CA2731892A1 - Sondes a diffusion raman a capsule nanometrique, methode de fabrication et utilisation - Google Patents

Description

SONDES A DIFFUSION RAMAN A CAPSULE NANOMÉTRIQUE, MÉTHODE DE FABRICATION ET UTILISATION
DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne de nouvelles sondes à capsule nanométrique pour la diffusion Raman. L'invention concerne également la méthode de préparation de ces sondes et l'utilisation de celles-ci pour le contraste et le marquage moléculaire en imagerie et spectroscopie Raman.

DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR

Les techniques de contraste et de marquage moléculaire les plus courantes appliquées en imagerie optique incluent l'absorption lumineuse, la réflexion optique et la fluorescence moléculaire. De telles techniques d'imagerie optique sont souvent utilisées pour réaliser un diagnostic médical, améliorer la sécurité civile ou les rendements de l'exploration minière, etc... Les exemples de marquage en fluorescence sont nombreux et servent par exemple à automatiser le séquençage de l'ADN.

Il existe depuis quelques années un intérêt grandissant pour développer des techniques en imagerie optique offrant des contrastes importants et caractéristiques des vibrations moléculaires. L'enjeu est de permettre une détection moléculaire explicite, tout en offrant le maximum de sensibilité. La spectroscopie Raman se place parmi les techniques les plus puissantes pour l'identification et l'analyse vibrationnelle de molécules. Cependant, sa sensibilité est l'une des plus faibles parmi les techniques spectroscopiques, ce qui fait que l'imagerie Raman et le marquage moléculaire avec des sondes Raman sont généralement peu utilisés dans les applications commerciales.

2 Le problème de sensibilité du Raman Les sensibilités des différentes techniques d'imagerie se comparent directement si on considère la section efficace pour observer un processus de diffusion de lumière. En Raman, l'intensité (en photon s"1 CM-2 ) de lumière diffusée, 1, pour une molécule est proportionnelle à la section efficace de diffusion par molécule, UR, et à
l'intensité de la lumière excitatrice, /o selon la relation : 1= 6R /o. Le aR du Raman est de entre 1029 et 10.32 cm"2, alors que les sections efficaces équivalentes en fluorescence et absorption optique sont de l'ordre de 1019-10-18 et 10.21-10"18 cm"2, respectivement [S.
Nie and S. R.
Emory, "Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface-Enhanced Raman Scattering", Science 275 1102-1106 (1997)]. Il y a donc généralement plus de 12 ordres de grandeur entre l'efficacité relative des processus Raman et ceux de l'absorption optique ou de la fluorescence. La spectroscopie Raman profite toutefois des intensités remarquables des lasers, ce qui compense pour le peu d'efficacité
de ce processus de diffusion et rend très accessible cette technique d'analyse.
Néanmoins, le manque de sensibilité pose toujours un problème pour l'imagerie Raman. L'usage de fortes intensités lumineuses des lasers vient souvent altérer les échantillons par chauffage local. Pour cela, l'acquisition d'une image Raman se fait généralement en balayant la sonde lumineuse point par point avec une intensité réduite pour éviter le chauffage. L'acquisition est ainsi longue et peu efficace. Étant beaucoup plus sensibles, la fluorescence et l'absorption/réflexion demeurent jusqu'ici des techniques de prédilection pour faire de l'imagerie optique [V. Ntziachristos, Fluorescence molecular Imaging, Annual Review of Biomedical Engineering, Vol. 8: 1-33 (2006)].

Usage de sondes optiques pour l'analyse chimique Une analyse chimique est possible en spectroscopie d'absorption et de fluorescence, mais les bandes d'absorption ou d'émission fluorescente sont larges et peu spécifiques.
Par ailleurs, les contrastes optiques en absorption sont généralement faibles pour des matériaux transparents similaires. Pour cela, il est souvent nécessaire d'ajouter des colorants optiques aux échantillons. Il y a sur le marché une vaste gamme de molécules

3 colorantes ou fluorescentes et celles-ci sont fréquemment utilisées comme agents de contraste ou comme sondes moléculaires. Cette pratique est aussi courante pour améliorer les contrastes en imagerie photoacoustique [A. De La Zerda et al.
"Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice" Nat.
Nanotechnol.
Vol. 3, No. 9, 557-562 (2008)]. Comme les émissions ou absorptions de ces agents de contraste ont des bandes très larges en longueur d'onde, il est toutefois difficile de mélanger plusieurs de ces agents et de conserver une signature propre à
chacun.

En contrepartie, un contraste moléculaire ultra spécifique est possible avec les spectroscopies Raman et infrarouge car elles offrent une information sur les transitions vibrationnelles des molécules (de 100 cm"' à 6000 cm"') et présentent une série de bandes spectrales très étroites (généralement moins de 5 cm"'). Chaque molécule ou solide possède un riche spectre de transitions vibrationnelles fines et leurs spectres infrarouge et Raman donnent précisément cette information; le spectre vibrationnel étant un peu comme l'empreinte digitale de la molécule.

Le Raman et l'absorption infrarouge sont donc très puissants pour l'analyse chimique.
Par contre, les faiblesses de l'une sont les forces de l'autre. D'une part, l'absorption infrarouge présente une bonne sensibilité ( 10-21 cm-2) par rapport au Raman a-R-1 0-29 cm-2) , mais cette efficacité est mitigée par les faibles sensibilités des détecteurs optiques dans l'infrarouge. Le Raman lui opère plutôt dans la gamme du visible (400-800 nm) où la détection par les détecteurs de type Si MCCD est très efficace et sensible (quelques photons à peine sont nécessaires pour une détection). D'autre part, la résolution spatiale est mauvaise en infrarouge et excellente en Raman car la limite de résolution dépend de la longueur d'onde (le critère de Rayleigh donne -X/2) et celles-ci sont longues en infrarouge (1-30 m) et courtes en Raman (X=400-600 nm). Des applications avec le Raman seraient idéales, mais le problème vient des sections efficaces de diffusion Raman. Celles-ci sont trop faibles pour être utile en imagerie optique ou marquage moléculaire.

4 Sondes Raman amplifiées Des solutions ont été proposées pour tenter d'améliorer la sensibilité de la détection moléculaire en diffusion Raman.

Par exemple, il a été observé que l'on pouvait avoir une amplification du signal Raman lorsque des molécules-sondes se trouvent à proximité de particules métalliques ou de surfaces rugueuses [S. Nie and S. R. Emory, "Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface-Enhanced Raman Scattering", Science, 275, 1102-1106 (1997)]. Cette exaltation du signal vient d'une amplification locale du champ électrique dans les environs immédiats d'obstacles métalliques, ce qui permet une amélioration importante de la section efficace de diffusion Raman. Pour désigner ces effets d'exaltation du signal Raman, on parle généralement de "Surface-Enhanced Raman Spectroscopy" (SERS) ou de "Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy" (SERRS). Il existe un bon nombre de sondes SERS ou SERRS
préparées à partir de particules métalliques ou de surfaces métalliques liées chimiquement ou physiquement avec une ou plusieurs molécules colorantes. Ces sondes sont parfois munies de molécules résonnantes et les amplifications possibles avec ces sondes peuvent atteindre 1014. Ces sondes sont toutefois complexes à
préparer, souvent toxiques (pour des applications in-vivo) et occasionnent des préparations ou synthèses qui sont difficiles à reproduire et coûteuses. De plus, il est difficile d'étendre ces effets à des sondes ayant des dimensions nanométriques.

