KR20230126523A - 라만 분광 분석을 이용한 세포 치료제의 car 단백질 정량화 방법 및 장치 - Google Patents
라만 분광 분석을 이용한 세포 치료제의 car 단백질 정량화 방법 및 장치 Download PDFInfo
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Abstract
라만 분광 분석을 이용한 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법 및 장치가 제공된다. 본 발명에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법은 면역세포를 포함하는 제1 검체 및 세포 치료제를 포함하는 제2 검체를 각각의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사를 준비하는 전처리 단계, 라만 분광 검사를 수행하여, 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 각각 검출하는 단계, 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 비교하는 단계, 상기 세포 치료제와 형광 비드의 결합을 통한 CAR 단백질 발현량을 확인하는 단계, 및 미리 설정된 기계 학습 모델을 이용하여 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널의 차이값을 기반으로 상기 CAR 단백질 발현량을 정량화하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 라만 분광 분석을 이용한 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법 및 장치에 관한 것이다.
환자의 면역 세포를 유전자 조작하여 다시 환자에게 투여하는 세포 치료제로서의 CAR-T(Chimeric Antigen Receptor-T, 이하 CAR-T)는 B 세포 유래의 재발성, 불응성 급성 백혈병, 및 림프종 등에 혁신적인 약효를 입증하였다. 이러한, CAR-T는 환자의 T 세포에 암세포 특이적인 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 유전 정보를 조합하여 만든 면역세포치료 항암제이기도 하다. CAR-T 외에도 CAR-NK 등이 세포 치료제로 사용되기도 한다.
하지만, CAR-T 등의 세포 치료제는 CSC(Cytokine Release Syndrome)와 신경 독성이라는 부작용을 가지고 있으며, 암세포에만 특이적으로 발현되는 항원을 타겟으로 하는게 아니라면, 정상 세포에 존재하는 항원을 타겟으로 하여 환자를 사망에 이르게 하는 등 치명적인 부작용을 일으킬 수도 있다.
종래 기술에 따른 CAR(Chimeric Antigen Receptor, 이하 CAR)를 이용한 항원 표적화는 CAR 설계에서 중요한 문제이며, CAR의 구조는 1세대에서 4세대까지 발전하였다. 현재 FDA(Food and Drug Administration)의 승인을 받은 CAR-T는 2세대의 세포 치료제로서 하나씩의 신호전달 도메인과 공동자극 도메인을 가지고 있다. 하지만, 3세대 및 4세대 CAR-T의 경우 각각 두 개의 공동자극 도메인을 가지며, 추가된 IL-12 도메인 등으로 인해 강력한 사이토카인 생산과 심각한 독성으로 인해 임상에서 많이 사용되고 있지 않다. 이러한 이유로 임상에서는 2세대의 CAR-T를 안정적인 세포 치료제로 사용하고 있다.
다만, 종래 기술로서 CAR-T를 세포 치료제로 사용함에 있어서, 바이러스 벡터를 이용한 CAR-T 세포 치료제에 CAR 유전자를 삽입하는 방법은 성공 확률이 높지 않아 성공적으로 만들어진 CAR-T의 양을 가늠하기 어려우며, 환자에게 투여하는 CAR-T 중에서는 CAR 단백질이 얼마나 발현되는지 예측하기 어려운 문제가 있었다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 라만 분광 분석을 이용한 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 라만 분광 분석을 이용하여 CAR-T 등 환자들에게 투여되는 세포 치료제들에 대한 CAR 단백질 발현량, 또는 다양한 세포외 기질(Extracellular Expression)들이 제외된 CAR 단백질 발현량을 검출할 수 있는 세포 치료제의 단백질 정량화 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
또한, 기계 학습 모델을 통해 세포 치료제들에 대한 CAR 단백질의 발현량을 정량화할 수 있는 세포 치료제의 단백질 정량화 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급된 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 면에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법은 면역세포를 포함하는 제1 검체 및 세포 치료제를 포함하는 제2 검체를 각각의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사를 준비하는 전처리 단계, 라만 분광 검사를 수행하여, 상기 면역세포에 대한 고유 시그널 및 상기 세포 치료제에 대한 고유 시그널을 각각 검출하는 단계, 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 비교하는 단계, 상기 세포 치료제와 형광 비드의 결합을 통한 CAR 단백질 발현량을 확인하는 단계, 및 미리 설정된 기계 학습 모델을 이용하여 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널의 차이값을 기반으로 CAR 단백질 발현량을 정량화하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 제1 검체는, T cell, NK cell, iNKT cell, 및 γδT cell 중 적어도 하나의 면역세포를 포함하고, 상기 제2 검체는 CAR-T, CAR-NK, CAR-iNKT, 및 γδCAR-T 중 적어도 하나의 세포 치료제를 포함할 수 있다.
