JP4754213B2 - Serrs活性粒子群 - Google Patents
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Description
本発明では、また、アクリル酸エステル末端を有するかまたは不飽和の、ウレタン類、炭酸エステル類およびエポキシ類、またはシリコン−ベースモノマー類を使用することができる。対象ポリマー化合物に堅さを与える架橋剤が当業者に知られており、その例として、ジ−、トリ−、テトラ−、およびペンタ−官能性アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、アクリルアミド類、ビニル類、アリル類、およびスチレン類が挙げられるがこれらに限られない。
1)吸収されたSERRS活性染料を含む凝集金属コロイドを形成する工程;
2)適当な溶媒中で凝集金属コロイドとモノマーを混合する工程;および
3)凝集金属コロイドをカプセル化するポリマービーズ群を形成するようモノマーを重合する工程。
a)特異的に同定できるSERRS信号を持つようにビーズを生成させ、その表面を修飾してそこに前記標的分子を結合させることができる部分を付けるようにした本発明によるSERRS活性ビーズ(群)を供給する工程;
b)前記ビーズ(群)を前記試料と接触させ、試料中の前記標的分子を前記ビーズ(群)と結合させる工程;および
c)前記標的分子に結合したビーズまたはビーズ群から得られる特異的に同定できるSERRS信号を検出する前記標的分子を検出する工程。
典型例としては、プライマーが結合したビーズから、一定の距離、例えば100ヌクレオチドから2000ヌクレオチドの距離で標的核酸分子に結合するように設計された他のプライマーも利用される。これにより、当業者によく知られた、適当なDNAポリメラーゼおよび必要なdNTPs(デオキシヌクレオチドトリリン酸)を使用し、標的核酸配列が組み込まれた二重鎖分子が生成する。
1)感度:
個々のビーズは、数百万個までのSERRS活性染料標識を収容可能な別個の感知単位である。利用できる銀表面全体を染料標識できっちりと包むことができる。例えば蛍光性を有する2つの標識の密接を妨げる分子内消光メカニズムはSERRSに適合しない。したがって、1個のビーズについての信号が、低濃度で、非常に強く、迅速に検出される。
2)強固性:SERRSからの最大信号を得るために必須の凝集工程は、ビーズの形成中に行われる。したがって、ビーズを前もって調整して、長寿命で、不変で、かつ生物学的事象による影響を受けない信号を形成するポリマーによって環境から保護される。さらに、特異的検体を見出すのに用いられる感知性種はポリマー表面に共有結合で付けられる。
3)多重検出性:ビーズ群は、多数のコロイド性懸濁液の各々の中に種類の異なる染料混合物を使用することにより、および2以上の懸濁液の凝集コロイドと染料とを特定のビーズに加えることにより、“書かれた(witten)”多数のコードを含むように製造される。これにより得られるSERRSの鋭いピーク群により、分離せずにビーズ群混合物中の各々のビーズの型を認識することができる。SERRS活性表面に強く付着する発色団は全て使用できることから、蛍光の利用に比べてより簡単で、かつよい広範囲の染料化学が可能である。例えば、アゾ等の染料からのSERRS信号群のパターンは、発色団の周囲の置換に対する感度が非常によく、蛍光の場合と比較してより容易に多重標識を創ることができる。
[コロイドの調製]
LeeおよびMeiselの方法によりクエン酸塩還元コロイドを調製した(Rodger, C., Smith, W.E., Dent, G., Edmonson, M., J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1996, 5, 716; Munro, C. H., Smith, W. E., Garner, M., Clarkson, J. and White, P. C., Langmuir, 1995, 11, 3712)。全てのガラス器具は王水(3:1,塩酸:硝酸)を使用して充分に洗浄し、次いで水で充分にすすぎ、蒸留水で洗浄した。硝酸銀(90mg)を40℃の温度でで蒸留水(500mL)に溶かした。次いで、ブンゼンバーナーを使用して溶液をすばやく加熱し98℃とした。この時点でクエン酸3ナトリウム塩の1%溶液10mLを加えた。次いで、90分間98℃の温度に一定に維持されるように注意深く温度を制御した。一定温度に保った後コロイド懸濁液を冷却し、そのUV吸収スペクトルを測定した。以下に詳細を述べる実施例では、403〜410nmの範囲内に最大UV吸収を持つコロイドを使用した。
