CN113049822A - 一种基于核苷酸适配体的金属探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于核苷酸适配体的金属探针及其制备方法和应用，涉及生物检测技术领域。该探针由167Er金属阳离子、双功能聚合物和‑SHC6‑A10‑3.2适配体组成。其制备方法为：双功能聚合物中三胺五乙酸(DTPA)螯合167Er阳离子形成聚合物基167Er镧系金属螯合物MCPs(167Er),将螯合成功的MCPs(167Er)和‑SHC6‑A10‑3.2核酸适配体发生加成反应，生成基于核苷酸适配体的IMC探针。该金属探针可作为非侵入性诊断成像试剂，识别靶标物质、用于细胞系或组织的蛋白质的定量和定位分析。本发明公布的基于核苷酸适配体的金属探针具有高灵敏度、精准定位、染色准确性高等优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于核酸适配体的金属探针及其制备方法和应用。
背景技术
单细胞质谱成像技术(IMC)主要通过使用镧系金属同位素标记抗体(Antibody,Ab)，用质谱代替光谱作为检测方式，具有超低背景、通道间无干扰、多参数检测等完全区别于传统模式的优势特点。IMC技术具有应用方便，标记靶点多样，通量高等优点，在疾病诊疗、药物研发以及生物学基础研究等领域发挥着重要作用。与以前的组织分析方法相比，多通道IMC成像技术可以全面了解组织成分和生物标志物含量分布。现代医学研究需要对细胞或组织成像进行高维灵敏的多组分分析，以探究潜在疾病的复杂生物学机制。
目前IMC技术中的金属标签是由Fluidigm公司研发的聚合物基镧系金属螯合物(lanthanide metal-chelating polymers,MCPs(Ln))的金属试剂盒，探针是传统的具有优异识别性能的Ab。由于Ab存在着价格昂贵、稳定性差和重现性差等明显的缺点。因此，寻找IMC技术中新的小分子生物探针不仅具有重要的科学意义，而且具有巨大的经济价值。
核苷酸适配体(Aptamer)通常是通过一个称为配体系统进化的过程，即通过指数扩增技术(SELEX)在体外产生的能够与目标抗原高亲和力和特异性结合的单链DNA或RNA寡核苷酸，长度从15到100个核苷酸不等。Aptamer的核苷酸序列决定了其与目标分子特异性结合的三维结构。另外，它能对无机离子、有机小分子、多肽、蛋白、细菌、病毒和细胞等进行专一识别。与Ab比较，Aptamer具有合成容易、稳定性好和价格低廉的优势，筛选能识别特定蛋白或其特定结构域的Aptamer应用于组学分析、疾病诊断和信号通路调控等领域。Aptamer能够特异性地结合细胞表面标记物，已被用于开发多效价抗体类似物和荧光流式细胞仪分析。Zhang等筛选出的荧光标记的特异结合人CD30蛋白的RNA基Aptamer，通过流式细胞仪检测后结果显示:低浓度(0.3nM)的Aptamer就能特异地、敏感地检测到淋巴细胞上表达CD30抗原，与临床公认的诊断探针-Ab探针效果一样，从而认为该Aptamer可作为检测表达CD30的探针。Tan等通过cell-SELEX技术筛选得到针对过表达人表皮生长因子受体III型突变体的人脑胶质瘤细胞(U87-EGFRvIII)的Aptamer，其中一条序列与靶细胞共孵育时能定位于细胞核。经“pull-down”实验表明，该Aptamer能识别EGFRvIII蛋白，实验者推测，可能是由于Aptamer结合在EGFRvIII蛋白上，由于该蛋白介导的内吞作用而进入细胞，为细胞核靶向输送提供了颇有前景的分子工具。Yang课题组筛选出能够特异性识别肿瘤细胞上过表达的上皮细胞粘附分子(EpCAM)的Aptamer，可用于肿瘤细胞成像和循环肿瘤细胞捕获，此外他们还对筛选得到的Aptamer进行序列优化，经过优化的Aptamer-SYL3C对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞系和胃癌细胞Kato III细胞系识别解离常数分别为(38±9)nmol/L和(67±8)nmol/L。其富集肿瘤细胞的效率达到63％，捕获后细胞的纯度为80％,可用于血液中肿瘤细胞的检测。Aptamer-AX102能够特异性靶向血管新生中的特定蛋白血小板源生长因子B(PDGF-B)，有利于捕捉癌细胞发生发展的过程。
