KR101444995B1

KR101444995B1 - 세포질 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 방법

Info

Publication number: KR101444995B1
Application number: KR1020120058255A
Authority: KR
Inventors: 김정락; 송아름; 최완수
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2014-10-01
Also published as: KR20130134622A

Abstract

본 발명은 기존의 생체물질 상호작용 탐색 방법들이 가지는 부정확성 및 복잡성 등의 단점을 극복하고 기존의 형질주입(transfection) 분석법과 차별화되는 새로운 세포질 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 세포내에서 일어나는 물질결합(binding) 및 상호작용(interaction)을 살아있는 세포에서 실시간으로 검출할 수 있으며, 기존의 생체물질 상호작용 탐색 방법들이 가지는 부정확성 및 복잡성 등의 단점을 극복하고 기존의 형질주입(transfection) 분석법과 차별화되는 새로운 실시간 분석 방법을 제공하는 효과가 있다.

Description

세포질 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 방법{Method for detecting protein-protein interaction of cytosolic proteins}

본 발명은 기존의 생체물질 상호작용 탐색 방법들이 가지는 부정확성 및 복잡성 등의 단점을 극복하고 기존의 형질주입(transfection) 분석법과 차별화되는 새로운 세포질 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 방법에 관한 것이다.

세포는 다양하고 복잡한 단백질-단백질 상호작용을 통하여 유전자 표현, 세포성장, 세포 주기, 대사, 신호전달 등의 여러 생물학적 기능을 수행함으로써 생명현상을 유지하고 있다. 따라서 세포내에서의 단백질-단백질 상호 작용 및 상호작용의 기능을 이해하는 것은 생명현상들을 이해하는 초석이 되며 신약개발 및 질병 치료의 중요한 기반이 된다.

세포 외부의 신호는 세포막의 수용체를 통과하여 세포질내에서 여러 생화학적 반응을 통해 세포의 핵 내로 전달되며, 거기서 특정 유전자들을 발현시킨다. 이러한 외부 신호의 세포내 전달과정은 여러 단계의 단백질간 상호작용에 의해 이루어진다. 예로써 성장조절인자(growth factor)나 사이토카인(cytokine) 등은 세포 표면의 해당 수용체(receptor)에 결합하고 이러한 결합은 수용체가 서로 뭉치도록(clustering) 유도한다. 이러한 수용체의 리간드에 의한 뭉침은 그 수용체의 세포질내 도메인끼리도 서로 뭉치도록 유도함으로써 세포내 신호전달과정에 관계된 여러 단백질들과의 상호작용을 유발한다. 이 신호전달체계는 단백질 키나제에 의한 단백질의 인산화, 단백질 포스파타제에 의한 탈인산화등을 통해 여러 단계의 신호를 전달할 수 있는 중간체 단백질을 만들면서, 결국 그의 신호를 전사촉진 단백질(transcriptional activator)에 전달한다. 활성화된 전사촉진 단백질은 DNA에 결합하고, mRNA 를 합성하는 RNA 중합효소 등 기본적인 전사 조절 단백질들(basal transcriptional apparatus)과 상호작용하여 특정 유전자들을 활성화시킨다. 따라서 이러한 상호작용은 특정 조직, 발생학적 과정 및 외부자극 등에 반응하여 특이적으로 전사가 일어나도록 조절하는 것이다. 이때 외부물질의 침입 또는 내부 활성 단백질의 유전적 변이 등에 의해 특정 단백질간의 상호작용이 변경, 억제, 촉진 등 비정상적으로 일어나게 된 것이 병(disorder)의 원인이라고 할 수 있다. 따라서 이러한 상호작용을 조절할 수 있는 물질은 곧 그에 기인된 병에 대한 치료의 방법을 제공할 수 있으므로 이에 관한 연구가 계속되어 왔다.

시험관내 또는 생체 내에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 방법으로는 교차결합(crosslinking), 친화성 크로마토그래피(affinity chromoatography), 공동면역침전(coimmunoprecipitation), 파아지 디스플레이(phage display), 투-하이브리드 어세이(two-hybrid assays), GST-융합 단백질 풀-다운(GST-fusion protein pulldown), 면역조직화학(immunohistochemistry)와 같은 기존의 방법들이 존재하지만, 이들 방법들은 여러 장점들도 있으나 빠르게 세포내 단백질-단백질 상호작용을 규명하는데 여러 단점들을 가지고 있다.

단백질 친화성 크로마토그래피(Protein affinity chromatography)의 경우, 정제된 단백질이 준비되어야하는 어려움이 있다. 또한 단백질 간 상호작용 확인이 시험관 내에서 일어나므로, 세포내에서는 상호작용하지 않는 단백질들이 컬럼을 통과하는 동안 정전기적 상호작용에 의하여 결합하는 것처럼 보일 수 있는 false-positive 결과를 도출 할 수 있다. 공동면역침전의 경우 정제된 민감성이 높은 항체가 필요하며 이 항체는 세포내에서 존재하는 단백질의 형태를 인식할 수 있는 것이어야 한다. 따라서 항체의 민감성과 특이성이 낮은 경우 단백질들 간 상호작용을 증명하기 힘들다. 파아지 디스플레이의 경우 단백질이 파아지의 캡시드나 외막 단백질과 융합된 형태로 발현되므로 발현할 수 있는 단백질의 크기가 제한되어있다. 포유류 세포의 많은 단백질들이 번역 과정 이후 여러 변형(modification)들을 거치게 되나 파아지에서는 진핵세포에서 만들어지는 단백질과 동일한 폴딩 및 번역 후 변형을 거치지 못하므로 단백질의 변형을 연구하기 어렵다. 한가지의 단백질도 여러 변형을 거침으로써 다양한 단백질들과 상호작용하여 세포 내 기능을 수행하기 때문에 어떠한 변형을 거치느냐 및 다양한 변형 이후 상호작용하는 짝들을 연구하는 것은 복잡한 세포의 기능조절을 이해하는 초석이 된다. 하지만 파아지 디스플레이를 이용하여 상호작용을 연구하는 경우 포유류 세포에서 일어나는 다양한 변형이 일어나지 못하므로 여러 변형을 거친 후 상호작용 하게 되는 단백질 간 상호작용 연구에 어려움이 있다. 투-하이브리드 스템은 주로 효모와 포유류 세포에서 많이 사용되는데 효모의 경우 목적 단백질들이 진핵세포에서와 동일하게 만들어지고 폴딩(folding) 및 변형이 일어나야 한다. 포유류 세포를 이용한 투-하이브리드 시스템의 경우 단백질의 합성 후 폴딩이나 변형이 제대로 일어나지만 단백질의 상호작용을 DNA 결합 도메인을 이용하여 핵에서 전사활성화를 통하여 상호작용을 확인하므로, 세포질에서의 상호작용하는 단백질 간 상호작용의 경우 세포질에서 상호작용을 확인하기가 힘들다. 또한 단백질 간 상호작용이 리포터 유전자를 충분히 활성화시키지 못하는 경우, 상호작용하여 오히려 전사를 억제하는 경우 등에서 대조군과 활성화 정도의 차이가 크지 않아 상호작용을 증명하기 어려운 단점이 있다. 면역조직화학은 시료의 준비 과정 중 파라핀 및 포르말린으로 고정하는 과정을 거치게 되는데 이 과정 중 세포가 영향을 받을 수 있으며, 민감한 항체가 요구되고, 단지 목적 단백질들이 존재하는 세포 내 위치들을 염료들로 염색 후 이들 결과를 토대로 단백질들의 위치로 이들 간 상호작용을 추측하게 되므로 정확한 단백질-단백질 간 상호작용을 연구하기 힘들다. GST 풀-다운 어세이는 박테리아에서 목적 단백질들을 발현시키고 정제하는 과정을 거치게 되는데 단백질들을 수용성으로 발현시키는 과정이 쉽지 않으며 발현시킨 단백질이 포유류세포에서 발현되는 것과 다른 구조를 가질 수도 있다. 또한 정제과정 도중 및 정제 후 단백질의 분해가 일어날 수 있으므로 지속적인 단백질 상태가 모니터링 되어야 한다. 또한 단백질 간 결합이 사용하는 버퍼의 조성에 의하여 큰 영향을 받는다. 따라서 적절한 버퍼의 조성 연구가 수반되어야하며 시험관내 실험이므로 생체 내 상호작용과 다른 결과를 얻을 수 있다.