コントロールポリマーはコロイドを含まないが、ブランクポリマーはコロイドを含み染料を含まない。染料装填ポリマーはコロイドおよび染料を含む。
1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)(500mg)をMES(25mL)に含有する0.1M MES緩衝液(pH4.5)をポリマービーズに加え、25℃で2時間培養してアミン表面活性種を形成した。図1に上述のようにして調製したビーズ(1)を示す。ビーズ(1)は、凝集コロイドおよびSERRS活性染料ビーズ群(5)をカプセル化しているポリマー・シェル(3)で形成される。ポリマー・シェル(3)の表面は、アミノ表面活性種群(7)を持つように官能化され、DNAと反応させることができる。ビーズ1g当たりオリゴ(oligo)3μgを含むりん酸ナトリウム緩衝液(PH7.2)25mLを活性ビーズ群に加え、25℃で一夜反応させた。遠心分離によってビーズ群を溶液から除去し、準備してあったりん酸緩衝液(PH7.2)に再懸濁させた。
次いで、12本の遠心分離管を使用してさらに一組のペレット状の銀を調製した。ブランクビーズ群は、1管につきコロイド9.6mLおよび水2.4mLを含んでいた。染料被覆ビーズ群は、1管につき染料2.4mL(1×10-6M)およびコロイド9.6mLを含んでいた。
次いで、超音波を使用してPVAの溶液中に少量のビーズ群を懸濁させた。次いで、ビズ群を乾燥し小さなガラスディスク中に入れ、分析前真空下で乾燥し貯蔵した。次いで、5kVの電子線を使用したCameca SX100電子マイクロプローブ・マイクロアナライザーで図5のSEM像を記録した。大きなビーズは約1.5μmであり、小さなビーズは約 0.5μmである。
図6および図7は、PVA安定基質中の2つの混合物の2つの試料のラマンスペクトルである。
[ビーズの調製]
磁性ナノ粒子群の溶液50mLを、実施例1と同様の染料混合物で処理した銀コロイド50mLに加えた。次いで、ナノ粒子群の混合物を遠心分離し、実施例1と同様にビーズ工程を実行した。次いで、ビーズを実施例1と同様にオリゴヌクレオチドで官能化した。
この方法は、粒子群の磁気的性質を用いる分離と精製を組み合わせたものである。
この方法は、標識化されない銀粒子群を持つ磁性粒子群のみを含む誘導化されたビーズ(誘導ビーズ)使用時の選択性の利点を説明するものである。市販の誘導ビーズも使用することができる。
この方法は、ラマン(Raman)および蛍光を磁性ビーズ群と組み合わせた使用を説明するものである。
この実施例では、SERRSビーズ群が特定のDNA配列の検出のための標識として使用される。その構成は、SERRSビーズ群の高感度および多重化の増大した容量を示すPCR分析に基づいている。最初の蛍光スクリーン(screen)は、応答信号を生じたチューブまたはウェルを知らせることができる。このホットウェル群はSERRSによって検査され、ハイブリダイズしている実際のDNA配列または配列群が決定される。
PCRは、試料から二本鎖DNAの特定の断片を増幅するために用いられる。これは、対立遺伝子に特異的な遺伝子型解析用オリゴヌクレオチドを使用してPCRに存在する特異性を利用する。最初に、プライマー配列を選び特定の疾患に見られるもっとも普通の突然変異の変異状態を検出することができる。DNA試料の遺伝子型を分析するために、多重化増幅無反応性変異システム(multiplexed amplification refractory mutation)ARMS)で、2つのフォワードプライマーが1つのリバースプライマーと共に使用される。フォワードプライマーが、特定のプライマー用の標識として作用する異なったSERRSビーズ群上に5’−末端リンカー(linker)を介して固定化される。リバースプライマーは、5’−末端にビオチンのタグを付される。PCRの進行と共に、生成物はSERRSビーズから離れたアンプリコン(amplicon)の末端に組込まれたビオチンを持つSERRSビーズ上に構築される。別の場合として、SERRSビーズ群上でPCRを実行することが課題の場合は、標的の通常のPCRを行い、続いてSERRSビーズ群を導入することが可能である。
