CN106566879B - 用于生物分子筛选或检测的编码微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于生物分子高通量筛选或检测的编码微球及其制备方法和应用。本申请的用于生物分子高通量筛选或检测的编码微球为核壳结构，以介孔有机微球为核心，介孔有机微球吸附磁性粒子和量子点，然后以有机材料或无机材料为外壳，通过吸附的磁性纳米粒子实现磁性，通过吸附的量子点的类型和数量实现微球编码。本申请的用于生物分子高通量筛选或检测的编码微球，由于采用量子点编码，提高了编码微球的编码能力，以及荧光检测系统的检测能力。并且，由于量子点具有较宽的吸收光谱，与传统的荧光染料微球相比，本申请的编码微球仅采用一个激发光源即可实现多色量子点的激发，节约了研究成本。
Description
技术领域
本申请涉及分子筛选或检测领域，特别是涉及一种用于生物分子高通量筛选或检测的编码微球及其制备方法和应用。
背景技术
生物分子检测技术与人类生命健康密切相关，特别是在医学诊断、药物筛选、蛋白分析、基因组测定等方面，直接关系着人类疾病的预防和控制。随着世界人口增涨、环境恶化造成的疾病种类不断增多以及人们对自身健康需求的不断增高，低成本、快速、高效的检测方式显得尤为重要，因此，客观上要求检测技术不断改进和发展。
近年来，随着生物工程技术和生物分析技术的进步，微阵列芯片、微型生物传感器以及微流体设备得到快速发展，使得高通量生物分子检测成为可能。而以功能性高分子荧光编码微球为核心的液态生物芯片技术，因其检测通量高、样本用量少、灵敏度高等优点显示了广阔的应用前景。
液态生物芯片技术是集流式技术、荧光微球合成技术、生物分子杂交技术、高效数字信号处理技术为一体的尖端生物分子检测技术。在保证信息质量的同时，又能实现高通量检测，因此被喻为后基因组时代的新型生物芯片技术。
荧光微球是指粒径在纳米至微米范围内，负载有荧光物质，受激发光照射后能够发射出荧光的固体微球。微球材料为有机高分子聚合物，上面负载有荧光染料或上转换发光材料。并且，可在微球表面修饰以羧基、氨基、羟基等生物功能基团，使其作为固定蛋白质和核酸等生物大分子的载体，进行生物分子杂交反应。用不同颜色、不同比例含量的荧光物质染色的微球具有不同的光谱特征，因而可用于不同生物分子的检测。传统的按照荧光强度对微球进行编解码的原理如图1所示，其中A、B、C、D、E代表不同的探针分子，用于捕获不同的待分析物。荧光微球捕获可溶性大分子，进而形成液态生物微球的原理如图2所示，首先用荧光物质对微球进行编码标记，形成具有特定荧光特征的荧光微球；然后通过微球上含有的功能基团，如羧基、氨基等，对单个微球键合上同一种捕获探针分子，形成捕获微球；将不同于编码标记所用的荧光物质接枝到互补的探针分子上，形成带有荧光的报告分子；接着在液相生物环境下，将捕获微球、待分析物、报告分子混合，按照sandwich-likestructure进行充分反应。反应结束后，将微球逐个置于激发光照射下激发出所有荧光信号，并以此提取出每种荧光成分的含量，编码荧光确定了待测分子的类型，报告荧光则确定了待分析物的含量。将不同编码的捕获微球放入同一液相体系的待测样品中，可实现单样本多成分的分析。实际检测中，可同时分析蛋白质和核酸两种成分。
目前，应用中的编码微球使用的荧光物质是有机荧光染料。有机荧光染料荧光亮度较低、光褪色现象严重、具有较窄的吸收谱和较宽的发射谱、发射谱不对称且与吸收谱具有重叠等，这些不足之处影响了微球的编码能力和系统的检测能力。由于吸收谱较窄，因此往往需要两个或多个激光器。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的用于生物分子高通量筛选和检测的编码微球，以及该编码微球的制备方法和应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种用于生物分子高通量筛选或检测的编码微球，该编码微球为核壳结构，以介孔有机微球为核心，介孔有机微球吸附磁性粒子和量子点，然后以有机材料或者无机材料为外壳，通过吸附的磁性纳米粒子实现磁性，通过吸附的量子点的类型和数量实现微球编码。
