CN105176987A - 生物条形码检测中的np探针、其制备方法与生物条形码检测试剂盒 - Google Patents
生物条形码检测中的np探针、其制备方法与生物条形码检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明生物条形码检测中的NP探针、其制备方法与生物条形码检测试剂盒，是在生物条形码检测方法的基础上，缩短NP探针标记的单链条形码DNA的长度(60碱基)，以减少NP探针表面条形码DNA形成折叠或弯曲，从而减少检测中存在的干扰，并确保这一长度仍可用于基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检测，并采用DNA酶降解未标记的游离条形码DNA，以提高检测特异性。本发明可提高核心抗原检测的灵敏度和精确度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中的生物条形码检测技术，特别是涉及其中的一种与NP探针联结的单链条形码DNA、新型NP探针、该探针的制备以及基于该新型NP探针形成的生物条形码检测试剂盒，本发明可用于与该单链条形码DNA无核酸序列同源性的病毒抗原的高灵敏度检测。
背景技术
生物条形码检测技术(bio-barcodesassay，BCA)于2003年Mirkin等开发以来，为分子诊断领域，尤其是微量蛋白质检测提供了一个全新的技术平台(NamJM,ThaxtonCS，MirkinCA.Nanoparticle-basedbio-barcodesfortheultrasensitivedetectionofproteins.Science，2003，301(5641):1884-1886)。该技术检测蛋白的原理是利用标记被检物单抗的磁性微球(magneticmicroparticles，MMP)、标记被检物多抗和条形码DNA链的金纳米颗粒(nano-particle，NP)，通过形成MMP-被检物-NP三明治复合物，利用磁场进行分离，洗脱释放NP上标记的条形码DNA链，通过PCR或银染法鉴定就可确定被检物的存在。
BCA技术中，NP探针标记有双链DNA(48bp)和病原的多克隆抗体，双链DNA的其中一条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码DNA，每一个直径为30nm的胶体金上大约标记有400条左右的条形码DNA链(HurstSJ,Lytton-JeanAR,MirkinCA.MaximizingDNAloadingonarangeofgoldnanoparticlesizes.AnalChem,2006,78:8313-8318)；MMP探针是对应于分选磁场的直径约为1μm的磁珠微球，其表面上包被有抗病原的单克隆抗体。BCA技术通过抗原抗体高度特异性反应捕获抗原，再通过检测条形码DNA而实现对被检物的间接检测，由于双链DNA标记的一次放大以及PCR反应和芯片检测的二次放大效应，使检测灵敏度得到极大提高。
发明人所在实验室对传统BCA技术进行了改进，先后建立了用于蓝舌病病毒检测的新型BCA检测技术(YinHQ,JiaMX,YangS,JingPP,WangR,ZhangJG.Developmentofahighlysensitivegoldnanoparticleprobe-basedassayforbluetonguevirusdetection.JournalofVirologicalMethods,2012,183(1):45-48)以及蓖麻毒素检测的新型BCA检测技术(YinHQ,JiaMX,ShiLJ,LiuJ,WangR,LvMM,MaYY,ZhaoX,ZhangJG.Evaluationofanovelultra-sensitivenanoparticleprobe-Basedassayforricindetection.JournalofImmunotoxicology,2013,earlyonline:1-5)，其中蓖麻毒素新型BCA检测方法申报并获得了国家发明专利(ZL201010530075.2,2013-06-19，申请日2010-10-29)。
在上述新型BCA检测技术中，标记的条形码DNA链改进为单链，其长度为90个碱基(如序列表中SEQIDNo：5所示)，其长度适于进行TaqMan探针法的荧光定量PCR检测，但是这一长度的DNA链容易在NP探针表面形成弯曲折叠结构，从而不利于后续基于抗原-抗体反应的NP-被检物-MMP免疫复合物的形成。此外，NP探针制备中，仅采用离心法去除未标记到NP上的游离条形码DNA，这一制备方法不易去除游离条形码DNA，而游离条形码DNA的残留会导致BCA检测的假阳性结果。
