CN113355398A - 一种基于BCA技术以Au NP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法 - Google Patents

一种基于BCA技术以Au NP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，具体方法是基于生物条形码扩增方法BCA(bio‑bar‑code amplification)，采用硫醇化物为条形码，采用金纳米颗粒为基质对目标DNA或目标蛋白质进行MALDI MS检测的一种新型分析检测方法。该方法具有高灵敏度、高特异性、高电离效率、操作简易等特点，应用前景广阔。

Description

一种基于BCA技术以Au NP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质 的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域中的检测方法，特别是涉及一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法。
背景技术
自从1985年引入聚合酶链反应(PCR)发明以来，PCR已经对生物学和医学界产生了重大影响。然而，PCR通常因其复杂，昂贵，耗时且劳动密集的程序以及PCR扩增后的窄靶DNA定量范围而受到不满。核苷酸检测分析方法有放射性标记、分子荧光团、化学发光、电化学标签以及最近的基于纳米结构的标签等方法。虽然一些基于纳米结构标签的分析检测方法的敏感性接近PCR的敏感性，但到目前为止任没有达到PCR提供的高灵敏度水平。
生物条形码扩增方法BCA(bio-bar-code amplification)是一种无PCR的靶DNA扩增方法，该方法依赖于新型双组分寡核苷酸修饰的金纳米颗粒(Nanoparticle NP)和单组分寡核苷酸修饰的磁性微粒(Magnetic MP)，随后使用基于芯片的检测方法以条形码的形式检测扩增的目标DNA或目标蛋白质。相关文献报道可以用生物条形码扩增(BCA)方法检测低阿托摩尔(10-18M)水平的前列腺特异性抗原(PSA)。
生物条形码技术是指通过构建“金纳米颗粒-目标物-磁纳米颗粒”三明治结构,通过磁场作用将结合在金纳米颗粒表面的大量相同序列的寡聚核苷酸洗脱下来后进行进一步的信号放大,从而实现对目标物的间接或直接检测。该技术在蛋白质、核酸等生物大分子检测方面显示出极大的优势以及较高的灵敏度，为分子生物学、分子诊断、临床治疗、食品有毒物质检测等领域提供了非常有利的平台。
目前,国内外测定核苷酸的方法主要有离子交换液相色谱法、反相液相色谱法、亲水色谱法和毛细管电泳法等。其中,离子交换色谱法具有较高的分离效率,但需要对分离柱进行平衡(再生),分析时间较长；亲水作用色谱法虽然对于分离亲水性代谢产物给予很大希望,但对于相对分子质量相近的核苷酸糖的分离仍是个挑战。质谱法(MS)是通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行结构分析和含量测定。随着20世纪80年代两种软电离方式——基质辅助激光解吸附电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)的出现,使得质谱法能用于分析高极性、难挥发和热不稳定的生物样品。通过对生物样品分子进行轰击获得多个碎片离子,根据其质荷比进行定性或定量分析。质谱，还具有固有多路复用能力的工具，通过同时为多种分析物提供质量分辨，可以避免使用生物芯片成像技术中信号读数的限制，图案化阵列的必要性以及表面束缚识别元件的复杂性等等。然而，对于具有低电离效率和容易碎裂的分子(例如DNA)，在基于芯片的生物诊断中可重复地实施这种技术是极具挑战性的。
