KR20120028914A - 고체상 기반 바이오어세이에 있어서 시그널 판독성을 향상시키기 위한 시그널생성 및 시그널 국소화 방법 - Google Patents

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윙 청 맥
링 와이 웡
푸이 이 캉겔 찬
라이하르트 레네베르크
킹 컹 신
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수퍼노바 다이아그노틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 고체상 기질 검출 시스템에서 시그널을 생성 및 국소화하는 방법으로서, 이 방법은: 표적 물질 용액을 고체상 기질에 적용하는 단계; 상기 표적 물질을, 복수개의 시그널 전구체 분자를 포함하는 비촉매적 표지가 부착된, 상기 표적 물질에 특이적인 친화성 분자와 결합시키는 단계; 상기 고체상 기질에 캐리어 매질을 적용하는 단계; 및 복수개의 시그널 전구체 분자들을 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위해 표지를 처리하는 단계를 포함하여 이루어지며, 여기서 상기 캐리어 매질은 비촉매적 표지를 용해시키기 위한 용매와, 상기 검출가능한 시그널 생성 분자들에 의해 생성된 시그널을 국소화시켜서 상기 표적의 존재 여부 및/또는 양을 나타내는 농후제를 포함하여 이루어지는 것이다. 몇가지 실시상태에서, 캐리어 매질은 또한 복수개의 시그널 전구체 분자들을 복수개의 시그널 생성 분자들로 변환시키는 시그널 발달 시약을 포함할 수도 있다. 또 다른 실시상태에서는 복수개의 시그널 전구체 분자들이 온도 변화, pH 변화, 초음파 처리, 광조사 또는 마이크로웨이브 가열과 같은 물리적 수단에 의해 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환되기 때문에, 시그널 발달 시약이 필요하지 않다. 유체 샘플 중에서 표적을 검출하기 위한 검사 장치, 및 유체 샘플 중에서 표적의 존재 여부를 판정하기 위한 키트 오브 파츠 역시도 개시된다.

Description

고체상 기반 바이오어세이에 있어서 시그널 판독성을 향상시키기 위한 시그널생성 및 시그널 국소화 방법{METHODS OF SIGNAL GENERATION AND SIGNAL LOCALIZATION FOR IMPROVEMENT OF SIGNAL READABILITY IN SOLID PHASE BASED BIOASSAYS}
본 발명은 체액과 같은 액체 시료 중에서 예컨대 항원과 같은 피검물을 분석하는데 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 측면 유동(lateral flow) 장치와 같은 고체상 플랫폼을 이용하는 현장현시검사(PoC test)에 있어서 검출가능한 물질을 포함하는 컨쥬게이트를 이용하여, 뇨, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 대변 추출액과 같은 체액 중에서 피검물을 검출하는 비촉매적 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 음식물 검사나 수질 오염 검사, 또는 수의학이나 군사분야와 같은 비임상적 상황에도 적용가능하다.
본 발명은 분석시 시그널 발생용과 시그널 국소화용의 서로 다른 시약들을 담지하기 위한 캐리어 매질을 이용한다. 이러한 캐리어 매질은:
(i) 용매, 예컨대, 완충액, 염용액, 물을 비롯한 수용액; 유기 용매, 예컨대 에탄올, 프로판올과 같은 알코올; 테트라히드로퓨란(THF)와 같은 에테르, 및 디메틸설폭사이드(DMSO)와 같은 극성 비양성자성 용매;
(ii) 용매 중에 콜로이드 혼합물로서 용해되어, 고점도 유체로부터 겔에 이르는 범위의 캐리어 매질 특성을 결과시키는 내부 구조를 형성하는 농후제. 겔형 캐리어 매질은 고체 형상을 갖지만 대부분 용매로 구성되어 있다. 그 예로는 폴리아크릴아미드 및 폴리이소부틸렌과 같은 폴리머; 전분, 셀룰로스, 갈조류로부터 얻은 알기네이트, 한천, 카라기난, 펙틴과 같은 다당류; 로커스트빈 검 및 구아검과 같은 검; 콜라겐, 알부민 및 젤라틴과 같은 단백질을 들 수 있다
몇가지 실시상태에서, 캐리어 매질은 시그널 전구체 분자를 검색가능한 시그널을 발생하는 상태로 변환시키는 물질인 시그널 발달 시약을 포함할 수도 있다. 또 다른 실시상태에서, 시그널 발생 시약은 반드시 필요한 것은 아닌데, 이는 복수개의 시그널 전구체 분자들이 온도, pH 변화, 초음파 처리, 광조사 또는 마이크로웨이브 가열과 같은 물리적 수단에 의해 복수개의 검출가능한 시그널로 변환되기 때문이다.