또한, 상기 면역세포에 대한 고유 시그널을 검출하는 단계는, 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행하여 상기 제1 검체에 대한 제1 라만 시그널 및 상기 제1 라만 시그널의 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함하고, 상기 세포 치료제에 대한 고유 시그널을 검출하는 단계는, 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행해서 상기 제2 검체에 대한 제2 라만 시그널 및 상기 제2 라만 시그널의 스펙트럼을 획득한다.
또한, 상기 고유 시그널을 비교하는 단계는, 상기 제1 검체의 상기 제1 라만 시그널과 상기 제2 검체의 상기 제2 라만 시그널 간의 차이값을 추출하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 CAR 단백질 발현량을 확인하는 단계는, 상기 제2 검체와 형광 비드를 결합시키고, 형광 현미경을 통해 상기 형광 비드의 개수를 카운팅함으로써, 상기 제2 검체의 용량 또는 상기 제2 검체의 단위 면적당 CAR 단백질과 결합한 형광 비드의 개수를 확인하고, 상기 세포 치료제에서 증가된 CAR 단백질의 라만 시그널과 상기 형광 비드의 개수를 매칭하여 상기 CAR 단백질의 라만 시그널의 증가량 만으로 상기 CAR 단백질의 발현량을 정량화할 수 있다.
또한, 상기 CAR 단백질의 발현량을 정량화하는 단계는, 상기 CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, 상기 CAR 단백질의 발현량 및 검출 인적 정보를 매칭시켜서 상기 면역세포의 라만 시그널 및 상기 세포 치료제의 라만 시그널의 차이값 만으로 상기 CAR 단백질 발현량을 정량화할 수 있다.
또한, 상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 면에 따른 세포 치료제의 단백질 정량화 장치는, 면역세포를 포함한 제1 검체 및 세포 치료제를 포함한 제2 검체를 각각의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사를 수행하여 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 각각 검출하는 검사 모듈과, 상기 면역세포의 고유 시그널과 상 세포 치료제의 고유 시그널을 비교하고, 상기 세포 치료제와 형광 비드 결합을 통한 CAR 단백질 발현량을 확인하는 검사 신호 분석 모듈, 및 미리 설정된 기계 학습 모델을 이용하여 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널의 차이값을 기반으로 상기 CAR 단백질의 발현량을 정량화하는 정량화 학습 모듈을 포함한다.
이때, 상기 검사 모듈은, 상기 제1 검체 및 상기 제2 검체를 각각의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사를 준비시키는 검체 검사 및 전처리부와, 라만 분광 검사를 통해 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 각각 검출하는 라만 시그널 검출부, 및 상기 제2 검체와 상기 형광 비드를 결합시키고, 형광 측정을 통해 상기 제2 검체의 용량 또는 상기 제2 검체의 단위 면적당 CAR 단백질과 결합한 형광 비드의 개수를 검출 및 발현량을 확인하는 형광 측정부를 포함한다.
또한, 상기 라만 시그널 검출부는, 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행하여 상기 제1 검체에 대한 제1 라만 시그널 및 상기 제1 라만 시그널의 스펙트럼을 획득하고, 라만 산란 방식의 검사를 수행해서 상기 제2 검체에 대한 제2 라만 시그널 및 상기 제2 라만 시그널의 스펙트럼을 획득할 수 있다.
또한, 상기 검사 신호 분석 모듈은, 상기 제1 검체의 상기 제1 라만 시그널과 상기 제2 검체의 상기 제2 라만 시그널 간의 차이값을 추출하는 신호 비교 분석부, 및 상기 형광 비드가 결합된 제2 검체로부터 상기 형광 비드의 개수를 카운팅하여 상기 제2 검체의 용량 또는 단위 면적당 상기 CAR 단백질과 결합된 형광 비드의 개수를 확인하는 발현량 검출부를 포함할 수 있다.
이때, 상기 세포 치료제에서 증가된 CAR 단백질의 라만 시그널과 상기 형광 비드의 개수가 매칭되어, 상기 CAR 단백질의 라만 시그널의 증가량이 상기 CAR 단백질의 발현량을 정량화하는 데이터로 적용될 수 있다.
또한, 상기 정량화 학습 모듈은, 상기 CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, 상기 CAR 단백질의 발현량 및 검출 인적 정보를 매칭시켜서, 상기 세포 치료제의 라만 시그널 및 상기 면역세포의 라만 시그널의 차이값 만으로 상기 CAR 단백질 발현량을 정량화할 수 있다.
본 발명의 기타 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 실시예에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법 및 장치는 라만 분광 분석을 이용하여 CAR-T 등 환자들에게 투여되는 세포 치료제들에 대한 CAR 단백질 발현량을 검출할 수 있다. 그리고 기계 학습 모델을 통해 CAR 단백질의 발현량을 정량화할 수 있다. 이에, 환자에게 투여되는 세포 치료제의 투여 농도를 적당하게 결정할 수 있도록 지원할 수 있다.
