KR20150018224A - T7 박테리오파지를 이용한 표적-특이적 프로브 및 이를 이용한 바이오마커의 탐지 - Google Patents

T7 박테리오파지를 이용한 표적-특이적 프로브 및 이를 이용한 바이오마커의 탐지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 T7 박테리오파지와 표적화 항체를 함유하는 표적-특이적 프로브 및 상기 프로브를 이용한 바이오마커의 탐지방법, 정량방법 또는 탐지키트에 관한 것으로서, T7 박테리오파지를 유전자 재조합기술을 이용하여 다양한 기능성 이종단백질과 펩타이드를 박테리오파지 표면에 발현하는 파지 디스플레이, 항원-항체 특이반응으로 바이오마커나 박테리아를 표적화하는 기술 및 양자점을 사용하여 표적 물질을 정량적으로 분석하는 방법으로 이용된다.

Description

T7 박테리오파지를 이용한 표적-특이적 프로브 및 이를 이용한 바이오마커의 탐지{TARGET-SPECIFIC PROBE COMPRSING T7 BACTERIOPHAGE AND DETECTING FOR BIOMARKER USING THE SAME}
본 발명은 T7 박테리오파지와 표적화 항체를 함유하는 표적-특이적 프로브 및 상기 프로브를 이용한 바이오마커의 탐지방법, 정량방법 또는 탐지키트에 관한 것이다.
바이오마커(biomarker)는 생물학적 또는 의학적 검체내에 존재하는 일종의 생체분자로서, 이들의 구조나 농도의 변화를 정성적 및/또는 정량적으로 탐지함으로써 질병의 상태를 진단하고, 약물의 치료효과 및 다른 질병과의 연관성을 종합적으로 판단하게 해주는 표식자 역할을 수행한다. 질병의 조기진단을 위해서는 발병 초기단계에서 나타나는 바이오마커를 정량적으로 분석하는 기술이 필수적이다. 이는, 질병의 모니터링을 위해 현재 사용되는 기술은 민감도, 검역속도, 및 비용 등의 한계성 때문에 질병의 조기진단에 대한 기술적 요구에 적절히 대응하지 못하고 있기 때문이다.
바이오마커를 정량적으로 분석하기 위해서, 효소면역항체법 (ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)법, 및 웨스턴 블랏팅법 및 질량분석기(Mass spectrometry)를 이용한 방법이 보편적으로 사용된다. ELISA의 경우 검정시료에 존재하는 다당류 혹은 페놀화합물들에 의해 반응이 저해되거나 조직 내에 존재하는 박테리오파지의 농도가 낮아, 정확히 탐지하기 어렵다. 질량분석기를 이용한 방법은 민감도가 매우 좋아서 미량의 바이오마커 분석에 적용 가능하나 주로 크로마토그래피법과 연계되어 분석되는 실험방법으로 인하여 재현성 확보가 곤란하고, 기기오차로 인하여 분석 데이터의 편차가 심한 단점이 있다. 또한 이들 방법은 과도한 노동력과 많은 시간이 소요된다.
최근 나노기술의 급격한 발달에 따라, 기존 검출법으로는 불가능하던 검출 기술이 부상하고 있다. 일례로 하버드 대학의 Lieber 그룹은 단일 박테리오파지를 검지하는 나노 검지 센서를 발표하였고 (Science, vol. 329, pp. 830-4, Aug 13 2010), 노쓰웨스턴 대학의 Mirkin 그룹은 나노프로브를 이용한 분자 검지 기술 (Sensors, vol. 12, pp. 1657-1687, Feb 7 2012)을 가지고 나노스피어 (Nanosphere)사를 설립하였다.
최근 나노기술의 급격한 발달에 따라, 기존 검출법으로는 불가능하던 검출 기술이 부상하고 있다. 일례로 하버드 대학의 Lieber 그룹은 단일 박테리오파지를 검지하는 나노 검지 센서를 발표하였고 (Science, vol. 329, pp. 830-4, Aug 13 2010), 노쓰웨스턴 대학의 Mirkin 그룹은 나노프로브를 이용한 분자 검지 기술 (Sensors, vol. 12, pp. 1657-1687, Feb 7 2012)을 가지고 나노스피어 (Nanosphere)사를 설립하였다.
그러나 나노입자를 활용하는 방법을 검지 감도는 뛰어나지만 나노소자와 같은 2차원 검출법은 극미량을 정량분석하기에는 검지대상에 대한 접근성이 떨어지는 문제와(도 1), 크기의 제약 때문에 바이러스나 박테리아처럼 나노입자에 비해 상대적으로 크기가 큰 경우 분리하고 검출하는데 한계가 있기 때문에 단백질이나 혈당 같은 저분자 물질에 응용이 국한되어 있다(도 2).
양자점은 나노크기를 갖는 무기반도체 물질로서 높은 양자효율, 뛰어난 광퇴색에 대한 저항성, 크기에 따른 형광특성의 제어, 중첩되지 않는 형광 스펙트럼 등 뛰어난 광특성으로 최근 다양한 의공학적 분야에 응용되고 있다. 중요한 질병 바이오마커들의 정량화에 양자점을 이용하려는 시도가 있어 왔다(Analytical Chemistry, vol. 76, pp. 4806-4810, Aug 15 2004; Analytical Chemistry, vol. 82, pp. 5591-5597, Jul 1 2010).
또한, 양자점의 형광 세기가 급격히 약해지는 ?칭(quenching)현상을 극복하기 위해 양자점의 개수를 다른 방식으로 측정하려고 시도들이 발표된 바 있다. 예를 들면, Prostate-specific Antigen (PSA)를 분리검출하고 정량화할 때 양자점을 강산에 용해하여 양자점을 구성하는 원소인 카드뮴 이온으로 인한 전기전도도의 변화를 측정한 바가 있었으나(Small, vol. 4, pp. 82-86, Jan 2008), 유독성 물질인 다량의 카드뮴 이온이 발생하여 문제가 있었다. 양자점을 이용한 분석법의 다른 예에서, 양자점을 분리시켜 고유한 형광을 측정하려는 목적에서 스트랩트아비딘(streptoavidin)-바이오틴(biotin) 결합을 절단하기 위해 고농도의 알칼리 용액과 유기용매를 사용하였으나(Analyst, vol. 135, pp. 381-389, 2010.), 유기용매에 의한 양자점의 뭉침현상(aggregation)이 발생할 수 있고, 실험조건이 양자점의 안정성과 광학적 특성이 열화(deterioration)하여 다양한 완충용액을 만들어서 시험해야 하는 단점이 있고, 재현성이 떨어지는 문제점이 있었다.
따라서 바이오마커를 고감도로 검출하기 위해서, 나노입자 또는 나노소자를 포함한 기존 검출 시스템이 갖는 한계점을 극복하고, 분석이 간단하고, 취급이 편리하며, 고감도로 정확한 검출결과를 제공하는 바이오마커의 새로운 탐지 시스템이 필요하다.
