CN105080439B - 一种高荧光强度微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高荧光强度微球及其制备方法，将油溶性量子点与高分子介孔微球分散于氯仿，以马来酸酐共聚物为表面活性介导分子，加入碱性水溶液或胺类化合物，使油溶性量子点进入高分子介孔微球的孔道内部，从而获得表面具有丰富羧基功能基团的荧光微球。通过本发明制备得到的荧光微球与传统溶胀法相比，荧光强度提高10倍以上，且荧光微球表面具有丰富的功能基团，有利于其在下游生物医学领域的应用。

Description

一种高荧光强度微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种微球的制备方法，尤其涉及一种高荧光强度微球的制备方法，属于纳米生物材料领域。

背景技术

基于荧光编码微球的悬浮微阵列技术具有对同一种样品中的多种蛋白、细胞因子等进行同时筛选和定量的能力，在疾病诊断领域具有很高的研究和应用价值。悬浮微阵列技术的核心技术是在检测过程具有独特标记信号的编码微球，该微球可以通过有机荧光基团、拉曼探针、或者量子点纳米晶等发光材料标记获得。相比其他发光材料，量子点因具有宽激发谱、窄发射谱、发射波长可通过尺寸调节等优点而被认为是理想的荧光编码材料。因此，自从Nie等(Nature Biotechnology，2001,19,631-635)首先提出以量子点为原料制备多色编码微球以来，应用于多指标检测体系，基于量子点进行多色编码的概念得到了科学家们的广泛关注。

为了将量子点微球应用于高通量的多指标检测体系，大量的研究都集中到如何将量子点装载入微球内部，从而获得高荧光强度、尺寸均一、表面功能化、生物相容性良好的量子点编码微球。目前制备量子点编码微球的方法主要有三种：

一、通过溶胀法直接将量子点包埋于聚合物微球中。Nie等(NatureBiotechnology，2001,19,631-635)首先利用溶胀法制备多色量子点微球，证明其可应用于生物检测，但该种方法制备得到的荧光微球量子点装载数量有限，荧光强度低，不能实现高通量的多指标检测。为了提高量子点编码微球性能，Gao和Nie(Anal.Chem.2004,76,406-2410)利用15μm的介孔聚苯乙烯微球为基质，合成了尺寸均一、高荧光强度的量子点微球，该多孔微球相比于无孔微球，微球内部装载的量子点数量大，其荧光强度提高了近1000倍。然而，由于该溶胀法采用氯仿/正丁醇作为混合溶剂进行溶胀与装载，而正丁醇会影响量子点的表面结构，导致其荧光淬灭，因此采用该方法制备得到的荧光微球内部的量子点的荧光性能会受到影响，得到的微球总体荧光强度与荧光编码能力仍无法满足多指标检测的编码需求。最近，Wang等(langmuir 2012,28,6141-6150)发展了一种溶胀-蒸发法，通过在微球溶胀装载量子点的过程中不断蒸发氯仿来提高溶胀溶剂中量子点浓度，以此为推动力使量子点更有利于扩散进入微球孔道，避免使用传统溶胀法中正丁醇等不良溶剂对量子点表面结构的破坏，从而获得高荧光强度的量子点微球。但是由于蒸发氯仿的过程难控制，极易引起量子点自身团聚粘附于微球表面，最终获得的荧光微球的荧光均一性变差。

二、在微球合成过程中通过化学接枝或者包埋法装载量子点，其中包括种子生长法与微乳液聚合法。前者是以聚合物微球为种子，加入单体、引发剂以及量子点在种子表面进行聚合反应，Bawendi等(Langmuir 2006,22:3782–3790)通过在乙醇相中聚合制备得单色量子点微球，量子点能够均匀分布于微球内部，但聚合获得的微球尺寸不均一，且不能有效控制量子点的装载数量，因此认为该法不适合制备编码微球。Joumaa等(Langmuir 2006,22,1810-1816)采用微乳液聚合法虽然能够保证量子点在微球内部分布，但由于量子点与聚苯乙烯在制备过程两相分离，透射电镜结果显示量子点在微球内部成团聚状分布，影响微球的荧光强度与均一性。