기존 방법의 단백질-단백질 상호작용을 분석하는 방법이 가지는 클로닝 과정에서의 시간 소요, 정제된 항원 특이적 항체의 필요성, 실험 수행 과정에서 세포 파괴와 같은 과정 중의 오염 및 세포의 환경변화, 단백질 정제 과정의 어려움, 고비용 등과 같은 한계성을 극복하여 고속으로 간편하고 정확하게 단백질간의 상호작용을 분석하기 위한 새로운 분석 시스템이 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제886,312호 대한민국 등록특허 제445,912호

이에 본 발명자들은 기존의 방법들의 한계를 극복하고 in vivo 상에서 단백질-단백질 상호작용을 정확하게 확인하기 위하여 핵 이동 분석법(nuclear transport assay)에 기반을 둔 “attractor 벡터”와 “attractee 벡터”를 이용하는 새로운 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 세포질에 존재하는 서로 상호작용하는 세포질 단백질들을 검출할 수 있는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 핵 위치 시그널(nuclear localization signal)이 태그된 Attractor(Ar) 벡터와 Attractee(Ae) 벡터 각각에 목적물질을 코딩하는 핵산 또는 표적물질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 단계에서 준비한 목적물질을 발현하는 벡터 및 표적물질을 발현하는 벡터의 세포 내 분포를 확인하는 단계; 를 포함하는 세포질 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 내 분포를 확인하는 단계는 상기 (i) 단계에서 준비한 목적물질을 발현하는 벡터 및 표적물질을 발현하는 벡터를 세포에 형질주입 또는 동시형질주입시키고 배양하는 단계; 및 목적물질과 표적물질 간의 상호작용을 형광 단백질의 형광으로 측정하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 핵 위치 시그널은 rNL1(rat glucocorticoid receptor의 nuclear localization signal 1)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 rNL1은 28개의 아미노산으로 구성되고, YRKCLQAGMNLEARKTKKKIKGIQQATA의 아미노산 서열을 코팅하는 핵산 서열을 갖을 수 있다. 상기에서, Y는 티로신, R는 아르기닌, K는 리신, C는 시스테인, L은 류신, Q는 글루타민, A는 알라닌, G는 글리신, M은 메티오닌, N은 아스파라긴, E는 글루탐산, T는 트레오닌, I는 이소루신을 나타낸다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Attractor(Ar) 벡터는 적색 형광 단백질을 가지고 있으며, Attractee(Ae) 벡터는 녹색 형광 단백질을 가지고 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 형광 단백질이 GFP(green fluorescent protein), EGFP(enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein), mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein), DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), AzG(AzamiGreen), HcR(Heteractis crispa red fluorescent protein, HcRed) 및 BFP(Blue Fluorescent Protein) 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (ⅲ) 단계에서 형광을 형광 현미경 또는 레이저 공초점 형광현미경으로 측정할 수 있다.