상기와 같은 과제를 달성하고자, 본 발명의 일 구현예는 T7 박테리오파지와 상기 T7 박테리오파지에 결합된 결합 펩타이드를 포함하는 복합체와 상기 복합체에 결합된 표적화 항체 (targeting agent)를 포함하는 표적-특이적 프로브(target-specific probe)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 나노입자나 나노소자를 포함한 기존 검출 시스템이 갖는 한계점을 극복하고, 분석이 간단하고, 취급이 편리하며, 고감도로 정확한 바이오마커의 탐지 결과를 제공하는, 상기 표적-특이적 프로브를 이용한 바이오마커의 탐지방법, 정량방법 및 탐지키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 달성하고자, 본 발명은 본 발명은, T7 박테리오파지의 머리부분에 연결된 결합 펩타이드와 상기 결합 펩타이드에 연결된 표적화 항체, 및상기 T7 박테리오파지의 꼬리부분에 연결되는 탐지 가능한 표지물질(detectable labeling agent) 을 포함하는 표적-특이적 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는, 탐지대상인 표적 바이오마커를 함유하는 시료에, 상기 바이오마커에 특이적인 표적화 항체와 탐지가능한 표지물질을 포함하는 표적-특이적 프로브를 접촉시키는 단계, 및 상기 바이오마커에 표적화된 프로브의 표지물질을 검출하는 단계를 포함하는 바이오마커의 탐지방법에 관한 것이다.
상기 바이오마커의 탐지방법에서, 상기 표지물질이 검출되는 경우 바이오마커가 상기 시료에 존재하는 것으로 결정하거나, 상기 표지물질의 표준곡선을 제작하고 상기 바이오마커에 표적화된 표지물질의 검출량을 상기 표준곡선과 비교하여, 시료내 바이오마커를 정량할 수 있다.
본 발명의 추가적인 구현예는, 상기 표적-특이적 프로브 및 표적화된 프로브의 표지물질을 검출하는 검출기를 포함하는 바이오마커의 탐지키트에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명에 따른 표적-특이적 프로브는, T7 박테리오파지의 머리부분에 연결된 결합 펩타이드와 상기 결합 펩타이드에 연결된 표적화 항체; 및 상기 T7 박테리오파지의 꼬리부분에 연결되는 탐지 가능한 표지물질(detectable labeling agent) 을 포함한다.
상기 결합 펩타이드는 상기 표적화 항체와 결합하여 T7 박테리오파지가 바이오마커로 표적화하는 기능을 돕는다. 상기 결합 펩타이드는 별도의 펩타이드로 제조하고 T7 박테리오파지 머리부분 단백질에 결합되거나, T7 박테리오파지 머리부분 단백질의 C-말단에 연결된 하나의 융합 단백질 형태로 제공될 수 있다. 상기 결합 펩타이드는 T7 박테리오파지의 머리부분에 직접 연결되거나, 15 내지 30 개 아미노산, 바람직하게는 15 내지 25개 아미노산으로 구성된 링커 펩타이드를 사용하여 결합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산의 임의의 중합체 쇄를 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 쇄를 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
본 발명에 적용 가능한 결합 펩타이드는 단백질 G(Pro G), 단백질 A(ProA), 단백질 A/G, Fc 수용체, 단백질 Z (Pro Z) 또는 바이오틴화 Tag(biotinylation tag)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 결합 펩타이드는 195개 아미노산으로 구성된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 G, 508개 아미노산으로 구성된 서열번호 2을 갖는 단백질 A일 수 있다.
상기 표적화 항체 또는 상기 표지물질은, HIS Tag, CYS Tag, GST Tag 및 바이오틴화 tag (biotinylation tag)중에서 선택되는 링커를 통해 상기 T7 박테리오파지의 머리부분의 결합 펩타이드 또는 꼬리부분에 연결될 수 있다. 상기 바이오틴화 tag은 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열(LAAIPGAGLIGTH)을 갖는 바이오틴 결합 펩타이드일 수 있으나 이에 한정되는 의도는 아니다. 상기 tag은 상기 T7 박테리오파지의 머리부분 또는 꼬리부분 단백질에 삽입된 또는 말단에 연결된 융합 단백질 형태로 제공될 수 있다.
바람직하게는, 상기 표적화 항체는 T7 박테리오파지 머리부분에 결합된 결합 펩타이드에 연결되고, 상기 표지물질은 T7 박테리오파지 꼬리부분에 결합된 tag 펩타이드를 통해 상기 T7 박테리오파지의 꼬리부분에 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 표적-특이적 프로브에서, 표적화 항체와 표지물질을 결합하는 센서 플랫폼으로서 T7 박테리오파지를 이용하는 것이다. 예를 들면, 센서 플랫폼으로서 T7 박테리오파지는 야생형 파지를 이용하는 경우, T7 박테리오파지 머리부분에 결합 펩타이드를 결합시키고, 결합 펩타이드에 표적화 항체를 직접 또는 링커 펩타이드를 통해 결합하여 제조하고, T7 박테리오파지 꼬리부분에 표지물질을 직접 또는 tag를 통해 결합하여 제조할 수 있다. 야생형 T7 박테리오파지의 머리부분의 염기서열 (1008bp) 및 꼬리부분(1662bp)의 염기서열을 서열번호 4 및 서열번호 5에 각각 나타냈다. 상기 머리부분의 염기서열은 전체 T7 박테리오파지 염기서열의 19363 내지 20370염기를 포함하는 부분이고, 상기 꼬리부분 염기서열은 30936 내지 35597 염기를 포함하는 부분이다.
또한, 센서 플랫폼으로서 유전적으로 변형된 T7 박테리오파지를 이용하는 경우, T7 박테리오파지 머리부분 단백질의 C-말단에 직접 또는 링커 펩타이드를 통해 연결된 하나의 융합 단백질 형태로 결합 펩타이드를 제공하고, T7 박테리오파지 꼬리부분에 삽입되거나 C-말단에 연결된 tag가 하나의 융합 단백질 형태로 제공되며, 상기 tag에 표지물질을 결합시켜 표적-특이적 프로브를 제조할 수 있다. 상기 tag을 T7 박테리오파지 꼬리부분에 결합하기 위해서는, 꼬리 부분을 암호화하는 유전자에 원하는 제한효소자리를 2개 삽입하고, tag 역시 양 끝에 위와 동일한 종류의 제한효소자리를 삽입하여 제한효소로 유전자를 절단한 후, 절단된 유전자를 라이게이션을 이용하여 융합할 수 있다.
본 발명의 구체적 일예에서, T7 박테리오파지 꼬리부분에 6XHis tag 이 삽입된 하나의 융합 단백질 형태로 제공될 수 있으며, 이에 대한 유전자 구성은 도 5에 나타낸다. 도 5에는 야생형 T7 박테리오파지의 꼬리부분 염기서열중 33589bp 내지 32608bp 위치에 6XHis tag를 암호화하는 유전자를 삽입한 염기서열을 나타낸다(서열번호 6 참조).
상기 센서 플랫폼으로서 유전적으로 변형된 T7 박테리오파지는 머리부분 단백질의 C-말단에 직접 또는 링커 펩타이드를 통해 연결된 결합 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 함유하는 머리부분과, 꼬리부분 단백질에 삽입되거나 C-말단에 연결된 tag 펩타이드를 포함하는 융합 단백을 함유하는 꼬리부분을 포함할 수 있다. 따라서, T7의 머리부분에는 표적(targeting moiety) 기능을, 꼬리부분에는 정량표시(quantitative indicator moiety) 기능을 부여함으로써 세포나 조직의 특정 부분을 이미징하거나 바이오마커를 정확히 정량화할 수 있는 센서를 개발하였으며, 이를 바탕으로 이미징 키트와 탐지키트를 개발하는 것이다.