三、通过层层自组装的方法在微球表面包覆量子点。Rogach等(Colloids andSurfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects 163(2009):39–44)通过利用相反电荷间的静电作用，将水溶性量子点CdTe包覆于聚合物微球表面，Pang等(Anal.Chem.2013,85,11929-11935)以聚苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米微球为模板，通过层层自组装的方法将荧光量子点与磁性纳米氧化铁颗粒组装到微球表面，通过在包覆过程中调节量子点的种类以及两种纳米粒子的包覆量，来制备不同荧光发射和磁响应性的双编码微球。但水溶性量子点相比油溶性量子点，其量子产率低，且层层自组装法的制备过程复杂，不易获得具有高荧光强度的量子点荧光微球。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种高荧光强度微球及其制备方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种高荧光强度微球的制备方法。将油溶性量子点与高分子介孔微球分散于氯仿，以马来酸酐共聚物为表面活性介导分子，加入碱性水溶液或胺类化合物，使油溶性量子点进入高分子介孔微球的孔道内部，从而获得高荧光强度的微球。本发明制备的荧光微球的荧光强度比现有溶胀方法制得的微球荧光强度提高至少10倍以上，且微球表面具有丰富的功能基团，更有利于其在下游生物医学领域的应用。

进一步地，所述高分子介孔微球为聚苯乙烯介孔微球，粒径为1～100μm，优选粒径为3-10μm；微球的介孔孔径为10-50nm，优选为30-40nm。

进一步地，本发明中所述的马来酸酐聚合物包括均聚物或者共聚物，包括两个单元形成的聚合物，还包括三个或多个单体单元形成的聚合物，聚合物可以是交替、无规嵌段和接枝共聚物，优选疏水性马来酸酐无规聚合物。具体包括但不限于：聚马来酸酐或其任意的高级脂肪类聚合物或芳香类聚合物，如聚马来酸酐十八醇酯、聚马来酸酐十六醇酯、聚马来酸酐十四醇酯、聚马来酸酐十八醇醚、聚马来酸酐十六醇醚和聚马来酸酐十四醇醚、聚马来酸酐十八碳烯、聚马来酸酐十六碳烯、聚马来酸酐十四碳烯、聚(乙烯-alt-马来酸酐)、聚(苯乙烯-alt-马来酸酐)、聚(苯乙烯-co-马来酸酐)、聚(乙烯基甲醚-alt-马来酸酐)、聚(异丁烯-alt-马来酸酐)、聚(乙烯-co-乙酸乙烯酯)-graft-马来酸酐。

进一步地，本发明所述的胺类化合物包括分子链中含有伯胺、仲胺、叔胺中任意一种或多种的胺类化合物，具体包括但不限于：水合氨、氨基烷烃如2-氨基己烷；氨基硅烷如3-氨基三甲氧基硅烷；氨基醇类如氨基乙醇；氨基酸类如3-氨基丁酸；烷胺类如乙胺、丁胺、乙醇胺；亚胺类如聚乙烯亚胺、马来酰亚胺。

进一步地，本发明所述的量子点为球形或类球形，是由半导体材料(通常由IIB～VIA或IIIA～VA元素组成)制成的、粒径在2～20nm的纳米粒子。优选粒径在2～6nm的纳米粒子，如包括含镉的油溶性纳米晶CdS、CdSe、CdTe；不含镉的油溶性纳米晶InP、CuInS；含镉的油溶性核壳结构纳米晶CdSSe/ZnS、CdSe/ZnS、CdTe/ZnS；不含镉的油溶性核壳结构纳米晶InP/ZnS、CuInS/ZnS。

进一步地，本方法具体包括以下步骤：

a)准备聚苯乙烯介孔微球；

b)配制溶液；

c)制备量子点分散液；

d)制备高荧光强度的聚苯乙烯介孔微球。

进一步地，所述步骤(a)具体为：将聚苯乙烯介孔微球加入离心管中，聚苯乙烯介孔微球的质量与离心管的体积比为：1:2-5:1mg/mL。

进一步地，所述步骤(b)所述的溶液包括马来酸酐共聚物溶液，配制方法为：称取马来酸酐共聚物，分散于氯仿中，超声溶解，其中马来酸酐共聚物的质量与氯仿的体积比为：20:1-80:1mg/mL，超声频率为80-500W。

进一步地，所述步骤(b)所述的溶液还包括碱性水溶液A、碱性水溶液B、3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES或3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS溶液，配制方法为：