发明内容
针对现有BCA检测技术中存在的不足，本发明目的在于改进BCA检测技术，提供一种新型NP探针以及该探针的制备方法。
本发明首先提供一种生物条形码检测中与NP探针联结的单链条形码DNA，所述条形码DNA长度少于90碱基仍适用于荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，优选为60个碱基。
具体的，该单链条形码DNA核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。
本发明进一步提供一种生物条形码检测中的NP探针，其金纳米颗粒上包被有如上所述的长度少于90碱基的单链条形码DNA。
所述生物条形码检测中的NP探针中，金纳米颗粒上还包被有被检病原的多抗，所述被检病原的核酸序列与所述单链条形码DNA无同源性。例如丙型肝炎病毒核酸序列与单链条形码DNA无同源性，因而可对丙型肝炎病毒进行检测，可采用抗丙型肝炎病毒的多抗进行包被，同理，也可采用乙型肝炎病毒多抗标记以用于乙型肝炎病毒抗原的检测。
本发明提供一种生物条形码检测中NP探针的制备方法，包括以下步骤：1)合成所述的单链条形码DNA；2)在金纳米颗粒上分别标记被检病原的多抗和所述单链条形码DNA；3)用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)降解未标记上的游离单链条形码DNA；由此得到NP探针。
以上所述生物条形码检测中NP探针的制备方法，所述步骤3)的过程为：将1体积的DNaseⅠ(100U)、1体积的25mMMgCl2、1体积的小牛血清和5体积的0.01MPBS混合均匀，加入2体积的步骤2)得到的标记有多抗和DNA的纳米金颗粒PBS重悬液中，37℃孵育2h，4℃、13000g离心10min，去除上清，0.01MPBS重悬沉淀得到去除了游离单链条形码DNA的NP探针，4℃保存。
本发明进一步目的在于提供一种基于该新型NP探针形成的用于新型生物条形码检测的产品。
此类产品可以为生物条形码检测中的MMP-核心抗原-NP三明治复合物，是将所述NP探针、MMP探针和被检病原抗原通过抗原、抗体作用制备得到，所述MMP探针为标记有抗被检病原单抗的磁珠。
此类产品还可以为生物条形码检测试剂盒，其中包括所述NP探针、标记有抗被检病原单抗的MMP探针以及用于实时荧光定量PCR检测的引物对和TaqMan荧光探针。
具体的，该生物条形码检测试剂盒中，用于实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：3所示，TaqMan荧光探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：4所示。
以上单链条形码DNA、NP探针、MMP-核心抗原-NP三明治复合物或试剂盒可用于核酸序列与所述单链条形码DNA无同源性的病原的抗原检测。
具体的，所述试剂盒为丙型肝炎病毒核心抗原生物条形码检测试剂盒，其中包含：包被有抗丙型肝炎病毒核心抗原多抗和条形码DNA的NP探针、包被有抗丙型肝炎病毒核心抗原单抗的MMP探针以及用于实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan荧光探针。
以丙型肝炎病毒核心抗原的检测为例，基于本发明的新型生物条形码检测是在普通生物条形码检测方法的基础上，将单链条形码DNA的长度改为60碱基，其长度可适用于荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测，三明治反应复合物中条形码DNA链不用解离，直接用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法对三明治反应复合物中条形码DNA链进行定性、定量检测。此外，在NP探针制备中，采用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)处理来降解未标记上的游离条形码DNA，从而避免检测中存在的假阳性。
具体来讲，丙型肝炎病毒核心抗原的新型生物条形码检测可包括以下步骤：