본 발명의 일구현예에 따라, 상기 센서 플랫폼으로서 유전적으로 변형된 T7 박테리오파지를 포함하는 표적-특이적 프로브는, T7 박테리오파지의 머리와 꼬리 부분을 유전공학적으로 변형하여 T7 박테리오파지 센서 플랫폼을 만드는 단계; 및 T7 박테리오파지의 머리부분에는 바이오마커를 표적화할 수 있는 표적화 항체를 고정화시키고, 꼬리부분에는 탐지가능한 표지물질을 결합함으로써 T7 박테리오파지 표적 특이적-프로브 (이미징/정량화 센서)를 만드는 단계를 포함한다.
상기 결합 펩타이드와 표적화 항체의 결합은, 결합 펩타이드가 표적화 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 특성을 이용하거나, 또는 화학적 결합방법을 이용한 비특이적 결합을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 결합 펩타이드가 표적화 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 특성을 이용하여, 표적화 항체의 Fab 부분이 항상 활성화될 수 있도록 함으로써 표적능력을 향상시킬 수 있다. 상기 Fc 서열의 예를 들면, 단백질 G가 표적화하는 Fc 서열로서, 토끼, 염소, 인간 또는 마우스 유래 Fc 수용체I를 들 수 있으며, 구체적인 예로는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 마우스 유래 Fc receptor I인 Mus musculus (Mouse) Fc receptor I과 서열번호 8의 Homo sapiens (Human) Fc receptor I일 수 있다.
상기 화학적 결합방법의 구체예는, 엔-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide)(NHS), 및 에틸(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)를 이용한 화학결합방법(Nat Protoc 2007, 2 (5), 1152-1165)을 사용할 수 있으며, 상기 표적화 항체가 결합 펩타이드에 비특이적으로 결합하여 항체의 Fab부분이 활성화를 억제할 가능성이 있어, 다량의 항체를 반응시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 적용 가능한 표지 물질은 양자점, 자성비드 나노입자, 금 나노입자, 형광염료, 형광단백질, 나노인광체 또는 실리콘 나노입자가 가능하며, 상기 표지물질은 형광현미경, SEM, TEM, CT, 및 MRI 등으로 검출할 수 있다.
상기 T7 박테리오파지의 꼬리부분에 표지물질을 결합하는 방법은, 예를 들면 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용할 수 있다.
상기 T7 박테리오파지 1 분자에 대해서, 표지물질 1개 분자가 결합하는 1:1몰비 결합비율을 가지며, 표지물질의 높은 검출수준 및 민감도와, 표지물질간 공간확보가 가능하며, 기존보다 정확한 정량분석이 가능하다.
상기 표지물질은 그 자체로 상기 T7 박테리오파지의 꼬리부분에 연결된 tag을 통해 결합시킬 수도 있고, 상기 tag에 대한 결합능을 높이기 위해서 상기 표지물질에 화학적 처리를 가한 후에 결합시킬 수도 있다.
상기 표지물질이 양자점인 경우 그 자체로 사용할 수 있으나, 친수성기와 소수성기를 모두 포함하는 양친성 물질로 표면을 처리하여 얻어진 친수성 표면층을 포함하는 표지물질일 수 있다. 상기 친수성 표면을 갖는 양자점은 친수성을 가지면서 뭉침현상이 최소로 발생하는 것이 바람직하고, 니켈로 기능화하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 양친성 물질을 단독으로 또는 2이상의 혼합물로 처리할 수 있다. 상기 양자점의 표면처리 물질의 구체적인 예는 마이리스토일-2-하이드록시-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphocholine)(MHPC), 및 1,2-디스티어로일-에스엔-글라이세로-3-포스포에탄올아민-엔-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000 (DPPE-PEG2000), "1,2-디오레일- 에스엔-글리세로-3-엔-{5-아미노-1-카복실펜틸}이미노디아세틱 에시드 석시닐 니켈 쏠트 (Ni-NTA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. MHPC는 단일 아실(acyl)기 사슬지질이기 때문에 구형의 표면에 조밀하게 코팅될 수 있고, DPPE-PEG2000은 지질이 코팅된 양자점에 안정성을 부여하고, Ni-NTA는 T7 박테리오파지의 꼬리부분 또는 tag에 있는 아미노산과 결합하여 양자점을 T7 박테리오파지의 꼬리부분에 결합할 수 있도록 한다.
본 발명의 구체적 일예에 따르면, MHPC, DPPE-PEG2000 및 Ni-NTA를 각각 단독으로 사용하거나, 상기 세가지 성분을 포함하는 혼합물 형태로 사용할 수 있다. 예를 들면 MHPC 50 내지 95 몰 %, DPPE-PEG2000 5 내지 35 몰 %, 및 Ni-NTA 1 내지 15 몰 % 의 비율의 혼합물을 양자점과 혼합하여 에멀젼 상태를 만들고, 초음파 처리를 수행하여 양자점 표면에 친수성 표면층을 형성하도록 한다. 상기 혼합물의 조성은 예시로서 제시된 것이며, 사용하는 양친성 화합물의 종류 등에 따라 다양한 비율로 조절될 수 있다.
본 발명의 추가 구현예에 따라, 상기 표적-특이적 프로브를 이용하여 세포(cell)이나 조직(tissue)의 원하는 부분을 정량 이미징(quantitative imaging) 키트를 제공하거나, 혈액, 소변, 타액 등과 같은 생체 시료에서 표적 바이오마커들을 탐지하는 방법, 또는 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일예는, 바이오마커를 함유하는 시료에, 상기 바이오마커에 특이적인 표적화 항체와 표지물질을 함유하는 상기 표적-특이적 프로브를 접촉시키는 단계, 및 상기 바이오마커에 표적화된 프로브의 표지물질을 검출하는 단계를 포함하는 바이오마커의 탐지방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 일예는 표적-특이적 프로브 및 표적화된 프로브의 표지물질을 검출하는 검출기를 포함하는 바이오마커의 탐지키트에 관한 것이다. 상기 표적-특이적 프로브에 관해서는 상기 상세히 기술한 바와 같다.
상기 바이오마커의 탐지방법에 있어서, 상기 표지물질이 검출되는 경우 바이오마커가 상기 시료에 존재하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또는, 상기 다양한 농도의 표지물질에서 측정된 검출량으로 표준곡선을 제작하고, 상기 바이오마커에 표적화된 표지물질의 검출량을 상기 표준곡선과 비교하여 시료내 바이오마커를 정량하는 방법일 수 있다.
상기 바이오마커 탐지키트는 표적-특이적 프로브 및 표적화된 프로브와 표지물질을 검출하는 검출기를 포함한다.