특히, CAR-T에 단순하게 국한되지 않고, 바이러스 벡터를 이용해 CAR-iNKT, CAR-NK, γδCAR-T 등의 세포 치료제들에 대한 전반적인 응용이 가능하다. 또한, 단순히 라만 분광법뿐만이 아닌 세포 비파괴적인 방법으로서 유세포 분석, qPCR 등의 다른 측정 장비들과 호환해서 세포 치료제들에 대한 단백질 발현량 분석이 가능하다.
본 발명의 효과들은 이상에서 언급된 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법을 순서대로 설명하기 위한 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 검체로 적용되는 2세대의 세포 치료제인 CAR-T 구조를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 면역세포의 고유 시그널 및 세포 치료제의 고유 시그널의 차이를 비교하여 CAR 단백질의 라만 시그널 획득을 위한 과정을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 형광 비드 결합을 통한 단위 면적당 CAR 단백질의 발현량 확인 과정을 나타낸 도면이다.
도 5은 본 발명에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 장치를 구체적으로 나타낸 구성 블록도이다.
도 2는 본 발명에 따른 검체로 적용되는 2세대의 세포 치료제인 CAR-T 구조를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 면역세포의 고유 시그널 및 세포 치료제의 고유 시그널의 차이를 비교하여 CAR 단백질의 라만 시그널 획득을 위한 과정을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 형광 비드 결합을 통한 단위 면적당 CAR 단백질의 발현량 확인 과정을 나타낸 도면이다.
도 5은 본 발명에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 장치를 구체적으로 나타낸 구성 블록도이다.
명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성요소를 지칭한다. 본 명세서가 실시예들의 모든 요소들을 설명하는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적인 내용 또는 실시예들 간에 중복되는 내용은 생략한다. 명세서에서 사용되는 '부, 모듈, 부재, 블록'이라는 용어는 소프트웨어 또는 하드웨어로 구현될 수 있으며, 실시예들에 따라 복수의 '부, 모듈, 부재, 블록'이 하나의 구성요소로 구현되거나, 하나의 '부, 모듈, 부재, 블록'이 복수의 구성요소들을 포함하는 것도 가능하다.
어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
제1, 제2 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위해 사용되는 것으로, 구성요소가 전술된 용어들에 의해 제한되는 것은 아니다.
단수의 표현은 문맥상 명백하게 예외가 있지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
각 단계들에 있어 식별부호는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다.
이하 첨부된 도면들을 참고하여 본 발명의 작용 원리 및 실시예들에 대해 설명한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법을 순서대로 설명하기 위한 순서도이다.
도 1에 도시된 일 실시예에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법으로는 환자에게 투여하는 세포 치료제에 대한 CAR 단백질 발현량을 확인 및 정량화한다. 이를 위해, 일 실시예에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법은 면역세포를 포함하는 제1 검체 및 세포 치료제를 포함하는 제2 검체를 각각의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사를 준비하는 전처리 단계(ST1), 라만 분광 검사를 수행하여 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 각각 검출하는 단계(ST2), 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 비교하는 단계(ST3), 상기 세포 치료제와 형광 비드의 결합을 통한 CAR 단백질 발현량을 확인하는 단계(ST4), 및 미리 설정된 기계 학습 모델을 이용하여 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널의 차이값을 기반으로 상기 CAR 단백질 발현량을 정량화하는 단계(ST5)를 포함한다.
구체적으로, 상기 전처리 단계(ST1)에서는 상기 제1 검체를 적어도 하나의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사를 준비하고, 상기 제2 검체가 배치된 적어도 하나의 검사 키트를 전처리한다.
상기 세포 치료제를 만들 수 있는 면역세포의 제1 검체로는 T cell, NK cell, iNKT cell, 및 γδT cell 중 적어도 하나의 면역세포가 적용될 수 있다.
상기 고유 신호를 검출하는 단계(ST2)에서는 상기 면역세포에 해당하는 상기 제1 검체에 대해 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행해서 상기 제1 검체의 제1 라만 시그널을 획득할 수 있다.
일 실시예에 따른 라만 산란 방식은 생물학적 및 화학적 검체들에 대한 분자 특이적 정보를 제공하는 분석법이다. 라만 산란 방식의 검사로는 분자의 특징적인 피크의 세기(intensity) 변화를 측정하여 제1 검체에 대한 구성 물질(예를 들어, 단백질)을 정량화한다.
또한, 상기 전처리 단계(ST1)에서는 세포 치료제로 이용되는 제2 검체를 적어도 하나의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사를 준비하고, 세포 치료제가 배치된 적어도 하나의 검사 키트를 전처리한다.세포 치료제로 이용되는 상기 제2 검체로는 CAR-T, CAR-NK, CAR-iNKT, 및 γδCAR-T 중 적어도 하나의 세포 치료제가 적용될 수 있다.
