CN104698171B - 一种基于胶体金与发光量子点二聚体的二级可选灵敏度侧向层析快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于胶体金与发光量子点二聚体的可选二级灵敏度侧向层析快速检测方法，灵敏度要求较低时，可见光下利用胶体金的红色反射光检测；灵敏度要求较高或胶体金不可区分时，紫外灯下利用量子点的荧光检测。本发明以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的毛细作用，滴加在膜条一端的液体向另一端渗移，通过抗原抗体结合，利用胶体金呈现颜色和量子点的荧光检测抗原，试纸包括吸水垫①、结合垫、检测线、质控线、吸水垫、底板、硝酸纤维素膜。吸水垫①、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫②由底板一侧依次向底板另一侧粘贴在所述底板上，硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，其检测准确灵敏，并实现对多种大分子或小分子物质的可选检测。
Description
技术领域：
本发明涉及医学检测、食品质量检测、环境监测、农业和畜牧业检测、出入境检验检疫等检测领域，以三聚氰胺为例叙述可选二级灵敏度检测试纸的制备方法、检测方法及应用。
背景技术：
可选二级灵敏度检测试纸是基于胶体金免疫层析试纸发展起来的，胶体金免疫层析试纸是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将胶体金快速检测技术应用于抗原抗体反应，将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当干燥的硝酸纤维膜一端浸入样品后，由于微孔膜的毛细作用，样品将沿着该纤维膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，通过反应区域颜色变化来实现特异性的免疫诊断。胶体金免疫层析试纸具有检测效率高、方法简便、成本低廉等特点，技术已经广泛应用于食品、药品、水质控制、医疗等各个领域。
目前胶体金免疫层析试纸的检测方法主要是依靠人眼观察判断，检测灵敏度只能在纳克级(ng)；当待检测物质浓度处于临界范围时，试纸条条纹质控区带和待测区带的颜色对比不明显，目测难以判断，存在假阳性和假阴性问题；因此亟待开发一种可以在同一种试纸上便可实现高、低两种不同灵敏度的检测试纸。
发明内容：
发明目的：本发明提供一种可选灵敏度的侧向层析免疫检测试纸，在对灵敏度要求较低的条件下，此试纸与目前的胶体金试纸相同，只需肉眼在可见光下即可进行检测；但在对灵敏度要求较高的条件下(或者超出目前胶体金试纸灵敏度范围的条件下)，此试纸在一个简易的紫外灯照射下，可以实现比胶体金试纸灵敏度高10倍以上的检测效果，所以是一种灵敏度可选的免疫检测试纸。
本发明的技术方案：发明原理以竞争结合法具体说明(如图1所示)。G处为胶体金与量子点二聚体标记的抗体，T处包被标准抗原，C处包被抗免疫二聚体抗体的抗体(二抗)，测试时待测标本加于A端，若待测标本中含有待测抗原，流经G处时结合二聚体标记的抗体，当混合物移至T处时，因无足够游离的二聚体抗体与膜上标准抗原结合，T处无棕红色线条出现，游离二聚体标抗体或二聚体抗体复合物流经C处，与该处的抗二聚体抗体结合出现棕红色的质控带，此时实现低灵敏度检测；在紫外灯照射下可以实现高灵敏度检测；检测依据是：T处没有荧光，C处有荧光，实验结果为阳性，若标本中不含待测抗原，二聚体抗体则与T处膜上的标准抗原结合，在T处出现棕红色的线条，待测液继续前行，C处也出现红色，且用紫外灯照射T处有荧光，C处也有荧光，实验结果为阴性。