T7 박테리오파지을 포함하는 표적-특이적 프로브를 시료에 접촉하여 표적화된 상태에서, 표지물질(예, 양자점)과 T7 박테리오파지 사이의 결합을 선택적으로 분리시킴으로써, 다른 물질의 영향을 받지 않고 바이오마커의 양에 정확히 비례하는 분리된 양자점만의 고유한 흡광도 값으로부터 표적된 바이오마커를 고감도로 정량분석할 수 있다. 상기 표지물질과 T7 박테리오파지의 선택적 분리를 수행하는 방법은, 예를 들면 양자점 표면의 친수성 반응기와 기능화된 T7 박테리오파지 꼬리 부분의 히스티틴과 형성된 결합을 이미다졸을 첨가하여 수행하며 이로써, 양자점만을 선택적으로 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 T7 박테리오파지 센서 플랫폼을 이용한 표적-특이적 프로브, 이를 이용한 바이오마커 탐지 및 정량 기술의 장점은 다음과 같다.
T7 박테리오파지 프로브는 60nm 정도의 크기가 큰 환경 유해인자를 표적화할 수 있고, 머리와 꼬리 부분이 있어서 각각 개별적으로 기능화시키면 형상적/구조적 장점을 지니고 있다. 또한, 매질 속에서 3차원적으로 환경 유해인자를 표적화하여 검출하기 때문에 2차원적인 나노입자 비해 극미량의 정량 검출이 가능하다.
T7 박테리오파지 프로브는 표적화 항체가 대상 표적물질과 1:1 몰비로 표적하기 때문에 정확한 정량분석이 가능하다. T7 박테리오파지 프로브의 머리부분에 1개의 표적화 항체를 결합시킴으로써 표적물질과 1:1로 표적화한다. 이는 정량 분석을 할 때, 바이오마커의 개수만큼 T7 박테리오파지에 표지된 정량지시물질의 개수와 대응하기 때문에 정확히 바이오마커의 양을 측정할 수 있다.
T7 박테리오파지 프로브의 크기가 60nm로 일정하기 때문에 바이오마커의 측정 농도와 T7 박테리오파지의 수는 비례하게 된다. 이로 인해, 정량 분석시 측정오차는 작아지게 된다. 바이오마커는 나노미터 단위의 크기를 갖는 경우가 많으며 이에 다른 단백질들 또는 화학물질이 섞여있는 혈액 안에서 바이오마커와 선택적 결합이 유리하다.
본 발명의 일예에 따라, Ni-NTA로 표면처리된 양자점을 표지물질로 사용하고 6 His tag을 포함하는 변형 T7 박테리오파지를 사용하는 경우, 양자점의 Ni-NTA 와 T7 박테리오파지의 히스티딘 사이의 결합을 사용하기 때문에, 매질 교체 때문에 생기는 정량지시물질의 손실을 막아 정확한 정량분석이 가능하다. Ni-NTA 와 히스티딘 사이의 결합은 금속이온인 Ni을 중심으로 히스티딘이 그 주변에 수소결합으로 배위하여 결합을 형성하는 특징을 이용한 것으로, 화학적 결합이 아니다. 때문에, 화학적 결합으로 생길 수 있는 T7 박테리오파지 센서의 응집현상을 방지할 수 있고, 화학물질을 제거하기 위해 매질을 교체하는 과정에서 생길 수 있는 센서물질의 손실을 막을 수 있다.
T7 박테리오파지 프로브는 파지 디스플레이(phage display) 기술을 응용해 양산하기 때문에 변형 T7 박테리오파지를 다량으로 용이하게 생산할 수 있다. 대장균(Escherichia coli)을 숙주로 하는 박테리오파지이기 때문에 생산비용이 적어 경제적이다. 이러한 장점들을 활용하여, T7 박테리오파지를 유전자 재조합기술을 이용, 조작해서 매우 다양한 기능성 이종단백질과 펩타이드를 박테리오파지 표면에 발현하는 파지 디스플레이와 항원-항체 특이반응으로 바이오마커나 박테리아를 타겟팅 하는 기술, 양자점을 사용하여 타겟 물질을 정량적으로 분석하는 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 T7 박테리오파지를 이용한 표적 특이적 프로브 및 이를 이용한 탐지방법은 2차원적인 나노입자 비해 극미량의 정량 검출이 가능하고, 바이오마커의 개수만큼 T7 박테리오파지에 표지된 정량지시물질의 개수와 대응하기 때문에 정확히 바이오마커의 양을 측정할 수 있으며 화학적 결합으로 생길 수 있는 T7 박테리오파지 센서의 응집현상을 방지할 수 있고, 화학물질을 제거하기 위해 매질을 교체하는 과정에서 생길 수 있는 센서물질의 손실을 막을 수 있다.
도 1은 종래기술에 따른 나노입자와 같은 2차원 검출법은 검지대상에 대한 접근성의 한계로 미량을 초고감도로 검지하는데 한계를 보이는 모식도이다.
도 2는 종래기술에 따른 나노입자만을 이용한 검출법은 크기의 한계로 바이러스나 박테리아를 검출하기 어렵고, 단백질 등의 검출 등에 한정된다는 문제점을 보여주는 모식도이다.
도 3은 T7 박테리오파지의 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예 따라 T7 박테리오파지 유전자의 PCR 실시를 보여주는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예 따라 6개의 히스티딘 서열을 T7 박테리오파지의 꼬리부분에 삽입한 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에 따른 변형 T7 박테리오파지 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 유전공학적으로 변형된 T7 박테리오파지의 일례를 도시한 것이다.
도 8 및 도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 유전공학적으로 변형된 T7 박테리오파지를 이용하여 세포를 표적화한 이미지 사진이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 유전공학적으로 변형된 T7 박테리오파지의 TEM 사진이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 양자점 농도에 따른 350nm에서의 흡광도를 보여주는 표준곡선이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 CRP 바이오마커의 정량분석 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 이들에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: T7 박테리오파지의 제조
1-1: T7 박테리오파지의 각 부분 제조
T7 박테리오파지의 DNA는 머크(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. 본 실시예에 사용된 PCR 키트는 카이아젠(Qiagen,Hiden,Germany)으로부터 구입했고, Sac II 을 포함한 나머지 제한효소들은 뉴잉글랜드바이오랩스(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)으로부터 구입했다. DNA 프라이머와 올리고뉴클레오티드는 코스모진텍(Cosmogenetech,Seoul, Korea)에서 주문 제작하였다.
도 3에서와 같이 T7 유전자를 세 부분으로 나누어서 각각에 대한 PCR을 실시하였다. 도 4는 본 발명의 일실시예 따라 T7 박테리오파지 유전자의 PCR 실시를 보여주는 도면이다. 도 4-①은 T7 유전자 길이의 전체 37.2 kb 중 앞부분 33.2 kb에 해당하는 부분이다. 도 4-②은 T7 유전자 길이의 전체 37.2 kb 중 중간부분 400 bp에 해당하며, 상기 유전자는 his6 태그를 포함하고, 이는 코스모진텍(Cosmogenetech, Seoul, Korea)에서 플라스미드 상태로 구입하였다. 도 4-③은 T7 유전자 전체 중 뒷부분 3.6 kb에 해당하였다.