碱性水溶液A：将氢氧化钠溶于水，配制成0.5mM-50mM浓度的氢氧化钠水溶液，调节pH范围在10～12；

碱性水溶液B:将聚乙烯亚胺(PEI)溶于水，聚乙烯亚胺水溶液的浓度为：0.5-80mg/mL，,调节pH范围在9～12；

3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES溶液配制方法：取30μL APTES，加入170μL氯仿，充分溶解得到APTES氯仿溶液；

3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS溶液配制方法：取30μL APTMS，加入170μL氯仿，充分溶解得到APTMS氯仿溶液。

进一步地，所述步骤(c)具体为：取30μM的CdSe/ZnS正己烷分散液10-200μL于离心管中，加入20-500μL乙醇，将CdSe/ZnS乙醇混合液离心，离心后弃去上清液，得到沉淀，沉淀为量子点颗粒，室温敞口放置离心所得沉淀10min，挥发去表面残余的乙醇溶剂，再将所得沉淀重新分散于20-100μL氯仿中，超声分散，得到量子点分散液，离心转速为：5000-10000rpm，离心时间为3-5min；超声功率为80-500W，时间为2～3分钟。

进一步地，所述步骤(d)包括以下步骤：

1)将步骤(c)中获得的量子点分散液中加入步骤(b)中配制的马来酸酐共聚物的氯仿溶液，超声分散，使混合均匀，得到量子点马来酸酐共聚物分散液，超声功率为80-500W，时间为2～3分钟；

2)向步骤(a)中准备的聚苯乙烯介孔微球加入获得的30～150μL量子点马来酸酐共聚物分散液，使聚苯乙烯介孔微球完全浸润于分散液中，超声分散，得到量子点聚苯乙烯介孔微球分散液，超声功率80～500W，时间2～10分钟；

3)向量子点聚苯乙烯介孔微球分散液中加入50-500μL步骤(b)中配制的碱性水溶液A或碱液水溶液B，超声振荡混合，使溶液分散均匀，得到反应混合液，将所述反应混合液离心，离心后弃去上清液，保留离心后的微球颗粒；超声温度15～35℃，超声功率80～500W，时间2～10min，离心时间3～5min，离心转速6000～14500rpm；

4)向微球颗粒加入100～1000μL超纯水，重新分散，离心弃去上清液，再次加入超纯水重新分散并离心，重复2～5次，将所得微球颗粒重新分散于100～1000μL超纯水中保存，超声功率80～500W，离心时间3～5min，离心转速6000～14500rpm，超纯水pH值为6-8。

进一步地，所述步骤(d)还可以包括以下步骤：

1)将步骤(c)中获得的量子点分散液中加入步骤(b)中配制的马来酸酐共聚物的氯仿溶液，超声分散，使混合均匀，得到量子点马来酸酐共聚物分散液，超声功率为80-500W，时间为2～3分钟；

2)向步骤(a)中准备的聚苯乙烯介孔微球加入获得的30～150μL量子点马来酸酐共聚物分散液，再加入50-350μL步骤(c)中配制的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液或3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)溶液，使聚苯乙烯介孔微球完全浸润于分散液中，超声分散，并转轮混合，得到量子点聚苯乙烯介孔微球分散液，超声功率80～500W，超声时间1～2分钟，转轮混合时间为20min，转轮温度为15～35℃；

3)向量子点聚苯乙烯介孔微球分散液中加入50-2500μL超纯水，超声振荡混合，使溶液分散均匀，得到反应混合液，将所述反应混合液离心，离心后弃去上清液，保留离心后的微球颗粒；超声温度15～35℃，超声功率80～500W，超声时间2～10min，离心时间3～5min，离心转速6000～14500rpm；

4)向微球颗粒加入100～1000μL乙醇，重新分散，离心弃去上清液，再次加入乙醇重新分散并离心，重复2～5次，将所得微球颗粒重新分散于100～1000μL乙醇中保存，超声功率80～500W，离心时间3～5min，离心转速6000～14500rpm，超纯水pH值为6-8。