一、可选灵敏度检测试纸的制备：包括两性聚合物合成、纳米颗粒(胶体金和量子点)油相转水相、量子点与胶体金二聚体的制备、二聚体标记单抗、喷膜、组装。试纸组件由：1、吸水垫①；2、结合垫；3、检测线；4、质控线；5、吸水垫②；6、底板；7、硝酸纤维素膜。如图2所示。在硝酸纤维素膜的上面两端分别连接结合垫、吸水垫①和吸水垫②，吸水垫①位于结合垫的上表面，硝酸纤维素膜的下表面与底板固定相连。结合垫是含有二聚体标单抗的玻璃纤维素膜，检测线为包被在硝酸纤维素膜上的小分子抗原与蛋白的偶联物，质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠二抗。
二、可选灵敏度检测试纸的制备流程：
1、两性聚合物合成：将十二烷胺和异丁烯马来酸酐在有机溶剂中充分反应，产生一种既有亲水基团又有疏水基团的齿状聚合物。此聚合物可将油相的纳米颗粒转到水相。
2、纳米颗粒(胶体金和量子点)油相转水相：适量的纳米颗粒与两亲聚合物在有机溶剂中混合，充分反应后，聚合物将纳米颗粒包裹，聚合物的亲水基团(羧基)暴露在外。
3、量子点与胶体金二聚体的制备：
(1)经过修饰的PEG一端带有氨基，另一端带有炔基；EDC可以活化纳米颗粒表面的羧基，使得PEG上的氨基与纳米颗粒上的羧基反应，最终纳米颗粒会带有一炔基。
(2)经过修饰的PEG一端带有氨基，另一端带有叠氮基；EDC可以活化纳米颗粒表面的羧基，使得PEG上的氨基与纳米颗粒上的羧基反应，最终纳米颗粒会带有一叠氮基。
(3)利用琼脂糖电泳分离法，将分子量在5kDa以上的PEG分子在2％的琼脂糖电泳胶上分离出一个颗粒只带一个PEG分子的纳米复合物；叠氮基和炔基在一价铜的催化下，环加成形成五元环将两个纳米颗粒高效链接，形成二聚体。
4、颗粒二聚体标记单抗：纳米颗粒自身有生物相容性，纳米颗粒与单抗混合，在适当的pH条件下，二聚体与单抗静电吸附，通过离心法去除过量的单抗，重新溶解沉淀得到颗粒二聚体标记的单抗溶液。
5、喷膜：在玻璃纤维素膜上喷颗粒二聚体标记的单抗，制备好结合垫。在硝酸纤维素膜上靠近结合垫的一端喷偶联物，即为检测线，与检测线相隔约1厘米的另一端喷羊抗鼠二抗，即为质控线。
6、组装：在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴颗粒二聚体垫，二聚体垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。
7、结果检测：可见光下(或在紫外灯照射下)试纸条可有四种不同结果(图3)。
有益效果：可选灵敏度检测试纸在灵敏度要求较低时，只用肉眼在可见光下即可得到胶体金的红色检测结果；而在要求灵敏度较高的环境下，或者在可见光无法分辨的情况下，置于紫外等照射的条件下，即可观察荧光结果。从而不仅使得检测的结果更加准确可靠，而且至少可以比传统的胶体金试纸提高10倍以上的检测灵敏度。
附图说明：
图1可选灵敏度检测试纸的原理示意图；
图2可选灵敏度检测试纸的结构示意图；
图3是可选灵敏度检测试纸的阳性、阴性及无效结果示意图；
具体实施方式：以三聚氰胺作为检测实例
一种基于胶体金和量子点的三聚氰胺可选灵敏度检测试纸条，其特征在于1、吸水垫①；2、结合垫；3、检测线；4、质控线；5、吸水垫②；6、底板；7、硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上表面分别设置检测线和质控线，样品垫位于结合垫上表面，硝酸纤维素膜下表面与底板固定相连，所述结合垫为含有二聚体标记的三聚氰胺单抗；所述检测线为包被在硝酸纤维素膜上的三聚氰胺与牛血清蛋白的偶联物；所述质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG二抗。