NP的新兴生物化学应用包括用于生物反应的催化剂，药物包封或靶向，聚合分析，可调量子标记，多重编码量子标记，表面增强拉曼光谱以及质谱分析等，现在统称为纳米生物技术。金纳米粒子作为MALDI基质与常规有机酸基质相比，分析物比率降低了14个数量级,故AuNP基质为更佳的基质。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS新型检测方法。为了使用MALDI测定目标DNA或目标蛋白质，我们利用BCA技术，将目标DNA或目标蛋白质用硫醇化物进行编码，作为生物条形码来间接测定，并使用金纳米粒子(AuNP)作为基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的基质。因为硫醇化物在施加脉冲激光的条件下容易解析，所以可以进行MALDI MS分析。硫醇化物除了有条形码的作用外，也还可以阻止生物分子和基质表面之间非特异性相互作用。
通过使用基于金纳米微粒为基质的MALDI MS检测方法以硫醇化物为条形码的形式检测扩增的目标DNA或目标蛋白质与使用有机基质的常规UVMALDI相比，AuNPMALDI MS的基质与分析物的摩尔比(M/A)表明AuNP的高效电离过程，其中AuNP可具有每个激光脉冲下电离一种以上分析物的能力，或者说在激光脉冲之间再生成基质——“活性”状态的可能性更大。对于本发明由于Au-S键合能力非常强，从而保证了MALDI MS检测的灵敏度。
本发明的技术方案在于提供一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，所述MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法采用硫醇化物为条形码，采用金纳米颗粒为基质，对目标DNA或目标蛋白质进行MALDI MS分析检测。
所述检测方法具体包括如下步骤：
(1)双组分寡核苷酸修饰的金纳米颗粒(NP)的制备：
通过柠檬酸盐还原HAuCl4制备金纳米颗粒。将3'-硫醇化目标DNA或目标蛋白质特异性寡聚物加入到上述金纳米颗粒中，并在室温下温和摇动，经过老化过程，加入硫醇化物分子并继续轻轻摇动，制得双重修饰的金纳米颗粒(NP)，即NP探针；NP探针在使用之前，将其在低温(4℃)下旋转30min，并用缓冲液(缓冲液中氯化钠和磷酸盐的质量比是3:1，溶液pH值为7.0)冲洗三次以除去未与金纳米颗粒结合的特异性寡聚物；NP探针应储存在过量的特异性寡聚物中，需要使用时需经上述纯化处理后再使用。
(2)单组分寡核苷酸修饰的磁性颗粒(MP)的制备：
用DMSO(二甲基亚砜)洗涤胺官能化磁性微粒，然后使用异双功能交联剂SMPB(琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)与5'-硫醇化寡核苷酸链偶联；在此过程中，可以用钝化DNA未反应的胺位点以使非特异性结合最小化；将MP在4℃下储存在缓冲液(缓冲液中氯化钠和磷酸盐的质量比是3:1，溶液pH值为7.0)中；在用于测定之前，需要进行纯化处理，即用缓冲液(缓冲液中氯化钠和磷酸盐的质量比是3:1，溶液pH值为7.0洗涤MP三次。
(3)三明治夹心复合物的形成：
夹心复合物通过碱基配对的原理形成。在25℃温育以允许在MP和目标靶DNA之间尽可能完全杂交；在磁力分离器上将MP-目标复合物分离出来，并用缓冲液洗涤三次；然后将MP-目标复合物再分散于缓冲液中，再加入NP溶液进行杂交，合成具有三种组分的MP-目标物-NP三明治夹心复合物。将三明治夹心复合物与未反应的NP一起通过磁力分离器拉到反应容器的壁上，最后用缓冲液冲洗反应容器壁重复该洗涤步骤数次，以除去杂交反应中未与靶标特异性结合的NP。最后，除去磁场，将纳米纯水加入到反应容器中，并将管持续加热以使三明治夹心复合物去除杂质以释放NP探针。
(4)硫醇化物条形码的释放：
将灭菌水加入到上述三明治夹心复合物种并剧烈震荡25-35min，使硫醇化物条形码去杂交，用磁铁固定MP探针，收集的上清液中即含硫醇化物条形码。
(5)AuNP基质的制备：