라만 분광 검사를 통해 세포 치료제의 고유 시그널을 검출하는 단계(ST2)에서는 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행하여 상기 세포 치료제에 해당하는 상기 제2 검체에 대한 제2 라만 시그널 및 상기 제2 라만 시그널의 스펙트럼을 획득할 수 있다.
일 실시예에 따른 라만 산란 방식은 생물학적 및 화학적 검체들에 대한 분자 특이적 정보를 제공하는 분석법이다. 라만 산란 방식의 검사로는 분자의 특징적인 피크의 세기(intensity) 변화를 측정하여 CAR-T 검체에 대한 구성 물질(예를 들어, 단백질)을 정량화한다.
도 2는 본 발명에 따른 검체로 적용되는 2세대의 세포 치료제 CAR-T 구조를 나타낸 도면이다.
도 2를 참조하면, 면역세포 및 세포 치료제의 고유 시그널을 검출하는 단계(ST2)에서는 라만 산란 방식을 이용하며, 라만 시그널 획득시에는 라만 분광 장비(예를 들어, 532nm laser 785nm laser Raman Device)를 이용하여 200cm-1 ~ 3000cm-1 등 미리 설정된 파장 범위를 샘플링하고, 샘플링된 파장 범위의 스펙트럼 분포를 분석할 수 있다. 특히, 라만 시그널의 스펙트럼 분포를 컴퓨터의 미리 설정된 프로그램을 통해 분석하면, 유기 및 무기 분자의 고유 라만 스펙트럼 분포 및 포함 범위에 따라 단백질의 종류, 지질, RNA, DNA 등을 검출할 수 있다. 도 3은 본 발명에 따른 면역세포의 고유 시그널 및 세포 치료제의 고유 시그널의 차이를 비교하여 CAR 단백질의 라만 시그널 획득을 위한 과정을 나타낸 도면이다.
면역세포의 고유 시그널 및 세포 치료제의 고유 시그널을 비교하는 단계(ST3)에서는 상기 제1 검체인 면역세포의 상기 제1 라만 시그널 및 상기 제2 검체인 세포 치료제의 상기 제2 라만 시그널을 비교하고, 상기 비교된 결과에 따른 상기 제1 라만 시그널 및 상기 제2 라만 시그널의 차이값을 추출한다.
상기 차이값을 추출 시에는 T cell 등의 면역세포와 CAR-T 등의 세포치료제를 각각 고배율(x100, x60)의 침지대물렌즈로 맵핑한 뒤 두 라만 시그널의 차이 값을 확인 및 추출할 수 있다.
도 4는 본 발명에 따른 형광 비드 결합을 통한 단위 면적당 CAR 단백질의 발현량 확인 과정을 나타낸 도면이다.
즉, 도 4는 본 발명에 따른 상기 제2 검체인 세포 치료제의 항원 인지 부위와 항원-형광 비드(세포 치료제의 항원 인지 부위와 항원-항체 결합 반응을 발생시킬 수 있는 항원과 결합한 형광 비드)의 항원-항체 결합 반응을 통한 단위 면적당 CAR 단백질의 발현량을 확인하는 과정을 나타내고 있다.
도 4를 참조하면, 상기 제2 검체인 세포 치료제의 항원 인지 부위와 항원(CD19, CD22, CD33, CD147, CD340 중 어느 하나)-형광 비드의 항원-항체 결합 반응을 통한 CAR 단백질 발현량 확인 단계(ST4)에서는, 먼저 제2 검체의 항원 인지 부위와 항원-형광 비드를 결합시킨다. 그리고, 레이저 현미경 또는 형광 현미경 등을 통한 형광 측정을 통해 상기 제2 검체의 용량 또는 상기 제2 검체의 단위 면적당 CAR 단백질의 항원 인지 부위와 결합된 형광 비드의 개수를 확인 및 CAR 단백질의 발현량을 검출한다.
이와 같이, CAR 단백질 발현량 확인 단계(ST4)에서 상기 제2 검체와 형광 비드를 결합시킨 다음 형광 현미경 등을 통해 비드 개수를 카운팅함으로써, 상기 제2 검체의 용량 또는 상기 제2 검체의 단위 면적당 CAR 단백질과 결합한 형광 비드의 개수를 확인하고, 상기 세포 치료제에서 증가된 CAR 단백질의 라만 시그널과 형광 비드의 개수를 매칭하여 상기 CAR 단백질의 라만 시그널의 증가량 만으로 상기 CAR 단백질의 발현량을 정량화할 수 있다.