또한, 본 발명은 (i) 핵 위치 시그널(nuclear localization signal)이 태그된 Attractor(Ar) 벡터와 Attractee(Ae) 벡터 각각에 목적물질을 코딩하는 핵산 또는 표적물질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; (ⅱ) 상기 (i) 단계에서 준비한 목적물질을 발현하는 벡터 및 표적물질을 발현하는 벡터를 세포에 형질주입 또는 동시형질주입시키고 배양하는 단계; (ⅲ) 상기 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (ⅳ) Attractor(Ar) 벡터 및 Attractee(Ae) 벡터의 세포내 분포를 검출하는 단계;를 포함하는 목적물질과 표적물질간의 상호작용을 변화시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법은 세포내에서 일어나는 물질결합(binding) 및 상호작용(interaction)을 살아있는 세포에서 실시간으로 검출할 수 있으며, 기존의 생체물질 상호작용 탐색 방법들이 가지는 부정확성 및 복잡성 등의 단점을 극복하고 기존의 형질주입(transfection) 분석법과 차별화되는 새로운 실시간 분석 방법을 제공하는 효과가 있다. 또한, 구성물 모두에 표지를 함으로써 정확도를 더욱 높일 수 있어 단백질의 다양한 기능적 변화를 밝혀냄으로써 치료제 또는 약물과 표적 단백질 사이의 상호작용을 규명하는데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 핵 이동 분석법(nuclear transport assay)에 따른 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 원리를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 rNL1의 염기서열을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 양성 대조군과 음성 대조군의 염기서열을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 테스트 샘플의 염기서열을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 rNL1이 태그된 attractor 벡터의 구조를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 COS-7 세포에서 DsRed 벡터와 rNL1이 태그된 attractor 벡터의 위치를 나타내는 형광 이미지이다.
도 7은 본 발명에 따른 hAvC를 희석하는 경우 양성 대조군에서 colocalization 양상을 비교하여 나타낸 형광 이미지이다.
도 8은 본 발명에 따른 COS-7 세포에서 양성 대조군의 세포 내 위치를 레이저 공초점 형광현미경으로 확인한 형광 이미지이다.
도 9는 본 발명에 따른 핵 이동 분석법(nuclear transport assay)과 전통적인 transfection assay를 이용하여 확인한 양성 대조군의 colocalization 양상을 비교하기 위해 레이저 공초점 형광현미경으로 확인한 형광 이미지이다.
도 10은 본 발명에 따른 COS-7 세포에서 음성 대조군의 세포 내 위치를 레이저 공초점 형광현미경으로 확인한 형광 이미지이다.
도 11은 본 발명에 따른 핵 이동 분석법(nuclear transport assay)과 전통적인 transfection assay를 이용하여 확인한 음성 대조군의 colocalization 양상을 비교하기 위해 레이저 공초점 형광현미경으로 확인한 형광 이미지이다.
도 12는 본 발명에 따른 COS-7 세포에서 테스트 샘플의 세포 내 위치를 레이저 공초점 형광현미경으로 확인한 형광 이미지이다.
도 13은 본 발명에 따른 핵 이동 분석법(nuclear transport assay)과 전통적인 transfection assay를 이용하여 확인한 테스트 샘플의 colocalization 양상을 비교하기 위해 레이저 공초점 형광현미경으로 확인한 형광 이미지이다.
도 14는 본 발명에 따른 핵 이동 분석법(nuclear transport assay)과 전통적인 transfection assay를 이용하여 확인한 양성 대조군의 colocalization 양상을 비교하기 위해 형광현미경으로 확인한 형광 이미지이다.
도 15는 본 발명에 따른 핵 이동 분석법(nuclear transport assay)과 전통적인 transfection assay로 형광현미경을 이용하여 확인한 음성 대조군의 colocalization 양상을 비교하기 위해 형광현미경으로 확인한 형광 이미지이다.
도 16은 본 발명에 따른 핵 이동 분석법(nuclear transport assay)과 전통적인 transfection assay로 형광현미경을 이용하여 확인한 테스트 샘플의 colocalization 양상을 비교하기 위해 형광현미경으로 확인한 형광 이미지이다.

본 발명은 기존의 생체물질 상호작용 탐색 방법들이 가지는 부정확성 및 복잡성 등의 단점을 극복하고 기존의 형질주입(transfection) 분석법과 차별화되는 새로운 세포질 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 방법에 관한 것으로서, in vivo 상에서 단백질-단백질 상호작용을 정확하게 확인하기 위하여 핵 이동 분석법(nuclear transport assay)에 기반을 둔 새로운 방법을 제공한다는 점에서 특징이 있다.

기존에 사용되는 일시적 형질주입 분석법(Transient transfection assay)은 in vivo에서 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 방법으로, 상호작용을 하는 두 단백질은 in vivo 상에서 같은 세포에서 나타나는(colocalization) 양상을 보인다. 도 1에 나타난 바와 같이, 단백질 X와 단백질 Y 각각은 시토졸(cytosolic) 단백질이며, 2개의 단백질이 서로 상호 작용하는 경우에 그들은 in vivo에서 같은 세포에서 나타난다(colocalized). 그러나, 두 단백질이 같은 세포에서 나타나는 것이 두 단백질의 결합(binding)에 의한 것인지 아니면 우연히 오버랩(overlapping) 된 것인지 확인하는 것이 어렵다.

본 발명자들은 이러한 기존 방법의 한계점을 극복하고, 세포질 단백질-단백질 상호작용을 좀 더 확실하게 확인하기 위하여, in vivo에서 핵 이동 분석법(nuclear transport assay)에 기반을 둔 “Attractor 벡터”와 “Attractee 벡터”를 이용하여 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 새로운 방법을 연구하였다.

본 발명은 세포 내에서 일어나는 생체물질간의 상호작용을 직접적으로 그리고 실시간으로 분석할 수 있도록 하기 위하여, 신호전달기작에 의해 발생되는 단백질의 세포내 위치이동을 이용하였다.

즉, 신호전달기작이 표지된 벡터에 상호작용의 하나의 대상이 되는 목적물질을 융합하고, 이를 추적할 수 있도록 표지물질을 포함하는 Attractor 벡터(Ar)를 디자인하였다. 또한, 목적물질과 상호작용하는 표적물질 및 이를 추적할 수 있도록 또다른 표지물질을 포함하는 Attractee 벡터(Ae)를 디자인하였으며, 상기 Attractor 벡터(Ar) 및 Attractee 벡터(Ae)가 세포내에서 동시에 존재하도록 하여 이들의 상호작용을 세포내에서 직접적, 그리고 실시간으로 분석할 수 있도록 하였다.

본 발명에 따르면 Attractor 벡터(Ar)와 Attractee 벡터(Ae)를 이용하여 확인하고자 하는 세포질 단백질들을 상기 각각의 벡터에 연결시킨 후, 신호전달기작의 핵속으로 이동하는 이동 능력을 이용하여 목적 단백질들이 결합하는 경우 신호전달기작에 의해 핵 속에 두 단백질이 함께 존재하는 것으로 나타나는 반면, 목적 단백질들이 서로 결합하지 않는 경우 Ar이 태그된 세포질 단백질은 신호전달기작에 의해 핵 속에 존재하고 Ae가 태그된 세포질 단백질은 세포질에 존재하게 되어 두 단백질의 위치 확인을 통해 결합여부를 확인할 수 있다. 이러한 방법은 치료제인 약물과 표적 단백질의 상호작용을 위한 확인용도로도 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 신호전달기작으로 rNL1을 사용하였으며, 이러한 신호전달기작을 포함하는 attractor 벡터와 Ar이 태그된 세포질 단백질 모두 COS-7 세포에서 rNL1에 의해 핵 속으로 이동된 양상을 나타내었으며, 기존의 형질주입 분석법에 비해 본 발명에 따른 새로운 방법을 사용했을 때 보다 명확한 세포질 단백질-단백질 상호작용을 확인하였다.

이러한 결과를 바탕으로 본 발명에 따른 방법이 세포질 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 정확하고, 믿을 수 있는 새로운 분석법으로 자리잡을 수 있을 것으로 기대된다.