需要说明的是，本申请的编码微球，其关键在于采用量子点进行编码，量子点具有独特的光学特性，可通过改变粒径大小调控发射光谱波长、发射光谱窄而对称、吸收光谱宽且连续分布、荧光效率高、光化学稳定性高、荧光寿命长；与传统的有机荧光染料相比，量子点的编码能力更强，提高了系统的检测能力。并且，由于量子点的吸收光谱宽且连续分布，因此使用一个激发光源即可实现多色量子点的激发，节约了研究成本。
可以理解，本申请的关键在于量子点编码，至于介孔有机微球和微球外壳，可以参考现有的液相芯片微球或其它荧光微球，在此不做具体限定。但是，本申请的优选方案中，为了获得更好的效果，分别对介孔有机微球和微球外壳进行了限定。其中，磁性粒子的作用是为微球提供磁性。
优选的，本申请的编码微球的表面具有修饰基团，这些修饰基团包括羧基，氨基。
需要说明的是，本申请的编码微球具有很强的编码功能，因此，可以在其表面进行各种修饰，以实现不同的功能，例如，对其表面进行氨基或羧基修饰，或者在其表面耦合DNA序列对特定的基因片段进行捕获，又或者在编码微球表面耦合特定的抗原簇或多肽对特定的蛋白质进行吸附，又或者根据离子交换柱原理在编码微球的表面进行阳离子或阴离子修饰，以对特定的物质进行吸附。具体的修饰可以根据不同的试验需求而定，在此不做具体限定。
优选的，介孔有机微球为介孔聚苯乙烯微球或介孔聚丙烯酸酯类微球，介孔有机微球的孔径为50埃-500埃。
优选的，编码微球的外壳的有机材料包括聚乙烯亚胺、聚苯乙烯磺酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、重氮树脂或聚丙烯酸；无机材料为二氧化硅。
优选的，磁性粒子为磁性γ-Fe2O3纳米粒子和/或Fe3O4纳米粒子。
优选的，本申请的编码微球的粒径为3微米-30微米。
本申请的另一面还公开了本申请的编码微球在高通量筛选或检测生物分子高通量筛选和检测检测中的应用，其中，生物分子包括但不仅限于DNA、RNA、蛋白质、多肽或药物分子。
本申请的另一面还公开了本申请的编码微球在DNA、RNA、蛋白质、药物分子或多肽筛选或检测试剂盒或装置中的应用。
本申请的另一面还公开了一种用于生物分子高通量筛选或检测的试剂盒，试剂盒中含有本申请的编码微球。
可以理解，本申请的编码微球，由于其编码能力强，荧光效率高，完全可以替代现有的荧光染料微球，并且具有更好的效果。因此，现有的荧光染料微球所能够应用的领域，都可以采用本申请的编码微球。也可以将本申请的编码微球制成试剂盒，或者特定的检测装置，如试剂条等，应用于各种生物分子的检测。
本申请的再一面公开了本申请的编码微球的制备方法，包括利用疏水作用，将油酸修饰的量子点和磁性粒子吸附到介孔有机微球内部，然后采用有机材料或者无机材料包覆，在介孔有机微球表面形成10-500nm的壳层。
本申请的有益效果在于：
本申请的用于生物分子高通量筛选或检测的编码微球，由于采用量子点编码，提高了编码微球的编码能力，以及荧光检测系统的检测能力。并且，由于量子点具有较宽的吸收光谱，与传统的荧光染料微球相比，本申请的编码微球仅采用一个激发光源即可实现多色量子点的激发，节约了研究成本。
附图说明
图1是本申请背景技术中荧光染料微球编码的原理示意图；
图2是本申请背景技术中荧光染料微球捕获大分子的原理示意图；
图3是本申请实施例中编码微球的结构示意图；
图4是本申请实施例一中编码微球的扫描电镜图；
图5是本申请实施例一中编码微球的荧光显微镜观察图；
图6是本申请实施例二中编码微球的扫描电镜图；
图7是本申请实施例二中编码微球的荧光显微镜观察图；
图8是本申请实施例三中荧光显微镜四个荧光通道的观察结果图。
具体实施方式
本申请采用量子点对生物分子高通量筛选和检测的微球进行编码，从而获得本申请的用于生物分子检测的编码微球，在本申请的一种实现方式中，该编码微球，尤其指液相芯片检测微球，与传统的荧光染料微球相比，本申请的量子点编码微球具有编码能力强，荧光效率高等优点，能够提高系统的检测能力。
本例的量子点编码的编码微球为核壳结构，如图3所示，以介孔有机微球1为核心，介孔有机微球吸附磁性粒子2和量子点3，然后以有机材料或者无机材料为外壳4，通过吸附的磁性纳米粒子2实现磁性，通过吸附的量子点3的类型和数量实现微球编码。
需要说明的是，本申请的量子点是一种准零维的纳米材料，由少量原子构成，具有显著的量子限域效应。目前已经有很多关于量子点的研究，也有比较成熟的量子点制备方法；但是，将量子点应用于生物分子高通量筛选和检测的编码微球，尚未实际应用。