另一方面，传统免疫染色技术的一抗二抗复合物可达25nm长，空间位阻可能导致标记密度低。因此，小探针有望提高生物样品的染色准确性。最近，有研究表明，在超分辨显微镜下，小的单域抗体(single domain antibody，sdAb或纳米体)能够将荧光分子定位到更接近预定目标的位置，从而提高了与传统抗体染色相比的更佳的定位准确性。同样，Aptamer也被认为是在超分辨显微镜领域具有相当优势的另一种小探针，因此，Aptamer探针的应用对提高多通道IMC的蛋白分子的精准定位具有重要意义。前列腺癌上皮细胞特异性跨膜蛋白PSMA是一种著名的跨膜糖蛋白，过表达于前列腺上皮细胞，通常作为PaC诊断和患者治疗的标志物。为了靶向PSMA，早期从合成的RNA适配体文库中筛选出的Aptamer由79个核苷酸组成的A10和A9，但长序列的高分子量的Aptamer的靶向性受到了一定的限制。在后续的实验中，研究人员不断缩短其序列，最终开发出仅有37个核苷酸碱基的A10-3.2适配体分子，A10-3.2的分子量明显降低，且与PSMA的结合亲和力仍保持良好，其平衡解离常数(KD)为2.9nM。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种高灵敏度、精准定位并且能提高生物样品的染色准确性的价格低廉的IMC探针。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种高灵敏度、精准定位并且能提高生物样品的染色准确性的价格低廉的IMC探针。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于核酸适配体的金属探针，即MCPs(Ln)与特异性靶向抗原的Aptamer进行偶联反应制备镧系金属标记的Aptamer探针。本发明将亲和识别替代免疫识别，将Aptamer替代Ab，设计合成一种基于MCPs(Ln)的Aptamer探针，并用IMC技术验证金属标记的Aptamer探针结合细胞或组织中靶标物质的靶向性和灵敏性能力；后续计划结合IMC多通道检测，旨在建立一种高通量、高灵敏度、精准定位的IMC新技术，为细胞系或组织的蛋白质的定量、定位分析提供新的手段和方法，建立亚细胞水平的关键信号通路蛋白和蛋白质复合物的测定方法，该工作可望为精准药效评价和个性化药物筛选等重要应用提供科学可靠的依据。
本发明提供一种基于核苷酸适配体的金属探针，包括由167Er金属阳离子、双功能聚合物和-SHC6-A10-3.2适配体组成的金属标记的Aptamer探针。
进一步地，双功能聚合物的第一末端为三胺五乙酸DTPA；其第二末端为马来酰亚胺功能基团。
本发明还提供一种基于核苷酸适配体的金属探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备聚合物基镧系金属螯合物，利用双功能聚合物中第一末端中的三胺五乙酸DTPA基团螯合167Er阳离子生成聚合物基167Er镧系金属螯合物MCPs(167Er)；
步骤2、-SHC6-A10-3.2适配体中加入磷酸三氯乙酯TCEP，得到暴露巯基的-SHC6-A10-3.2适配体，其中，磷酸三氯乙酯TCEP进一步还原了二硫键，二硫键是-SHC6-A10-3.2适配体放置过程中形成的；
步骤3、将步骤1获得的聚合物基167Er镧系金属螯合物MCPs(167Er)与步骤2获得的暴露巯基的-SHC6-A10-3.2适配体反应，其中，聚合物基167Er镧系金属螯合物MCPs(167Er)第二末端的马来酰亚胺功能化基团与暴露巯基的-SHC6-A10-3.2适配体的-SH基团发生迈克尔加成反应，合成了金属标记的适配体探针，即基于核苷酸适配体的IMC探针。