여기서, 상기 카운팅 된 비드 개수는 CAR 단백질의 발현량을 나타내는 학습 인자로 적용될 수 있다. 이러한, 면역세포인 상기 제1 검체 및 세포 치료제인 상기 제2 검체 간의 라만 시그널의 차이 값으로 획득되는 CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, 세포 치료제와 형광 비드 결합으로 확인된 CAR 단백질의 발현량 등은 기계 학습을 위한 학습 인자로 적용될 수 있다.
미리 설정된 기계 학습 모델을 이용하여 단백질 발현량을 정량화하는 단계(ST5)에서는 상기 CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, 및 상기 CAR 단백질의 발현량등의 검출된 학습 인자들이 입력 프로그램과 데이터 베이스에 입력 값들로 입력되어 상기 세포 치료제의 라만 시그널과 상기 면역세포의 라만 시그널 차이값 만으로도 상기 CAR 단백질 발현량을 정량화 할 수 있도록 한다.
학습 인자들의 입력시, 미리 설정된 기계 학습 프로그램들 중 적어도 하나의 기계 학습 프로그램을 선택해서 검체 관련 정보를 비롯한 라만 시그널 검출 결과 및 라만 스펙트럼 검출 결과를 학습 인자로 추가 입력할 수 있다.
기계 학습 프로그램으로는 PCA(Principal component analysis)-LDA(Linear Discriminant Analysis)모델, NMF(Non-Negative Matrix Factorization)-LDA(Linear Discriminant Analysis)모델, RFML(Random Forest Machine Learning) 모델, K-means clustering, MCR(multivariate curve resolution)분석 모델, 딥러닝(예를 들어, CNN(Convolutional Neural Networks)) 등이 동반적으로 적용될 수 있다. 학습 인자 입력시에는 결과적인 분류 정보들을 명확히 구분하기 위해 CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, CAR 단백질의 발현량 외에도 검출 인적 정보(예를 들어, CAR 유전자 삽입량 등)을 각각 추가 입력할 수 있다.
단백질 발현량을 정량화하는 단계(ST5)에서는 기계 학습 프로그램의 입력 값으로 입력된 기 산출되었었던 정량화 데이터들, CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, CAR 단백질의 발현량, 및 검출 인적 정보를 매칭시켜서 기계 학습이 수행되도록 한다.
최종적으로 산출되는 정량화 데이터들을 통해서는 CAR-T, CAR-NK cell 등 세포 치료제들에 대한 CAR 단백질 발현 정도를 정량화 할 수 있다.
CAR-T, CAR-NK, CAR-iNKT, γδCAR-T 등을 제2 검체로 적용해서는 CAR-T, CAR-NK, CAR-iNKT, γδCAR-T에 대한 CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, CAR 단백질의 발현량 등을 정량화할 수 있다.
도 5은 본 발명에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 장치를 구체적으로 나타낸 구성 블록도이다.
도 5에 도시된 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 장치는 검사 모듈(100), 검사 신호 분석 모듈(200), 및 정량화 학습 모듈(300)을 포함한다.
검사 모듈(100)은 면역세포를 포함한 제1 검체 및 세포 치료제를 포함한 제2 검체를 각각의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사의 수행을 통해, 상기 면역세포에 대한 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 각각 검출한다. 이를 위해, 검사 모듈(100)은 검체 검사 및 전처리부(101), 라만 시그널 검출부(103), 및 형광 측정부(105)를 포함한다.
검체 검사 및 전처리부(101)는 세포 치료제를 만들수 있는 면역세포를 포함한 상기 제1 검체와 세포 치료제로 이용되는 상기 제2 검체를 적어도 하나의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사를 준비하고, 상기 제1 검체 및 제2 검체가 배치된 적어도 하나의 검사 키트를 전처리시킨다.
상기 세포 치료제를 만들 수 있는 면역세포의 제1 검체로는 T cell, NK cell, iNKT cell, 및 γδT cell 중 적어도 하나의 면역세포가 적용될 수 있다. 또한, 세포 치료제로 이용되는 상기 제2 검체로는 CAR-T, CAR-NK, CAR-iNKT, 및 γδCAR-T 중 적어도 하나의 세포 치료제가 적용될 수 있다.
라만 시그널 검출부(103)는 상기 면역세포에 해당하는 상기 제1 검체에 대해 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행해서 상기 제1 검체의 제1 라만 시그널을 획득하고, 상기 세포 치료제에 해당하는 상기 제2 검체에 대해 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행해서 상기 제2 검체의 제2 라만 시그널 및 상기 제2 라만 시그널의 스펙트럼을 획득하고, 상기 획득된 제1 라만 시그널, 상기 제2 라만 시그널을 데이터 베이스에 저장한다.