따라서, 본 발명은 (i) 핵 위치 시그널(nuclear localization signal)이 태그된 Attractor(Ar) 벡터와 Attractee(Ae) 벡터 각각에 목적물질을 코딩하는 핵산 또는 표적물질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 단계에서 준비한 목적물질을 발현하는 벡터 및 표적물질을 발현하는 벡터의 세포 내 분포를 확인하는 단계; 를 포함하는 세포질 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 준비된 목적물질을 발현하는 벡터 및 표적물질을 발현하는 벡터의 세포 내 분포를 확인하는 단계는 상기 (i) 단계에서 준비한 목적물질을 발현하는 벡터 및 표적물질을 발현하는 벡터를 세포에 형질주입 또는 동시형질주입시키고 배양하는 단계; 및 목적물질과 표적물질 간의 상호작용을 형광 단백질의 형광으로 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 목적물질(molecule of interest) 및 표적물질(target molecule)이란 각각 상호작용이 대상이 되는 물질을 나타낸다. 상기 목적물질 및 표적물질은 각각 단백질, 폴리펩티드, 소유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 상호작용의 검출 또는 스크리닝을 위해서 목적물질은 실험자가 알고 있는 물질을 나타내며, 표적물질은 미지의 물질을 지칭하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 목적물질과 표적물질을 서로 바꾸어 Attractor(Ar) 벡터 또는 Attractee(Ae) 벡터의 일부를 이룰 수 있다.

본 발명에서 “Attractor 벡터(Ar)”는 신호전달기작이 표지된 DsRed 벡터이고 빨간색 형광 단백질을 가지고 있으며, “Attractee 벡터(Ae)”는 EGFP 벡터이고 녹색 형광 단백질을 가지고 있다.

본 발명에서 신호전달기작으로 NLS(nuclear localization signal)를 사용하며, 보다 바람직하게는 rNL1을 사용할 수 있다. “rNL1”은 마우스 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 수용체의 핵 위치 신호 1(nuclear localization signal 1)를 말하며, 표적 단백질을 핵 속으로 이동시키는 기능을 나타낸다. 그러므로 Ar이 태그된 세포질 단백질은 rNL1에 의해 핵 속으로 이동할 수 있다.

도 1B에 나타낸 바와 같이, Ar 벡터에 융합된 단백질 X(Ar-X)는 rNL1에 의해 핵으로 이동한다. 단백질 X와 단백질 Y가 서로 상호작용하는 경우에, Ar-X는 Ae 벡터에 융합된 단백질 Y(Ae-Y)를 핵으로 이동시킬 수 있으며, Ae-Y는 Ar-X에 의해 핵으로 이동될 수 있다. 따라서 2개의 단백질의 위치(localiztion) 패턴이 변하게 된다. 그러므로 핵에 위치하는 Ar-X와 세포질에 위치하는 Ae-Y가 같이 나타나는 것은 단백질-단백질 상호작용이 발생했다는 것을 명확하게 나타낸다. 반대로 2개의 단백질이 서로 상호작용하지 않는 경우에는 Ar-X는 핵에 위치하고 Ae-Y는 세포질에 위치한다. 따라서 단백질 X와 단백질 Y의 상호작용은 Ar-X와 Ae-Y 사이의 위치 패턴에 의해 확인할 수 있다.

참고로, 글루코코르티코이드 수용체에는 두개의 다른 핵 위치 신호(NLS)인 NL1과 NL2가 존재한다(도 2A 참조). 본 발명에서는 NL1을 사용하는데, NL1은 28개의 아미노산으로 구성되고, YRKCLQAGMNLEARKTKKKIKGIQQATA의 아미노산 서열을 코팅하는 핵산 서열을 갖는다(도 2B 참조). 여기서, Y는 티로신, R는 아르기닌, K는 리신, C는 시스테인, L은 류신, Q는 글루타민, A는 알라닌, G는 글리신, M은 메티오닌, N은 아스파라긴, E는 글루탐산, T는 트레오닌, I는 이소루신을 나타낸다.

본 발명에서 표지물질은 당업자가 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 물질을 나타내며, 예를 들어 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 이에 제한되지는 않으나, 형광단백질, 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 그 중 형광단백질로는 당 업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들어, GFP(green fluorescent protein), EGFP(enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein), mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein), DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), AzG(AzamiGreen), HcR(Heteractis crispa red fluorescent protein, HcRed) 또는 BFP(Blue Fluorescent Protein) 등이 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 이에 제한되지는 않으나, 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 이에 제한되지는 않으나, 콜로이드 금, 철, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 이에 제한되지는 않으나, 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등 이 있다. 방사성 동위원소로는 이에 제한되지는 않으나, ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 표지물질의 탐색에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 표지물질은 형광 단백질일 수 있으며, Attractor(Ar) 벡터와 Attractee(Ae) 벡터에 표지되는 형광 단백질은 서로 구별되게 하기 위하여 별개의 형광 단백질인 것이 좋다. 더 바람직하게는 Attractor(Ar) 벡터는 적색 형광 단백질을 가지고 있으며, Attractee(Ae) 벡터는 녹색 형광 단백질을 가지고 있다.

Attractor(Ar) 벡터 및 Attractee(Ae) 벡터의 세포내 분포의 검출은 표지물질에 따라서 당업계에 공지된 통상적인 검출방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어 표지물질이 형광 단백질인 경우 형광 현미경 또는 레이저 공초점 형광 현미경을 사용하여 Attractor(Ar) 벡터와 Attractee(Ae) 벡터의 세포내 분포를 검출할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 각 단백질의 위치 패턴과 동시 발현된(coexpression) 단백질의 위치 패턴을 비교하기 위해서, COS-7 세포에 Ar이 태그된 세포질 단백질과 Ae가 태그된 다른 세포질 단백질을 일시적 형질주입(transient transfection)시켰다. 그 결과, Ar이 태그된 세포질 단백질은 핵 속으로 이동이 되고, Ae가 태그된 다른 세포질 단백질은 세포질에 존재하는 것으로 나타났다.

만약 두 단백질이 상호작용을 하게 되면 Attractor(Ar) 벡터에 존재하는 rNL1에 의해 Ae가 태그된 다른 세포질 단백질이 세포질에서 핵으로 이동하게 된다. 이와 같이 두 단백질이 상호작용을 하게 되면 위치 패턴이 바뀌게 되므로 두 단백질 사이의 상호작용을 쉽게 확인할 수 있다. 그러므로 세포질에 존재하는 두 단백질의 상호작용은 Ar이 태그된 세포질 단백질과 Ae가 태그된 다른 세포질 단백질의 위치 패턴을 통해 확인할 수 있다.