Il a aussi été observé que la section efficace de diffusion Raman par des nanotubes de carbone est exceptionnelle, de l'ordre de X10-21 CM-2 [A. Jario et al.
"Structural (n, m) Determinattion of Isolated Single-Wall Carbon Nanotubes by Resonant Raman Scattering", Phys. Rev. Lett., Vol. 86, No. 6, 1118-1121 (2001); J. E. Bohn et al.
"Estimating the Raman cross sections of single carbon nanotubes", ACS Nano 4 (6), 3466-3470 (2010)]. Cette propriété est quasi unique dans le monde des nanostructures et se compare avec les sections efficaces en Raman résonnant pour un agrégat de molécules assemblées par empilement dans une structure de taille géométrique similaire. Les raisons physiques du phénomène de diffusion Raman dans les nanotubes sont assez bien comprises, car il s'agit d'un processus de résonance et l'objet comporte plusieurs atomes bien organisés (le nanotube est gros par rapport à une molécule). Le nanotube est donc en soi une sonde Raman très intéressante, mais ce matériau est un

5 mélange de différents nanotubes et il est difficile d'obtenir un échantillon de nanotubes d'un même type. Pour rendre utile comme sonde, il faudra trier les nanotubes par chiralité. Il existe des procédés de séparation des nanotubes, mais ils sont très coûteux et ne produisent que très peu de matériel [R. Martel " Sorting Carbon Nanotubes for Electronics", ACS NANO Vol. 2, No. 11, 2195-2199 (2008)]. Par ailleurs, une fonctionnalisation chimique du nanotube diminue généralement son signal Raman.
L'élaboration d'une sonde Raman à base de nanotubes est intéressante, mais il demeure difficile d'utiliser son signal Raman pour identifier clairement la sonde.
Molécules fortement actives en Raman Même si la diffusion Raman est peu efficace, il existe un grand nombre de molécules actives en Raman. Pour obtenir un signal fort, il faut nécessairement une concentration élevée des molécules dans la zone d'analyse. Malgré cette limitation, la spectroscopie Raman permet de caractériser les molécules présentes dans un milieu. Certaines molécules sont fortement actives en Raman et c'est le cas lorsqu'elles offrent des résonances dans le spectre du visible. Les exemples les plus connus sont ceux des molécules conjuguées comme le [i-carotène, la pyridine ou la rhodamine 6-G. Il s'agit dans ces cas d'une diffusion de type Raman résonnant et leurs sections efficaces (par molécule) peuvent atteindre aux longueurs d'onde de résonance _10-24-10-25 cm-2.
Malgré cela, ces sections efficaces demeurent faibles par rapport à ce qui serait nécessaire pour des applications de marquage moléculaire. Pour cela, il n'est pas possible de détecter une seule molécule avec le Raman résonnant et il faut plusieurs molécules dans la zone d'analyse avant d'atteindre un signal acceptable. De plus, ces molécules sont pour la plupart instables sous l'influence des lasers et présentent aussi une luminescence qui vient nuire ou masquer le signal Raman.

6 Il y a donc un besoin pour de nouvelles sondes utiles en imagerie optique ou pour le marquage moléculaire ayant une bonne sensibilité et pouvant être obtenue par des méthodes de préparation relativement simples et peu coûteuses.

Il y a un besoin pour de nouvelles sondes utiles en imagerie optique ou pour le marquage moléculaire, du type sondes à diffusion Raman, ayant une fluorescence diminuée et qui permettent un signal Raman fort et distinct.

Il y a un besoin pour de nouvelles sondes utiles en imagerie optique ou pour le marquage moléculaire, pour lesquelles il n'est pas nécessaire d'atteindre une concentration élevée de sondes pour obtenir un signal acceptable.

Il y a un besoin pour de nouvelles sondes utiles en imagerie optique ou pour le marquage moléculaire, du type à diffusion Raman, qui sont détectables et identifiables individuellement.

Il y a un besoin pour de nouvelles sondes utiles en imagerie optique ou pour le marquage moléculaire, qui permettent d'avoir dans la sonde plusieurs colorants différents tout en conservant une signature propre à chacun.

SOMMAIRE DE L'INVENTION

La présente invention a pour objet de surmonter les problèmes de l'art antérieur décrits ci-dessus et de répondre aux besoins identifiés précédemment. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet de nouvelles sondes à capsule pour la diffusion Raman comprenant une capsule de taille nanométrique, au moins une molécule active en Raman et au moins un groupement chimique greffé sur la capsule. L'invention a également pour objet une méthode de préparation de telles sondes et leur utilisation pour le marquage moléculaire en imagerie Raman.

Selon un premier aspect, la présente invention concerne une sonde à diffusion Raman comprenant une capsule de taille nanométrique ayant une surface externe, et au moins

7 une première molécule active en Raman. La capsule est fonctionnalisée par au moins un groupement chimique à l'extérieur de celle-ci. La première molécule active en Raman est soit insérée à l'intérieur de la capsule, soit greffée chimiquement sur la surface externe de celle-ci, ou bien les deux à la fois.

Lorsque la molécule active en Raman est greffée sur la surface externe de la capsule, il est possible que cette molécule active soit insérée dans le groupement chimique. En d'autre terme, la molécule active peut être fixée sur la surface externe de la capsule, avec le groupement chimique lui-même lié à la molécule active.

Selon une autre réalisation possible de l'invention, la sonde comprend au moins une deuxième molécule active en Raman, différente de la première molécule active en Raman. La sonde peut aussi comprendre plusieurs molécules différentes actives en Raman.

Selon une autre réalisation possible de l'invention, la sonde est fonctionnalisée par plusieurs groupements chimiques, ceux-ci pouvant être identiques ou différents.

Selon un second aspect, la présente invention concerne une méthode de préparation d'une sonde à diffusion Raman telle que décrite ci-dessus. La méthode comprend une première étape de nettoyage et ouverture de la capsule de taille nanométrique sous forme brute. Une deuxième étape consiste soit en l'encapsulation de la molécule active en Raman dans la capsule, soit en l'association chimique de la molécule active à la surface externe de la capsule, soit la combinaison de l'encapsulation et de l'association chimique, pour former un complexe capsule-molécule active. Une troisième étape consiste en la fonctionnalisation de la capsule par le groupement chimique à
l'extérieur de celle-ci. Il est à noter que la troisième étape pourrait être effectuée avant la deuxième. Il serait donc possible de fonctionnaliser la capsule par le groupement chimique avant de former le complexe capsule-molécule active.

8 Selon un troisième aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une sonde à
diffusion Raman telle que décrite ci-dessus pour le marquage moléculaire en spectroscopie et en imagerie Raman.

L'invention et ses avantages ressortiront mieux de la description détaillée et des exemples qui suivent illustrant des modes de réalisations préférés de l'invention.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

Les Fig. 1A, 1B et 1C représentent schématiquement des sondes à diffusion Raman selon trois modes de réalisation préférés de l'invention.

La Fig. 2 représente schématiquement les différentes étapes du procédé de préparation de sondes à diffusion Raman selon un mode de réalisation préféré de l'invention.

La Fig. 3 représente le spectre d'absorption de complexes de a-sexithiophènes dans des SWNT dans le diméthylformamide (DMF).

La Fig. 4 représente les spectres Raman complets d'une poudre de complexes de a-sexithiophènes dans des SWNT à différentes longueurs d'onde d'excitation (488, 514, 633 et 782 nm).

La Fig. 5 représente les spectres Raman d'une poudre de complexes de a-sexithiophènes dans des SWNT comparés à ceux de SWNT bruts. Les longueurs d'onde d'excitation sont 488, 514, 633 et 782 nm. Le spectre des nanotubes dans lesquels sont insérées les molécules d'a-sexithiophènes est représenté en gris (spectre du haut) et le spectre des nanotubes bruts est représenté en noir (spectre du bas).
La Fig. 6 représente l'image obtenue par microscopie de champ de force atomique (AFM) (à gauche sur la figure) d'un échantillon de SWNT dans lesquels sont encapsulés des a-sexithiophènes déposé sur un substrat de silicium (voir cercle). L'image AFM
révèle un fagot de nanotubes fonctionnalisés ayant environ 3 nm de haut. La Fig. 6

9 présente également le spectre Raman (à droite sur la figure) d'un petit agrégat de deux ou trois sondes localisées dans le même échantillon. La longueur d'onde d'excitation est de 633 nm.

La Fig. 7 représente un spectre Raman de la sonde DPP2@SWNT mesuré à 633 nm et le spectre du produit de fabrication préparée avec des nanotubes sans avoir pratiqué
l'étape d'ouverture des nanotubes. Ce test en Raman a permis de vérifier le protocole de fabrication de la sonde et confirmer l'encapsulation de la molécule.

La Fig. 8 représente des spectres Raman pendant les étapes de fabrication de la sonde DPP2@SWNT juste après l'encapsulation et après la fonctionnalisation avec un groupement R. Les spectres Raman sont mesurés à 633 nm.

La Fig. 9 représente les spectres Raman des sondes DPP3@SWNT, DPP2@SWNT à
633 nm et la sonde DPP1@SWNT à 514nm.