형광 측정부(105)는 상기 제2 검체와 형광 비드를 결합시키고, 형광 측정을 통해 상기 제2 검체의 용량 또는 상기 제2 검체의 단위 면적당 CAR 단백질과 결합한 형광 비드의 개수를 검출하고 CAR 단백질의 발현량을 확인한다. 구체적으로, 형광 측정부(105)는 상기 제2 검체와 형광 비드가 결합되면, 레이저 현미경 또는 형광 현미경 등을 통한 형광 측정을 통해 상기 제2 검체의 용량 또는 상기 제2 검체의 단위 면적당 CAR 단백질과 결합한 형광 비드의 개수를 검출하고 CAR 단백질의 발현량을 확인한다. 이때, 형광 현미경 등을 통해 비드 개수를 카운팅함으로써, 상기 제2 검체의 용량 또는 상기 제2 검체의 단위 면적당 CAR 단백질의 발현량을 확인할 수 있다.
검사 신호 분석 모듈(200)은 상기 세포 치료제의 고유 시그널과 상기 면역세포의 고유 시그널을 비교하고, 상기 세포 치료제와 형광 비드 결합을 통한 CAR 단백질 발현량을 확인한다. 이를 위해, 검사 신호 분석 모듈(200)은 타겟 신호 확인부(202), 신호 비교 분석부(204), 및 발현량 검출부(206)를 포함할 수 있다.
타겟 신호 확인부(202)는 세포 치료제와 면역세포의 고유 신호 비교를 위해 각각의 라만 시그널을 검출한다.
신호 비교 분석부(204)는 면역세포인 제1 검체의 제1 라만 시그널과 세포 치료제인 제2 검체의 제2 라만 시그널을 비교하여 그 차이값을 추출한다. 여기서, 상기 차이 값을 추출 시에는 T cell 등의 면역세포와 CAR-T 등의 세포 치료제를 각각 고배율(x100, x60)의 대물렌즈로 맵핑한 뒤 두 라만 시그널의 차이 값을 확인 및 추출할 수 있다.
발현량 검출부(206)는 형광 비드가 결합된 CAR-T 검체로부터 형광 현미경 등을 통해 비드 개수를 카운팅함으로써, CAR-T 검체 용량 또는 CAR-T 검체의 단위 면적당 CAR 단백질과 결합한 형광 비드의 개수를 검출하고 CAR 단백질의 발현량을 확인한다. 여기서, 카운팅 된 비드 개수는 CAR 단백질의 라만 시그널 증가량과 CAR 단백질의 발현량을 매칭시키는 기계 학습을 위한 학습 인자로 적용될 수 있다.
정량화 학습 모듈(300)은 미리 설정된 기계 학습 모델을 이용하여 단백질 발현량을 정량화한다. 이를 위해, 정량화 학습 모듈(300)은 학습 인자 입력부(301), 기계학습 처리부(303), 기계학습 프로그램 입력부(305), 및 정량화 데이터 생성부(307)를 포함한다.
학습 인자 입력부(301)는 CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, CAR 단백질의 발현량을 포함하는 학습 인자들을 입력 프로그램과 데이터 베이스에 입력 값들로 입력한다.
기계학습 처리부(303)는 기계 학습 프로그램의 입력 값으로 입력된 정량화 데이터들, CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, CAR 단백질의 발현량, 검출 인적 정보들을 매칭시켜서 기계 학습을 수행한다. 그리고 CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, CAR 단백질의 발현량, 검출 인적 정보들을 매칭시켜서 세포 치료제의 라만 시그널과 면역세포의 라만 시그널 차이 값 만으로도 CAR 단백질 발현량을 정량화시킬 수 있다. 기계학습 프로그램 입력부(305)는 복수의 기계 학습 모델별 기계 학습 프로그램을 저장하고, 적어도 하나의 기계 학습 모델 및 기계 학습 프로그램을 선택해서 컴파일한다. 이때, 기계 학습 프로그램으로는 PCA(Principal component analysis)-LDA(Linear Discriminant Analysis)모델, NMF(Non-Negative Matrix Factorization)-LDA(Linear Discriminant Analysis)모델, RFML(Random Forest Machine Learning) 모델, K-means clustering, MCR(multivariate curve resolution)분석 모델, 딥러닝(예를 들어, CNN(Convolutional Neural Networks)) 등이 동반적으로 적용될 수 있다.
정량화 데이터 생성부(307)는 기 산출되었었던 정량화 데이터들, CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, CAR 단백질의 발현량, 검출 인적 정보들을 매칭시켜서 CAR 단백질 발현량을 정량화시킨 정량화 데이터를 생성한다.
검사 신호 분석 모듈(200) 및 정량화 학습 모듈(300)은 각 모듈의 프로세서 내 구성요소들의 동작을 제어하기 위한 알고리즘 또는 알고리즘을 재현한 프로그램에 대한 데이터를 저장하는 메모리(미도시), 및 메모리(또는, 데이터 베이스)에 저장된 데이터를 이용하여 전술한 동작을 수행하는 프로세서(미도시)를 포함할 수 있다. 이때, 메모리와 프로세서는 각각 별개의 칩으로 구현될 수 있다. 또는, 메모리와 프로세서는 단일 칩으로 구현될 수도 있다.