进一步地，上述步骤1步骤1中双功能聚合物的聚合度DP，决定聚合物基镧系金属螯合物MCPs(167Er)中金属离子的数量。
进一步地，聚合物基镧系金属螯合物MCPs(Ln)的聚合度DP优选为20-25。
本发明还提供一种基于核苷酸适配体的金属探针在识别靶标物质中的应用。
进一步地，靶标物质包括蛋白质、金属离子、小分子化合物、细胞膜表面受体；其中，蛋白质包括前列腺癌上皮细胞特异性跨膜糖蛋白PSMA。
本发明还提供一种基于核苷酸适配体的金属探针在定位目标分子中的应用。
本发明还提供一种基于核苷酸适配体的金属探针在细胞系或细胞组织的蛋白质定量和定位分析中的应用。
本发明还提供一种基于核苷酸适配体的金属探针在非侵入性诊断成像试剂中的应用。
进一步地，构建一种基于聚合物基镧系金属螯合物(lanthanide metal-chelating polymers,MCPs(Ln))的Aptamer探针平台，用于靶向前列腺癌(Prostaticadenocarcinoma,PaC)组织切片的前列腺上皮细胞过表达的前列腺癌特异性跨膜抗原(Prostate specific membrane antigen,PSMA)，采用质谱成像技术(Imaging masscytometry,IMC)对金属标记的Aptamer纳米探针靶向性、灵敏性进行初步验证。
在本发明的较佳实施方式中，通过核苷酸适配体识别靶标分子的示意图，说明了核苷酸适配体与目标分子特异性结合的原理，Aptamer的核苷酸序列决定了其与目标分子特异性结合的三维结构。此外，它能对无机离子、有机小分子、多肽、蛋白、细菌、病毒和细胞等进行专一识别。
在本发明的另一较佳实施方式中，详细说明了基于核苷酸适配体的金属探针的合成路径。
在本发明的另一较佳实施方式中，采用质谱成像技术(Imaging mass cytometry,IMC)对金属标记的Aptamer纳米探针靶向性进行初步验证。利用IMC成像技术对经过MCPs(167Er)修饰后的-SHC6-A10-3.2适配体制备的金属探针167Er-A10-3.2和经过MCPs(167Er)修饰后的YPSMA-1抗体制备的金属探针167Er-YPSMA-1探针的靶向能力进行了验证，证明修饰后的基于核苷酸适配体的金属探针仍保留特异性识别靶标的能力。
在本发明的另一较佳实施方式中，采用质谱成像技术(Imaging mass cytometry,IMC)对金属标记的Aptamer纳米探针灵敏性进行初步验证。金属标记的适配体探针能够特异性识别前列腺癌组织切片中的特定PSMA抗原，同时采取37℃条件下组织抗原修复对照试验，IMC技术检测结果显示，适配体探针的金属信号是抗体探针携带的金属信号的3倍，探针的灵敏性得到了明显提高。
核苷酸适配体是一类能够特异性地和靶标分子结合的寡核苷酸序列，它可作用于蛋白质、金属离子、小分子化合物、细胞膜表面受体等靶标物质，其结合能力可与Ab相当甚至更强,同时具有低免疫原性、稳定性好等特点。MCPs(Ln)与特异性靶向抗原的Aptamer进行偶联反应制备镧系金属标记的Aptamer新型探针，这种基于核苷酸适配体的金属探针至少具有以下技术效果：
1、Aptamer的分子量小、组织渗透性好、血浆消除率高、信噪比高、成像效果好，特别适合作为非侵入性诊断成像试剂。
2、核酸适配体可以通过化学合成，易修饰，价格低廉。
3、基于核苷酸适配体的金属探针应用于IMC成像技术，将有利于改善IMC技术中的蛋白分子的精准定位。
4、利用Aptamer的分子识别特性，可设计多种针对不同类型靶标物质的Aptamers金属探针，结合IMC技术高通量特性，极大地扩展了Aptamer探针在生命科学领域应用范围。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例1中的核苷酸适配体识别靶标分子的示意图；
图2是本发明的另一个较佳实施例2中的基于核苷酸适配体的金属探针合成路径示意图；