La Fig. 10 représente le spectre Raman de la sonde Méthylène Violet B@SWNT
mesuré
à 633 nm et compare celui-ci avec un spectre Raman du méthylène violet B en poudre mesuré à 488 nm.

La Fig. 11 représente le spectre Raman de la sonde DTDCI@SWNT mesuré à 633 nm et compare celui-ci avec le spectre Raman du DTDCI en poudre mesuré à 488 nm.
La Fig. 12 représente le spectre de la sonde Bleu de Toluidine attaché par liens covalents à la surface externe de nanotubes double paroi (DWNT). Le spectre en dessous est celui des DWNT en absence de fonctionnalisation chimique.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION

Définitions Le terme "capsule" se rapporte à la structure de base formant la sonde selon l'invention.
La capsule est la structure de base à laquelle est associée la molécule active en Raman.

Cette structure de base ou capsule est aussi fonctionnalisée à l'extérieur sur la surface externe de celle-ci par des groupements chimiques. La capsule peut être tout contenant de taille nanométrique de forme sphérique, cylindrique, conique, ou autre, connue de l'homme de l'art. Par exemple, sans toutefois se limiter à ces exemples, la capsule peut-5 être un nanotube de carbone (monoparoi, double paroi, ou multiparois), un nanotube de nitrure de bore (nanotube BN) ou un fullerène (C60, C70 etc...).

L'expression "taille nanométrique" se rapporte à la taille de la capsule définie ci-dessus.
Plus particulièrement cette expression réfère au diamètre de la structure de forme sphérique, cylindrique, conique ou autre formant la capsule. Ce diamètre est en général

10 de l'ordre de 0,3 nm à 5 nm. La longueur de la capsule peut varier, selon l'application, de 0,5 nm à 1 mm.

Les expressions "molécules actives en Raman", "molécules actives pour la diffusion Raman", "molécules actives", "molécules colorantes" et "colorants" sont utilisées indépendamment pour définir les molécules actives qui sont encapsulées dans la capsule utilisée pour former la sonde selon l'invention, ou greffées à
l'extérieur de celle-ci. La molécule doit être active en diffusion Raman, c'est-à-dire qu'elle doit pouvoir être détectée et identifiée par spectroscopie Raman. Un fort signal Raman est aussi possible si la molécule offre une résonance optique dans la gamme des excitations laser disponibles par l'appareil Raman qui est utilisé. Une grande variété de molécules actives est donc envisageable et une personne versée dans le domaine de l'invention saura identifier quelle molécule utiliser. Par exemple, sans toutefois se limiter à
ces exemples, les molécules actives peuvent être des dérivés du type oligothiophènes, des caroténoïdes tel que par exemple la n-carotène, le méthylène violet B de formule le Bleu de Toludine, le "Fast Black K sait" (FBK), le DTDCI de

11 formule S Les dérivés du type oligothiophènes sont par exemple des dérivés du 3,6-dithiophen-2-yl-2,5-dihydro-pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4-dione (dérivés DPP). A ceux-ci s'ajoutent toutes les molécules actives en Raman de résonance dans le visible comme les chromophores ou oligomères à base de conjugaison de type n. En guise d'exemples, il y a notamment les oligomères de polymères conjugués comme les carbazoles, la polyaniline, les polyfuranes, les polypyrroles, les paraphénylènes ou polyhétéro-atomic vinylènes, etc. Il y a aussi les grosses molécules polyaromatiques comme les fullerènes, les dérivés de pentacène, d'anthracène, de perylène, de naphtalène etc. et les systèmes bien connus en résonance Raman comme les benzotriazoles (e.g. 6-tolyltriazole), rhodamines (e.g.
rhodamine 6G), pyrolines (e.g. pyroline G et thiopyronine), etc...

L'expression "groupement chimique" se réfère aux groupements greffés à
l'extérieur de la capsule. Les groupements chimiques peuvent être soit greffés directement sur la surface externe de la capsule, soit greffés à la molécule active en Raman lorsque celle-ci est greffée à l'extérieur de la capsule. Les groupements chimiques sont des groupements qui vont faciliter la dispersion ou la solubilité de la sonde dans un milieu liquide, ou bien ils vont permettre la compatibilité de la sonde avec le milieu, et/ou ils permettent une adhésion sélective de la sonde à des sites moléculaires spécifiques.
Pour cela, un très grand nombre de stratégies différentes peuvent être adaptées pour diverses applications visées. Par exemple, l'ajout de charges positives ou négatives sur la capsule à partir de groupements chimiques comme les acides carboxyliques ou les amines permet une association sélective avec un substrat chargé de signes opposés [J.
Cabana, M. Paillet and R. Martel, "Directed Assembly of SWNTs by Electrostatic Interactions and its Application for Making Network Transistors", Langmuir, 26(1), 607-612 (2010)]. L'usage notamment de groupements d'ADN ou d'ARN en association avec son complémentaire ou de protéines avec son récepteur sont d'autres bons exemples

12 pour développer des applications de marquage moléculaire pour le diagnostique ou le dépistage médical.

Description de modes de réalisations préférés de l'invention Les inventeurs de la présente invention ont mis au point de nouvelles sondes pour la diffusion Raman tout à fait originales.

Les sondes selon l'invention comprennent une capsule de taille nanométrique, au moins une molécule active en Raman qui est soit insérée dans la capsule soit greffée sur la surface externe de la capsule, et au moins un groupement chimique greffé à
l'extérieur de la capsule.

Les Figures 1A, 1B et 1C représentent des sondes selon un mode de réalisation possible de l'invention. La sonde 10 comprend une structure de base représentée parla capsule 12. Cette capsule joue un rôle structural important dans la sonde, mais elle pourra aussi servir de référence spectroscopique lors du traitement du spectre Raman de la sonde.

La capsule 12 représentée sur les Figs. 1A, 1B et 1C a une forme cylindrique.
Par exemple, sans toutefois se limiter à ces exemples, une capsule de forme cylindrique peut être un nanotube de carbone ou un nanotube de nitrure de bore (nanotube BN). Il est à noter que la capsule 12 peut aussi avoir une forme sphérique comme par exemple un fullerène (C60, C70 etc...) ou conique comme par exemple les nanohorns, ou toute autre forme connue de l'homme de l'art. Dans le cas où la capsule est un nanotube, il peut s'agir de nanotube monoparoi, double paroi ou multiparois.

La capsule 12 est de taille nanométrique. Plus particulièrement, le diamètre de la capsule 12 est en général de l'ordre de 0,3 nm à 5 nm. Lorsque la capsule est un nanotube, sa longueur est en général de l'ordre de 0,5 nm à 1 mm.

13 La sonde 10 comprend aussi au moins une molécule active en Raman 14. Comme on peut le voir sur les Figs. 1A, 1B et 1C, la sonde peut comporter plusieurs molécules actives 14. Celles-ci peuvent être identiques ou différentes.

Sur la Fig. 1A, les molécules actives 14 sont insérées (encapsulées) à
l'intérieur de la capsule. Ceci implique que les molécules actives ont une dimension qui permette justement à celle-ci d'être insérées dans la capsule et maintenue à
l'intérieure par interactions non-spécifiques comme des interactions de van der Waals ou électrostatiques. Alternativement, comme représenté sur les Figs. 1B et I C, les molécules actives peuvent être greffées chimiquement sur la surface externe de la capsule 12. Même si cela n'est pas représenté sur les figures, les molécules actives 14 peuvent à la fois être encapsulées dans la capsule et greffées sur la surface externe de celle-ci.

Les molécules actives 14, aussi appelées "molécules colorantes" ou simplement "colorants" sont des molécules qui sont actives en diffusion Raman, c'est-à-dire qu'elles doivent pouvoir être détectées et identifiées par spectroscopie Raman. Ceci est possible si ces molécules offrent une résonance optique dans la gamme des excitations laser disponibles par l'appareil Raman qui est utilisé. Une grande variété de molécules actives est donc envisageable et une personne versée dans le domaine de l'invention saura identifier quelles molécules utiliser. Par exemple, sans toutefois se limiter à ces exemples, les molécules actives peuvent être des dérivés du type oligothiophènes, des caroténoïdes tel que par exemple la a-carotène, le méthylène violet B de formule le Bleu de Toludine, le "Fast Black K sait" (FBK), le DTDCI de formule s CH3 1"

14 Les dérivés du type oligothiophènes sont par exemple le DPP (3,6-dithiophen-2-yl-2,5-dihydro-pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4-dione) ou des dérivés du DPP.