采用“一锅法”将HAuCl4·3H2O溶解于四氢呋喃(THF)后用冰浴冷却，随后将通过BCA得到的硫醇化物条形码缓慢加入到反应体系，并低速搅拌至溶液颜色从黄色将变成无色；等到溶液变澄清后，一次性快速加入NaBH4并持续搅拌1.5-2.5h；移去冰浴、陈化，去除沉淀溶液浓缩后加入冰水，收集沉淀并用甲醇反复清洗，最后用水重新分散即得产物。
(6)MALDI MS分析硫醇化物间接测定目标DNA/蛋白质：
将步骤5制得的Au NP基质应用于MALDI“平板”，随后在环境温度25℃下干燥6h，并使用三氟乙酸(TFA)进行目标洗涤；在正离子反射模式下在质谱分析中分析检测所有目标样品。
进一步地，所述步骤(1)和步骤(2)中还包括分别对NP探针和MP探针进行纯化处理。
进一步地，如权利要求1所述的一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)中金纳米颗粒通过柠檬酸盐还原HAuCl4制备而得。
进一步地，所述步骤(1)中金纳米颗粒的粒径为：13-15nm。
进一步地，所述步骤(1)中硫醇化物为丙硫醇。
进一步地，所述步骤(2)中磁性颗粒的粒径为：1-3μm。
进一步地，所述步骤(3)中目标靶为DNA或蛋白质中的一种。
进一步地，，所述步骤(4)灭菌水为120℃处理后的蒸馏水。
进一步地，所述步骤(5)中低速搅拌的速度为90-110r/min，搅拌时间为1.5-2.5h。
本技术方案与背景技术相比，具有如下有益效果：
1.本发明通过生物条形码检测技术(bio-bar code assay,BCA)，将特异性抗体或核酸探针标记在金纳米颗粒上,以识别待检的蛋白分子或核酸分子,然后针对金纳米颗粒上的条形码DNA进行检测；生物条形码检测技术对蛋白的检测敏感性极高,最低检出限达到attomolar(10-18aM)水平；
2.本发明BCA可以做定量分析，MALDI MS可以做定性分析，两者结合可对核酸/蛋白质进行定性定量分析，BCA同时也能起到提纯效果，使得MALDI测试更加精准；
3.本发明生物条码的自组装是基于纳米颗粒上探针之间的特异性杂交反应，对于不同目标DNA或目标蛋白质，选用的硫醇化物条形码不同，可以达到特异性识别，具有高特异性；
4.本发明相对于PCR技术操作相对简单，环境要求较低，耗时较少；
5.本发明以金纳米颗粒为基质比传统有机基质具有较高的电离效率，金纳米材料对有机化合物、多肽和聚合物的低分子量分析物的检测具有显着的敏感性；AuNP可具有每个激光脉冲下电离一种以上分析物的能力，或者说在激光脉冲之间再生成基质-“活性”状态的可能性更大。
6.为了使用MALDI检测目标DNA或目标蛋白质，我们利用BCA技术，将相关目标DNA或目标蛋白质用硫醇化物进行编码，作为生物条形码来间接测定。因为硫醇化物在施加脉冲激光的条件下容易解吸，所以可以进行MALDI MS分析。除了条形码的作用外，硫醇化物也可以阻止生物分子和基质表面之间非特异性相互作用。
7.与常规MALDI MS检测基质相比，Au NP基质无法通过激光辐射电离，仅引起基质局部温度升高。热量传递至基质颗粒表面的分析物，实现其有效的解吸与离子化。通过AuNP基质分析小分子有效地解决了有机基质离子干扰的问题，同时提高了测试样品的均一性。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1a为本发明NP探针和MP探针的制备原理图；图1b为本发明MP-目标-NP三明治夹心复合物的形成、硫醇化物条形码的释放、Au NP基质的制备及MALDI MS分析硫醇化物间接测定目标DNA/蛋白质原理图。
1.金纳米颗粒
2.磁性纳米颗粒
3.与金纳米颗粒结合的硫醇修饰的寡核苷酸
4.与磁性纳米颗粒结合的硫醇修饰的寡核苷酸
5.硫醇化物条形码
6.目标DNA或目标蛋白质
7.磁铁
图2为实施例中MALDI-TOF MS测量大肠杆菌质谱图；
图3为实施例中大肠杆菌质荷比与TOF飞行时间有关时间稳定性的关系。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将通过实施例对本发明的内容进行更详细地描述，但本发明的保护范围并不受限于这些实施例。