명명 증폭대상 서열 5'--> 3' 서열번호
정방향 프라이머 1 T7의 앞부분
33.2 kb		 TCTCACAGTGTACGGACCTAAAGTTCCCCCATAG 9
역방향 프라이머 1 T7의 앞부분
33.2 kb		 TACCATCAGT GGCCACAACG GCCTGACCTAC 10
정방향 프라이머 2 T7의
중간부분 400bp		 TAGGTCAGGCCGTTGTGGCCACTGATG 11
역방향 프라이머 2 T7의
중간부분 400bp		 GAGAGTCCATCCGCGGACTACACGTC 12
정방향 프라이머 3 T7의 뒷부분
3.6kb		 GACGTGTAGTCCGCGGATGGACTCTC 13
역방향 프라이머 3 T7의 뒷부분
3.6kb		 AGGGACACAGAGAGACACTCAAGGTAACACC 14
PCR을 실시하기 위해, 프라이머(Forward Primer 1, Backward Primer 1) 20 pmol, T7 유전자 10 ng, dNTP 25 mM, PCR 버퍼 5 μl, PCR 효소 0.4 μl를 PCR 튜브에 혼합해준다. 그리고 다음과 같은 온도 사이클로 PCR을 실시하였다.
Segment Cycle 온도 시간
1 1 93℃ 3분
2 10 93℃ 15초
Tm-5℃ 30초
68℃ 1분/kb
3 25 93℃ 15초
Tm-5℃ 30초
68℃ 1분/kb (+20초/cycle)
4 1 4℃ ∞
각각의 PCR 생성물은, 아가로즈 젤에 PCR 생산물을 넣고 전기영동을 실시하여 PCR 단계에서의 성공 여부를 확인하였다. 진한 밴드가 나오는 것을 확인함으로써 프라이머로 만들어진 T7 박테리오파지의 유전자 주형이 증폭되었다는 것을 확인하였다.
1-2: 도 4-② 400 bp 와 도 4-③ 3.6 kb 의 접합
다음, PCR로 증폭시킨 세 유전자를 라이게이션하여 6X His tag가 코딩된 T7 유전자를 만들었다. 도 4-② 400 bp와 도 4-③ 3.6 kb는 PCR 라이게이션 방법을 이용하여 라이게이션을 실시했고, 새로운 도 4-④ 4 kb의 2차 PCR 생성물과 도 4-①은 머크(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에서 구입한, 라이게이션 키트를 이용하여 라이게이션을 실시하여 His6 tag가 코딩된 T7 유전자를 완성하였다.
도 4-② 400 bp와 도 4-③ 3.6 kb를 PCR 라이게이션 방법으로 두 개의 유전자를 라이게이션 시킨다. PCR 라이게이션을 위해 사용한 프라이머는 상기 표 1에 나타낸 정방향 프라이머 3와 역방향 프라이머 3를 사용하였다.
20pmol, 도 4-② 400 bp PCR 생성물 1 ul, 도 4-③ 3.6 kb PCR 생성물 1 ul, dNTP 25 mM, PCR 버퍼 5 ul, PCR 효소 0.4 ul를 PCR 튜브에 혼합해준다. 그리고 상기 PCR 실험에서와 같은 온도 사이클로 PCR을 실시하였다.
1-3: 도 4-④ 4 kb 와 도면 4-① 33.2 kb 의 접합
도 4-④ 4 kb의 2차 PCR 생성물과 도 4-① 33.2 kb를 단일 제한 효소인 Sfi I을 이용해, 각각 유전자의 말단 부분을 절단하였다. 스티키 엔드 부분으로 잘린 두 유전자를 라이게이션 효소를 이용하여 His6 tag가 코딩된 37.2 kb 길이의 T7 유전자로 만들었다.
올리고뉴클레오티드와 T7 박테리오파지 주형을 전기영동을 실시하여 염이나 enzyme등의 다른 불순물을 분리시키고, 정제키트를 이용해서 정제하였다.
T4 DNA ligase 1 ?, 10 mM, ATP 0.5 ?, DTT 0.5 ?를 0.05 pmol의 올리고뉴클레오티드와 0.02 mol의 T7 박테리오파지 주형이 들어있는 튜브에 넣었다. 그 후, 반응물을 16 ℃에서 4시간 동안 인큐베이팅시켜 반응시켰다.
실시예 2: 변형 T7 박테리오파지 벡터의 제조
2-1: 단백질G가 연결된 T7 박테리오파지 벡터
Promega사에서 구입한 Protein G의 유전자를 N- 말단에 EcoR I과 C- 말단에 Hind III의 제한효소 인식자리를 만들었다. 상기 실험을 실시하기 위해서, 아래와 같은 2개의 Primer를 디자인하여 Protein G 유전자를 주형으로 PCR을 실시하였다. 정방향 프라이머 4는 EcoR I 제한효소 인식자리를, 역방향 프라이머 4는 Hind III 제한효소 인식자리를 포함한다.
정방향 프라이머 4(서열번호 15): 5'-GCTGAATTCATGACTTACAAA-3'
역방향 프라이머 4(서열번호 16): 5'-AAGCTTTTAT TCAGTTACCG-3'
PCR후 완성된 제한효소 인식자리를 갖는 단백질 G 유전자를 1% 아가로즈 젤에 전기영동을 실시하고, Qiagen사의 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
꼬리유전자에 6His Taq을 연결한 T7 박테리오파지 벡터를 EcoR I과 Hind III 두 종류의 제한효소를 사용하여 잘랐다. 자른 후 0.5%의 아가로즈 겔에 전기영동을 실시한 후 밴드를 정제하였다.
T7 박테리오파지 벡터와의 유전자 결합을 위해 알카인 포스테이스(Alkaine Phophatase)를 사용하여 5'말단의 인산기를 제거하였다. T7 박테리오파지의 꼬리 부분에 6개 HIS을 암호화하는 염기서열이 포함된 염기서열을 도 5 및 서열번호 6에 나타냈다.
2-2: 변형 T7 박테리오파지 벡터
0.05pmol의 제한효소 인식자리를 갖는 단백질 G와 0.02pmol의 T7 박테리오파지 벡터를 T4 DNA ligase 1 μl, 10mM, ATP 0.5 μl, DTT 0.5 μl를 0.05pmol의 시약을 첨가하여, Protein G와 T7 박테리오파지 벡터를 결합시켰다(단백질G-T7 박테리오파지-(HIS)tag)(도 6의 벡터 개열지도) .
실시예 3: 변형 T7 박테리오파지의 생산 및 배양
3-1: 세포 형질전환
BLT5403 컴피턴트 세포(competent cell)을 얼음 위에 녹이고 1.5 ml 폴리프로필렌 튜브(polypropylene tube)에 40 μl의 세포와 실시예 2-3에서 얻은 단백질G-T7 박테리오파지-(HIS)tag) 2 μl를 혼합하였다. 1분간 얼음 위에서 반응시킨 후 0.1 cm 전기천공용 큐벳(Electroporation cuvette)으로 옮긴 후 MicropulserTM Electroporation Apparatus(Bio-rad, USA) 을 이용하여 1.8 kV, 4 ms, 200 Ohm, 25μF 의 조건에서 전기충격 1회 실시하였다.
전기천공을 실시한 후 바로 혼합물에 1 ml의 M9LB 배지를 첨가해주고 37 ℃에서 1시간 배양을 실시함으로써 전기충격 후에 필요한 세포의 회복기간을 주었다.