Les dérivés DPP peuvent être par exemple:

s I
O
S

0 I ( ~ s CeHn DPP(2) Br %NI/ ~-~Br S

DPP(2)Br2 ou CeHn S IN
S S

S S
C SS
CeHn DPP(3) A celles-ci s'ajoutent les molécules actives en Raman de résonance comme les chromophores ou oligomères à base de conjugaison de type 7C. En guise d'exemples, il y a notamment les oligomères de polymères conjugués comme les carbazoles, la polyaniline, les polyfuranes, les polypyrroles, les paraphénylènes ou polyhétéro-atomic 5 vinylènes, etc... Il y a aussi les grosses molécules polyaromatiques comme les fullerènes, les dérivés de pentacène, d'anthracène, de perylène, de naphtalène etc... et les systèmes bien connus en résonance Raman comme les benzotriazoles (e.g. 6-tolyltriazole), rhodamines (e.g. rhodamine 6G), pyrolines (e.g. pyroline G et thiopyronine), etc...

10 Il est à noter que la sonde 10 peut comprendre plusieurs molécules actives identiques ou bien plusieurs molécules actives différentes, chacune ayant sa propre résonance en Raman. L'intérêt avec ces sondes plus complexes est de permettre une détection Raman des sondes avec plusieurs longueurs d'onde.

La sonde 10 représentée sur les Figs. 1A, 1 B et 1 C est également fonctionnalisée par

15 des groupements chimiques 16 fixés à l'extérieur de la capsule 12. Sur les Figs. 1A et 1 B, les groupements chimiques 16 sont greffés sur la surface externe de la capsule 12.
Dans la réalisation particulière illustrée à la Fig. 1 C, les groupements chimiques sont liés chimiquement aux molécules actives qui sont elles-mêmes greffées à la surface externe de la capsule 12.

Les groupements chimiques 16 peuvent être très variés. Leur rôle est de faciliter la dispersion ou la solubilité de la sonde dans un milieu liquide, ou bien de permettre la compatibilité de la sonde avec le milieu. Par exemple, un milieu membranaire lipidique demande l'ajout de groupements aliphatiques hydrophobes alors que des milieux aqueux exigent plutôt des groupements polaires ou chargés. Selon leur nature, ils peuvent aussi permettre une adhésion sélective de la sonde à des sites moléculaires spécifiques. Une personne versée dans le domaine de l'invention est en mesure de choisir les groupements chimiques appropriés selon l'utilisation préconisée pour la

16 sonde.. Il existe un très grand nombre de stratégies de fonctionnalisation différentes dépendant de l'application visée. Par exemple, l'ajout de charges positives ou négatives sur la capsule avec des groupements comme des acides carboxyliques ou des amines permet une association sélective avec un substrat chargé de signe opposé [J.
Cabana, M. Paillet and R. Martel, "Directed Assembly of SWNTs by Electrostatic Interactions and its Application for Making Network Transistors", Langmuir, 26(1), 607-612 (2010)].
L'usage notamment de groupements d'ADN ou d'ARN pour une association avec son complémentaire ou de protéines avec son récepteur sont d'autres bons exemples pour des applications de diagnostique ou de dépistage médical. Selon un mode de réalisation de l'invention, le groupement chimique peut être un groupement halogénophényl, tel que par exemple iodophényle, bromophényle. Il peut aussi être un phényldiazonium.
Ces groupements peuvent eux-mêmes être facilement fonctionnalisés pour former d'autres groupements chimiques 16.

Les sondes à diffusion Raman selon l'invention présentent de nombreux avantages comme par exemple:

i) La capsule offre une protection pour les molécules actives encapsulées dans celle-ci [K. Yanagi, Y. Miyata, and H. Kataura, "Highly Stabilized R-Carotene in Carbon Nanotubes", Adv. Mater. 2006, 18, 437-4411. En effet, les nanotubes de carbone ne s'oxydent pas en condition normale et sont très résistants aux différents traitements chimiques et thermiques. Cette protection permet aussi aux molécules actives en Raman de résister à des conditions extrêmes de chauffage ou d'attaque chimique.

ii) Par l'isolement de la capsule, on peut empêcher les interactions fortes entre les molécules actives et le milieu dans lequel les sondes sont dispersées.
Alternativement, et selon l'application souhaitée pour la sonde, on peut favoriser ces interactions lorsque les molécules actives sont à l'extérieur de la capsule.

iii) Grâce à la fonctionnalisation chimique (covalente ou non-covalente) de la capsule, les sondes à capsules peuvent présenter des affinités chimiques très

17 spécifiques. Les sondes sont ainsi compatibles avec divers milieux et peuvent être adaptées à des applications spécifiques comme le marquage moléculaire.

iv) La sonde est de dimension nanométrique et peut être fonctionnalisée de diverses façons afin de mieux cibler une application particulière. Par exemple, elle offre la possibilité d'inclure des groupements chimiques qui servent de sites de reconnaissance pour un ou des substrats spécifiques.

v) Pour une même sonde, il est possible de greffer plusieurs fonctions différentes à
la surface de la capsule, rendant ainsi possible différentes applications pour une même sonde.

vi) Les sondes présentent peu ou pas d'émission parasite (fluorescence ou phosphorescence des molécules) superposée au signal Raman. Le rapport signal Raman sur bruit optique est donc amélioré.

vii) Chaque sonde possède une signature Raman unique et plusieurs sondes peuvent être différentiées les unes des autres par comparaison de leur spectre Raman.
viii) Les sondes peuvent être optimisées pour une longueur d'onde spécifique du laser en choisissant des molécules actives qui sont en résonance avec la source d'excitation.
ix) Chaque sonde présente une sensibilité exceptionnelle pour une détection Raman et il est possible d'obtenir un signal fort permettant l'identification d'une sonde individuelle. En imagerie Raman, il est donc possible d'identifier la présence ou non de la sonde à un endroit précis et ce avec une haute résolution spatiale de 500 nm ou moins.

x) Les sondes sont composées d'une ou plusieurs molécules actives orientées par rapport à la capsule, ce qui confère une anisotropie dans le signal Raman par rapport à
la polarisation du laser. Cette anisotropie permet donc de mesurer l'orientation de la sonde dans le milieu.

18 xi) Les résidus de fluorescence de la sonde combinés avec sa signature Raman (à
une longueur d'onde où il y a peu de fluorescence) permettent une détection plus sensible et spécifique des sondes. On parle alors d'un usage couplé des sondes à
capsule en fluorescence et Raman.

Comme indiqué ci-dessus, les sondes à capsule nanométrique selon l'invention peuvent avoir un large éventail d'applications. Par exemple, ces sondes peuvent être utilisées pour le marquage moléculaire en spectroscopie et en imagerie Raman.

En médecine, les sondes fonctionnalisées par des groupements chimiques appropriées peuvent par exemple être utilisées pour identifier la présence ou non d'un récepteur membranaire sur une cellule ou bien d'une protéine dans le sang. En milieu in vitro, les sondes peuvent être appliquée pour identifier un pathogène ou une cellule malade.
Lorsque spécifiques à un récepteur, elles peuvent être insérées dans un être vivant et servir d'outil pour établir un diagnostic médical ou pour identifier localement la présence de cellules malades ou cancéreuses. De plus, ces sondes peuvent être utilisées comme agent de contraste en imagerie Raman biomédicale.

Dans d'autres contextes, comme par exemple dans le domaine de la sécurité
civile et/ou la médecine légale, elles peuvent servir à la détection de composés traces comme des explosifs, des drogues, l'ADN, l'ARN, des protéines ou des hormones. Ces sondes Raman peuvent aussi servir à l'authentification de documents. L'insertion d'une sonde spécifique dans le matériel du document et l'identification de celle-ci par l'analyse Raman du document offre rapidement une preuve solide de l'authenticité du document.
Comme outil de recherche, les sondes selon l'invention peuvent servir de traceurs optiques pour étudier des processus complexes comme le métabolisme et les systèmes physico-chimiques, biochimiques ou biologiques. L'usage notamment des sondes dans un système de micro-fluidique permet de localiser par mesure Raman la présence ou non d'une substance dans un des canaux du dispositif.