그 결과, 본 발명의 방법은 기본적으로 살아있는 세포 내에서의 생체고분자물질의 직접결합 또는 복합체 결합을 영상분석을 통하여 실시간으로 탐색할 수 있게 하며, 종래의 기술에 비해서 다음과 같은 유리한 점을 가지게 된다.

1) 살아있는 세포 내에서 일어나는 모든 결합분석을 대상으로 할 수 있다.

2) 조직, 개체 수준의 분석이 가능하다.

3) 동물세포 및 효모, 박테리아에서의 적용이 가능하다.

4) 목적물질 및 표적물질에 대한 항원이 불필요하다.

5) 세포 전체를 대상으로 하는 타 방법과 달리 세포내 위치이동 변화를 분석 척도로 사용함으로써 분석의 정확도가 높다.

6) 2차원적 위치변화를 분석하는 것으로도 정확한 결과를 얻을 수 있으며, 필요에 따라 3차원 분석도 수행할 수 있다.

7) 다양한 세포 소기관별 결합분석 가능하다.

8) 살아있는 세포 내에서 일어나는 결합을 탐색함으로써 in vitro 방법과는 달리 외부 환경에 영향을 받지 않는다.

9) 목적물질과 표적물질의 실시간 결합 측정이 가능하다.

10) 단일 목적물질과 복수개의 표적물질들 간의 복합체 결합을 검증 가능하다.

11) all or none 탐색 분석 척도로 위양성 (false positive)을 최소화할 수 있다.

12) 목적물질과 탐색물질의 유전자 및 자극물질만을 사용할 경우 외부 물질의 세포내 유입에 의한 결합특성의 혼란을 원천적으로 배제한다.

13) 영구결합(binding)과 일시적인 결합(transient binding) 및 순간적으로 발생하는 상호작용(interaction)의 검출이 가능하다.

14) 현재까지 개발된 신호전달 저해제의 표적을 특정화할 수 있다.

15) 저해제의 표적 특정화를 통해 저해제의 특성 재평가(drug re-positioning/re-purposing)가 가능하다.

16) 표적물질의 대량 표지 라이브러리를 사용하여 미지의 생체물질에 대한 결합 스크리닝이 가능하다.

17) HCS(High Contents Screening) 시스템과 연계한 고효율 시스템을 구현할 수 있다.

18) 무자극 위치이동 특성을 이용한 분석의 단순화를 할 수 있다.

19) 외부자극의 종류 변경으로 신호전달 경로별 결합 특성을 분석할 수 있다.

20) 구성물 모두에 표지물질을 사용함으로 목적물질과 표적물질의 상대적인 정량이 가능하며, 표적물질의 외부자극 또는 내재적인 이동현상에 의한 실험적인 오류를 동시에 확인할 수 있어 위-양성 또는 위-음성 반응을 현저히 감소시켜 준다.

또한, 본 발명은 (i) 핵 위치 시그널(nuclear localization signal)이 태그된 Attractor(Ar) 벡터와 Attractee(Ae) 벡터 각각에 목적물질을 코딩하는 핵산 또는 표적물질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 (i) 단계에서 준비한 목적물질을 발현하는 벡터 및 표적물질을 발현하는 벡터를 세포에 형질주입 또는 동시형질주입시키고 배양하는 단계; (ⅲ) 상기 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (ⅳ) Attractor(Ar) 벡터 및 Attractee(Ae) 벡터의 세포내 분포를 검출하는 단계를 포함하는 목적물질과 표적물질간의 상호작용을 변화시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기에서 “시험물질(test agent)”이라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.

본 발명의 방법으로 스크리닝되거나 동정될 수 있는 시험물질은 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 상기 시험물질은 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 시험 물질은 펩타이드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스화(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.

또한 상기 시험 물질은 "핵산”일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스화” 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.

또한 상기 시험 물질은 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다.

상기에서 목적물질과 표적물질간의 상호작용의 변화는 상호작용의 저해 또는 증진일 수 있다. 상호작용의 저해는 목적물질과 표적물질간의 결합의 저해를 나타내며, 본 발명의 방법에 있어서는 시험물질을 처리하지 않았을 경우 Attractor(Ar) 벡터 및 Attractee(Ae) 벡터가 동일 또는 유사하게 이동하는 데에 비해 시험물질을 처리하였을 경우 Attractee(Ae) 벡터가 이동하지 않는 것(또는 이동하는 빈도, 정도, 강도의 감소)을 통해 판단할 수 있다. 상호작용의 증진은 목적물질과 표적물질간의 결합의 증진을 나타내며, 본 발명의 방법에 있어서는 시험물질을 처리하지 않았을 경우 Attractee(Ae) 벡터가 이동하지 않는 데에 비해 시험물질을 처리하였을 경우 Attractee(Ae) 벡터가 Attractor(Ar) 벡터와 동일 또는 유사하게 이동하는 것(또는 이동하는 빈도, 정도, 강도의 증가)을 통해 판단할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

실험군 설계 및 제작

<1-1> 양성 대조군

양성 대조군으로 상호 작용 펩티드 쌍[인간 archvillin C-말단 지역(이하, “hAvC”라고 함) 및 네뷸린(nebulin) 단편(Neb6457F/6527R)]을 사용하였다. hAvC는 archvillin의 아미노산 1398-2214로 구성된다(도 3A). 또한, Neb6457F/6527R는 네뷸린(nebulin)의 아미노산 6457-6527을 암호화한다(도 3B).

<1-2> 음성 대조군

음성 대조군으로 비 상호작용 펩티드 쌍[hAvC 및 nebulin fragment (Neb6528F/6612R)]을 사용하였다. Neb6528F/6612R은 세린이 풍부한(serine-rich) 반복 단위이고, 네뷸린(nebulin)의 아미노산 6528-6612를 암호화한다(도 3B).

<1-3> 테스트 샘플

테스트 샘플로는 펩티드 쌍[hAvC 및 xeplin 단편(Xep920F/938R)]을 사용하였다. Xep920F/938R은 archvillin C-말단 지역과 결합하는 단백질인 xeplin의 아미노산 920-938로 구성된다(도 4B).

< 실시예 2>

attractor 벡터의 설계 및 제작

마우스 골격근 세포주(L6) cDNA는 MMLV 역전사효소(Promega)를 사용하여 총 RNA 2μg 으로부터 제조사의 지침에 따라 RT-PCR 반응으로 준비하였다.