基于胶体金和量子点的三聚氰胺可选灵敏度检测试纸条的制备方法：
1、两性聚合物合成：
(1)称取1.35g十二烷胺溶于50ml的四氢呋喃；
(2)称取1.54g的异丁烯马来酸酐粉末置于另一个250ml的圆底烧瓶；
(3)待十二烷胺和四氢呋喃混匀并快速倒入装有异丁烯马来酸酐250ml的圆底烧瓶中并快速摇晃避免瓶中粉末结块；
(4)超声半个小时，56℃下旋转蒸发仪加热反应约3小时，期间溶液慢慢变澄清；
(5)停止加热待温度冷却至室温后抽真空将THF抽干，最后用20ml的氯仿重溶。
浓缩目的：提高马来酸酐环与十二烷胺的氨基的反应(靠四氢呋喃的挥发达到浓缩)。
2、纳米颗粒油相转水相：
(1)两亲聚合物80ul和纳米颗粒500ul混于圆底烧瓶。
(2)向该圆底烧瓶中加入适量氯仿(2m1)，浓缩至干。
(3)将(2)中固体溶于50mmol硼砂，搅拌溶解至清澈。
3、量子点(QDs)与胶体金(Au)二聚体的制备：
(1)QDs∶氨基-PEG-叠氮基(分子量5kDa)∶EDC=1∶500∶500制得QD-叠氮基
①取1个2mL的EP管，加入100μL3mmol／L的氨基-PEG-叠氮基(分子量5kDa)，
②向以上试管加入100μL 3mmol／L的EDC；
③快速的向以上试管加入100μL 6μmol／L的量子点，用枪把溶液吹打混匀，静置反应。
(2)Au∶氨基-PEG-炔基(分子量5kDa)∶EDC=1∶500∶500制得Au-炔基
①取1个2mL的EP管，加入100μL 3mmol／L的氨基-PEG-炔基(分子量5kDa)；
②向以上试管加入100μL 3mmol／L的EDC；
③快速的向以上试管加入100μL 6μmol／L的金颗粒，用枪把溶液吹打混匀，静置反应。
(3)做量子点与胶体金的二聚体(QD-Au)
①配置100mL0.05M Vc-Na(pH7.04)和100mL 0.005M Cu(II)(pH4.67)，各取1mL在EP管里混合反应。
②先加入Vc-Na，再加入CuSO4的同时，溶液首先变透亮棕红，紧接着瞬间变成黄色浑浊液，最后放置1h，黄色浑浊液中泛墨绿色，Cu(I)生成。
③将利用2％琼脂糖电泳胶分离得到的连有1条PEG的炔基-Au颗粒与叠氮基-QD颗粒等摩尔比装入透析带中，用夹子固定，泡在200mL 0.025M Vc-Na和0.0025M Cu(II)的反应液里，搅拌。
④反应液里生成的Cu(I)进入透析带，促进叠氮和炔基的反应，生成量子点与胶体金的二聚体最终利用2％的琼脂糖电泳胶进行分离纯化。
4、二聚体标记单抗：
(1)取二聚体10ml，调PH到7。
(2)向二聚体溶液中加入三聚氰胺单抗2ml，室温下培养10分钟。
(3)再加入3ml5％的BSA，室温下培养10分钟。
(4)100000*g离心，30min。
(5)将标记的二聚体沉淀溶于2ml 0.02mol／L的PB液(含5％蔗糖、1％BSA、0.5％吐温20)。4℃冰箱储存。
5、喷膜：在玻璃纤维素膜上喷二聚体标记的单抗，制备得结合垫。在硝酸纤维素膜上靠近结合垫的一端喷偶联物(三聚氰胺与牛血清蛋白的偶联物)，即为检测线，与检测线相隔约1厘米的另一端喷羊抗鼠二抗，即为质控线。
6、组装：在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴结合垫，结合垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。
7、使用方法：将可选灵敏度检测试纸平放，在靠近试纸的样品垫滴加待测液，由于毛细管作用，样品将沿着该纤维膜向前移动，约一分钟后待测液流到另一端，此时便可观察结果。
8、结果判断：①.检测线为红色即显色区有两条红线，且紫外灯照射可看到两条荧光线为阴性。
