳米颗粒；将得到的深红色沉淀用含0.1M NaCl的10mM PBS(pH 7.0)溶液洗涤3次，去除未标记的金纳米颗粒；最后，将条形码DNA链(终浓度为2μmol/L)加入上述互补探针NP链修饰的金纳米颗粒中，室温下杂交4小时后，14,000rpm离心30分钟，得到NP探针。

6、抗VP7蛋白的单克隆抗体的制备

用杂交瘤细胞株3E2(杨姝，李文超，吕茂民等.群特异性蓝舌病病毒单克隆抗体的制备和鉴定.生物技术通讯，2008年第6期)腹腔注射BALB/c小鼠制备抗VP7蛋白的单克隆抗体，方法为：采用6-8周雌性BALB/c小鼠，在注射杂交瘤细胞前7天，预先腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡；然后，每只鼠腹腔注射含1-5×10⁶个杂交瘤细胞的0.5mL的培养液；当小鼠产生腹水时(1-3周)，腹部穿刺放出腹水(1-5mL)，隔天穿刺直至小鼠死亡；随后，3000rpm离心15min，除去腹水中的细胞；将上清无菌储存或加0.01％叠氮钠置于-70℃冰箱保存备用。

7、MMP探针的制备、纯化

将100μg抗VP7蛋白的单克隆抗体溶于20mL PBS中，将其加入到激活的磁珠(直径为1.0um，0.5-1.5um均可)中，剧烈振荡，然后将烧瓶置于混合器上反应16-24小时；磁性分离，弃掉上清；在40mL PBS中重悬磁珠；加入20mL淬灭剂(甘氨酸)，剧烈振荡，将其放在混合器上反应30min；磁性分离，弃掉上清；用PBS洗3次，磁性分离；最后，用50mL洗液重悬磁珠，4℃保存。

8、蓝舌病病毒的荧光定量型生物条形码检测方法的建立

将50μL步骤7制备的抗VP7抗原的单克隆抗体功能化的磁性微球(5mg/mL)加入10μL已知浓度的VP7蛋白(100fg/mL)或一定滴度的蓝舌病病毒中，在37℃下剧烈振荡1小时；加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连结的VP7抗原和不相关的蛋白；加入步骤5制备的被双链DNA和抗VP7蛋白的多克隆抗体修饰的0.1nmol/L金纳米颗粒探针50μl，剧烈振荡30分钟，形成NP-VP7-MMP三明治结构；加上磁场，再用磁铁固定MMPs的同时，用500μl的PBS缓冲液反复冲洗4次，除去未连接的NP探针；最后，加入50μl超纯水到三明治结构中，60℃剧烈振荡30分钟，使条形码DNA链去杂交。三明治复合物被磁性分离，收集上清液，内含条形码DNA链，用于定性、定量检测。

9、条形码DNA链的实时荧光定量PCR检测

对获得的条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测，反应条件如下：

引物1：5’-CGCATTCAGGATTGCATGAT-3’(序列表中SEQ ID No：3)

引物2：5’-TACGACTTGACACCGTTAAG-3’(序列表中SEQ ID No：4)

条形码DNA链：5’-CGCATTCAGGATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTA-3’(序列表中SEQ ID No：1)

VP7蛋白的实时荧光定量PCR检测中VP7蛋白浓度分别为1pg/mL、100fg/mL、10fg/mL、1fg/mL、100ag/mL、10ag/mL、1ag/mL，蓝舌病病毒的实时荧光定量PCR检测中蓝舌病病毒滴度分别为10^-1TCID₅₀/0.1mL、10^-2TCID₅₀/0.1mL、10^-3TCID₅₀/0.1mL、10^-4TCID₅₀/0.1mL、10^-5TCID₅₀/0.1mL、10^-6TCID₅₀/0.1mL；分析结果时，基线和阈值可取仪器默认值，一般情况下取前6-15个循环的荧光信号为基线。此外，在进行数据分析时，一般需要进行托运设置，把数据纵轴改为线性。检测结果表明本检测的VP7蛋白检测灵敏度可达1ag/mL，蓝舌病病毒检测灵敏度可达10^-6TCID₅₀/0.1mL。

10、条形码DNA链的常规PCR检测

在引物1：5’-CGCATTCAGGATTGCATGAT-3’和引物2：5’-TACGACTTGACACCGTTAAG-3’的引导下，对步骤8获得的条形码DNA链进行普通PCR扩增(对照)，PCR反应条件如下：

反应结束后，取5μl扩增产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为TAE，100伏25分钟，在凝胶成像系统下观察并记录结果。VP7蛋白的常规PCR检测结果如1所示(泳道M：低分子量Marker；泳道1-7：VP7蛋白的浓度依次为1pg/mL、100fg/mL、10fg/mL、1fg/mL、100ag/mL、10ag/mL、0g/mL)，蓝舌病病毒的常规PCR检测结果如图2(泳道M：低分子量Marker；泳道1-7：蓝舌病病毒滴度的浓度依次为10^-1TCID₅₀/0.1mL、10^-2TCID₅₀/0.1mL、10^-3TCID₅₀/0.1mL、10^-4TCID₅₀/0.1mL、10^-5TCID₅₀/0.1mL、10^-6TCID₅₀/0.1mL、OTCID₅₀/0.1mL)，当有扩增条带时，结果为阳性。检测结果表明VP7蛋白检测灵敏度可达1fg/mL，蓝舌病病毒检测灵敏度可达10^-4TCID₅₀/0.1mL。