캐리어 매질의 기능은:
(i) 시그널 분자의 확산을 방해하여 시그널을 축적시키고;
(ii) 고체상 플랫폼 상의 시그널의 판독성(샤프니스, 시그널 체류 시간의 연장)을 향상시킴으로 해서, 감도를 향상시키는 것이다.
몇가지 실시상태에서, 복수개의 시그널 전구체 분자들의 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로의 변환이 화학적 또는 생화학적 수단에 의하는 경우, 캐리어 매질은 다음과 같은 제3의 기능, 즉:
(iii) 복수개의 시그널 전구체 분자들을 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자로 변환시킴으로써 시그널을 생성하는 기능을 갖는다.
가시광선의 검출을 이용하는 분석법에 있어서, 캐리어 매질은 실질적으로 광학적으로 투명하다.
뇨, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 대변 추출액과 같은 체액 중에서 다양한 표적 물질의 존부를 검출하기 위하여 다양한 유형의 표적-수용체 분석법이 이용되어 왔다. 이 분석법들은 일반적으로 항원-항체 반응, 방사능의, 효소적, 형광물질, 발광물질, 화학발광물질 또는 육안관찰가능한 금속 태그와의 합성 컨쥬게이트 및 용도에 따라 맞춤식으로 고안된 반응 챔버를 이용한다. 이러한 모든 분석법에서는 예컨대 항원과 같은 선택된 표적에 특이적인 항체와 같은 수용체와, 표적-수용체 반응 생성물의 존재 여부와 그 양을 측정하기 위한 수단이 있다. 현재 이용되는 많은 검사법은 반 정량적 또는 정량적 측정 결과를 제공하기 위하여 고안된 것이지만, 실제로는, 표적 종의 존재 여부를 가리켜주는 정성적 검출 결과만이 필요로 되는 경우가 많다. 이러한 정성적 분석법의 예로는 혈액검사, 뇨검사의 대부분의 유형 및 결장암종의 스크리닝 분석법으로서 대단히 중요한 분변 잠혈검사를 들 수 있다. 이러한 검사에 있어서는, 예컨대 금색 입자와 같은 유색 입자의 축적여부, 응집의 존재 여부 또는 색상 변화와 같은 육안 관찰 가능한 지표가 선호된다.
그럼에도 불구하고, 정성적 분석법은 피검액 중에 목적하는 표적 농도가 종종 낮기 때문에 매우 민감해야만 한다. 샌드위치 분석법 및, 금속 졸 또는 기타 유형의 유색 입자들을 이용하는 다른 민감한 검출법이 개발된 바 있다. 그러나, 이 기술드은 신속한 검출법에서 문제가 되는 여러가지 문제점들을 해결하지 못하고 있고 다른 풀어야만 개선 사항도 여전히 존재하는 실정이다.
예를 들어서, 측면 유동 샌드위치 분석법에서는 콜로이드상 골드가 종종 제1 항체(1)의 표지로서 이용되는 반면 다른 항체(2)는 니트로셀룰로스 막과 같은 막 상의 잘 정의된 검출 부위에 고정된다. 문제의 피검물이 시료 중에 존재할 경우에는, 피검물이 금 표지된 항체(1)과 반응하여 니트로셀룰로스에 결합된 항체(2) 쪽으로 이동하게 된다. 여기서 이것은 샌드위치를 형성하고 이 샌드위치 복합체들은 수집되어 검출 부위에서 농축되는 것이다. 이 부위는 은 이온과의 부가 반응에 의해, 어느 정도까지는 좀 다 잘 관찰가능하게 만들 수 있다(즉 확대).