각각의 구성요소는 소프트웨어 및/또는 Field Programmable Gate Array(FPGA) 및 주문형 반도체(ASIC, Application Specific Integrated Circuit)와 같은 하드웨어 구성요소를 의미한다.
한편, 개시된 실시예들은 검사 신호 분석 모듈(200) 및 정량화 학습 모듈(300)에 의해 실행 가능한 명령어를 저장하는 기록매체의 형태로 구현될 수 있다. 명령어는 프로그램 코드의 형태로 저장될 수 있으며, 프로세서에 의해 실행되었을 때, 프로그램 모듈을 생성하여 개시된 실시예들의 동작을 수행할 수 있다. 기록매체는 검사 신호 분석 모듈(200) 및 정량화 학습 모듈(300)이나, 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체로 구현될 수 있다.
검사 신호 분석 모듈(200) 및 정량화 학습 모듈(300)이나, 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체로는 컴퓨터에 의하여 해독될 수 있는 명령어가 저장된 모든 종류의 기록 매체를 포함한다. 예를 들어, ROM(Read Only Memory), RAM(Random Access Memory), 자기 테이프, 자기 디스크, 플래쉬 메모리, 광 데이터 저장장치 등이 있을 수 있다.
전술한 본 발명에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법 및 장치로는 라만 분광 분석을 이용하여 환자들에게 투여되는 세포 치료제들에 대한 CAR 단백질 발현량을 검출할 수 있다. 그리고 기계 학습 모델을 통해 CAR 단백질의 발현량을 정량화할 수 있다. 이에, 환자에게 투여되는 세포 치료제의 투여 농도를 적당하게 결정할 수 있도록 지원하여, 세포 치료제들에 대한 안정성을 향상시킬 수 있다. 특히, 세포 치료제가 CAR-T에 단순하게 국한되지 않고, 바이러스 벡터를 이용해 CAR gene을 삽입한 CAR-iNKT, CAR-NK, γδCAR-T 등의 세포 치료제들에 대한 전반적인 응용이 가능하다. 또한, 단순히 라만 분광법뿐만이 아닌 세포 비파괴적인 방법으로서 유세포 분석, qPCR 등의 다른 측정 장비들과 호환해서 세포 치료제들에 대한 CAR 단백질 발현량 분석이 가능하다.
이상에서와 같이 첨부된 도면을 참조하여 개시된 실시예들을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고도, 개시된 실시예들과 다른 형태로 본 발명이 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 개시된 실시예들은 예시적인 것이며, 한정적으로 해석되어서는 안 된다.
100: 검사 모듈
101: 검체 검사 및 전처리부
103: 라만 시그널 검출부 105: 형광 측정부
200: 검사 신호 분석 모듈 202: 타겟 신호 확인부
204: 신호 비교 분석부 206: 발현량 검출부
300: 정량화 학습 모듈 301: 학습 인자 입력부
303: 기계학습 처리부
103: 라만 시그널 검출부 105: 형광 측정부
200: 검사 신호 분석 모듈 202: 타겟 신호 확인부
204: 신호 비교 분석부 206: 발현량 검출부
300: 정량화 학습 모듈 301: 학습 인자 입력부
303: 기계학습 처리부
Claims (13)
- 세포 치료제의 단백질 정량화 장치에 의해 수행되는 방법에 있어서,
면역세포를 포함하는 제1 검체 및 세포 치료제를 포함하는 제2 검체를 각각의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사를 준비하는 전처리 단계;
라만 분광 검사를 수행하여, 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 각각 검출하는 단계;
상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 비교하는 단계;
상기 세포 치료제와 형광 비드의 결합을 통한 CAR 단백질 발현량을 확인하는 단계; 및
미리 설정된 기계 학습 모델을 이용하여 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널의 차이값을 기반으로 상기 CAR 단백질 발현량을 정량화하는 단계를 포함하는 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법. - 제1 항에 있어서,
상기 제1 검체는, T cell, NK cell, iNKT cell, 및 γδT cell 중 적어도 하나의 면역세포 포함하고,
상기 제2 검체는, CAR-T, CAR-NK, CAR-iNKT, 및 γδCAR-T 중 적어도 하나의 세포 치료제를 포함하는 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법. - 제2 항에 있어서,
상기 면역세포의 고유 시그널을 검출하는 단계는, 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행하여 상기 제1 검체에 대한 제1 라만 시그널 및 상기 제1 라만 시그널의 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함하고,
상기 세포 치료제의 고유 시그널을 검출하는 단계는, 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행해서 상기 제2 검체에 대한 제2 라만 시그널 및 상기 제2 라만 시그널의 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함하는 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법. - 제3 항에 있어서,