按上述方法制得的高荧光强度微球，是表面具有羧基功能基团的量子点荧光微球。

本发明通过引入马来酸酐共聚物为表面介导活性分子，使得油溶性量子点以较好地单分散状态按照一定的分配系数在油水两相之间进行浓度分配，由于聚苯乙烯介孔孔道与量子点表面配基之间存在较强疏水键作用，从而促使量子点进入介孔孔道内部获得量子点装载的介孔微球。同时，因马来酸酐共聚物的疏水端与聚苯乙烯微球也有疏水作用而分布于其表面，其亲水端马来酸酐在碱性(pH10～13)条件水解开环变成羧基，或者氨解开环最终获得表面具有丰富羧基等功能基团的量子点荧光微球。该种荧光微球的荧光强度不仅比现有溶胀技术所制得的微球荧光强度提高10倍以上，且微球表面具有丰富的功能基团，更有利于其在下游生物医学领域中的应用。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的荧光微球在流式细胞仪测得的荧光分布图。

图2是本发明实施例2制备的荧光微球在流式细胞仪测得的荧光分布图。

图3是本发明实施例3制备的荧光微球在流式细胞仪测得的荧光分布图。

图4是本发明实施例4制备的荧光微球在流式细胞仪测得的荧光分布图。

具体实施方式

实施例1

步骤1、精密天平称量1份6.85mg孔径为30nm的聚苯乙烯介孔微球，加入2mL离心管中；

步骤2、称取40mg聚马来酸酐十八醇酯(PMAO，Mn～30000-50000)，溶解于1mL氯仿，待用；

步骤3、配制碱性水溶液：吸取200μL 1M的氢氧化钠水溶液，加入到4mL超纯水中，10mL玻璃瓶保存；

步骤4、取120μL CdSe/ZnS分散液(正己烷分散液，30μM)于500μL离心管，加入200μL乙醇絮凝；

步骤5、对步骤4中的量子点乙醇混和液离心(3min，8000rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤6、室温挥发步骤5获得的量子点颗粒表面残余的乙醇，然后再将量子点重新分散于100μL氯仿；

步骤7、向步骤6中获得的量子点氯仿分散液中加入步骤2配制的50μL聚马来酸酐十八醇酯(氯仿，40mg/mL)，超声分散，使混合均匀；

步骤8、向称好的6.85mg聚苯乙烯微球中加入步骤7获得的150μL量子点氯仿分散液，使聚苯乙烯颗粒完全浸润于氯仿分散液中，得到分散液，超声分散10min；

步骤9、向步骤8中获得的分散液中加入500μL步骤3中配好的氢氧化钠溶液，超声5min，使溶液分散均匀，得反应混合液；

步骤10、将步骤9获得的反应混合液离心(2min，13000rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤11、向步骤10获得的微球颗粒加入1mL超纯水，超声重新分散后离心(2min，13000rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤12、重复步骤102～5次，最后将所得微球颗粒重新分散于1mL水，即得所述荧光微球。

如图1所示，实施例1制得的微球的平均荧光强度为57951.08，荧光强度CV值为19.73％。

实施例2

步骤1、精密天平称量1份6.85mg孔径为30nm的聚苯乙烯介孔微球，倒入2mL离心管中；

步骤2、称取40mg聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(PSMA，Mn～1700)，溶解于1mL氯仿，待用；

步骤3、配制碱性水溶液：吸取200μL 1M的氢氧化钠水溶液，加入到4mL超纯水中，10mL玻璃瓶保存；

步骤4、取120μL CdSe/ZnS分散液(正己烷分散，30μM)于500μL离心管，加入200μL乙醇絮凝；

步骤5、对步骤4中的量子点乙醇混和液离心(3min，8000rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤6、室温挥发步骤5获得的量子点颗粒表面残余的乙醇，然后再将量子点重新分散于100μL氯仿；

步骤7、向步骤6中获得的量子点氯仿分散液中加入步骤2配制的50μL聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(氯仿，40mg/mL)，超声分散，使混合均匀；

步骤8、向称好的6.85mg聚苯乙烯微球中加入步骤7获得的150μL量子点氯仿分散液，使聚苯乙烯颗粒完全浸润于氯仿分散液中，得到粉色分散液，超声分散2min；

步骤9、向步骤8中获得的分散液中加入500μL步骤3中配好的氢氧化钠溶液，超声10min，使溶液分散均匀，得到反应混合液；

步骤10、将步骤9获得的反应混合液离心(2min，13000rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤11、向步骤10获得的微球颗粒加入1mL超纯水，超声重新分散后离心(2min，13000rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤12、重复步骤102～5次，将所得微球颗粒重新分散于1mL水，即得荧光微球。