本申请中，生物分子包括DNA、RNA、蛋白质、多肽和药物分子等。本申请的编码微球可以用于这些生物分子的筛选或者检测。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例一
本例采用孔径大小为300埃、粒径5μm的介孔聚苯乙烯微球作为核心，以二氧化硅作为壳层，并采用苏州星烁纳米科技有限公司提供的五种量子点，五种量子点按照五个不同的浓度进行组合，编码了超过1000种微球。量子点和磁性粒子利用疏水作用吸附于介孔聚苯乙烯微球内部。其中，磁性粒子为γ-Fe2O3粒子，五种量子点的发射峰分别为：450nm、500nm、580nm、650nm、750nm。五种量子点及其五个浓度的代码如表1所示。
表1量子点及其浓度的代码
表1中量子点代码A表示发射峰450nm的量子点，量子点代码B表示发射峰500nm的量子点，量子点代码C表示发射峰580nm的量子点，量子点代码D表示发射峰650nm的量子点，量子点代码E表示发射峰750nm的量子点；浓度代码1表示50mg编码微球中含有0mg的量子点，浓度代码2表示50mg编码微球中含有0.25mg的量子点，浓度代码3表示50mg编码微球中含有0.5mg的量子点，浓度代码4表示50mg编码微球中含有0.75mg的量子点，浓度代码5表示50mg编码微球中含有1.0mg的量子点。在具体的编码微球中，以五种量子点代码及五种浓度代码表示该编码微球的编号，例如A2B2C1D1E1表示50mg编码微球中含有发射峰450nm的量子点0.25mg，含有发射峰500nm的量子点0.25mg而其它量子点的含量为0mg。
本例的编码微球的具体制备方法包括：
称取介孔聚苯乙烯微球2g，加入100mL甲苯，超声分散10min后，加入0.2g油酸修饰的γ-Fe2O3磁性纳米粒子，机械搅拌吸附10h后，用G4砂芯漏斗过滤，分别用50mL甲苯和乙醇清洗三次，50℃真空干燥后制得磁性微球。其中，油酸修饰的γ-Fe2O3磁性纳米粒子参考文献Park J,An K,Hwang Y,et al.Ultra-large-scale syntheses of monodispersenanocrystals[J].Nature materials,2004,3(12):891-895.在此不累述。
将0.1g磁性微球溶于25mL甲苯，向其中加入量子点A2B2C1D1E1机械搅拌吸附10h后，清洗，干燥后制得磁性荧光微球。其中，A2B2C1D1E1表示，添加发射峰450nm的量子点0.5mg，添加发射峰500nm的量子点0.5mg，而其它量子点的用量为0mg；更换不同的量子点组合可以获得不同量子点编码的微球。
将0.1g磁性荧光微球溶于5mL水和20mL乙醇，向其中加入50mg十六烷基三甲基溴化铵(缩写CTAB)、0.5ml 28％的氨水，机械搅拌2小时后，将10mL浓度为50g/L的正硅酸乙酯的乙醇溶液缓慢滴加到上述溶液中，常温边滴加边搅拌24h后，清洗，干燥后获得无机材料包裹的磁性荧光微球，即本例的用于生物分子检测或筛选的编码微球。
在本例的用于生物分子检测或筛选的编码微球的基础上，还可以对其编码微球进行氨基或羧基修饰，以使得编码微球具备不同的功能。具体如下：
将0.1g本例的用于生物分子检测或筛选的编码微球溶于20mL乙醇，向其中加入20微升的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，常温机械搅拌10h后，清洗，干燥后制的氨基修饰的编码微球。
将0.1g氨基修饰的编码微球溶于20mL乙醇，向其中加入0.5g丁二酸酐，常温机械搅拌3h后，清洗，干燥后制的羧基修饰的编码微球。
分别对本例制备的用于生物分子检测或筛选的编码微球、氨基修饰的编码微球、羧基修饰的编码微球，进行SEM和荧光显微镜观察。结果显示，微球粒径比较统一，表面比较光滑，单分散且荧光均一。部分结果如图4和图5所示，其中，图4是本例制备的用于生物分子检测或筛选的编码微球的扫描电镜图，可见其微球表面比较光滑，粒径统一；图5是本例制备的用于生物分子检测或筛选的编码微球的荧光显微镜观察得到的图，可见微球的单分散性比较好，荧光强度高且均一。
本例制备的氨基修饰的编码微球和羧基修饰的编码微球，可以用于常规的生物检测，例如基因筛查、癌症基因检测、药物筛选、多肽或蛋白检测等。
实施例二
本例的用于生物分子检测或筛选的编码微球，采用有机材料包裹介孔聚苯乙烯微球，其余与实施例一相同。具体如下：