实施例1
一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测大肠杆菌蛋白质的方法，本实施例对大肠杆菌蛋白定性及时间稳定性进行分析，具体包括以下步骤：
(1)双组分寡核苷酸修饰的金纳米颗粒(NP)的制备：
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，首先将配制好的100ml浓度为2mM的三水合氯金酸加入到圆底烧瓶中，加热至沸腾后，迅速倒入10mL浓度为50mM的柠檬酸钠溶液，待溶液颜色由黄色变澄清、继而变黑色；加入硫醇化物丙硫醇分子并继续轻轻摇动，持续加热30min后，停止加热，冷却至室温，制得AuNPs探针；然后向已加入1mLAuNPs溶液的离心管中加入300mL浓度为200μg/mL的大肠杆菌蛋白质，并在室温下温和摇动，并在4℃下反应16h进行老化，每隔4h需要手动摇匀一次；反应完全后将金纳米颗粒(NP)在低温(4℃)下旋转30分钟，缓慢加入提前制备好的盐化缓冲液(氯化钠与磷酸盐比例3:1，pH值为7.0)，以除去未结合在AuNPs探针上的蛋白质，分3-5次加入盐化缓冲液，以保证漂洗完全；将该制得的NP探针保存于4℃下备用，在用于测定之前，用缓冲液洗涤三次。
(2)单组分寡核苷酸修饰的磁性颗粒(MP)的制备：
称取10mg磁珠移入EP管并置于磁场中，使用1mL浓度为0.1M的碳酸盐缓冲液(1.59gNa2CO3,2.93gNaHCO3,1000ml蒸馏水)涡旋混合或者反复吹打，使磁珠完全沉降下来，除去上层清液；向磁珠中添加2ml的抗体和异双功能交联剂，在涡旋状态下缓慢加入；再向其加入10ml反应缓冲液(氯化钠与磷酸盐比例3:1，pH值为7.0)，涡旋混合或者反复吹打，在37℃下混合过夜孵育，确保均匀混合；最后将离心管放置在磁力架上，静止1min后，移去上层清液；将MP在4℃下储存在缓冲液(氯化钠与磷酸盐比例3:1，pH值为7.0)中，在用于测定之前，用缓冲液(氯化钠与磷酸盐比例3:1，pH值为7.0)洗涤三次。
(3)三明治夹心复合物的形成
在25℃温育，在管磁分离架上将MP-目标复合物分离出来，并用缓冲液洗涤三次；然后将MP-目标复合物再分散于缓冲液中；再将NP溶液加入管中进行杂交，合成具有三种组分MP-目标-NP的三明治夹心复合物；经过磁力分离及缓冲液洗涤，将纳米纯水加入到反应容器中，并将管持续加热以使夹心复合物去除杂质以释放NP探针。
(4)释放硫醇化物条形码
将灭菌水加入到三明治夹心复合物中并剧烈震荡30min，使条形码去杂交，用磁铁固定MP探针，收集的上层清液中含硫醇化物条形码。
(5)AuNP基质的制备：
采用“一锅法”将HAuCl4·3H2O溶解于四氢呋喃(THF)后用冰浴冷却，随后将通过BCA得到的硫醇化物条形码缓慢加入到反应体系，并以100r/min的搅拌速度搅拌2h至溶液颜色从黄色将变成无色；等到溶液变澄清后，一次性快速加入NaBH4并持续搅拌2h；移去冰浴、陈化，去除沉淀，溶液浓缩后加入冰水，收集沉淀并用甲醇反复清洗，最后用水重新分散即得产物。
(6)MALDI MS分析硫醇化物间接测定大肠杆菌蛋白质：
质谱定性检测：将AuNP基质应用于MALDI“平板”，随后在环境温度下干燥6h，并使用三氟乙酸(TFA)进行目标洗涤；采用MALDI-TOF MS质谱检测大肠杆菌蛋白质，结果如图2所示。图2显示的质荷比为9534.1，7274.3，6255.9，5381.4，是大肠杆菌的特征峰，其所测的质谱峰信号强度高且杂峰少。
质谱时间稳定性检测：每隔一个小时进行测量，并记录其飞行时间(ns)相关情况，结果如图3所示。图3显示质荷比为5381.4左右的特征峰，其质荷比与飞行时间随时间的关系，由图可知，其特征峰质荷比及飞行时间变化不大，均在误差范围内，说明该方法所测得的大肠杆菌质谱数据的稳定性较好，真实性更强。