3-2: T7 박테리오파지의 생성확인
전기천공법에서 박테리오파지의 생성유무를 확인하기 위해 플라크어세이(plaque assay)를 실시하였다. 45 내지 50℃의 탑 아가로즈(top agarose) 3 ml을 전기천공후 만들어진 샘플 300 μl와 혼합한 후, 항생제 암피실린 (ampicillin) 가 첨가된 LB 배지가 함유된 플레이트에 도말하였다. 37 ℃에서 3 내지 4 시간 동안 배양시킨 후 투명한 모양의 플라크의 숫자를 세어 박테리오파지의 생성유무를 확인하였다.
T7 박테리오파지의 생성을 추가로 확인하고자, Liquid lysate amplification을 수행하였다. 즉, 암피실린 항생제가 포함된 LB 용액 50 ml에 BLT5403 대장균(E. coil) 콜로니(colony) 한 개를 혼합한 후, 37℃ 200 rpm의 인큐베이터에서 O.D.(Optical Density)600 = 0.5~1.0에 도달할 때까지 배양하였다. 배양액과 전기천공후 만들어진 샘플 300 ?를 혼합한 후에, 혼합 용액이 박테리오파지에 의해 투명해지고 O.D.값이 감소할 때까지, 37℃ 200 rpm에서 1~3시간 동안 배양하였다. 얻어진 배양액을 8,000 g에서 10분간 원심분리하여, 대장균과 박테리오파지를 분리하고, 상등액을 멸균처리된 병에 옮겨 4℃에서 보관하였다.
3-3: 꼬리부분에 6 His Taq 이 결합된 T7 박테리오파지의 선택적 분리
친화도에 따른 선택적 분류(Affinity selection)방법을 이용하여 상기의 공정을 통해 꼬리부분에 6His Taq이 결합된는 T7 박테리오파지만을 선택적으로 분리하였다.
구체적으로, T7 lysate 용액 50 ml에 니켈 다공체(mesh = 800 nm) 조각을 넣고 1시간동안 4 ℃에서 반응시킨다. 홀의 크기가 0.5 ?인 에폭시 수지(epoxy resin)가 코팅되어있는 폴리프로필렌 컬럼(polypropylene column)에 반응시킨 니켈 다공체를 넣고, 70 % 에탄올 10 ml을 흘려 보내주어 2회 세척하였다. 1 M 이미다졸(imidazole) 용액 3 ml을 흘려보내 T7 박테리오파지의 히스티딘과 니켈 다공체와의 결합을 끊고 용액을 수집하였다. 밀리포어(Millipore, USA)사의 아미콘 한외여과막 (amicon ultra purification filter, UFC510024)를 사용해서 용액의 버퍼(buffer)를 PBS(phosphate buffered saline)로 교체하였다. 상기 공정을 통해 꼬리부분에 히스티딘이 달려있는 T7 박테리오파지만을 선택적으로 분리할 수 있었다. 본 발명의 일실시예에 따라 유전공학적으로 변형된 T7 박테리오파지의 TEM 사진을 도 10에 나타냈다.
실시예 4: 표적-특이적 프로브 제조
4-1: 표적-특이적 프로브
실시예 3에서 얻어진 1 pmol의 재조합 T7 박테리오파지 용액과 1 pmol 의 CLDN4(claudin-4) 인간항체 (anti claudin4 rabbit monoclonal antibody) 용액을 섞은 후, 1시간 동안 4 ℃에서 반응시켜 결합하여 표적화 항체가 결합된 표적-특이적 프로브를 제조하였다.
4-2: 표지물질의 준비
5% Ni-NTA 지방질(lipid), 15% PEG2000 지방질, 80% MHPC(1-myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-phosphocholine) 지방질로 코팅한 친수성의 양자점 1 pmol을 상기 혼합액에 넣는다. 공학적으로 제어된 T7 박테리오파지의 꼬리 부분의 히스티딘과 친수성의 양자점에서 Ni-NTA 지방질부분과 결합을 위해 1일간 4 ℃의 조건에서 반응하였다.
4-3: 세포 준비
이미지용 세포를 준비하기 위해서, T-25 플라스크에서 4000 cells/cm2의 분포를 가지는 Capan-1 세포를 37 ℃, 5 % CO2의 조건에서 3일간 배양시키고, 3.7 %의 포름알데히드(Formaldehyde)로 세포를 고정시켰다. 준비된 세포에 5 %의 혈청과 50 mM 의 염화암모늄(NH4Cl)의 버퍼조건에서, 항체와 양자점이 결합되어 있는 T7 박테리오파지 용액을 투여하였다. 37 ℃, 5 % CO2의 조건에서 8시간 동안 반응시킨 후, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 레이카(Leica, DP72) 형광현미경을 이용해, (TRITC 필터, 100ms 노광시간)의 조건에서 이미지를 관찰하였다. 도 8 및 도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 유전공학적으로 변형된 T7 박테리오파지를 이용하여 세포를 표적화한 이미지 사진이다.
실시예 5: 바이오마커의 정량
1 mg/ml 농도의 포획항체(capture antibody) (anti claudin4 rabbit monoclonal antibody)를 96웰플레이트(96 well plate)에 넣는다. 25 ℃에서 2시간동안 반응시킨 후 용액을 제거하고 200 μl의 PBS 버퍼로 3회 세척해준다. 300 μl의 스킴밀크(skim milk)을 넣고 25 ℃에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 반응이 일어나지 않도록 하였다. 반응 후 스킴 밀크(skimmed milk)를 제거해주고, 항원이 포함되어 있는 혈청 100 μl를 웰 안에 첨가하였다. 항체와 양자점이 결합된 기능화된 T7 박테리오파지 100 μl를 넣고 25 ℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후 PBS로 세척하였다.
농도를 알고 있는 양자점의 350nm 파장에서의 흡광도 값을 측정하여 표준곡선을 만들었다(0.37 nM, 0.9 nM, 1.6 nM, 3 nM, 5 nM, 12.5 nM, 25 nM). 상기 표준곡선은 도 11에 나타냈다. 도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 양자점 농도에 따른 350nm에서의 흡광도를 보여주는 표준곡선이다.