PCRの成功は、例えば、二本鎖DNAの量の増加に伴うSybrグリーン(図8c,64参照)の蛍光の増加によって判断することができる。PCR終了時の解離曲線を用いて、PCR産物の存在とプライマーダイマーの不存在を確認する。このように、もし増幅があれば蛍光がそれを示す。PCR時の蛍光の増加を測定するためにQPCR計器を使用することができるが、チューブを迅速に分析するために通常のプレートリーダーもPCR後に使用できる。テンプレートコントロールとナンセンスDNAを持つビーズ群との無いコントロールチューブが適当と考えられ使用することができる。
蛍光が増大したチューブがPCR産物を持つものとして、オプションで一旦同定されると、内容物がストレプトアビジン被覆スライド(図8dの66参照)上にスポットされる。これは、スライド表面のSERRSビーズ群によりビオチン化されたPCR産物を固定する。ビオチン化されたプライマーも固定される(しかし、特異的に検出できるSERRS信号を持たない)が、他の全ては一連の洗浄で除去される(これには、蛍光を発しSERRS信号と干渉する、挿入されたSybrグリーンを含む)。このようにして、ここに一連のSERRSビーズ群として、SERRSによる信号送信の準備ができたスライド表面上に固定される。
SERRSスペクトルが固定化されたSERRSビーズ群上で取られ、PCR産物を生成させるために使用された実際のプライマー配列が同定される。分離せずに混合物の成分を同定することができるSERRSの能力により、多重、例えば5重の特定のチューブからのSERRSビーズ群を眼によっても同定に使用できるが、統計学でも、多重化の程度を増大させる目的で非専門家がこれを確認することができる。
SERRSビーズ群結合分析の一例をここに示す。本例では、110塩基長配列の突然変異体濾胞性肺腺維症(Cystic Fibrosis)遺伝子を分析する。
SERRSビーズ群を、先に概要を記載した方法で、ジビニルベンゼン80およびメタクリル酸を用いて合成した。ビーズ群の表面が多数のカルボン酸基で覆われた。これらの活性酸基を使用してオリゴヌクレオチドおよび他の分子をビーズ表面に付けた。
迅速処理(Expedite)DNA合成機を使用して2つの配列を合成した。
アミンリンカーXを含む配列A:
配列A:−X−GTATCTATATTCATCATAGGAAACACCATT(配列番号1)
ビオチンBを含む配列B:
配列B:−B−GACTTCACTTCTAATGATGATTATGGGAGA(配列番号2)
3 ポリマー・シェル
5 凝集コロイドおよびSERRS活性染料ビーズ群
7 DNAと反応させることができるアミノ表面活性種群
10 ビーズ
12 オリゴヌクレオチド
14 標的配列
16 ビオチン化された配列
18 ビオチン基
20 ストレプトアビジン板またはビーズ
50 ビーズ
52 染料ラベルされたコロイド粒子群
54 オリゴヌクレオチド
60 ラベルされた産物
62 プライマーおよびビオチン化されたプライマー
64 Sybrグリーン
66 ストレプトアビジン被覆スライド
Claims (27)
- 標的分子の識別に使用する表面増強共鳴ラマン散乱(SERRS)活性ビーズであって、ポリマー・シェル内にカプセル化された多数のSERRS活性ナノ粒子群を含み、前記SERRS活性ナノ粒子群が凝集剤により凝集させてなる凝集金属コロイドおよびそれに吸収されたSERRS活性染料または染料群を含んでいて、前記ナノ粒子群の各々が同一のSERRS信号を発生するか、または異なった染料群または染料の組合せ群を備え区別することができるSERRS信号群を発生するSERRS活性ビーズ。
- 前記ポリマー・シェルまたはシェル群が次のいずれかおよびそれらの誘導体から形成される請求項1に記載のSERRS活性ビーズ:
アクリル酸およびその誘導体類(2−ブロモアクリル酸、アクリロイルクロライド、N−アクリロイルチロシン、N−アクリロイルピロリジノン)、アクリル酸エステル類(アクリル酸アルキルエステル類、アクリル酸アリルエステル類、アクリル酸ヒドロキシプロピルエステル)、メタクリル酸およびその誘導体類(イタコン酸、2−(トリフルオロメチル)プロペン酸)、メタクリル酸エステル類(メタクリル酸メチルエステル、メタクリル酸ヒドロキシエチルエステル、メタクリル酸3−スルホプロピルエステルナトリウム塩)、スチレン類((2、3、および4)−アミノスチレン、スチレン−4−スルホン酸、3−ニトロスチレン)、ビニル類(ビニルクロロホルメート、4−ビニル安息香酸、4−ビニルベンズアルデヒド、ビニルイミダゾール、4−ビニルフェノール、4−ビニルアミン、アクロレイン)、ビニルピリジン類((2、3、および4)−ビニルピリジン、3−ブテン1,2−ジオール)、ボロン酸類(4−ビニルボロン酸)、スルホン酸類(4−ビニルスルホン酸)、金属キレーター類(スチレンイミノ二酢酸)、アクリルアミド類およびその誘導体類(N−メチルアクリルアミド)、メタクリルアミド類およびその誘導体類(N,N−ジメチルアクリルアミド、N−(3−アミノプロピル)メタクリルアミド)、アルケン類(4−ペンテン酸、3−クロロ−1−フェニル−1−プロペン)、無水(メタ)アクリル酸およびその誘導体類(無水メタクリル酸)、シリコン含有モノマー類((3−メタクリロキシプロピル)トリメトキシシラン、テトラメチルジシロキサン)、ポリエン類(イソプレン、3−ヒドロキシ−3,7,11−トリメチル−1,6,10−ドデカトリエン)、アジド類(4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロ安息香酸)、チオール類(アリルメルカプタン)。 - 前記ポリマー・シェル(群)がアクリル酸エステル末端を有するか、または不飽和の、ウレタン類、炭酸エステル類およびエポキシ類、またはシリコン−ベースモノマー類から形成される請求項1に記載のSERRS活性ビーズ。
- 前記ポリマー・シェル(群)が、ジ−、トリ−、テトラ−、およびペンタ−官能性アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、アクリルアミド類、ビニル類、アリル類、およびスチレン類から選択される対象ポリマー化合物に堅さを与える架橋剤を含む先行するいずれかの請求項に記載のSERRS活性ビーズ。
- 凝集金属コロイドが、銀、金、銅または金属合金コロイド表面を含む先行するいずれかの請求項に記載のSERRS活性ビーズ。
- 凝集金属コロイドが、露出金属または金属表面に金属酸化物層を含む先行するいずれかの請求項に記載のSERRS活性ビーズ。
- 凝集金属コロイドが、その収着(吸収吸着)容量を増強するクエン酸塩またはポリリジンもしくはポリフェノールポリマーの有機被覆を含む先行するいずれかの請求項に記載のSERRS活性ビーズ。
- 凝集金属コロイドが、凝集金属コロイド粒子または粒子群の形態である先行するいずれかの請求項に記載のSERRS活性ビーズ。
- 凝集金属コロイド粒子群が4〜50nm、または25〜36nmの断面を有する請求項9に記載のSERRS活性ビーズ。
- SERRS活性ビーズが1μmより小さい断面を有する先行するいずれかの請求項に記載のSERRS活性ビーズ。
- 最も外側のポリマー・シェルが、さらにカルボン酸類、カルボン酸類の活性エステル類、アルコール類、アミン類、エポキサイド類、クロロメチルスチリール基類、ビニル基類、チオール基類、マレイミドおよびサクシンイミドのいずれかから選ばれる官能基を含むか、またはさらに連結基もしくは連結基群によって誘導化されていて、標的分子群が反応してビーズ(群)の表面に結合するかまたは一部が反応してビーズ(群)の表面(その部分に前記標的分子が結合できる)に結合する、先行するいずれかの請求項に記載のSERRS活性ビーズ。
- ビーズ群が、蛋白および抗体検出のための標識技術として使用される先行するいずれかの請求項に記載のSERRS活性ビーズ。
- 分子刷込法(molecular imprinting methods)が適用されて、鋳型手法によりポリマー・シェルに特異的な分子認識特性を付与する先行するいずれかの請求項に記載のSERRS活性ビーズ。
- SERRS活性ビーズに磁気性を与える、ポリマービーズ内にカプセル化された磁気性粒子または粒子群をさらに含む先行するいずれかの請求項に記載のSERRS活性ビーズ。