图3是本发明的另一个较佳实施例3中金属标记的核苷酸适配体靶向PaC组织切片特异性抗原并用于IMC检测的过程示意图以及其与金属标记的抗体蛋白探针的检测结果相比较的示意图，其中图中(A)部分：金属标记的核苷酸适配体特异性靶向PaC组织切片的PSMA抗原并用于IMC检测的过程；(B)部分：金属标记的核苷酸适配体167Er-A10-3.2和金属标记的抗体167Er-YPSMA-1的IMC图像；(C)部分：表示两种探针对PaC组织切片染色后IMC图像中的167Er金属信号平均强度图和191Ir金属信号平均强度图；(D)部分：表示两种探针对PaC组织切片染色后IMC图像中的167Er金属信号相对强度的柱状图；
图4是是本发明的另一个较佳实施例4中37℃抗原修复条件下，167Er-YPSMA-1和167Er-A10-3.2探针标染的PaC连续组织切片的IMC图像和组织形态细胞分析工具箱(HistoCAT)读取金属信号的比较图，其中，(A)部分：167Er-YPSMA-1和167Er-A10-3.2探针标染的PaC组织切片的IMC图像,IMC图像相应的灰度图和HistoCAT软件读取的167Er信号的热图,标尺:100μm；(B)部分：167Er和191Ir金属信号强度图与箱式图(虚线代表167Er-A10-3.2探针,实线代表167Er-YPSMA-1探针)；(C)部分：167Er-YPSMA-1和167Er-A10-3.2探针的167Er信号的相对强度值的柱状图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1核苷酸适配体识别靶标分子的原理
核苷酸适配体(Aptamer)通常是通过一个称为配体系统进化的过程，即通过指数扩增(SELEX))在体外产生的能够与目标抗原高亲和力和特异性结合的单链DNA或RNA寡核苷酸，长度从15到100个核苷酸不等。如图1所示，核苷酸适配体Aptamer识别靶标分子，两者结合，是亲和结合过程，结合体具有三维结构。核苷酸适配体Aptamer的核苷酸序列决定了其与目标分子特异性结合的三维结构。另外，它能对无机离子、有机小分子、多肽、蛋白、细菌、病毒和细胞等进行专一识别。
实施例2基于核苷酸适配体的金属探针的合成路径
金属标记的Aptamer探针167Er-A10-3.2由167Er金属阳离子、双功能聚合物和-SHC6-A10-3.2核苷酸适配体组成。首先，双功能聚合物中第一末端的三胺五乙酸(DTPA)基团螯合167Er阳离子形成了聚合物基镧系金属螯合物(lanthanide metal-chelatingpolymers,MCPs(167Er))，其中金属离子的数量由聚合物的聚合度(degree of polymer，DP)决定。MCPs(Ln)聚合物的DP一般为20-25。MCPs(167Er)聚合物第二末端的马来酰亚胺功能化基团与-SHC6-A10-3.2的-SH发生迈克尔加成反应，合成了金属标记的适配体探针。
如图2所示，基于核苷酸适配体的金属探针合成路径步骤为：
步骤1将167Er阳离子和双功能聚合物分别加入超滤管中反应，该聚合物中第一末端的三胺五乙酸(DTPA)基团螯合167Er阳离子形成了聚合物基167Er镧系金属螯合物MCPs(167Er)；
步骤2由于巯基极易形成二硫键，将磷酸三氯乙酯和核苷酸适配体-SHC6-A10-3.2分别加入超滤管中；其中磷酸三氯乙酯用来破开核苷酸适配体-SHC6-A10-3.2放置过程中的形成的二硫键，暴露巯基，以进行后续反应；
步骤3将步骤1获得的聚合物基167Er镧系金属螯合物MCPs(167Er)与步骤2获得的暴露巯基的-SHC6-A10-3.2适配体反应，其中，聚合物基167Er镧系金属螯合物MCPs(167Er)第二末端的马来酰亚胺功能化基团与暴露巯基的-SHC6-A10-3.2适配体的-SH基团发生迈克尔加成反应，合成了金属标记的适配体探针，即基于核苷酸适配体的金属探针，其反应活性位点为巯基与马来酰亚胺基团加成反应后形成的化合键。