(1)NP探针的制备：设计长度为60碱基的适用荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的单链条形码DNA，在金纳米颗粒上分别标记抗丙型肝炎病毒核心抗原的多克隆抗体和条形码DNA，然后用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)降解未标记上的游离条形码DNA，以避免检测结果存在假阳性，得到NP探针；
(2)MMP探针的制备：在磁性微球(磁珠)上标记抗丙型肝炎病毒核心抗原的单抗，得到MMP探针；
(3)条形码DNA检测：将NP探针、MMP探针和丙型肝炎病毒核心抗原通过抗原、抗体作用制备三明治复合物，然后经磁场分离纯化后，将复合物上标记的条形码DNA直接进行基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检测，以对丙型肝炎病毒核心抗原进行定性、定量检测。
在上述丙型肝炎病毒核心抗原的新型生物条形码检测方法中，所述步骤(1)中金纳米颗粒的直径可为15-30nm，优选为15nm；优选的用于基于金纳米探针的丙型肝炎病毒核心抗原超灵敏检测的条形码DNA的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。
所述步骤(2)中磁性微球的直径可为0.5-3μm，优选为2.8μm。
所述步骤(3)中优选的用于对条形码DNA进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：3所示，TaqMan荧光探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：4所示。
所述抗丙型肝炎病毒核心抗原的单抗和抗丙型肝炎病毒核心抗原的多抗均可采用生物技术领域中的常规方法制备，也可直接购买。
根据文献报道(ParakW.J.,PellegrinoT,MicheelC.M.,GerionD.,WilliamsS.C.,AlivisatosA.P.Conformationofoligonucleotidesattachedtogoldnanocrystalsprobedbygelelectrophoresis.NanoLetters,2003,3(1):33-36)，使用的条形码DNA长度增加时，条形码DNA会出现卷曲，非特异地包绕在金纳米颗粒上，增加空间占位，包被效率下降。因而，本发明在生物条形码检测中缩短了单链条形码DNA的长度(60碱基)，目的是减少NP探针表面条形码DNA形成折叠或弯曲，从而减少了后续检测中存在的干扰。同时，确保这一长度仍可用于基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检测。本发明验证了60碱基的单链条形码DNA(序列表中SEQIDNo：1)的荧光定量PCR检测有效性，能得到有效的荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线(图3、图4)，显示该条形码DNA能进行荧光定量PCR检测。
此外，本发明在NP探针制备中采用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)去除未标记上的游离条形码DNA，从而避免检测结果存在假阳性。本发明可提高对核心抗原检测的灵敏度和精确度，对于与单链条形码DNA同源性较低的抗原检测具有指导意义，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明丙肝NP探针上多抗标记的斑点ELISA鉴定图；
图2为本发明丙肝NP探针上条形码DNA标记的荧光定量PCR鉴定扩增曲线；
图3为本发明生物条形码检测技术对条形码DNA重组质粒标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线；
图4为本发明生物条形码检测技术对条形码DNA重组质粒标准品的实时荧光定量PCR标准曲线；
图5为本发明生物条形码检测技术对丙型肝炎病毒核心抗原检测的灵敏度；
图6为采用未经降解游离单链条形码DNA制备的NP探针进行生物条形码检测丙型肝炎病毒核心抗原得到的荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物、条形码DNA单链和TaqMan荧光探针均由TaKaRa公司合成；纳米金颗粒购自BBisolutions公司；磁性微球颗粒购自Invitrogen公司；实验中用到的丙型肝炎病毒核心抗原和抗丙型肝炎病毒核心抗原单抗由军事医学科学院基础医学研究所制备并提供，抗丙型肝炎病毒核心抗原多克隆抗体购自Abcame公司。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、新型生物条形码检测(BCA)中NP探针的制备