如图2所示，实施例2制得的微球的平均荧光强度为42171.86，荧光强度CV值为23.66％。

实施例3

步骤1、精密天平称量1份1.37mg孔径为30nm的聚苯乙烯介孔微球，加入2mL离心管中；

步骤2、取24μL CdSe/ZnS分散液(正己烷，30μM)于500μL离心管，加入50uL乙醇絮凝；

步骤3、对步骤2中的量子点乙醇混和液离心(3min，8000rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤4、室温挥发步骤3获得的量子点颗粒表面残余的乙醇，然后再将量子点重新分散于30μL氯仿；

步骤5、向步骤4中获得的量子点氯仿分散液中加入0.4mg聚马来酸酐十八醇酯，超声分散，使混合均匀；

步骤6、向称好的1.37mg聚苯乙烯微球中加入步骤5获得的30μL量子点氯仿分散液，使聚苯乙烯颗粒完全浸润于氯仿分散液中，超声分散10min得到粉色分散液；

步骤7、称取4.5mg聚乙烯亚胺，溶于200μL超纯水后，加入步骤6获得的分散液，超声反应10分钟，获得粉红色乳液；

步骤8、将步骤7获得的反应混合液离心，离心条件为5min，12500rpm，离心后倾倒上清液；

步骤9、向步骤8获得的颗粒沉淀加入1mL超纯水,超声重分散后离心(5min，12500rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤10、重复步骤9洗涤3次，最后向微球颗粒中加入于1mL超纯水，超声重新分散后离心(5min，1500rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤11、将所得微球颗粒重新分散于1mL超纯水，即得荧光微球。

如图3所示，实施例3制得的微球的平均荧光强度为138470.51,荧光强度CV值为54.21％。

实施例4

制备过程包括以下步骤：

步骤1、精密天平称量1份2.7mg孔径为30nm的聚苯乙烯介孔微球，加入2mL离心管中；

步骤2、取48μL CdSe/ZnS分散液(正己烷，30μM)于500μL离心管，加入100uL乙醇絮凝；

步骤3、对步骤2中的量子点乙醇混和液离心(3min，8000rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤4、室温挥发步骤3获得的量子点颗粒表面残余的乙醇，然后再将量子点重新分散于300μL氯仿；

步骤5、向步骤4中获得的量子点氯仿分散液中加入0.8mg聚马来酸酐十八醇酯，超声分散，使混合均匀；

步骤6、向称好的6.85mg聚苯乙烯微球中加入步骤5获得的300μL量子点氯仿分散液，使聚苯乙烯颗粒完全浸润于氯仿分散液中，得到粉色分散液，超声分散10分钟；

步骤7、吸取30μL氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，溶于170μL氯仿后，加入步骤6获得的分散液，转轮反应20分钟；

步骤8、反应完毕后，向步骤7所得混合液加入1mL超纯水，超声反应2-3分钟，直至获得粉红色乳液；

步骤9、将步骤8获得的反应混合液离心(2min，13000rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤10、向步骤9获得的微球颗粒加入1mL乙醇，超声重新分散后离心(2min，13000rpm)，离心后倾倒上清液；

步骤11、重复步骤102～5次，将所得微球颗粒重分散于1mL乙醇，即得荧光微球。

如图4所示，实施例4制得的微球的平均荧光强度为95189.48,荧光强度CV值为70.34％。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种高荧光强度微球的制备方法，其特征在于，首先将油溶性量子点与马来酸酐共聚物氯仿溶液混合；然后，加入高分子介孔微球，以马来酸酐共聚物为表面活性介导分子得到量子点、马来酸酐共聚物与高分子介孔微球分散液；最后，加入碱性水溶液或胺类化合物，使油溶性量子点进入高分子介孔微球的孔道内部，从而获得高荧光强度的微球；

其中，所述高分子介孔微球为具有疏水性的高分子介孔微球；所述马来酸酐共聚物为具有亲水端和疏水端的马来酸酐共聚物。

2.如权利要求1所述的一种高荧光强度微球的制备方法，其特征在于，所述高分子介孔微球为聚苯乙烯介孔微球，粒径为1～100μm，所述微球的介孔孔径为10-50nm，所述马来酸酐共聚物包括两个单元形成的聚合物，还包括三个或多个单元形成的聚合物，所述的胺类化合物包括分子链中含有伯胺、仲胺、叔胺中一种或多种的胺类化合物。

3.如权利要求1所述的一种高荧光强度微球的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(a)准备聚苯乙烯介孔微球；