98bp의 rNL1 단편은 L6 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR 반응으로 증폭시켰다. PCR은 BglⅡ 및 EcoRⅠ 제한효소 사이트를 포함하는 서열 특이적 프라이머(rNL1-497F 및 rNL1-524R, 표 1)를 사용하여 수행하였으며, 이러한 프라이머는 마우스 글루코티코이드 수용체 cDNA 서열(accesstion No. M14053)로부터 디자인되었다. PCR 반응은 Ex Taq polymerase(Takara)로 수행하였다. 총 PCR 산물은 2% 아가로스겔에서 분리하였으며, QIAEXⅡ gel elution kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 증폭된 단편은 pDsRed1-C1 벡터(Clontech)의 BglⅡ 및 EcoRⅠ위치에 삽입하여 서브클로닝하였다(도 5). rNL1 서열은 생물정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 Blast alignment로 확인하였다.

< 실시예 3>

본 발명의 새로운 방법을 위한 분자클로닝

<3-1> 양성 대조군과 음성 대조군의 분자 클로닝

hAvC는 인간 골격근(skeletal muscle) cDNA 라이브러리(Clontech)를 주형으로 하여 Taq DNA 폴리머라제 키트(Clontech)를 사용하여 PCR 반응으로 증폭시켰다. PCR은 EcoRⅠ/BamH 과 BamHⅠ/SalⅠ 제한효소 사이트를 각각 포함하는 프라이머쌍(AV1398F/AV1646R 및 AV1641F/AV2214R, 표 1 참조)을 사용하여 수행하였다. 이러한 프라이머는 인간 archvillin cDNA 서열(accession No. AF109135)로부터 디자인되었다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로스겔에서 분리하고 QIAEXⅡ gel elution kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 겔-정제된 밴드(gel-purified band)는 pGEM-T 벡터(Promega)로 클로닝하고, 완전히 서열화하였다(completely sequenced). 재조합(ligated) 플라스미드는 각각 EcoRⅠ/BamHⅠ과 BamHⅠ/SalⅠ로 절단하였다. 절단된 AV1398F/AV1646R 단편과 AV1641F/AV2214R 단편은 각각 pEGFP-C2 벡터(Clontech)의 EcoRⅠ/BamHⅠ과 BamHⅠ/SalⅠ위치에 삽입하여 서브클로닝하였다.

Neb6457F/Neb6527R 단편(양성 대조군)과 Neb6528F/Neb6612R 단편(음성 대조군)은 human brain Large Insert cDNA 라이브러리(Clontech)를 주형으로 하여 Ex Taq polymerase (Takara)를 사용하여 PCR 반응으로 증폭시켰다. Neb6457F, Neb6527R, Neb6528F 및 Neb6612R 프라이머(표 1 참조)들은 인간 네뷸린(nebulin) cDNA 서열(accession No. X83957)로부터 디자인되었다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로스겔에서 분리하고 QIAEXⅡ gel elution kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 그리고 정제된 각각의 Neb6457F/Neb6527R 단편과 Neb6528F/Neb6612R 단편은 pGEM-T 벡터(Promega)로 클로닝하고, 완전히 서열화하였다(completely sequenced). 재조합(ligated) 플라스미드는 각각 EcoRⅠ/SalⅠ로 절단하고, pDsRed1-C1 벡터(Clontech)와 rNL1-tagged attractor 벡터의 EcoRⅠ/SalⅠ 위치에 삽입하여 서브클로닝하였다.

<3-2> xeplin 의 분자 클로닝

Xeplin 단편은 EcoRⅠ/SalⅠ(Xep920F/Xep938R, 표 1 참조)을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 통해 증폭시켰다. Xep920F 및 Xep938R 프라이머는 human xeplin variant 2 cDNA library (accession No. EF119718)로부터 디자인하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로스겔에서 분리하고 QIAEXⅡ gel elution kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 겔-정제된 밴드(gel-purified band)는 pGEM-T 벡터(Promega)로 클로닝하고, 완전히 서열화하였다(completely sequenced). 재조합(ligated) 플라스미드는 EcoRⅠ및 SalⅠ로 절단하고, pDsRed1-C1 벡터(Clontech) 및 rNL1-tagged attractor 벡터의 EcoRⅠ와 SalⅠ 위치에 삽입하여 서브클로닝하였다.

PCR 프라이머

서열 번호	올리고	유전자	방향	서열	절단부위
1	rNL1-497F	rat GR	F	5'-AGATCTTATCGGAAATGTCTTCAGGCTGG-3'	Bgl Ⅱ
2	rNL1-524R	rat GR	R	5'-GAATTCGATGCAGTGGCTTGCTGAATCC-3'	EcoR Ⅰ
3	AV1398F	hArchvillin	F	5'-CCGGAATTCATGTCTTCCAACTCCA-3'	EcoR Ⅰ
4	AV1646R	hArchvillin	R	5'-TGCATTCTCCAGGATCCAGG-3'	BamH Ⅰ
5	AV1641F	hArchvillin	F	5'-CCTGGATCCTGGAGAATGCA-3'	BamH Ⅰ
6	AV2214R	hArchvillin	R	5'-ACGCGTCGACTCAGAACAGGCCTTTTGC'3'	Sal Ⅰ
7	Neb6457F	Nebulin	F	5‘-GAATTCCATCACTGAACGAGTAAAG-3'	EcoR Ⅰ
8	Neb6527R	Nebulin	R	5'-GAGCGTCGACATTAATCATGTGTAAGCT-3'	Sal Ⅰ
9	Neb6528F	Nebulin	F	5'-GAATTCCGTCCAAGCTCAGCGCCGG-3'	EcoR Ⅰ
10	Neb6612R	Nebulin	R	5'-GTCGACTCCAGCAGTAGATGGATG-3'	Sal Ⅰ
11	Xep920F	hXeplin	F	5'-GAATTCCGAACAACTCACGGTGGAAG-3'	EcoR Ⅰ
12	Xep938R	hXeplin	R	5'-GCGTCGACTTACTCAGTGTCACTGTAGC-3'	Sal Ⅰ

< 실시예 4>

형광현미경(Fluorescence microscopy) 분석

<4-1> COS -7 세포 배양

원숭이 신장의 섬유아세포인 COS-7 세포는 한국 세포주 은행(KCLB 21651)으로부터 구입하여 사용하였다. 세포는 10% 소태아혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다.

<4-2> Ar-Neb6457F/6527R와 희석된 Ae-hAvC의 동시형질주입(Cotransfection)

제조사의 지침에 따라 X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent (promega)를 사용하여 COS-7 세포에 Ar-Neb6457F/6527R 및 원래 농도(0.5μg)의 1/2, 1/4 및 1/8로 연속으로 희석시킨 Ae-AvC를 동시형질주입(cotransfection)하였다.