1)、合成单链条形码DNA：设计并合成可用于本发明中NP探针的长度为60碱基的单链条形码DNA，其序列为：5’-TGCCCAAGCGAATGTGGAATTTGCCGATAGGCCGATGGTAGGCCAAACCAGATTTCCGGT-3’(序列表中SEQIDNo：1)。
2)纳米金颗粒上标记待检病原多抗和单链条形码DNA：
取0.5μg待检病原的多抗(该待检病原的核酸序列与SEQIDNo：1所示的条形码DNA序列无同源性加入到100μL纳米金(纳米金粒径15nm，10-30nm均可)溶液里混合均匀，之后用0.1MNaOH调节pH值至9.5；室温下振荡30min；
加入6μL100μM的单链条形码DNA(步骤1)制备得到的)，10℃下孵育16h，使溶液中的纳米金粒子和抗体、DNA能充分作用；7.5μL的2MNaCl分成6等份，在40h内等时间间隔分六次加入，使NaCl终浓度0.1M；
加入0.03mL10％BSA稳定纳米金颗粒，室温孵育30min；4℃、13000g离心30min，去除上清,用1mL0.01MPBS重悬，重复1次；0.01MPBS重悬沉淀，得到标记有待检抗原多抗和单链条形码DNA的纳米金颗粒，用PBS定容至原来的体积。
3)降解游离的单链条形码DNA：将50μLDNaseⅠ(100U)、50μL的25mMMgCl2、50μL小牛血清和250μL的0.01MPBS混合均匀，加入100μL步骤2制备的标记有多抗和条形码DNA的纳米金颗粒PBS重悬液中，37℃孵育2h，4℃、13000g离心10min，去除上清，0.01MPBS重悬沉淀得到NP探针溶液，4℃保存。
用上述方法制备了包被有抗丙型肝炎病毒核心抗原多抗和单链条形码DNA的NP探针(简称丙肝NP探针)。用斑点ELISA方法鉴定丙肝NP探针的多抗标记效果，结果如图1所示[a为阴性对照(具体为封闭液)，b为阳性对照(具体为抗丙型肝炎病毒核心抗原多抗，c、d为丙肝NP探针(重复样)]，证实丙肝NP探针上已标记有抗丙型肝炎病毒核心抗原多抗。
用荧光定量PCR鉴定丙肝NP探针的条形码DNA标记效果，结果如图2所示(曲线a、b、c、d、e、f分别为109copies/μL、108copies/μL、107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL的条形码DNA重组质粒标准品，曲线g为丙肝NP探针，曲线k为荧光定量PCR体系空白对照(具体为ddH2O))，结果证实丙肝NP探针上标记有条形码DNA(SEQIDNo：1表示)，其浓度为109copies/μL。
实施例2：生物条形码检测(BCA)中MMP探针的制备
缓冲液A(BufferA)：6.18gH3BO3(MW61.83)添加到800mL蒸馏水中，用5MNaOH调节pH值到9.5，使用蒸馏水定溶至1L。
缓冲液B(BufferB)：在缓冲液A中溶解39.64g(NH4)2SO4，用NaOH调节pH值至9.5，最后用缓冲液A定溶至100mL。
缓冲液C(BufferC)：0.88gNaCl(MW58.4)、0.5％(W/V)BSAto80mL0.01MPBS(pH7.4)，充分混匀后定溶至100mL，用0.01MPBS(pH7.4)调节pH7.4。
缓冲液D(BufferD)：0.88gNaCl(MW58.4)、0.1％(W/V)BSA到80mL0.01MPBS(pH7.4)充分混匀后用0.01MPBS(pH7.4)定溶至100mL。
把165μL磁珠(直径为2.8μm，0.5-3μm均可，2×109beads/mL)移入EP管后置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清和除去磁场；加入1mLBufferA重悬磁珠，反复吹打；重新置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清；除去磁场；之后加入100μL待检病原的单抗(待检病原与实施例1相同)和50μL的BufferA，反复涡旋；加入100μLBufferB之后涡旋振荡，37℃孵育12-18h；重新置入磁场，使磁珠沉淀，去除上清；除去磁场；加入1mLBufferC37℃孵育1h；再次置入磁场，使磁珠再次完全沉淀，去除上清和磁场；加入1mLBufferD，涡旋5-10sec；置入磁场，使磁珠完全沉淀，去除上清和除去磁场；之后重复用1mLBufferD洗涤；最后用240μL的BufferD重悬磁珠，使磁珠浓度为20mg/mL，得到包被有待检病原单克隆抗体的MMP探针溶液。4～8℃保存。