(b)配制溶液；

(c)制备量子点分散液；

(d)制备高荧光强度的聚苯乙烯介孔微球。

4.如权利要求3所述的一种高荧光强度微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)具体为：将聚苯乙烯介孔微球加入离心管中，聚苯乙烯介孔微球的质量与离心管的体积比为：1:2-5:1mg/mL。

5.如权利要求4所述的一种高荧光强度微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)所述的溶液包括马来酸酐共聚物溶液，配制方法为：称取马来酸酐共聚物，分散于氯仿中，超声溶解，其中马来酸酐共聚物的质量与氯仿的体积比为：20:1-80:1mg/mL，超声功率为80-500W。

6.如权利要求5所述的一种高荧光强度微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)所述的溶液还包括碱性水溶液A、碱性水溶液B，3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES溶液或3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS溶液，配制方法为：

碱性水溶液A：将氢氧化钠溶于水，配制成0.5mM-50mM浓度的氢氧化钠水溶液，调节pH范围在10～12；

碱性水溶液B：将聚乙烯亚胺溶于水，聚乙烯亚胺水溶液的浓度为：0.5-80mg/mL，调节pH范围在9～12；

3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES溶液配制方法：取30μL APTES，加入170μL氯仿，充分溶解得到APTES氯仿溶液；

3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS溶液配制方法：取30μL APTMS，加入170μL氯仿，充分溶解得到APTMS氯仿溶液。

7.如权利要求6所述的一种高荧光强度微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)具体为：

取30μM的CdSe/ZnS正己烷分散液10-200μL，加入20-500μL乙醇；将CdSe/ZnS乙醇混合液离心，离心后弃去上清液，得到沉淀，沉淀为量子点颗粒，室温敞口放置离心所得沉淀10min，挥发去表面残余的乙醇溶剂，再将所得沉淀重新分散于20-100μL氯仿中，超声分散，得到量子点分散液。

8.如权利要求7所述的一种高荧光强度微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)包括以下步骤：

1)将步骤(c)中获得的量子点分散液中加入步骤(b)中配制的马来酸酐共聚物的氯仿溶液，超声分散，使混合均匀，得到量子点马来酸酐共聚物分散液；

2)向步骤(a)中准备的聚苯乙烯介孔微球加入30～150μL获得的量子点马来酸酐共聚物分散液，使聚苯乙烯介孔微球完全浸润于分散液中，超声分散，得到量子点、马来酸酐共聚物与聚苯乙烯介孔微球分散液；

3)向量子点、马来酸酐共聚物与聚苯乙烯介孔微球分散液中加入50-500μL步骤(b)中配制的碱性水溶液A或碱液水溶液B，超声振荡混合，使溶液分散均匀，得到反应混合液，将所述反应混合液离心，离心后弃去上清液，保留离心后的微球颗粒；

4)向微球颗粒加入100～1000μL超纯水，重新分散，离心弃去上清液，再次加入超纯水重新分散并离心，重复2～5次，将所得微球颗粒重新分散于100～1000μL超纯水中保存。

9.如权利要求7所述的一种高荧光强度微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)包括以下步骤：

1)将步骤(c)中获得的量子点分散液中加入步骤(b)中配制的马来酸酐共聚物的氯仿溶液，超声分散，使混合均匀，得到量子点马来酸酐共聚物分散液；

2)向步骤(a)中准备的聚苯乙烯介孔微球加入30～150μL获得的量子点马来酸酐共聚物分散液，再加入50-350μL步骤(c)中配制的3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液或3-氨丙基三甲氧基硅烷溶液，使聚苯乙烯介孔微球完全浸润于分散液中，超声分散，并转轮混合，得到量子点、马来酸酐共聚物与聚苯乙烯介孔微球分散液；

3)向量子点、马来酸酐共聚物与聚苯乙烯介孔微球分散液中加入50-2500μL超纯水，超声振荡混合，使溶液分散均匀，得到反应混合液，将所述反应混合液离心，离心后弃去上清液，保留离心后的微球颗粒；

4)向微球颗粒加入100～1000μL乙醇，重新分散，离心弃去上清液，再次加入乙醇重新分散并离心，重复2～5次，将所得微球颗粒重新分散于100～1000μL乙醇中保存。

10.一种如权利要求1-9所述的方法制得的高荧光强度微球，其特征在于，所述高荧光强度微球是表面具有羧基功能基团的量子点荧光微球。