간략하게, 세포는 형질주입 24시간 전에 12 웰 플레이트 안에 들어있는 살균된 커버슬립(coverslip) 상에 5×10⁴ cells/ml로 분주하였다. 연속적으로 희석된 Ae-hAvC, Ar-Neb6457F/6527R 및 20μl DMEM에 있는 X-tremeGENE 9 DNA 형질주입 시약을 포함하는 각각의 복합물 형성 용액은 상온에서 30분 동안 배양하였다. 표 2는 Ar Neb6457F/6527R, 희석된 Ae hAvC 및 형질주입(transfection) 시약의 농도를 보여준다. 다음으로, 각각의 복합물 형성 용액을 플레이트에 첨가하였다. 세포는 처리하기 전에 37℃의 온도, 5% CO₂ 대기조건 하에서 약 48시간 동안 배양하였다.

Ae-hAvC, Ar-Neb6457F/6527R 및 형질주입 용액의 사용농도

희석비	Ae - hAvC	Ar - Neb6457F /6527R	형질주입 용액
1	0.5 μg	0.5 μg	3.0 μl
1/2	0.25 μg	0.5 μg	2.3 μl
1/4	0.125 μg	0.5 μg	1.9 μl
1/8	0.0625 μg	0.5 μg	1.7 μl

<4-3> 전통적인 일시적 형질주입( transient transfection )

제조사의 지침에 따라 FuGENE HD Transfection Reagent (Promega)을 사용하여 COS-7 세포에 양성 대조군, 음성 대조군 및 테스트 샘플을 형질주입시켰다. 간략하게, 세포는 형질주입 24시간 전에 12 웰 플레이트 안에 들어있는 커버슬립 상에 5×10⁴ cells/ml로 분주하였다. 융합 구성체(fusion constructs)를 위한 0.5 μg DNA를 포함하는 복합물 형성 용액과 50 μl DMEM에 있는 1.5 μl FuGENE HD 형질주입 용액은 상온에서 15분 동안 배양하였다. 50 μl의 복합물 형성 용액을 플레이트에 첨가하였다. 세포는 처리하기 전에 37℃의 온도, 5% CO₂ 대기조건 하에서 약 48시간 동안 배양하였다.

<4-4> DsRed 및 EGFP 시각화(visualization)

세포에 있는 DsRed 및 EGFP의 형광 시각화는 다음과 같이 수행하였다:

Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS, Sigma)으로 세포를 세척한 후 DPBS/4% 파라포름알데히드(Sigma)를 사용하여 상온에서 30분간 고정시켰다. 커버슬립을 DPBS로 2회 세척하고, DAPI (Vector Laboratories)와 VECTASHIELD Mounting Medium을 갖는 슬라이드 상에 거치하였다. 이미지는 x100 배율의 레이저 공초점 형광현미경(LSM510 Meta, Carl Zeiss)과 40X oil immersion objective의 형광현미경 BX50(Olympus)을 사용하여 디지털 방식으로 얻었다. 형광 현미경 이미지는 DP70-BSW Version 01.02 소프트웨어에 연결된 디지털 카메라 DP70(Olympus)를 사용하여 기록하였다.

<실시예 5>

COS-7 세포에서 DsRed 벡터와 rNL1-태그된 attractor 벡터 사이의 세포 내 위치( subcellular localization ) 양상 비교

DsRed 벡터와 attractor 벡터의 세포 내 위치를 비교하기 위하여, 앞에서 설명한 바와 같이 COS-7 세포에 각각의 벡터를 형질주입시켰다. 도 6에 나타낸 바와 같이, DsRed 벡터는 세포질에서 관찰되었으며, 반면에 attractor 벡터는 오직 핵에서만 위치하는 것으로 나타났다.

<실시예 6>

양성 대조군에서 희석된 Ae-hAvC의 세포 내 위치(subcellular localization) 양상 비교

제조사의 지침에 따라 X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent (promega)를 사용하여 COS-7 세포에 Ar-Neb6457F/6527R 및 원래 농도(0.5μg)의 1/2, 1/4 및 1/8로 연속으로 희석시킨 Ae-AvC를 동시형질주입(cotransfection)하였다. 간략하게, 세포는 형질주입 24시간 전에 12 웰 플레이트 안에 들어있는 살균된 커버슬립(coverslip) 상에 5×10⁴ cells/ml로 분주하였다. 연속적으로 희석된 Ae-hAvC, Ar-Neb6457F/6527R 및 20μl DMEM에 있는 X-tremeGENE 9 DNA 형질주입 시약을 포함하는 각각의 복합물 형성 용액은 상온에서 30분 동안 배양하였다. 표 2는 Ar Neb6457F/6527R, 희석된 Ae hAvC 및 형질주입(transfection) 시약의 농도를 보여준다. 다음으로, 각각의 복합물 형성 용액을 플레이트에 첨가하였다. 세포는 처리하기 전에 37℃의 온도, 5% CO₂ 대기조건 하에서 약 48시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 1/8로 희석된 Ae-hAvC는 1, 1/2 및 1/4로 희석된 Ae-hAvC보다 좀더 명확하게 핵으로 이동하였으며, 이는 Ar-Neb6457F/6527R 상호작용 때문인 것으로 사료되었다.

<실시예 7>

COS-7 세포에서 레이저 공초점 형광현미경을 이용한 본 발명의 핵 이동 분석법과 전통적인 형질주입 분석법 사이의 세포 내 위치(subcellular localization) 양상 비교

<7-1> 양성 대조군의 세포 내 위치 양상 비교

양성 대조군(Neb6457F/6527R와 hAvC)의 상호작용을 확인하기 위하여, 앞에서 설명한 바와 같이 COS-7 세포에 각각의 융합 단백질(fusion construct)을 형질주입하거나 융합 단백질을 함께 동시형질주입시켰다. 각각의 DsRed-Neb6457F/6527R 단편 융합 단백질과 Ae-hAvC 융합 단백질은 형질주입된 COS-7 세포의 세포질에서 독점적으로 위치하였다. 대조적으로, Ar-Neb6457F/6527R 단편 융합 단백질은 핵에서 관찰되었다(도 8 참조).

도 9와 같이 DsRed-Neb457F/6527R 단편과 Ae-hAvC는 형질주입된 COS-7 세포의 세포질에서 동시에 나타난다. Ar-Neb6457F/6527R 단편과 Ae-hAvC는 동시형질주입된 세포의 핵에서 동시에 나타난다.