- 各ビーズが見分けることができるSERRS信号を含み、その見分けることができるSERRS信号がSERRS活性染料群および/または各ビーズ内の染料群の相対濃度を変えることにより得られる先行するいずれかの請求項に記載のSERRS活性ビーズのライブラリ。
- 次の工程を含む請求項1〜14のいずれかに記載のSERRS活性ビーズ群の調製方法:
1)吸収されたSERRS活性染料を含む凝集金属コロイドを形成する工程;
2)適当な溶媒中で凝集金属コロイドとモノマーを混合する工程;および
3)凝集金属コロイドをカプセル化するポリマービーズ群を形成するようモノマーを重合する工程。 - 試料中の標的分子を検出する次の工程を含む方法:
a)特異的に識別できるSERRS信号を持つようにビーズを生成させ、その表面を修飾してそこに前記標的分子を結合させることができる部分を付けるようにした請求項1〜14のいずれか1項に記載のSERRS活性ビーズ(群)を供給する工程;
b)前記ビーズ(群)を前記試料と接触させ、試料中の前記標的分子を前記ビーズ(群)と結合させる工程;および
c)前記標的分子に結合したビーズまたはビーズ群から得られる特異的に識別できるSERRS信号を検出する前記標的分子を検出する工程。 - 標的分子が、抗体、抗原、受容体、リガンド、または核酸分子である請求項17に記載の方法。
- 前記標的分子を結合させることができる部分が、それぞれ抗原、抗体、リガンド、受容体または相補的な核酸である請求項18に記載の方法。
- ビーズ(群)が磁気性であり、ビーズ(群)が工程b)後に容易に分離され、および/または濃縮されるものである請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中の特異的核酸を検出する次の工程を含む方法:
a)特異的に識別できるSERRS信号を持つようにビーズを生成させ、その表面を修飾し、そこに前記標的分子を結合させることができる部分を付けるようにし、前記部分が標的核酸と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである請求項1〜14のいずれか1項に記載のSERRS活性ビーズ(群)を供給する工程;
b)前記ビーズ(群)を試料と接触させ、試料中の前記標的核酸を前記ビーズ(群)と結合させる工程;
c)前記標的結合ビーズをさらにラベルされた核酸と接触させ、前記さらにラベルされた核酸をそこに特異的にハイブリダイズする工程;
d)所望により、増幅反応を遂行し、さらに所望により増幅反応が成功しているか否かを検出する工程;
e)前記ラベルされハイブリダイズした核酸結合ビーズを前記ラベルされた部分を結合できる表面と接触させる工程;および
f)前記表面に結合した前記ビーズ群から得られる特異的に識別できるSERRS信号を検出する前記標的分子の検出工程。 - 除去されるべき工程b、cおよび/またはeの未結合試薬類を除去する1または2以上の洗浄工程をさらに含む請求項21に記載の方法。
- 試料中の標的分子を検出する次の工程を含む方法:
a)特異的に識別できるSERRS信号を持つようにビーズを生成させ、その表面を修飾してそこに前記標的分子を結合させることができる部分を付けるようにした請求項1〜14のいずれか1項に記載のSERRS活性ビーズ(群)を供給する工程;
b)前記標的分子を結合させることができる部分を付けた磁性ビーズを供給する工程;
c)前記SERRS活性ビーズ(群)および磁性ビーズ(群)を試料と接触させ、試料中の前記標的分子のいずれかを前記ビーズ群と結合させる工程;および
d)前記標的分子に結合したSERRS活性ビーズまたはビーズ群から得られる特異的に識別できるSERRS信号を検出する前記標的分子を検出する工程。 - 工程c)がさらに、遠心分離または磁場により溶液からビーズ群を除去する工程を含む請求項23に記載の方法。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のSERRS活性ビーズをサンドイッチ分析法における標識として用いた標識方法。
- 検出抗原が、表面に固定化された抗体およびSERRS活性ビーズ上に被覆された抗体によって捕捉される請求項25に記載の標識方法。
- 前記表面が磁性ビーズの表面である請求項26に記載の標識方法。
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