本例对应实施例1制备得到了包被丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体的MMP探针(简称丙肝MMP探针)。
实施例3：新型生物条形码检测中三明治检测复合物的形成
将1μL实施例2得到的MMP探针溶液(磁珠浓度20mg/mL)加入10μL待检病原(待检病原与实施例1相同)核心抗原(1pg/mL)中，37℃剧烈振荡1h；放入磁场中固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗磁珠溶液，除去未连接的抗原和其它杂质；
磁珠溶液中再加入2μL实施例1制备得到的NP探针溶液，常温剧烈振荡1h；放入磁场，用200μLPBST反复冲洗7次，除去未连接的NP探针；反复冲洗后用50μL超纯水溶解，得到MMP-核心抗原-NP三明治复合物，复合物中的条形码DNA可用于待检病原的定性、定量检测。
本例对应丙型肝炎病毒制备得到了MMP-HCV核心抗原-NP三明治复合物，复合物中的条形码DNA将用于实时荧光定量PCR检测，以鉴定待检物——HCV核心抗原的存在。
实施例4：条形码DNA的实时荧光定量PCR检测
本实施例以丙型肝炎病毒(HCV)检测为例说明本发明生物条形码(BCA)检测技术，对实施例1和3的条形码DNA进行基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检测。
检测中25μl反应体系为：2×PCR缓冲液12.5μl，上游引物1μL(10μM)，下游引物1μL(10μM)，TaqMan荧光探针1μL(5μM)，MMP-HCV核心抗原-NP三明治复合物样品1μL，ddH2O8.5μL。
反应条件为：95℃预热3min，94℃10s，53℃10s，72℃10s，共40个循环，每一循环退火结束时收集HEX荧光信号。
上游引物：5’-TGCCCAAGCGAATGT-3’(序列表中SEQIDNo：2)
下游引物：5’-ACCGGAAATCTGGTTTGG-3’(序列表中SEQIDNo：3)
TaqMan荧光探针：5’-HEX-TTGCCGATAGGCCGATGGTAG-ECLIPSE-3’(序列表中SEQIDNo：4)
结果：对条形码DNA重组质粒的实时荧光定量PCR扩增曲线如图3所示(曲线a、b、c、d、e、f、g、h、i、j分别为109fg/mL、108fg/mL、107fg/mL、106fg/mL、105fg/mL、104fg/mL、103fg/mL、102fg/mL、101fg/mL和100fg/mL，曲线k为阴性对照(具体为ddH2O))，对条形码DNA重组质粒标准品进行实时荧光定量PCR的标准曲线如图4所示(标准曲线方程为y＝-2.734x+38.785)，对丙型肝炎病毒核心抗原进行生物条形码检测的荧光定量PCR扩增曲线如图5所示(曲线a、b、c分别为100fg/mL、10fg/mL、1fg/mL丙型肝炎病毒核心抗原，曲线k为荧光定量PCR体系空白对照(具体为ddH2O))，上述检测结果表明利用本发明的新型生物条形码检测方法对丙型肝炎病毒核心抗原的检测灵敏度可达1fg/mL。
实施例5：NP探针制备中降解游离条形码DNA对检测的影响
用实施例4相同的方法对丙型肝炎病毒核心抗原进行检测，实验例使用实施例1经过“步骤3)降解游离条形码DNA”的NP探针，对照例2使用实施例1步骤2)得到的标记有抗体和DNA的纳米金颗粒(未经过“步骤3)降解游离条形码DNA”)作为NP探针。
采用未经“步骤3)降解游离条形码DNA制备的NP探针进行检测，结果如图6所示(曲线a、b、c分别为100ng/mL、100pg/mL、0pg/mL丙型肝炎病毒核心抗原，K为荧光定量PCR体系空白对照(具体为ddH2O))。采用经“步骤3)降解游离条形码DNA制备的NP探针进行检测的结果见图5。以上结果表明，采用步骤3)降解游离条形码DNA的NP探针进行新型生物条形码检测时，可提高检测特异性。
实施例6、生物条形码(BCA)检测试剂盒
将实施例1中的NP探针、实施例2中的MMP探针以及实施例4中用于实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan荧光探针共同包装即得到新型生物条形码检测试剂盒。试剂盒中NP探针包被有被检病原多抗和序列表中SEQIDNo：1所示的条形码DNA。理论上，该试剂盒适于所有与该条形码DNA无核酸序列同源性的被检病原的抗原检测。