19 Les inventeurs de la présente invention ont également mis au point une nouvelle méthode de fabrication des sondes selon l'invention.

La Fig. 2 illustre les différentes étapes de la méthode de préparation d'une sonde à
diffusion Raman telle que décrite ci-dessus. La méthode comprend une première étape de nettoyage et d'ouverture de la capsule de taille nanométrique sous forme brute.
Selon un mode de réalisation, cette étape implique un nettoyage des capsules par reflux dans l'acide nitrique concentré. Le traitement à l'acide nitrique permet à la fois de nettoyer les capsules et de les ouvrir pour permettre ensuite l'encapsulation.
Après le nettoyage et l'ouverture des capsules, il est préférable de filtrer celles-ci sur une membrane poreuse à l'aide d'une pompe à vide et ensuite de les sécher à l'air.
Les capsules ainsi séchées sont enlevées du filtre et peuvent ensuite être placées dans de l'eau déionisée pour subir un traitement hydrothermique. Lors de ce traitement hydrothermique, les capsules se retrouvent fonctionnalisées par quelques groupements COOH. Le traitement hydrothermique se déroule en général sous reflux et agitation constante sur une période d'environ 3 heures. La phase aqueuse est ensuite éliminée par filtration. Les capsules sont ensuite lavées avec un solvant et séchées à
l'aide du vide. Un exemple de procédure détaillée est présenté ci-après pour le nettoyage et l'ouverture des capsules de nanotubes de carbone.

Dans une deuxième étape comme présentée sur la Fig. 2, la molécule active en Raman est soit insérée dans la capsule (encapsulation), soit liée par association chimique sur la surface externe de la capsule. On forme alors un complexe capsule-molécule active. Il est également possible que des molécules actives soit à la fois encapsulées dans la capsule et greffée sur la surface externe de celle-ci.

L'encapsulation peut se faire en phase vapeur ou en phase liquide. La méthode par voie gazeuse se fait de préférence dans une ampoule pompée sous vide. L'ampoule est remplie avec les capsules propres et ouvertes et avec un excès de molécules à
encapsuler. Un simple chauffage de l'ampoule à la température de sublimation des molécules à encapsuler permet l'encapsulation des molécules. Une encapsulation complète prend généralement plusieurs heures. Les molécules non-encapsulées sont ensuite retirées à l'aide de solvants ou par sublimation des molécules libres.
La méthode d'encapsulation en phase liquide consiste à disperser les capsules ouvertes dans un solvant contenant les molécules à encapsuler dissoutes à saturation dans ce même 5 solvant. Une diminution de solubilité des molécules à encapsuler dans le solvant est ensuite pratiquée par diminution lente de la température, par évaporation lente du solvant, ou par la substitution lente du solvant par un autre qui est moins favorable à la solubilité des molécules actives. L'encapsulation en phase liquide ou vapeur est un processus thermodynamique spontané.

10 L'association chimique de la molécule active sur la surface externe de la capsule peut se faire par une réaction de couplage carbone-carbone à l'aide d'une réaction radicalaire de la molécule avec la capsule. Plus de détails sur ce type de réaction sont donnés ci-après, comme par exemple dans le cas d'une sonde de nanotube de carbone greffée sur sa surface externe avec du bleu de Toluidine comme molécule active.

15 Dans une troisième étape du procédé de préparation des sondes selon la présente invention, la capsule est fonctionnalisée à l'extérieur de celle-ci par au moins un groupement chimique. Cette fonctionnalisation rend la sonde compatible avec un milieu liquide ou un récepteur. Pour cela, un groupement fonctionnel R est greffé
directement sur la capsule ou greffé sur la molécule active lorsque celle-ci est attachée à la surface

20 externe de la capsule. La fonctionnalisation par le groupement fonctionnel est en général effectuée par greffage covalent en milieu aqueux ou dans un solvant avec des réactifs radicalaires. Un exemple de réactif radicalaire est le phényldiazonium ou un dérivé de carbène. L'invention ne se limite pas à ces seuls réactifs et la personne de l'art saura facilement choisir d'autres types de réactifs radicalaires. Les excès de réactifs sont ensuite éliminés, par exemple à l'aide d'un solvant et par filtration sur membrane PTFE.
Des réactions subséquentes sur ces groupements offrent plusieurs variantes de fonctionnalisations. Le choix du groupement chimique dépend de l'application particulière visée avec la sonde. Des détails sur des réactions possibles avec les

21 nanotubes de carbone sont présentés ci-après. On peut également se référer à
la littérature récente sur le greffage chimique des nanotubes aux références suivantes : J.
Cabana, M. Paillet and R. Martel, "Directed Assembly of SWNTs by Electrostatic Interactions and its Application for Making Network Transistors", Langmuir, 26(1), 607-612 (2010); Janie Cabana, "Fonctionnalisation covalente des nanotubes de carbone:
propriétés, réversibilité et applications dans le domaine de l'électronique", Thèse de Doctorat (Ph.D.), Université de Montréal, Avril 2010.

Finalement, une fonctionnalisation non-covalente avec des surfactants peut aussi être pratiquée afin de mieux stabiliser les sondes dans un milieu aqueux. Dans ces cas, l'oxydation légère de la capsule lors de l'étape de nettoyage est utile pour stabiliser le complexe surfactant-nanotube. Cette étape consiste à ajouter un surfactant (ou un polymère) à la solution de sondes et à activer ensuite le mélange par un traitement ultrason. Une dernière étape de centrifugation sert à isoler les sondes en solution pour retirer par décantation les plus gros agrégats. Cette procédure est utilisée pour disperser les nanotubes de carbone. [J. L. Margrave et al., "Chemically modifying single wall carbon nanotubes to facilitate dispersion in solvents", US Patent No.
6,875,412 B2, April 5, 2005]

Selon un autre mode de réalisation de la méthode pour obtenir les sondes selon l'invention, la troisième étape décrite ci-dessus est effectuée avant la deuxième étape.
En effet, il est possible de fonctionnaliser la capsule par le groupement chimique R avant de former le complexe capsule-molécule active.

Il est possible de développer une très grande variété de sondes Raman différentes à
partir de la méthode de fabrication décrite ci-dessus. Le nombre est quasiment infini et dépend de l'application et de la longueur d'onde visée et disponible pour le Raman.

22 Exemples de sondes Raman à capsule et leurs méthodes de fabrication Dans les exemples qui suivent, des sondes à diffusion Raman selon l'invention ont été
préparées à partir d'un nanotube de carbone du type "single wall carbon nanonube"
(SWNT) ayant un diamètre -1,4 nm et des longueurs entre 100nm et 5 m ou plus.
Le groupement chimique lié sur la surface externe du nanotube est le groupement bromophényle ou phényldiazonium. Différentes molécules actives ont été
encapsulées aux nanotubes SWNT comme cela va être détaillé ci-dessous. Un autre type de sonde a également été préparé à partir d'un nanotube de type "double wall carbon nanotube"
(DWNT). Dans ce cas, le Bleu de Toluidine est utilisé comme molécule active et est fixé
de façon covalente sur la surface externe du nanotube.