그 후에 농도가 1 M인 이미다졸 100 μl를 샌드위치 어세이에 첨가시켜 상온에서 30 분 동안 반응시켜 T7 박테리오파지에 결합되어 있는 양자점을 분리시켰다. 항원의 분자의 개수와 일치하는 선택적으로 분리된 양자점은 상등액을 수거하여 얻을 수 있었고, 이렇게 얻어진 용액의 흡광도를 측정하여 상기 표준곡선을 이용하여 정량분석을 하였다. CRP biomarker 정량분석 결과를 도 12에 나타냈다. 도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 CRP 바이오마커의 정량분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12에 나타낸 것과 같이, T7 probe를 이용해 QD의 흡광도를 측정하여 정량분석 한 결과, 검출된 QD의 양과 실험에 사용된 CRP 단백질의 양이 비례하게 나타났다. 이로써, pico(10-12) molar 단위의 단백질들을 상기의 T7 probe로 검출이 가능할 뿐 만 아니라 정확히 정량이 가능함을 알 수 있다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> TARGET-SPECIFIC PROBE COMPRISING T7 BACTERIOPHAGE AND DETECTING FOR BIOMAKER USING THE SAME <130> DPP20127256KR <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ProG <400> 1 Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr 1 5 10 15 Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr 20 25 30 Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr 35 40 45 Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu 50 55 60 Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr 65 70 75 80 Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu 85 90 95 Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp 100 105 110 Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu 115 120 125 Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu 130 135 140 Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val 145 150 155 160 Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn 165 170 175 Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr 180 185 190 Val Thr Glu 195 <210> 2 <211> 508 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ProG <400> 2 Met Lys Lys Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Arg Lys Leu Gly Val Gly Ile 1 5 10 15 Ala Ser Val Thr Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro 20 25 30 Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 35 40 45 Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe 50 55 60 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly 65 70 75 80 Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln 85 90 95 Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 100 105 110 Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 115 120 125 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys 130 135 140 Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys 145 150 155 160 Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn 165 170 175 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 180 185 190 Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln 195 200 205 Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 210 215 220 Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly 225 230 235 240 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu 245 250 255 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn 260 265 270 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 275 280 285 Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys 290 295 300 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 305 310 315 320 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys 325 330 335 Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys 340 345 350 Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys 355 360 365 Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys 370 375 380 Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys 385 390 395 400 Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val 405 410 415 Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr 420 425 430 Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met 435 440 445 Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn 450 455 460 His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu 465 470 475 480 Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu 485 490 495 Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Arg Arg Glu Leu 500 505 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BIOTINYLATING tag <400> 3 Leu Ala Ala Ile Pro Gly Ala Gly Leu Ile Gly Thr His 1 5 10 <210> 4 <211> 1008 <212> DNA <213> Head part of wild type T7 bacteriophage <400> 4 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtactaacc aaggtaaagg tgtagttgct 60 gctggagata aactggcgtt gttcttgaag gtatttggcg gtgaagtcct gactgcgttc 120 gctcgtacct ccgtgaccac ttctcgccac atggtacgtt ccatctccag cggtaaatcc 180 gctcagttcc ctgttctggg tcgcactcag gcagcgtatc tggctccggg cgagaacctc 240 gacgataaac gtaaggacat caaacacacc gagaaggtaa tcaccattga cggtctcctg 300 acggctgacg ttctgattta tgatattgag gacgcgatga accactacga cgttcgctct 360 gagtatacct ctcagttggg tgaatctctg gcgatggctg cggatggtgc ggttctggct 420 gagattgccg gtctgtgtaa cgtggaaagc aaatataatg agaacatcga gggcttaggt 480 actgctaccg taattgagac cactcagaac aaggccgcac ttaccgacca agttgcgctg 540 ggtaaggaga ttattgcggc tctgactaag gctcgtgcgg ctctgaccaa gaactatgtt 600 ccggctgctg accgtgtgtt ctactgtgac ccagatagct actctgcgat tctggcagca 660 ctgatgccga acgcagcaaa ctacgctgct ctgattgacc ctgagaaggg ttctatccgc 720 aacgttatgg gctttgaggt tgtagaagtt ccgcacctca ccgctggtgg tgctggtacc 780 gctcgtgagg gcactactgg tcagaagcac gtcttccctg ccaataaagg tgagggtaat 840 gtcaaggttg ctaaggacaa cgttatcggc ctgttcatgc accgctctgc ggtaggtact 900 gttaagctgc gtgacttggc tctggagcgc gctcgccgtg ctaacttcca agcggaccag 960 attatcgcta agtacgcaat gggccacggt ggtcttcgcc cagaagct 1008 <210> 5 <211> 1662 <212> DNA <213> Tail part of wild type T7 bacteriophage <400> 5 atggctaacg taattaaaac cgttttgact taccagttag atggctccaa tcgtgatttt 60 aatatcccgt ttgagtatct agcccgtaag ttcgtagtgg taactcttat tggtgtagac 120 cgaaaggtcc ttacgattaa tacagactat cgctttgcta cacgtactac tatctctctg 180 acaaaggctt ggggtccagc cgatggctac acgaccatcg agttacgtcg agtaacctcc 240 actaccgacc gattggttga ctttacggat ggttcaatcc tccgcgcgta tgaccttaac 300 gtcgctcaga ttcaaacgat gcacgtagcg gaagaggccc gtgacctcac tacggatact 360 atcggtgtca ataacgatgg tcacttggat gctcgtggtc gtcgaattgt gaacctagcg 420 aacgccgtgg atgaccgcga tgctgttccg tttggtcaac taaagaccat gaaccagaac 480 tcatggcaag cacgtaatga agccttacag ttccgtaatg aggctgagac tttcagaaac 540 caagcggagg gctttaagaa cgagtccagt accaacgcta cgaacacaaa gcagtggcgc 600 gatgagacca agggtttccg agacgaagcc aagcggttca agaatacggc tggtcaatac 660 gctacatctg ctgggaactc tgcttccgct gcgcatcaat ctgaggtaaa cgctgagaac 720 tctgccacag catccgctaa ctctgctcat ttggcagaac agcaagcaga ccgtgcggaa 780 cgtgaggcag acaagctgga aaattacaat ggattggctg gtgcaattga taaggtagat 840 ggaaccaatg tgtactggaa aggaaatatt cacgctaacg ggcgccttta catgaccaca 900 aacggttttg actgtggcca gtatcaacag ttctttggtg gtgtcactaa tcgttactct 960 gtcatggagt ggggagatga gaacggatgg ctgatgtatg ttcaacgtag agagtggaca 1020 acagcgatag gcggtaacat ccagttagta gtaaacggac agatcatcac ccaaggtgga 1080 gccatgaccg gtcagctaaa attgcagaat gggcatgttc ttcaattaga gtccgcatcc 1140 gacaaggcgc actatattct atctaaagat ggtaacagga ataactggta cattggtaga 1200 gggtcagata acaacaatga ctgtaccttc cactcctatg tacatggtac gaccttaaca 1260 ctcaagcagg actatgcagt agttaacaaa cacttccacg taggtcaggc cgttgtggcc 1320 actgatggta atattcaagg tactaagtgg ggaggtaaat ggctggatgc ttacctacgt 1380 gacagcttcg ttgcgaagtc caaggcgtgg actcaggtgt ggtctggtag tgctggcggt 1440 ggggtaagtg tgactgtttc acaggatctc cgcttccgca atatctggat taagtgtgcc 1500 aacaactctt ggaacttctt ccgtactggc cccgatggaa tctacttcat agcctctgat 1560 ggtggatggt tacgattcca aatacactcc aacggtctcg gattcaagaa tattgcagac 1620 agtcgttcag tacctaatgc aatcatggtg gagaacgagt aa 1662 <210> 6 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tailgene of bacteriophage T7 with