该新型生物条形码检测试剂盒中用于对条形码DNA进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：3所示；用于对条形码DNA进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan荧光探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：4所示。
该新型生物条形码检测试剂盒可参考实施例4条形码DNA的实时荧光定量PCR检测方法使用。
检测中25μl反应体系为：2×PCR缓冲液12.5μl，上游引物1μL(10μM)，下游引物1μL(10μM)，TaqMan荧光探针1μL(5μM)，实施例3得到的“MMP-核心抗原-NP”三明治复合物样品1μL，ddH2O8.5μL。
依据以上试剂盒设计思路，将包被有抗丙型肝炎病毒核心抗原多抗和条形码DNA的NP探针、包被有抗丙型肝炎病毒核心抗原单抗的MMP探针以及用于实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan荧光探针共同包装，得到的为丙型肝炎病毒核心抗原的新型生物条形码检测试剂盒。
Claims (10)
1.生物条形码检测中与NP探针联结的单链条形码DNA，其特征在于，所述条形码DNA长度少于90碱基至仍适用于荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，优选为60个碱基。
2.根据权利要求1所述的单链条形码DNA，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。
3.一种生物条形码检测中的NP探针，其特征在于，其金纳米颗粒上包被有权利要求1或2所述的单链条形码DNA。
4.根据权利要求3所述生物条形码检测中的NP探针，其特征在于，金纳米颗粒上还包被有被检病原的多抗，所述被检病原的核酸序列与单链条形码DNA无同源性，例如为丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒。
5.一种生物条形码检测中NP探针的制备方法，包括以下步骤：
1)合成权利要求1或2所述的单链条形码DNA；
2)在金纳米颗粒上分别标记被检病原的多抗和所述单链条形码DNA；
3)用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)降解未标记上的游离单链条形码DNA；
得到NP探针。
6.根据权利要求5所述生物条形码检测中NP探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的过程为：将1体积的DNaseⅠ(100U)、1体积的25mMMgCl2、1体积的小牛血清和5体积的0.01MPBS混合均匀，加入2体积的步骤2)得到的标记有多抗和DNA的纳米金颗粒PBS重悬液中，37℃孵育2h，4℃、13000g离心10min，去除上清，0.01MPBS重悬沉淀得到去除了游离单链条形码DNA的NP探针，4℃保存。
7.一种生物条形码检测中MMP-核心抗原-NP三明治复合物，是将权利要求4所述NP探针、MMP探针和被检病原抗原通过抗原、抗体作用制备得到，所述MMP探针为标记有抗被检病原单抗的磁珠。
8.一种生物条形码检测试剂盒，包括权利要求3或4所述NP探针、标记有抗被检病原单抗的MMP探针以及用于实时荧光定量PCR检测的引物对和TaqMan荧光探针。
9.根据权利要求8所述生物条形码检测试剂盒，其特征在于，用于实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：3所示，TaqMan荧光探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：4所示。
10.根据权利要求8或9所述生物条形码检测试剂盒，其特征在于，所述被检病原为丙型肝炎病毒，其中包含：包被有抗丙型肝炎病毒核心抗原多抗和条形码DNA的NP探针、包被有抗丙型肝炎病毒核心抗原单抗的MMP探针以及用于实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan荧光探针，得到丙型肝炎病毒核心抗原生物条形码检测试剂盒。
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