称取介孔聚苯乙烯微球2g，加入100ml甲苯，超声分散10min后，加入0.2gγ-Fe2O3磁性纳米粒子，机械搅拌吸附10h后，清洗，干燥后制得磁性微球。
将0.1g磁性微球溶于25ml甲苯，向其中加入量子点A2B2C1D1E1机械搅拌吸附10h后，清洗，干燥后制得磁性荧光微球。其中，A2B2C1D1E1表示，添加发射峰450nm的量子点0.5mg，添加发射峰500nm的量子点0.5mg，而其它量子点的用量为0mg。
将0.1g磁性荧光微球溶于20ml乙醇，向其中加入0.5ml质量分数为15％的聚丙烯酸水溶液，机械搅拌吸附12h后，清洗，60℃真空干燥，制得本例的羧基修饰的有机材料包裹的荧光编码微球。需要说明的是，有机材料本身带羧基，所以包裹完成直接获得羧基修饰的编码微球。
将0.1g磁性荧光微球溶于20ml乙醇，向其中加入0.6ml质量分数为20％的聚乙烯亚胺水溶液，机械搅拌吸附20h后，清洗，60℃真空干燥，制得本例的氨基修饰的有机材料包裹的荧光编码微球。
分别对本例制备的羧基修饰的有机材料包裹的荧光编码微球、氨基修饰的有机材料包裹的荧光编码微球，进行SEM和荧光显微镜观察。结果显示，微球粒径比较统一，表面比较光滑，单分散且荧光均一。部分结果如图6和图7所示，其中，图6是本例制备的用于生物分子检测或筛选的编码微球的扫描电镜图，可见其微球表面比较光滑；图7是本例制备的用于生物分子检测或筛选的编码微球的荧光显微镜观察得到的图，可见微球的单分散性好，粒径统一，荧光强度高且均一。
本例制备的氨基修饰的编码微球和羧基修饰的编码微球，可以用于常规的生物检测，例如基因筛查、癌症基因检测、药物筛选、多肽或蛋白检测等。
实施例三
本例以实施例二制备的羧基修饰的编码微球进行埃博拉病毒基因序列检测，检测靶标序列是埃博拉病毒检测的比较常见的靶标序列，如下所示：
5’-GGA GTA AAT GTT GGA GAA CAG TAT CAA CAA-3’
本例的检测靶标及引物和探针设计等，可参考文献Alivisatos P.The use ofnanocrystals in biological detection[J].Nature biotechnology,2004,22(1):47-52.或者参考文献Zhu Q,Xiang D,Zhang C,et al.Multicolour probes for sequence-specific DNA detection based on graphene oxide[J].Analyst,2013,138(18):5194-5196.
本例具体的以含有埃博拉病毒基因序列的血清样品进行试验，血清样品由北京大学深圳研究生院提供保存。
其具体实验流程如下：
一、探针设计和溶液配制
1.埃博拉病毒基因捕获探针
本例采用的埃博拉病毒基因捕获探针为：5’-TCC AAC ATT TAC TCC-NH2-3’；藻红蛋白标记的显色探针(发射峰为580nm)5’-PE-TTG TTG ATA CTG TTC-3’。同时对照探针为：5’-GAA GAT ATG TCT CAT-NH2-3’。本例的捕获探针、显色探针和对照探针均由北京大学深圳研究生院提供和保存。
需要说明的是，本例的捕获探针用于捕获埃博拉病毒基因靶标片段，而显色探针与被捕获的埃博拉病毒基因靶标片段相邻区域互补，因此一起被捕获探针捕获，显色探针的藻红蛋白标记可以通过液相芯片分析平台或者荧光显微镜进行观察。
2.溶液配制
探针溶液：用去离子水配置10mL 0.01M的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(缩写MES)溶液，即MES溶液。将捕获探针溶于MES溶液中，制成100μL 1nM的捕获探针溶液。将显色探针溶于MES溶液中，制成100μL 1nM的显色探针溶液。将对照探针溶于MES溶液中，制成100μL 1nM的显色探针溶液。
编码微球溶液：分别量取5000个实施例二中的羧基修饰的450nm和500nm(A2B2C1D1E1)量子点标记的编码微球(下称450-500编码微球)和羧基修饰的650nm(A1B1C1D2E1)量子点标记的编码微球(下称650编码微球)，置于200μL的离心管中，用3mLpH7.4浓度0.01M的磷酸缓冲液(缩写PBS)离心洗涤三次，最终悬浮于20μL的pH7.4浓度0.01M的PBS中，即编码微球溶液。本例具体制备了20μL 450-500编码微球和20μL 650编码微球，每个编码微球的数量都是5000个。