实施例3基于核酸适配体的金属探针的特异性识别靶标的能力
选取前列腺癌PaC肿瘤组织切片上皮细胞的跨膜糖蛋白PSMA蛋白作为研究对象，以MCPs(167Er)为金属标签，选择Anti-PSMA的-SHC6-A10-3.2适配体Aptamer和Anti-PSMA的YPSMA-1抗体作为靶向基团，将MCPs(167Er)修饰Ab和Aptamer制备了167Er-YPSMA-1和167Er-A10-3.2两种不同类型的探针。采用紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、透射电子显微镜(TEM)等验证纳米探针的成功构建。通过传统免疫荧光成像(Immunofluorescence imaging,IF)技术结合IMC技术对选取的PaC肿瘤组织和正常组织中的PSMA的表达水平进行对比分析；利用IMC成像技术对合成167Er-A10-3.2和167Er-YPSMA-1探针纳米探针的靶向能力进行了验证，证明修饰后的Aptamer仍保留特异性识别靶标的能力。
如图3所示，(A)金属标记的适配体特异性靶向PaC组织切片的PSMA抗原并用于IMC检测的过程；具体过程如下：使用适配体金属探针标染PaC组织切片上的PSMA抗原，利用一束光斑为1μm的激光逐点烧蚀组织切片上的感兴趣的区域(Region of Interest，ROI),烧蚀产生的金属离子在惰性气体的保护下进入电感耦合等离子体飞行时间质谱中，得到质谱的检测信号，再将质谱的检测信号通过成像软件转换为图像输出，即组织成像，得到IMC图像。利用IMC技术采集扫描PaC组织中的金属信号，构建三维组织模型，实现了目标分子的成功定位。
(B)金属标记的适配体167Er-A10-3.2和金属标记的抗体167Er-YPSMA-1探针染色的IMC图像和167Er金属通道的热图，可见金属标记的适配体167Er-A10-3.2与金属标记的抗体167Er-YPSMA-1对于PSMA抗原具有相似的特异性识别能力，适配体金属探针可成功用于IMC技术。
(C)167Er-A10-3.2和167Er-YPSMA-1探针染色的IMC图像中167Er金属信号平均强度图(上)和191Ir平均强度图(下)，其中(上)图中虚线代表167Er-A10-3.2探针染色的IMC图像中167Er金属信号平均强度为0.59396，实线代表167Er-YPSMA-1探针染色的IMC图像中167Er金属信号平均强度为0.67057；其中(下)图中虚线代表167Er-A10-3.2探针染色的IMC图像中191Ir金属信号平均强度为147.9461，实线代表167Er-YPSMA-1探针染色的IMC图像中的191Ir金属信号平均强度为146.6549。
(D)167Er金属信号相对强度的柱状图，其中白色代表167Er-A10-3.2,黑色代表167Er-YPSMA-1，可见适配体167Er-A10-3.2的167Er金属信号相对强度略低于金属标记的抗体167Er-YPSMA-1的相对强度。表明在37℃抗原修复条件下，适配体金属探针的检测灵敏度与抗体金属探针相似。
实施例4IMC技术检测结果
金属标记的适配体探针能够特异性识别前列腺癌组织切片中的特定PSMA抗原，同时采取37℃条件下组织抗原修复对照试验，实验结果如图4所示，
(A)167Er-YPSMA-1和167Er-A10-3.2探针标染的PaC组织切片的IMC图像,IMC图像对应的灰度图和HistoCAT软件读取的167Er信号的热图,标尺:100μm；167Er-YPSMA-1抗体金属探针和167Er-A10-3.2适配体金属探针均可特异性靶向前列腺特异性抗原，且适配体金属探针展现出更强的167Er金属信号，结果表明适配体金属探针有望替代金属探针，在37℃进行抗原修复条件，提高对抗原的检测灵敏度。