<7-2> 음성 대조군의 세포 내 위치 양상 비교

음성 대조군(Neb6528F/6612R and hAvC)의 상호작용을 확인하기 위하여, 앞에서 설명한 바와 같이 COS-7 세포에 각각의 융합 단백질(fusion construct)을 형질주입하거나 융합 단백질을 함께 동시형질주입시켰다. 각각의 DsRed-Neb6528F/6612R 단편 융합 단백질과 Ae-hAvC 융합 단백질은 형질주입된 COS-7 세포의 세포질에서 독점적으로 위치하였다. 대조적으로, Ar-Neb6528F/6612R 단편 융합 단백질은 핵에서 관찰되었다(도 10 참조).

도 11과 같이 DsRed-Neb6528F/6612R 단편과 Ae-hAvC가 동시형질주입된 세포에서 두 단백질은 세포질에서 나타난다. 반면에 동시형질주입된 COS-7세포에서는 Ar-Neb6528F/6612R 단편이 오직 핵에서 나타나고, Ae-hAvC는 오로지 세포질에서 나타난다.

<7-3> 테스트 샘플의 세포 내 위치 양상 비교

테스트 샘플(Xep920F/938R 및 hAvC)의 상호작용을 확인하기 위하여, 앞에서 설명한 바와 같이 COS-7 세포에 각각의 융합 단백질(fusion construct)을 형질주입하거나 융합 단백질을 함께 동시형질주입시켰다. 형질주입된 COS-7 세포에서 DsRed-Xep920F/938R 단편 융합 단백질은 핵과 세포질에서 spread out되었다. 대조적으로, Ar-Xep920F/938R 단편 융합 단백질은 오직 핵에서만 관찰되었다. 그리고 Ae-hAvC 융합 단백질은 세포질에서 독점적으로 나타났다(도 12 참조).

도 13과 같이 DsRed-Xep920F/938R 단편과 Ae-hAvC가 동시형질주입된 세포에서 대부분 세포질에서 나타났다. 그리고 동시형질주입된 세포에서 Ar-Xep920F/938R 단편과 Ae-hAvC는 오직 핵에서만 나타났다.

<실시예 8>

형광 현미경을 사용한 본 발명의 핵 이동 분석법과 전통적인 형질주입 분석법 사이의 세포 내 동시발현(colocalization) 비교

<8-1> 양성 대조군

COS-7 세포에 Ae-hAvC와 DsRed 또는 Ar이 태그된 Neb6457F/6527R을 동시형질주입하였다. 40시간 동안 배양한 후, 배양물을 고정하고 형광현미경으로 관찰하였다. 핵은 DAPI로 염색하였다.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군의 세포 내 동시발현(colocalization) 양상은 그들의 동시발현 양상과 비교하여 상대적으로 유사한 동시발현 양상을 나타내는 것으로 나타났다.

<8-2> 양성 대조군

COS-7 세포에 Ae-hAvC와 DsRed 또는 Ar이 태그된 Neb6528F/6612R을 동시형질주입하였다. 40시간 동안 배양한 후, 배양물을 고정하고 형광현미경으로 관찰하였다. 핵은 DAPI로 염색하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군의 세포 내 동시발현(colocalization) 양상은 그들의 동시발현 양상과 비교하여 상대적으로 유사한 동시발현 양상을 나타내는 것으로 나타났다.

<8-3> 테스트 샘플

COS-7 세포에 Ae-hAvC와 DsRed 또는 Ar이 태그된 Xep920F/938R을 동시형질주입하였다. 40시간 동안 배양한 후, 배양물을 고정하고 형광현미경으로 관찰하였다. 핵은 DAPI로 염색하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 테스트 샘플에서는 그들의 동시발현 양상과 비교하여 모호한(obscure) 동시발현 양상을 나타내는 것으로 나타났다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

핵 위치 시그널(nuclear localization signal)로서 rNL1(rat glucocorticoid receptor의 nuclear localization signal 1)이 태그되고, 목적물질을 코딩하는 핵산이 도입되며, 적색 형광 단백질을 가지는 Attractor(Ar) 벡터를 제조하는 단계;
상기 목적물질과 결합하거나 결합하지 않는 표적물질을 코딩하는 핵산이 도입되고, 녹색 형광 단백질을 가지는 Attractee(Ae) 벡터를 제조하는 단계;
상기 Attractor(Ar) 벡터 및 Attractee(Ae) 벡터를 세포에 형질주입 또는 동시형질주입시키고 배양하는 단계;
상기 목적 단백질과 표적 단백질 간의 상호작용을 형광 단백질의 형광으로 측정하는 단계;
적색 형광 및 녹색 형광이 동시에 핵 속에서 측정되는 경우 상기 목적물질 및 결합물질은 서로 결합한 것으로 판단하는 단계; 및
적색 형광이 핵 속에서 측정되고 녹색 형광이 세포질에서 측정되는 경우 상기 목적물질 및 결합물질은 서로 결합하지 않는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 세포질 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 방법.
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제1항에 있어서,
상기 rNL1은 28개의 아미노산으로 구성되고, YRKCLQAGMNLEARKTKKKIKGIQQATA의 아미노산 서열을 코팅하는 핵산 서열을 가지며, 상기에서, Y는 티로신, R는 아르기닌, K는 리신, C는 시스테인, L은 류신, Q는 글루타민, A는 알라닌, G는 글리신, M은 메티오닌, N은 아스파라긴, E는 글루탐산, T는 트레오닌, I는 이소루신을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포질 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 방법.
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핵 위치 시그널(nuclear localization signal)로서 rNL1(rat glucocorticoid receptor의 nuclear localization signal 1)이 태그되고, 목적물질을 코딩하는 핵산이 도입되며, 적색 형광 단백질을 가지는 Attractor(Ar) 벡터를 제조하는 단계;
상기 목적물질과 결합하거나 결합하지 않는 표적물질을 코딩하는 핵산이 도입되고, 녹색 형광 단백질을 가지는 Attractee(Ae) 벡터를 제조하는 단계;
상기 Attractor(Ar) 벡터 및 Attractee(Ae) 벡터를 세포에 형질주입 또는 동시형질주입시키고 배양하는 단계;
상기 목적 단백질과 표적 단백질 간의 상호작용을 형광 단백질의 형광으로 측정하는 단계;
적색 형광 및 녹색 형광이 동시에 핵 속에서 측정되는 경우 상기 목적물질 및 결합물질은 서로 결합한 것으로 판단하는 단계; 및
적색 형광이 핵 속에서 측정되고 녹색 형광이 세포질에서 측정되는 경우 상기 목적물질 및 결합물질은 서로 결합하지 않는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 목적물질에 결합하는 표적물질을 스크리닝하는 방법.