C'est en effectuant des mesures expérimentales sur des fonctionnalisations chimique de nanotubes avec le Bleu de Toluidine que les inventeurs ont découvert, de façon totalement inattendue, que des sondes individuelles de SWNT fonctionnalisées chimiquement avec des colorants démontraient des propriétés de diffusion Raman exceptionnelles. Dépendant de la position du colorant, externe ou interne au nanotube de carbone, les inventeurs ont développé un protocole général de synthèse en trois étapes : i) Ouverture et nettoyage des nanotubes; ii) encapsulation du colorant; iii) réaction covalente sur la couche externe. Les détails concernant l'étape d'encapsulation est spécifique au colorant utilisé, mais les étapes i et iii) sont les mêmes pour toutes les sondes.

i) Protocole d'ouverture et nettoyage des nanotubes Tous les échantillons de nanotubes ont été préalablement nettoyés par reflux dans l'acide nitrique concentré [K. Balasubramanian and M. Burghard, "Chemically Functionalized Carbon Nanotubes" Small 1(2), 180-192 (2005)]. Ce protocole permet à
la fois de nettoyer les nanotubes, de les fonctionnaliser légèrement avec des groupements COOH, et d'ouvrir les bouts des nanotubes pour permettre l'encapsulation.
La procédure utilisée est la suivante: une masse de 100 mg de SWNT brut est placée

23 dans 300 ml d'acide nitrique 67% de qualité ACS (Fisher). Le mélange est chauffé à
reflux sous agitation constante pour une période d'environ 4 heures. Les nanotubes sont ensuite filtrés sur une membrane de PTFE 1,22 pm à l'aide d'une pompe à vide.
Le film résultant, couramment appelé "buckypaper" est séché à l'air. Par la suite, il est enlevé
de la membrane et placé dans 300 ml d'eau déionisée (18,2 Mt2 -Millipore) pour subir un traitement hydrothermique. Comme pour le traitement acide, ce traitement se déroule sous reflux et agitation constante sur une période de 3 heures. La phase aqueuse est éliminée par filtration sur membrane de PTFE de 1,22 pm. Le "buckypaper" est finalement lavé avec un solvant et séché à l'aide du vide jusqu'à ce qu'il s'enlève facilement de la membrane de PTFE. Généralement, la masse finale de nanotubes de' carbone est de 40 à 60 mg.

iii) Protocole de fonctionnalisation covalente de la surface externe des nanotubes de carbone avec un groupement R

La réaction de fonctionnalisation est effectuée en milieu aqueux avec une faible concentration en phényldiazonium. Une solution déoxygénée de tétrafluoroborate bromophényle diazonium 0,79 mM (96%, Sigma-Aldrich) à pH -10 est d'abord préparée.
L'ajustement du pH est réalisé par ajout d'hydroxyde de sodium. Les SWNT
encapsulés sont ensuite immergés dans la solution pendant 10 min sous agitation à la température de la pièce. lis sont finalement rincés avec de l'eau déionisée et du diéthyléther.

Plusieurs variantes de ces fonctionnalisations (différents groupements R) sont possibles afin d'adapter les sondes à capsule pour une application ou une autre. Par exemple, un greffage du Bleu de Toluidine, une molécule active en Raman, à l'extérieur de la capsule est possible à partir d'une réaction covalente sur le groupement R laissé par l'étape de fonctionnalisation par le sel de diazonium (étape précédente). Un autre exemple démontré par les inventeurs est le greffage d'une fonction chimique chargée négativement sur ce même groupement R pour permettre l'assemblage sélectif des nanotubes sur une surface. Les variantes de fonctionnalisation sont pratiquement

24 infinies et dépendent de l'application visée. Pour plus de détails sur ces réactions de couplage C-C sur un groupement R et une revue de la littérature récente sur les greffages chimiques des nanotubes on peut se référer aux références suivantes : J.
Cabana, M. Paillet and R. Martel, "Directed Assembly of SWNTs by Electrostatic Interactions and its Application for Making Network Transistors", Langmuir, 26(1), 607-612 (2010) et J. Cabana, "Fonctionnalisation covalente des nanotubes de carbone:
propriétés, réversibilité et applications dans le domaine de l'électronique", Thèse de Doctorat (Ph.D.), Université de Montréal, Avril 2010.

EXEMPLE 1 : Sondes de type oligothiophène@SWNT
a) Sondes a-sexithiophène@SWNT

L'assemblage de a-sexithiophènes dans des nanotubes de carbone est simple à
réaliser car l'encapsulation avec le sexithiophène est déjà connue. Il existe déjà une étude de fluorescence sur ces assemblages [M. A. Loi, J. Gao, F. Cordella, P. Blondeau, E.
Menna, B Bartova, C. Hébert, S. Lazar, G. A. Botton, M. Milko, et C. Ambrosch-Draxl, Adv. Mater. 22, 1-5 (2010)]. L'étude Raman présentée ici a été réalisée sur un échantillon fourni par les auteurs de l'article, car il existe une preuve expérimentale de l'encapsulation par microscopie électronique en transmission pour cet échantillon. [Voir M. A. Loi, J. Gao, F. Cordella, P. Blondeau, E. Menna, B Bartova, C. Hébert, S. Lazar, G. A. Botton, M. Milko, et C. Ambrosch-Draxl, Adv. Mater. 22, 1-5 (2010)].

Ce premier exemple est très bien défini et sert à illustrer le comportement général en Raman d'une grande famille de sondes dont le colorant est encapsulé dans les nanotubes. Le schéma ci-dessous illustre l'encapsulation du a-sexithiophènes dans le nanotube et montre schématiquement la grande taille de la capsule par rapport aux molécules.

\ -/

H H H H H H
S S S
S S
H H H H H H

Des mesures d'absorption et Raman sur la poudre, en solution et sur des échantillons de complexes a-sexithiophène@SWNT individuels déposés sur un substrat de silicium 5 ont été effectués par les inventeurs. Pour disperser les complexes a-sexithiophène@SWNT en solution dans un solvant, les échantillons ont été
fonctionnalisés par oxydation chimique dans le HNO3 concentré. Cette étape permet de greffer des fonctions COOH sur l'extérieur des nanotubes. Le spectre d'absorption de la poudre des a-sexithiophène@SWNT fonctionnalisés présente une bande d'absorption 10 principale située vers 510 nm et plusieurs autres bandes d'absorption entre 600 et 1200 nm (Fig. 3). La bande à 510 nm est associée aux molécules colorantes de a-sexithiophènes, alors que les autres bandes (900-1200 nm et 600-800 nm) sont associées à l'absorption optique des nanotubes de carbone.

Les spectres Raman de ces dispersions ont été mesurés à différentes longueurs d'onde 15 d'excitation (782, 633, 514 et 488 nm déduites de la Fig. 3). Les spectres Raman de la poudre de l'échantillon sont présentés dans la Fig. 4. La Fig. 5 reprend les spectres de la Fig. 4 dans la région autour de 1500 cm-1 et les compare aux spectres obtenus pour les nanotubes de carbone bruts. La bande se trouvant vers 1457 cm-' dans le spectre Raman est la signature la plus distincte du a-sexithiophène encapsulé. Une comparaison avec les spectres des nanotubes sans colorant permet d'identifier les autres bandes moins intenses associées aux nanotubes. Le signal provenant du colorant est plus intense que celui des nanotubes lorsque la longueur d'onde d'excitation est près ou directement en résonance avec le colorant, soit à 633 nm, 514 nm et à 488 nm. Cependant, à 782 nm, le signal pouvant être attribué au a-sexithiophène est peu intense par rapport à celui des nanotubes. Ces mesures mettent en lumière le caractère résonnant du processus de diffusion Raman avec le a-sexithiophène@SWNT. Les Figs.
4 et 5 montrent qu'il y a un processus de résonance car le signal Raman du a-sexithiophène est beaucoup plus intense que celui des nanotubes de carbone seulement lorsque l'énergie d'excitation est proche de l'énergie absorption du a-sexithiophène (Fig. 3).

Les mesures Raman du complexe a-sexithiophène@SWNT permettent de constater qu'il y a un fort signal Raman venant des molécules et que l'énergie de la résonance est essentielle pour maximiser la diffusion Raman. Il s'agit donc de Raman résonnant sur les molécules présentes. Par contre, une mesure sur la poudre ne permet pas de déterminer si la diffusion Raman des molécules est forte ou non. Les inventeurs ont toutefois constaté dans ces expériences qu'il n'y a pas de signal de fluorescence, même au delà de la zone du spectre présentée ici. Cette caractéristique rend la mesure du spectre Raman facile à réaliser car elle ne présente pas de bruit de fluorescence.
Pour déterminer la force du signal Raman, les inventeurs ont réalisés des expériences supplémentaires sur des a-sexithiophène@SWNT individualisées. Les résultats présentés à la Fig. 6 ont permis de démontrer que le signal Raman des molécules à
l'énergie de la résonance est plus fort que celui des nanotubes. Cette expérience est faite sur un petit fagot de a-sexithiophène@nanotubes ayant environ 1 micromètre de long et positionné sur une surface d'oxyde de silicium. L'image AFM de la sonde est présentée à la gauche de la Fig. 6. La mesure Raman locale à la position de cette sonde est présentée à droite de la figure. La bande associée au colorant est clairement visible dans le spectre et son intensité à 633 nm. Celle-ci est plus élevée que celles du nanotube. Cette mesure permet de conclure que le signal Raman des molécules de a-sexithiophène est généralement plus fort que celui des nanotubes. Comme la section efficace des nanotubes est de SR-10-22 cm"2, cette mesure démontre que la section efficace des molécules dans le faisceau est importante. Cette mesure a permis de confirmer que ce type de composés est très intéressant pour obtenir de forts signaux Raman. La démonstration de cette caractéristique en Raman sur une sonde individuelle est essentielle pour l'invention.