그러나, 분석 감도는 그다지 뛰어나지 않고 이 기술은 어떤 분석법, 예컨대 갑상선 자극 호르몬(TSH), 전립선 특이적 항원(PSA), 저농도 범위의 (그러나 진단학적으로 매우 중요한) 트로포닌 I 또는 트로포닌 T를 검사하는데 있어서는 쉽게 적용할 수 없다.
따라서, 이러한 분석법의 효율성을 개선하기 위해, 측정 반응 말기에, 예컨대, 샌드위치: 항체(2)고정됨 - 피검물 - {항체(1)-표지}의 형성 말기에 증폭될 수 있는 다른 표지들("시그널 증폭 전구체 분자(signal amplication precursor molecules)"라 명명됨)이 사용된다.
만일 증폭 표지가 결정성 플루오레신 디아세테이트(FDA: crystalline fluorescein diacetae)를 함유하는 마이크로캡슐 - 수백만개의 FDA 분자들로 이루어짐 - 인 경우, 그 증폭은, 마이크로캡슐을 분해하여 비형광 FDA-분자들을 형광 분자들이 되도록 가수분해함으로써, 측정 반응 후에 일어나게 된다. 이 증폭은 잘 입증되어 있으며 유럽특허등록 제 EP 1309867에 설명되어 있으며, 그 내용은 본 발명에 참조되었다.
일반적으로, 증폭 반응은 방출 시약 용액에서 일어난다. 이로 인해 이상적인 경우보다 분석 감도가 약간 감소되게 되는데, 이는 희석 인자 때문이다 - 즉 방출된 형광 분자들이 방출 시약의 반응 볼륨에서 희석됨.
불행히도, 특정 상황에서는, 증폭 효율이 시그널 소실의 불이익에 의해 상쇄되거나 압도되기도 한다. 예를 들어서, 검출 또는 측정이 막 상에서 수행되는 경우, 예컨대 측면 유동 검사 스트림에서 수행되는 경우, 시그널 증폭을 가능케 하는 방출 시약 용액을 첨가하면, 변형된 막을 따라 증폭된 시그널이 확산하게 된다. 이 방출/증폭된 분자들은 국소화되지 않으므로, 증폭 후에도 시그널을 검출하기가 어려울 수 있다. 기저 검사 반응이 완료된 후, 여하한 용액을 첨가하면 검출선, 검출 스팟 또는 검출대역의 확장이 야기된다. 확산은 검출 부위를 넓히므로, 검출 부위의 색상 강도를 신뢰할 수 있게끔 측정하는 것이 불가능하다.
종래 기술은 또한 턴오버 수가 많고, 기질과 반응할 경우 매우 많은 수의 반응 생성물 분자들을 형성하는 효소가 표지일 수 있는 예도 포함한다. 여기서도 수용액 중에서, 보다 구체적으로는 완충액 용액 중에서 효소에 대하여 특이적인 기질 분자와 반응이 수행된다. 효소 기반 시스템의 한가지 단점은, 이들이 촉매적이기 때문에, 기질의 변환이 일어날 때 그리고 이것이 지속적인 프로세스일 때 증폭이 개시된다는 것이다. 증폭은 기질 농도와 효소 반응을 위해 선택된 시간에 따라 달라진다. 중지 시약(stopping agent)이 첨가되지 않으면, 효소는 계속적으로 측정 시간 동안 (그리고 그 후에도) 작용하여, 일정한 시그널이 존재하지 않는다. 중지 시약을 첨가하면 희석 효과가 증대된다.