二、探针与编码微球偶联
称取1mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，迅速加入1mL的MES溶液中，制成EDC-MES溶液。
量取10μL EDC-MES溶液和10μL捕获探针溶液，加入20μL 450-500编码微球中，混合均匀后置于摇床上，于25℃下缓慢振荡2h；然后用4mL的PBS洗涤离心4次；向离心产物中加入50μL的质量分数为1％氨基乙醇水溶液，于25℃下缓慢振荡30min；然后用4mL的PBS洗涤离心4次；向离心产物中加入50μL的质量分数为1％的牛血清蛋白水溶液，于25℃下缓慢振荡30min；然后再用4mL的PBS洗涤离心4次；将离心产物分散于20μL含有0.15M NaCl的PBS缓冲液中，即获得偶联捕获探针的450-500编码微球。
650编码微球通过以上方法偶联对照探针。
三、埃博拉病毒基因检测
将10μL偶联有捕获探针的450-500编码微球，10μL偶联有对照探针的650编码微球，混合均匀；然后与20μL血清样品混合均匀，置于摇床中，于25℃下缓慢振荡30min；然后用4mL的PBS离心洗涤4次后，将最终得到的微球分散于20μL含有0.15M NaCl的PBS缓冲液中；然后向其中加入20μL显色探针溶液，混合均匀后至于摇床中，于25℃下缓慢振荡反应30min；然后用4mL的PBS离心洗涤4次后，将最终得到的微球分散于20μL含有0.15M NaCl的PBS缓冲液中。将反应完成的溶液滴在洁净的载玻片上，盖上盖玻片，用磁铁将微球固定，用液相芯片分析平台或者荧光显微镜进行观察，本例具体采用的是液相芯片分析平台。
四个荧光通道的结果如图8所示，其中1图为450nm通道、2图为500nm通道、3图为580nm通道、4图为650nm通道。结果发现，450-500编码微球有580nm的荧光，该荧光即藻红蛋白标记的荧光；而650编码微球没有发现580nm的荧光。证明，偶联了捕获探针的450-500编码微球能够有效的检测出血清样品中的埃博拉病毒，而作为对比的650编码微球则没有任何除自身外的荧光信号，与预期相符。进一步的，从580nm通道的荧光强度可以计算出，本例所采用的血清样品中，埃博拉病毒靶标序列的大概浓度为21±0.5ng/μL。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于生物分子高通量筛选或检测的编码微球，其特征在于：所述编码微球为核壳结构，以介孔有机微球为核心，介孔有机微球吸附磁性粒子和量子点，然后以有机材料或者无机材料为外壳，通过吸附的磁性纳米粒子实现磁性，通过吸附的量子点的类型和数量实现微球编码；
所述介孔有机微球为介孔聚苯乙烯微球或介孔聚丙烯酸酯类微球，介孔有机微球的孔径为50埃-500埃；
所述外壳的有机材料选自聚乙烯亚胺、聚苯乙烯磺酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、重氮树脂或聚丙烯酸；无机材料为二氧化硅；
所述磁性粒子为磁性γ-Fe2O3纳米粒子和/或Fe3O4纳米粒子；
所述编码微球的粒径为3μm-30μm。
2.根据权利要求1所述的编码微球，其特征在于：所述编码微球的表面具有修饰基团，所述修饰基团包括羧基、氨基。
3.根据权利要求1或2所述的编码微球在生物分子高通量筛选或检测中的应用，所述生物分子包括DNA、RNA、蛋白质、多肽或药物分子。
4.根据权利要求1或2所述的编码微球在制备筛选或检测DNA、RNA、蛋白质、多肽或药物分子的试剂盒或装置中的应用。
5.一种用于生物分子高通量筛选或检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1或2所述的编码微球。
6.根据权利要求1或2所述的编码微球的制备方法，其特征在于：包括利用疏水作用，将油酸修饰的量子点和磁性粒子吸附到介孔有机微球内部，然后采用有机材料或者无机材料包覆，在介孔有机微球表面形成10-500nm的壳层。
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