Section efficace de diffusion Raman des sondes a-sexithiophène@SWNT

Une première façon d'estimer la section efficace de la diffusion Raman des molécules de la Fig. 6 est d'utiliser la diffusion Raman des nanotubes comme référence interne.
Les données de la littérature indiquent que la section efficace de diffusion des nanotubes est dans la gamme entre 3x10-23 à 3x10-22 cm2/sr [R. Martel, "Perspective -Sorting Carbon Nanotubes for Making Electronic Materials", ACS Nano, 2(11), 2199 (2008)]. Comme le signal Raman venant des molécules est environ 3 fois plus intense que celui associé au nanotube, il est possible de déduire que la section efficace de l'ensemble des molécules sous le faisceau est dans la gamme 1022 à 10"21 cm2/sr.
Le nombre de molécules dans les nanotubes exposées sous un faisceau de 500 nm de diamètre est d'environ 455 par nanotube (peut être évaluée une densité
maximale de 4 molécules par 4.47 nm de longueur dans la structure polymorphe LT [voir P.
Hermet, J.-L. Bantignies, A. Rahmani, and J.-L. Sauvajol, J. Phys. Chem. A 109,4202-4207 (2005)]
ou à partir des images TEM tirés de l'article de M. Loi et al. Adv. Mater. 22, 1-5 (2010)).
En assumant qu'il y a l'équivalent d'un seul nanotube complètement rempli de molécules, la section efficace par molécule entre 2 x 10-25 et 2 x 10-24 cm2/sr.
Quoiqu'approximative, cette estimation est raisonnable car le fagot contient en réalité de 3 à 5 nanotubes mais ceux-ci sont partiellement remplis par les molécules. Il est à noter qu'une section efficace de 10-24 cm2/molécule est typique pour un processus de résonance en Raman pour des colorants comme le a-sexithiophène. L'aire typique d'une molécule dans ce complexe étant de 1.4 nm x 4.47nm/4 = 1.57 x10-6 m2 (ou 1.57x1014 cm2), il faudra alors compter environ 1011 - 1010 photons par molécule par nanotube pour obtenir un signal Raman.

Cette estimation de la section efficace par molécule peut être validée à
partir des mesures de puissance des lasers utilisés pour faire la mesure. Lors des expériences précédentes, la lumière du laser utilisé à 514 nm (puissance 14,5 mW) offre une puissance à la sortie de l'objectif 100X d'environ 2 W (à 100 %) et de 1 W
environ (à
50%). Pour le laser à 633 nm (13 mW), il y a 2 mW environ à la sortie de l'objectif 100X
(a 100 %) et 1 mW environ à 50%. L'ouverture numérique de l'objectif 100X est de 0.9 (angle est de 65 ou 1.13 sr) et la taille du spot est d'environ 500 nm. La puissance dans le cas de la Figure 5 est de 2mW sur un spot de 500 nm de diamètre (ou densité
d'énergie de r_106 W/cm2) et l'exposition pour le spectre est de 30 secondes.
Cette densité d'énergie correspond donc à une densité de 7x1017 photons m-2 (i.e.

secondes à 2x1016 photons s-1 m-2). Comme la section du nanotube sous le faisceau ne fait que 0.5 .tm de long et 1.4 nm de large, la quantité de photons totales pour la mesure du spectre n'est que de -6 x1014 photons. La quantité de molécules est d'environ 455, ce qui donne une densité de 1012 photons par molécule. Cette valeur est semblable à celle estimée précédemment à partir de la section efficace du nanotube tirée de la littérature. La différence peut être attribuée à l'efficacité
limitée du détecteur et à des pertes de photons par l'optique de transfert.

b) Sondes DPP@SWNT

D'autres sondes à base d'oligothiophène encapsulé ont été fabriquées afin d'explorer la fabrication de sondes actives à d'autres énergies de résonance. Les inventeurs ont préparé pour cela des composés DPP qui, comme cela est indiqué ci-après, permettent d'ajuster l'énergie de la résonance à diverses positions dans le spectre du visible. Les DPP (DPP1, DPP2 et DPP3) sont des analogues du polythiophène qui offrent des résonances intéressantes dans une gamme du rouge (vers 633 nm) au bleu (514 nm).
Ces molécules offrent une grande flexibilité de synthèse. La méthode de synthèse a été
adaptée à partir du protocole de la référence [A. B. Tamayo, M. Tantiwiwat, B.
Walker, and T.-Q. Nguyen, J. Phys. Chem. C, 112, 15543 (2008)]. Le schéma réactionnel suivant illustre les étapes pour la synthèse des composés DDP utilisés pour les encapsulations dans les SWNT. Dans le schéma, le DDP2 est le composé (6) et est le composé (Z) du schéma.

H C.Htr S CN / \ I
COH17Br, K2C03.
t-amyl alcohol, t-BuOK, O
120 C, 24 h B DMF, 130 C, 24 h s Buo\ ^ ~ 62.0% 52.3% s v \OBU O i \ / O
U H (7J caH t, CeHtr CaHir S / \ I 0 (4), Pd(P%)4, THF.
NBS, CHC13, KZ003 2M. 80 OC, 72 h RT,48h s \ ~' \ s \
72.9% s 70.9% N S
a i (à). Pd(PPh3)4. THF, C.Hn GÜ K2C03 2M, 80 C, 72' h CeHv 41.7% S N
O
S / S \ / B
lSJ \\ // B\O \ S / \ B
O N \ / S
'~` \ S O
L7) IeHtl B O

La préparation de ces sondes DPP@SWNT consiste d'abord à réaliser un nettoyage et une ouverture des nanotubes de carbone tel que décrit précédemment. Pour l'encapsulation, 2 mg de SWNT nettoyés et ouverts (voir étape i : Ouverture et nettoyage des nanotubes) sont dispersés dans 20 mL de DMF en sonicant pendant 30 minutes dans le bain. On ajoute 10 mg de colorant DPP (excès de colorant) et la solution est traitée aux ultrasons pendant 5 minutes. On chauffe ensuite à reflux pour la nuit sous azote. L'échantillon est récolté par filtration après 10 lavages avec THF avec sonication douce pendant 3 minutes entre les lavages pour disperser les tubes suivi d'une filtration et 10 autres lavages similaires avec le DMF. La fonctionnalisation de ces complexes avec le groupement R se fait selon le protocole décrit ci-haut (voir iii :
Protocole de fonctionnalisation covalente de la surface externe des nanotubes de carbone avec un groupement R).

5 La fabrication des sondes DPP3@SWNT, DPP2@SWNT et DPP1@SWNT a été
réalisée par étapes. Pour chaque étape, des spectres Raman ont été mesurés.
Les Figs.
7 et 8 présentent des exemples de spectres Raman mesurés pendant les étapes de synthèse de la sonde DPP2@SWNT. A la Fig. 7 sont présentés des spectres à 633 nm réalisés avec et sans l'étape d'ouverture des SWNT (protocole i)) décrit précédemment.
10 On note que ces spectres montrent clairement que l'étape i) (ouverture et nettoyage) est essentielle pour obtenir un signal fort des molécules de DPP. L'étape finale de fonctionnalisation (étape iii)) avec le groupement R (ici R=bromo-phényle) montre à la Fig. 8 que le spectre Raman demeure quasiment identique à celui mesuré avant cette étape. Cette expérience démontre que la réaction covalente sur la surface externe du 15 SWNT ne modifie pas (ou très légèrement) le spectre Raman. La Fig. 9 représente les spectres Raman des trois sondes DPP3@SWNT, DPP2@SWNT et DPP1 @SWNT.
L'étape de fonctionnalisation est donc invisible en Raman. Toutefois, elle clairement mise en évidence lorsque l'on compare la dispersion ou solubilité des sondes dans un solvant. Une sonde non-fonctionnalisée par l'étape iii) est insoluble dans un liquide 20 comme le DMF et forme un précipité insoluble. Une sonde fonctionnalisée par le groupement R se disperse très facilement dans un solvant et forme une suspension stable sans agrégation. De plus, une mesure par spectroscopie de photoémission X
(XPS) permet de confirmer que le greffage du groupement R a bien fonctionné.
Des exemples de caractérisation de ce type de mesures sont présentés à la référence

25 suivante : J. Cabana, "Fonctionnalisation covalente des nanotubes de carbone:
propriétés, réversibilité et applications dans le domaine de l'électronique", Thèse de Doctorat (Ph.D.), Université de Montréal, Avril 2010.