따라서 본 발명의 한가지 목적은 시그널 분자의 확산을 방해함으로써 종래 기술의 제약사항을 극복하고 그에 따라 시그널 분자의 샤프니스를 유지하고 시그널 체류 시간을 연장시킴으로써 시그널의 판독성을 향상시켜 시그널을 신뢰성 있게 검출할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 목적은 또한 유체 샘플, 특히 체액 샘플 중에서 피검물을 검출하는 신속하고 민감한 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 종래 분석법에 비해 민감도가 높은 분석법을 제공하는 데 있다. 또 다른 목적은 유체 중에 저농도로 존재하는 피검물을 검출하기 위한 검사 장치를 제공하는 데 있다.
정의
캐리어 매질( Carrier medium ): 캐리어 매질은 다수의 검출가능한 시그널 생성 분자들의 확산을 방해하여, 시그널 축적을 유도한다. 이로 인해 고체상 플랫폼 상에서의, 다수의 검출가능한 시그널 생성 분자들의 판독성이 향상되고 (샤프니스, 시그널 체류시간의 연장), 이에 따라 감도도 증강된다.
캐리어 매질은 다음, 즉:
(i) 용매, 예컨대, 완충액, 염용액, 물을 비롯한 수용액; 유기 용매, 예컨대 에탄올, 프로판올과 같은 알코올; 테트라히드로퓨란(THF)와 같은 에테르, 및 디메틸설폭사이드(DMSO)와 같은 극성 비양성자성 용매;
(ii) 용매 중에 콜로이드 혼합물로서 용해되어, 고점도 유체로부터 겔에 이르는 범위의 캐리어 매질 특성을 결과시키는 내부 구조를 형성하는 농후제.
캐리어 매질은 화학적 또는 생화학적 활성화를 요구하는 시그널 전구체 분자들을 위하여, 다음, 즉:
(iii) 시그널 전구체 분자들을 검출가능한 시그널을 생성하는 상태로 변환시키는 물질인 시그널 발달 시약
역시도 포함할 수 있다.
농후제 ( Thickeners ): 이 물질들은 액체 용액, 에멀젼 및 현탁액을 농후화 및 안정화시키기 위하여 사용된다. 이들은 용매 중에 콜로이드 혼합물로서 용해되어, 고점도 유체로부터 겔에 이르는 범위의 캐리어 매질 특성을 결과시키는 내부 구조를 형성한다. 겔형 캐리어 매질은 형상은 고체이지만, 그 대부분은 액체로 이루어져 있다. 겔형 캐리어 매질은 고체 형상을 갖지만 대부분 용매로 구성되어 있다. 농후제의 예로는 폴리아크릴아미드 및 폴리이소부틸렌과 같은 겔 형성 폴리머; 셀룰로스, 전분, 갈조류로부터 얻은 알기네이트, 한천, 카라기난, 펙틴과 같은 다당류; 로커스트빈 검 및 구아검과 같은 천연 검; 콜라겐, 알부민 및 젤라틴과 같은 단백질을 들 수 있다.
시그널 전구체 분자( Signal precursor molecules ): 이들은 1종 이상의 다른 시약과 반응시, 검출가능한 시그널을 유도하는 분자들이다. 개시된 반응을 통해 검출가능한 시그널에 이르는, 서로 다른 화학물질 부류로부터의 매우 다양한 여러가지 물질들이 존재하며, 예컨대 플루오로포어 및 그 유도체, 루미노포어 및 그 유도체, 크로모포어 및 그 유도체, 보결 원자단(prosthetic groups), 또는 레독스 매개체로부터 선택된 레독스 활성 물질, 전극 활물질, 생물발광 및 형광발광 단백질, 가시 염료, 형광 염료, 생물발광성 물질 또는 화학발광성 물질, 전기화학적 활성 물질 또는 자성 물질을 들 수 이다. 시그널 전구체 분자는 비촉매적(non-catalytic) 표지이다.