(B)167Er-A10-3.2和167Er-YPSMA-1探针染色的IMC图像中167Er和191Ir金属信号平均强度图(左)与箱式图(右)，其中左上图中虚线表示167Er-A10-3.2探针染色的IMC图像中167Er金属信号平均强度为0.47414，实线表示167Er-YPSMA-1探针染色的IMC图像中167Er金属信号平均强度为0.22335；左下图中虚线表示167Er-A10-3.2探针染色的IMC图像的191Ir金属信号平均强度为26.3837，实线表示167Er-YPSMA-1探针染色的IMC图像的191Ir金属信号平均强度为36.0286。
(C)167Er-YPSMA-1和167Er-A10-3.2探针染色的IMC图像中的167Er信号的相对强度值，其中白色代表167Er-A10-3.2探针,黑色代表167Er-YPSMA-1探针，可见金属标记的适配体探针染色的IMC图像中167Er相对金属信号信号是金属标记的抗体探针相对金属信号的3倍，表明适配体金属探针具有更高的检测灵敏度。
IMC技术检测结果显示，适配体探针的金属信号是抗体探针携带的金属信号的3倍，探针的灵敏性得到了明显提高。实验结果与我们最初构想的小尺寸的纳米探针能够接触到更多的抗原表位，实现高密度的染色的假定是相一致的。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于核苷酸适配体的金属探针，其特征在于，所述金属探针包括由167Er金属阳离子、双功能聚合物和-SHC6-A10-3.2适配体组成的金属标记的核苷酸适配体Aptamer探针。
2.如权利要求1所述的一种基于核苷酸适配体的金属探针，其特征在于，所述双功能聚合物的第一末端为三胺五乙酸DTPA；其第二末端为马来酰亚胺功能基团。
3.一种基于核苷酸适配体的金属探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、制备聚合物基镧系金属螯合物，利用双功能聚合物中第一末端中的三胺五乙酸DTPA基团螯合167Er阳离子生成聚合物基167Er镧系金属螯合物MCPs(167Er)；
步骤2、-SHC6-A10-3.2适配体中加入磷酸三氯乙酯TCEP，得到暴露巯基的-SHC6-A10-3.2适配体，其中，所述磷酸三氯乙酯TCEP进一步还原了二硫键，所述二硫键是所述-SHC6-A10-3.2适配体放置过程中形成的；
步骤3、将步骤1获得的聚合物基167Er镧系金属螯合物MCPs(167Er)与步骤2获得的暴露巯基的-SHC6-A10-3.2适配体反应，其中，所述聚合物基167Er镧系金属螯合物MCPs(167Er)第二末端的马来酰亚胺功能化基团与所述暴露巯基的-SHC6-A10-3.2适配体的-SH基团发生迈克尔加成反应，合成了金属标记的适配体探针，即所述基于核苷酸适配体的金属探针。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中双功能聚合物的聚合度DP，决定所述聚合物基镧系金属螯合物MCPs(167Er)中金属离子的数量。
5.如权利要求3所述的一种基于核苷酸适配体的金属探针的制备方法，其特征在于，所述聚合物基镧系金属螯合物MCPs(167Er)聚合度DP为20-25。
6.一种权利要求1或2中所述基于核苷酸适配体的金属探针在识别靶标物质中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述靶标物质包括蛋白质、金属离子、小分子化合物、细胞膜表面受体；所述蛋白质包括前列腺癌上皮细胞特异性跨膜蛋白PSMA。
8.一种权利要求1或2中所述基于核苷酸适配体的金属探针在定位目标分子中的应用。
9.一种权利要求1或2中所述基于核苷酸适配体的金属探针在细胞系或细胞组织的蛋白质定量和定位分析中的应用。
10.一种权利要求1或2中所述基于核苷酸适配体的金属探针在非侵入性诊断成像试剂中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210629 |