②.检测线为无色即显色区有一条红线，且紫外灯照射也只看见两条线检测线为阴性。
③.检测线为无色即显色区有一条红线，且紫外灯照射也只看见一条线检测线为阳性。
④.质控线为无色，紫外灯照射没有荧光，则此试纸为无效试纸。
检测结果见图
紫外灯照射检测条：
阳性结果：图3；
阴性结果：图3；
无效结果：图3。
本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。
Claims (3)
1.一种基于胶体金和量子点二聚体可选灵敏度侧向层析快速检测试纸条的制件流程方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
A、两性聚合物合成：将十二烷胺和异丁烯马来酸酐在有机溶剂中充分反应，产生一种既有亲水基团又有疏水基团的齿状聚合物，此聚合物可将油相的纳米颗粒转到水相；
B、纳米颗粒油相转水相：适量的纳米颗粒与两亲聚合物在有机溶剂中混合，充分反应后，聚合物将纳米颗粒包裹，聚合物的亲水基团暴露在外；
C、量子点与胶体金二聚体的制备：
(1)经过修饰的PEG一端带有氨基，另一端带有炔基；EDC可以活化纳米颗粒表面的羧基，使得PEG上的氨基与纳米颗粒上的羧基反应，最终纳米颗粒会带有一炔基；
(2)经过修饰的PEG一端带有氨基，另一端带有叠氮基；EDC可以活化纳米颗粒表面的羧基，使得PEG上的氨基与纳米颗粒上的羧基反应，最终纳米颗粒会带有一叠氮基；
(3)以上PEG链接的颗粒用琼脂糖电泳胶分离纯化出一个颗粒只带一个功能基团的颗粒复合物，等摩尔混合后，叠氮基和炔基在一价铜的催化下，环加成形成五元环将两个纳米颗粒连到一块儿，形成二聚体；
D、颗粒二聚体标记单抗：纳米颗粒自身有生物相容性，纳米颗粒与单抗混合，在适当的pH条件下，二聚体与单抗静电吸附，
E、喷膜：在玻璃纤维素膜上喷二聚体标记的单抗，制备得结合垫，在硝酸纤维素膜上靠近结合垫的一端喷偶联物，即为检测线，与检测线相隔约1厘米的另一端喷羊抗鼠二抗，即为质控线；
F、组装：在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴结合垫，结合垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条，再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装；
G、使用方法：将可选灵敏度检测试纸平放，在靠近试纸的样品垫滴加待测液，由于毛细管作用，样品将沿着该纤维膜向前移动，约一分钟后待测液流到另一端，此时便可观察结果；
H、结果判断：①.检测线为红色即显色区有两条红线，且紫外灯照射可看到两条荧光线为阴性，
②.检测线为无色即显色区有一条红线，且紫外灯照射也只看见两条线检测线为阴性，
③.检测线为无色即显色区有一条红线，且紫外灯照射也只看见一条线检测线为阳性，
④.质控线为无色，紫外灯照射没有荧光，则此试纸为无效试纸。
2.根据权利要求1所述的基于胶体金和量子点二聚体可选灵敏度侧向层析快速检测试纸条的制件流程方法，其特征在于，步骤A中是通过四氢呋喃的挥发实现十二烷胺和异丁烯马来酸酐的浓缩进而提高十二烷胺和异丁烯马来酸酐的反应速度。
3.根据权利要求1所述的基于胶体金和量子点二聚体可选灵敏度侧向层析快速检测试纸条的制件流程方法，其特征在于，步骤D中二聚体标记单抗过程中使用的PB液包含5％蔗糖、1％BSA、0.5％吐温20。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Granted publication date: 20170201 Termination date: 20171204 |