insertion of 6X His tag <400> 6 ggccgttgtg gccactgatg gtaatattca aggtactaag tggggaggta aatggctgga 60 tgcttaccta cgtgacagct tcgttgcgaa gtccaaggcg tggactcagg tgtggtctgg 120 tagtgctggc ggtggggtaa gtgtgactgt ttcacaggat ctccgcttcc gcaatatctg 180 gattaagtgt gccaacaact cttggaactt cttccgtact ggccccgatg gaatctactt 240 catagcctct gatggtggat ggttacgatt ccaaatacac tccaacggtc tcggattcaa 300 gaatattgca gacagtcgtt cagtacctaa tgcaatcatg gtggagaacg agcatcacca 360 tcaccatcac taattggtaa atcacaagga aagacgtgta gtccgcgg 408 <210> 7 <211> 404 <212> PRT <213> Mus musculus (Mouse) Fc receptor I <400> 7 Met Ile Leu Thr Ser Phe Gly Asp Asp Met Trp Leu Leu Thr Thr Leu 1 5 10 15 Leu Leu Trp Val Pro Val Gly Gly Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala 20 25 30 Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn 35 40 45 Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr 50 55 60 Gln Trp Phe Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Pro Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln 85 90 95 Ile Gly Ser Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn 100 105 110 Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu 115 120 125 Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn 130 135 140 Val Val Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser 145 150 155 160 Glu Val Ala Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His 165 170 175 Cys Ser Gly Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile 180 185 190 Thr Val Lys Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser 195 200 205 Ser Pro Phe Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val 225 230 235 240 Gly Ser Lys Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile 245 250 255 Ala Arg Ala Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala 260 265 270 Thr Glu Asp Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln 275 280 285 Val Leu Gly Pro Gln Ser Ser Ala Pro Val Trp Phe His Ile Leu Phe 290 295 300 Tyr Leu Ser Val Gly Ile Met Phe Ser Leu Asn Thr Val Leu Tyr Val 305 310 315 320 Lys Ile His Arg Leu Gln Arg Glu Lys Lys Tyr Asn Leu Glu Val Pro 325 330 335 Leu Val Ser Glu Gln Gly Lys Lys Ala Asn Ser Phe Gln Gln Val Arg 340 345 350 Ser Asp Gly Val Tyr Glu Glu Val Thr Ala Thr Ala Ser Gln Thr Thr 355 360 365 Pro Lys Glu Ala Pro Asp Gly Pro Arg Ser Ser Val Gly Asp Cys Gly 370 375 380 Pro Glu Gln Pro Glu Pro Leu Pro Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ala Gln 385 390 395 400 Thr Ser Gln Ser <210> 8 <211> 374 <212> PRT <213> Homo sapiens (Human) Fc receptor I <400> 8 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser 20 25 30 Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu 35 40 45 Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln 50 55 60 Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser 65 70 75 80 Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile 85 90 95 Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg 100 105 110 Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys 115 120 125 Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe 130 135 140 Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile 145 150 155 160 Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr 165 170 175 Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro 180 185 190 Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val 195 200 205 Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn 225 230 235 240 Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly 245 250 255 Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg 260 265 270 Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro 275 280 285 Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu 290 295 300 Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys 305 310 315 320 Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys 325 330 335 Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys 340 345 350 Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys 355 360 365 Glu Pro Gln Gly Ala Thr 370 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of the front part of T7 bacteriophage <400> 9 tctcacagtg tacggaccta aagttccccc atag 34 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of the front part of T7 bacteriophage <400> 10 taccatcagt ggccacaacg gcctgaccta c 31 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of the center part of T7 bacteriophage <400> 11 taggtcaggc cgttgtggcc actgatg 27 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of the center part of T7 bacteriophage <400> 12 gagagtccat ccgcggacta cacgtc 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of the end part of T7 bacteriophage <400> 13 gacgtgtagt ccgcggatgg actctc 26 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of the end part of T7 bacteriophage <400> 14 agggacacag agagacactc aaggtaacac c 31 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of proteinG gene <400> 15 gctgaattca tgacttacaa a 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of protein G gene <400> 16 aagcttttat tcagttaccg 20

Claims (17)

  1. T7 박테리오파지의 머리부분에 연결된 결합 펩타이드와 상기 결합 펩타이드에 연결된 표적화 항체, 및
    상기 T7 박테리오파지의 꼬리부분에 연결되는 탐지 가능한 표지물질(detectable labeling agent) 을 포함하는 표적-특이적 프로브.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 결합 펩타이드는 단백질 G(Pro G), 단백질 A(ProA), 단백질 A/G, Fc 수용체, 단백질 Z (Pro Z) 또는 바이오틴화 Tag(biotinylation tag)인 표적-특이적 프로브.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 표적화 항체의 Fc 부분이 상기 결합 펩타이드에 결합된 것인, 표적-특이적 프로브.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 결합 펩타이드는 T7 박테리오파지 머리부분 단백질의 C-말단에 연결된 융합 단백질인 표적-특이적 프로브.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 표적화 항체는, 상기 결합 펩타이드의 말단에 연결된 HIS Tag, CYS Tag, GST Tag 또는 바이오틴 결합 tag (biotin biding tag)을 통해 결합된 것인 표적-특이적 프로브.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 표지물질은 상기 T7 박테리오파지의 꼬리부분 단백질 말단에 연결된 HIS Tag, CYS Tag, GST Tag 또는 바이오틴 결합 tag (biotin biding tag)을 통해 결합된 것인 표적-특이적 프로브.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 tag은 상기 T7 박테리오파지의 꼬리부분 단백질에 삽입된 또는 연결된 융합 단백질인 표적-특이적 프로브.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 T7 박테리오파지는, HIS Tag, CYS Tag, GST Tag 또는 바이오틴 결합 tag (biotin biding tag)이 삽입된 T7 박테리오파지의 변형 꼬리부분 단백질과, 상기 결합 펩타이드가 T7 박테리오파지 머리부분 단백질의 C-말단에 연결된 변형 머리부분 단백질을 포함하는 것인, 표적-특이적 프로브.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 표지물질은 T7 박테리오파지 1몰에 대해, 1몰의 몰비로 결합된 것인 표적-특이적 프로브.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 표지물질은 양자점, 자성비드 나노입자, 금 나노입자, 형광염료, 형광단백질, 나노인광체 또는 실리콘 나노입자인 표적-특이적 프로브.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 양자점은 하나의 분자에 친수성기와 소수성기를 포함하는 양친성 물질로 처리되어 친수성 표면층을 포함하며, 상기 친수성기가 T7 박테리오파지의 꼬리부분에 결합하는 것인 표적-특이적 프로브.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 양친성 물질은 MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 표적-특이적 프로브.
  13. 바이오마커를 함유하는 시료에, 상기 바이오마커에 특이적인 표적화 항체와 표지물질을 함유하는 제7항 내지 12항중 어느 한항에 따른 표적-특이적 프로브를 접촉시키는 단계, 및
    상기 바이오마커에 표적화된 프로브의 표지물질을 검출하는 단계를 포함하는 바이오마커의 탐지방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 표지물질이 검출되는 경우 바이오마커가 상기 시료에 존재하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는 탐지방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 다양한 농도의 표지물질에서 측정된 검출량으로 표준곡선을 제작하고, 상기 바이오마커에 표적화된 표지물질의 검출량을 상기 표준곡선과 비교하여 시료내 바이오마커를 정량하는 탐지방법.
  16. 제 13 항에 있어서, 상기 검출단계에서, 표지물질로서 양자점에서 방출되는 형광강도를 검출하는 것인 탐지방법.
  17. 표적 바이오마커에 특이적인 표적화 항체와 표지물질을 함유하는 제7항 내지 제12항에 따른 표적-특이적 프로브 및 표적화된 표적-특이적 프로브의 표지물질을 검출하는 검출기를 포함하는 바이오마커의 탐지키트.
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