EXEMPLE 2: Sondes à diffusion Raman encapsulées avec des molécules commerciales Plusieurs sondes à capsule peuvent être fabriquées à partir de molécules commerciales.
Le choix d'une molécule active en Raman se fait sur la base de l'énergie de la résonance Raman et des spécificités spectrales nécessaires pour une application donnée. Le choix de molécules est très vaste et quasiment infini. Les inventeurs ont travaillé avec plusieurs molécules différentes comme par exemple le méthylène violet B
et le DTDCI.

a) Sondes méthylène violet B@SWNT

Les sondes à capsules préparées avec le méthylène violet B ont donné de bonnes réponses en diffusion Raman. Le méthylène violet B possède la structure suivante :
H3C-~ N
/ S O

La procédure de fabrication se fait selon les étapes générales décrites précédemment (voir étapes i) Ouverture et nettoyage des nanotubes; ii) encapsulation du colorant; iii) réaction covalente sur la surface exteme). Pour l'étape ii), on disperse les SWNT et le méthylène violet B en excès dans de l'heptane et on traite la suspension avec des ultrasons pendant environ 2 min. La suspension est ensuite agitée à reflux pour la nuit.
La suspension est finalement purifiée par des lavages successifs avec du DMF.
L'étape est terminée lorsque le filtrat ne demeure que très légèrement coloré ou lorsque les spectres Raman enregistrés avant et après la dernière séance de lavage sont équivalents.

Un exemple de spectre Raman à 633nm de la sonde méthylène violet B@SWNT obtenu après la synthèse est présenté à la Fig. 10. La signature Raman de la sonde est aussi comparée avec celui la poudre de méthylène violet B. On remarque des différences entre ces deux spectres, notamment dans la région autour de 1500 cm"'. Ces différences viennent de l'encapsulation des molécules dans la sonde à SWNT.

b) Sondes DTDCI@SWNT

La fabrication de sondes avec le diethylthiodicarbocyanine iodide (DTDCI) a aussi bien fonctionnée. Ces sondes ont été préparées selon le protocole général décrit précédemment (voir étapes i) Ouverture et nettoyage des nanotubes; ii) encapsulation du colorant; iii) réaction covalente sur la couche externe). La structure du DTDCI illustrée ci-dessous est celle d'une molécule conjuguée linaire qui offre une bonne polarisabilité
et donc de bonnes réponses en diffusion Raman dans le visible.

CH
S N

S

Structure du DTDCI (diethylthiodicarbocyanine iodide) La procédure de fabrication se fait selon les étapes générales décrites précédemment (voir étapes i) Ouverture et nettoyage des nanotubes; ii) encapsulation du colorant; iii) réaction covalente sur la couche externe). Pour l'étape ii), on disperse les SWNT et un excès de DTDCI dans de l'eau suivi d'un traitement ultrasons pour environ 15 min. La solution est ensuite portée à reflux sous agitation pendant 20 h. Plusieurs lavages au DMF ont été effectués jusqu'à extraction complète du colorant non encapsulé
(jusqu'à
ce que le filtrat soit incolore).

Le spectre Raman à 633nm de la sonde DTDCI@SWNT obtenu après la synthèse est présenté à la Fig. 11. Le spectre Raman de la sonde est aussi comparé avec celui de la poudre de DTDCI. On remarque des différences entre ces deux spectres. Ces différences viennent de l'encapsulation des molécules dans les SWNT.

EXEMPLE 3: sondes Bleu de Toluidine-DWNT (greffage externe du colorant) Un exemple de sonde à capsule tel que représenté à la Fig. 1 B a été réalisé
en utilisant le Bleu de Toluidine comme molécule active en Raman. Pour cette sonde, le colorant actif en Raman est attaché chimiquement par une réaction covalente à
l'extérieur des nanotubes. Cet exemple illustre la possibilité de fabriquer ce type de sonde avec la molécule active greffée sur la surface externe de la capsule.

La méthode de fabrication présente une variante par rapport à la méthode générale présentée précédemment avec les étapes i) Ouverture et nettoyage des nanotubes; ii) encapsulation du colorant; iii) réaction covalente sur la couche externe.
Étant donné que l'étape d'encapsulation n'est pas nécessaire pour ces sondes, l'étape ii) est omise. On procède plutôt directement au greffage chimique du colorant sur la capsule.
Pour la sonde Bleu de Toluidine-DWNT, 1 équivalent de nanotubes double paroi (DWNT) et équivalents de bleu de toluidine ont été placés dans un ballon. Le ballon est purgé avec de azote et chauffé à 130 C. 30 équivalents d'isoamylnitrite sont ensuite ajoutés au mélange et la réaction procède pendant 24 heures sous agitation vigoureuse. Le résidu qui contient le Bleu de Toluidine-DWNT est rincé avec de l'eau à deux reprises et lavé
ensuite plusieurs fois avec du DMF jusqu'au retrait complet du colorant libre puisque le Bleu de Toluidine libre est très soluble dans le DMF. Le lavage se fait par un traitement aux ultrasons pendant 10 minutes du résidu de la réaction dans le DMF. Le produit est ensuite récolté par filtration et séché avec du THF.

Une variante de cette réaction qui a donné le même résultat est de faire la réaction en phase liquide plutôt qu'à l'état solide. La procédure en phase liquide est la même sauf pour la quantité d'isoamylnitrite qui est de 45 équivalents (plutôt que 30) et que le DMF
anhydre est ajouté au milieu à raison de 200 équivalents. Le schéma de la réaction d'insertion du Bleu de Toluidine par greffage externe aux nanotubes est le suivant :

CH, H,C-N
CH, H,C-I \N
\ \ N \
5 CM, NTC + (CH, DMF (anhydre), 130 C, \ = _\
H,N

(NTC = NanoTube de Carbone) Le spectre Raman à 633 nm de la sonde Bleu de Toluidine-DWNT, obtenu après la synthèse solide, est présenté à la Fig. 12. Le spectre Raman de la sonde est comparé
5 avec celui des nanotubes double paroi (DWNT). On remarque des bandes additionnelles autour de 500 et de 1400cm"1 dans le spectre du Bleu de Toluidine-DWNT. Ces bandes viennent d'un signal Raman des molécules de Bleu de Toluidine greffées chimiquement aux DWNT.

Claims (3)

1- Une sonde à diffusion Raman comprenant une capsule de taille nanométrique ayant une surface externe, et au moins une première molécule active en Raman, ladite capsule étant fonctionnalisée par au moins un groupement chimique à l'extérieur de celle-ci, et la première molécule active en Raman étant soit insérée à l'intérieur de la capsule, soit greffée chimiquement sur la surface externe de celle-ci ou les deux à la fois.

2- Une méthode de préparation d'une sonde à diffusion Raman telle que définie à la revendication 1, comprenant une première étape de nettoyage et ouverture d'une capsule de taille nanométrique sous forme brute pour obtenir la capsule de taille nanométrique ayant une surface interne; une deuxième étape qui consiste soit en une encapsulation de la molécule active en Raman dans la capsule, soit en une association chimique de la molécule active sur la surface externe de la capsule, soit une combinaison de l'encapsulation et de l'association chimique, pour former un complexe capsule-molécule active; et une troisième étape qui consiste en une fonctionnalisation de la capsule par le groupement chimique à
l'extérieur de celle-ci.

3- Utilisation d'une sonde à diffusion Raman telle que définie à la revendication 1, pour le marquage moléculaire en spectroscopie et en imagerie Raman.