11、条形码DNA的芯片检测

1)检测探针的制备、纯化

将NP标签链(5’-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGA₁₀-(CH₂)₆-SH-3’，终浓度为2μmol/L)加入金纳米颗粒(浓度为4.5nmol/L)中，室温放置16小时；再用磷酸盐缓冲液调整pH值至7.0，增强离子浓度至0.1mol/L NaCl，室温放置40小时，10,000rpm离心30min得到检测探针；纯化：用0.3mol/L NaCl，10mmol/L pH7.0的PBS混悬，离心，洗涤两次，最后用0.3mol/L的PBS溶解，得到纯化的检测探针。

2)检测

取25μl条形码DNA和10μl步骤1)制备的检测探针和65μl PBS(pH7.0)混匀，点在检测玻片上，放置在杂交盒内，在42℃下杂交3小时，同时，向盒内加入500μl 3×SSC以保证湿度；杂交完毕后，用3×SSC洗脱，以除去多余的检测探针；将银染液A液1mL和B液1mL混匀，加在芯片的捕获DNA链(5’-HS-(CH₂)₆-A₁₀-TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA-3’)处，静置，平板扫描仪记录结果。VP7蛋白灵敏度的VP7蛋白灵敏度的芯片检测结果如图3所示(泳道M：低分子量Marker；泳道1-7：VP7蛋白的浓度依次为1pg/mL、100fg/mL、10fg/mL、1fg/mL、100ag/mL、10ag/mL、0g/mL)，蓝舌病病毒灵敏度的芯片检测结果如图4所示(泳道M：低分子量Marker；泳道1-7：蓝舌病病毒滴度的浓度依次为10^-1TCID₅₀/0.1mL、10^-2TCID₅₀/0.1mL、10^-3TCID₅₀/0.1mL、10^-4TCID₅₀/0.1mL、10^-5TCID₅₀/0.1mL、10^-6TCID₅₀/0.1mL、OTCID₅₀/0.1mL)，当结果大于cutoff值，结果为阳性。检测结果表明VP7蛋白检测灵敏度可达10fg/mL，蓝舌病病毒检测灵敏度可达10^-3TCID₅₀/0.1mL。

上述对比实验结果表明，本发明的荧光定量型生物条形码检测方法较普通生物条形码检测具有更高的检测灵敏度，且简单可行，适于推广应用。

实施例2、荧光定量型生物条形码检测试剂盒的制备

将实施例1中的条形码DNA链，互补探针NP链，以及引物1、引物2和条形码DNA链共同包装，得到蓝舌病病毒的荧光定量型生物条形码检测试剂盒。

                       序列表

<160>4

<210>1

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

<210>2

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Claims (10)

1、一种荧光定量型生物条形码检测方法，是在普通生物条形码检测方法的基础上，用实时荧光定量PCR技术代替普通PCR检测和芯片检测对条形码DNA链进行定性、定量检测的荧光定量型生物条形码检测方法。

2、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述荧光定量型生物条形码检测方法包括以下步骤：

1)NP探针的制备：用常规方法及金纳米颗粒、抗待测物的多克隆抗体、上述互补探针NP链和条形码DNA链制备NP探针；

2)MMP探针的制备：用磁性微球和抗待测物的单克隆抗体制备MMP探针；

3)荧光定量型生物条形码检测：利用NP探针、MMP探针和待测物通过抗原、抗体作用制备三明治复合物，然后在高温低盐条件下，释放条形码DNA链，最后对获得的条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测。

3、根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中用柠檬酸三钠还原法制备金纳米颗粒，金纳米颗粒的直径为20-40nm；用于荧光定量型生物条形码检测的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列。

4、根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤2)中磁性微球的直径为0.5-1.5um。

5、根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤3)中用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ ID No：3的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No：4的核苷酸序列。

6、根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤2)中还包括对NP探针和MMP探针进行纯化的步骤。

7、根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于：所述荧光定量型生物条形码检测方法对蓝舌病病毒、毒素、生物战剂、类固醇、脂类、维生素、肿瘤特异性标志物均可进行检测。

8、根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述待测物为蓝舌病病毒时，以蓝舌病病毒的VP7蛋白作为检测对象进行荧光定量型生物条形码检测。

9、根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法中使用的MMP探针包被有抗VP7蛋白的单克隆抗体，NP探针包被有抗VP7蛋白的多克隆抗体。

10、一种荧光定量型生物条形码检测试剂盒，包括包被有抗待测物单克隆抗体的MMP探针，包被有抗待测物多克隆抗体的NP探针，以及用于实时荧光定量PCR检测的引物对和条形码DNA链；所述与NP探针联结的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列；用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ IDNo：3的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No：4的核苷酸序列。

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