以上所述，仅作为说明的目的，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的修改，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，其特征在于，所述MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法采用硫醇化物为条形码，采用金纳米颗粒为基质，对目标DNA或目标蛋白质进行MALDI MS分析检测。
2.一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)双组分寡核苷酸修饰的金纳米颗粒的制备：将3'-硫醇化特异性寡聚物加入到金纳米颗粒中，经过老化过程，再加入硫醇化物分子制得双组分寡核苷酸修饰的金纳米颗粒，即NP探针；
(2)单组分寡核苷酸修饰的磁性颗粒的制备：用DMSO洗涤胺官能化磁性微粒，然后使用异双功能交联剂SMPB与5'-硫醇化寡核苷酸链偶联制得单组分寡核苷酸修饰的磁性颗粒，即MP探针；
(3)三明治夹心复合物的形成：将MP探针、目标靶和NP探针经杂交合成MP-目标物-NP的三明治夹心复合物；
(4)硫醇化物条形码的释放：将灭菌水加入到步骤(3)形成的三明治夹心复合物中，并剧烈震荡25-35min使条形码去杂交，用磁铁固定MP探针，收集硫醇化物条形码；
(5)Au NP基质的制备：将HAuCl4·3H2O溶解于四氢呋喃并用冰浴冷却，再加入步骤(4)制得的硫醇化物条形码，低速搅拌至溶液颜色至无色，然后加入NaBH4搅拌1.5-2.5h、去除沉淀，溶液蒸发浓缩后加入冰水，收集沉淀并用甲醇反复清洗，最后用蒸馏水重新分散即得Au NP基质；
(6)MALDI MS分析硫醇化物间接测定目标蛋白质/DNA：将Au NP作为MALDI测定基质应用于MALDI“平板”，干燥后用三氟乙酸进行洗涤，然后在正离子反射模式下在质谱分析中测定目标。
3.如权利要求2所述的一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中还包括分别对NP探针和MP探针进行纯化处理。
4.如权利要求2所述的一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)中金纳米颗粒通过柠檬酸盐还原HAuCl4制备而得。
5.如权利要求2所述的一种基于BCA技术以AuNP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)中金纳米颗粒的粒径为：13-15nm。
6.如权利要求2所述的一种基于BCA技术以Au NP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)中硫醇化物为丙硫醇。
7.如权利要求2所述的一种基于BCA技术以Au NP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(2)中磁性颗粒的粒径为：1-3μm。
8.如权利要求2所述的一种基于BCA技术以Au NP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(3)中目标靶为DNA或蛋白质中的一种。
9.如权利要求2所述的一种基于BCA技术以Au NP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(4)灭菌水为120℃处理后的蒸馏水。
10.如权利要求2所述的一种基于BCA技术以Au NP为基质的MALDI MS检测DNA/蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(5)中低速搅拌的速度为90-110r/min，搅拌时间为1.5-2.5h。
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