상기 고유 시그널을 비교하는 단계는,
상기 제1 검체의 상기 제1 라만 시그널과 상기 제2 검체의 상기 제2 라만 시그널 간의 차이값을 추출하는 단계를 포함하는 세포 치료제 CAR 단백질 정량화 방법. - 제3 항에 있어서,
상기 CAR 단백질 발현량을 확인하는 단계는,
상기 제2 검체와 형광 비드를 결합시키고 형광 현미경을 통해 상기 형광 비드의 개수를 카운팅함으로써, 상기 제2 검체의 용량 또는 상기 제2 검체의 단위 면적당 CAR 단백질과 결합한 형광 비드의 개수를 확인하고, 상기 세포 치료제에서 증가된 CAR 단백질의 라만 시그널과 형광 비드의 개수를 매칭하여 상기 CAR 단백질의 라만 시그널의 증가량 만으로 상기 CAR 단백질의 발현량을 정량화하는 것을 특징으로 하는 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법. - 제5 항에 있어서,
상기 CAR 단백질의 발현량을 정량화하는 단계는,
상기 CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, 상기 CAR 단백질의 발현량 및 검출 인적 정보를 매칭시켜서, 상기 세포 치료제의 라만 시그널 및 상기 면역세포의 라만 시그널의 차이값 만으로 상기 CAR 단백질 발현량을 정량화하는 것을 특징으로 하는 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법. - 하드웨어인 컴퓨터와 결합되어, 상기 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 따른 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 방법을 수행하기 위해 컴퓨터 판독 가능한 기록매체에 저장된 컴퓨터 프로그램.
- 면역세포를 포함한 제1 검체 및 세포 치료제를 포함한 제2 검체를 각각의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사를 수행하여 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 각각 검출하는 검사 모듈;
상기 면역세포의 고유 시그널과 상 세포 치료제의 고유 시그널을 비교하고, 상기 세포 치료제와 형광 비드 결합을 통한 CAR 단백질 발현량을 확인하는 검사 신호 분석 모듈; 및
미리 설정된 기계 학습 모델을 이용하여 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널의 차이값을 기반으로 상기 CAR 단백질의 발현량을 정량화하는 정량화 학습 모듈을 포함하는 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 장치. - 제8 항에 있어서,
상기 검사 모듈은,
상기 제1 검체 및 상기 제2 검체를 각각의 검사 키트에 배치하여 라만 분광 검사를 준비시키는 검체 검사 및 전처리부;
라만 분광 검사를 통해 상기 면역세포의 고유 시그널 및 상기 세포 치료제의 고유 시그널을 각각 검출하는 라만 시그널 검출부; 및
상기 제2 검체와 상기 형광 비드를 결합시키고, 형광 측정을 통해 상기 제2 검체의 용량 또는 상기 제2 검체의 단위 면적당 CAR 단백질과 결합한 형광 비드의 개수를 검출 및 발현량을 확인하는 형광 측정부를 포함하는 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 장치. - 제9 항에 있어서,
상기 라만 시그널 검출부는,
라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행하여 상기 제1 검체에 대한 제1 라만 시그널 및 상기 제1 라만 시그널의 스펙트럼을 획득하고,
라만 산란 방식의 검사를 수행해서 상기 제2 검체에 대한 제2 라만 시그널 및 상기 제2 라만 시그널의 스펙트럼을 획득하는 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 장치. - 제9 항에 있어서,
상기 검사 신호 분석 모듈은,
상기 제1 검체의 상기 제1 라만 시그널과 상기 제2 검체의 상기 제2 라만 시그널 간의 차이값을 추출하는 신호 비교 분석부; 및
상기 형광 비드가 결합된 제2 검체로부터 상기 형광 비드의 개수를 카운팅하여 상기 제2 검체의 용량 또는 단위 면적당 상기 CAR 단백질과 결합된 형광 비드의 개수를 확인하는 발현량 검출부를 포함하는 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 장치. - 제11 항에 있어서,
상기 세포 치료제에서 증가된 CAR 단백질의 라만 시그널과 상기 형광 비드의 개수가 매칭되어, 상기 CAR 단백질의 라만 시그널의 증가량이 상기 CAR 단백질의 발현량을 정량화하는 데이터로 적용되는 것을 특징으로 하는 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 장치. - 제12 항에 있어서,
상기 정량화 학습 모듈은,
상기 CAR 단백질의 라만 시그널 증가량, 상기 CAR 단백질의 발현량 및 검출 인적 정보를 매칭시켜서, 상기 세포 치료제의 라만 시그널 및 상기 면역세포의 라만 시그널의 차이값 만으로 상기 CAR 단백질 발현량을 정량화하는 것을 특징으로 하는 세포 치료제의 CAR 단백질 정량화 장치.
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