검출가능한 시그널은 다음에 기초할 수 있다:
- 형광측정학(fluorimetry)
- 발광측정학(luminometry)
- 자외선, 가시광선 및 근적외선 범위에 있어서의 색상 변화
- 레독스 전위의 변화
- 착물 형성 또는 침전에 의해 야기되는 질량 변화
- 방사성 붕괴 생성물의 검출
- 자기장 검출
시그널 분자( Signal molecules ): 본 명세서에서 시그널 분자라는 용어는 시그널 전구체 분자 및/또는 시그널 생성 분자의 두 가지 모두를 가리키며 문맥상, 이들은 시그널 전구체 상태 또는 시그널 생성 상태 중 특정한 어느 하나일 필요는 없다. 이 용어는 시그널 전구체 분자와 시그널 생성 분자 두가지 모두가 동시에 함께 존재할 수 있는 경우에도 사용된다.
시그널 발달 시약(Signal developing reagent): 시그널 발달 시약은, 존재할 경우, 시그널 전구체 분자로 하여금 검출가능한 시그널을 생성시킬 수 있도록 해주는 물질이다. 시그널 발달 시약은 플루오레신(fluorescins)과 그의 유도체, 예컨대 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트) 또는 플루오레신 디아세테이트 말레이미드(FDA-말레이미드), 시아닌, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 디아조-염료 기반 형광 물질, 및 소형 형광 방향족 및 헤테로방향족 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 플루오로포어를 활성화할 수 있다. 별법으로, 시그널 발달 시약은 시아닌, 피라졸론, 안트라퀴논, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 카로티노이드 및 디아조- 및 모노아조, 옥사진, 인디고이드 또는 리보플라빈 기반 염료 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 크로모포어를 활성화시킬 수도 있다.
검사 장치( Test device ): 본 명세서에서, 검사 장치라는 용어는 고체상 기질을 이용하는 장치를 가리킨다. 고체상 기질은 막, 마이크로타이터 플레이트, 비드(자성 및 비자성), 뉴브 및 슬라이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 검사 장치는 측면 유동, 수직 유동, 시험관, 마이크로타이터 플레이트, 페탈(petal) 등을 포함한 여러가지 형식의 분석법에 알맞게 적용될 수 있다. 고체상 기질용 물질 및 형태로는 다음을 들 수 있다: 다공성 막 예컨대 니트로셀룰로스, 나일론; 비다공성 플랫 기질, 예컨대 유리, 폴리스티렌, 금속, 카본; 시험관 또는 마이크로타이터 플레이트의 내벽; 자성 또는 비자성 비드와 같은 구체(spheres).
검출막 ( Detection membrane ): 검출막은 예컨대, 시약이 제공되어 있는 여러가지 패드(예컨대 컨쥬게이트 패드, 샘플 패드, 흡수 패드)가 부착된 니트로셀룰로스 스트립과 같은 반응막으로 이루어진다. 항체 또는 항원과의 반응 부위(검출 부위, 컨트롤 부위)는 반응막 상의 잘 정의된 위치에서 코팅된다. 반응 부위의 코팅은 반응막 상에서 수동적으로 흡착될 수 있으며, 이들은 공유적으로 결합되거나, 또는 면역화학적으로, 예컨대 스트렙트아비딘(스트렙트아비딘 코팅 ← 바이오티닐화 항체)을 경유하거나 또는 종-특이적 항체 (염소 항마우스 항체 ← 마우스 항체)를 경유하여 결합될 수 있다.
친화성 분자( Affinity molecules ): 친화성 분자는 다음의 물질 군들로부터 선택된 생물인식 분자일 수 있다:
(a) 항체, 유전적으로 변형된 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 수용체, 항원, 렉틴, 아비딘, 올리고펩타이드, 지질단백질, 당단백질, 펩타이드 호르몬 및 알레르겐 또는 그의 일부로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질;
(b) DNA, RNAs, 올리고뉴클레오타이드, 앱타머 및 그의 일부로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산;
(c) 단당류, 올리고당류, 다당류, 당지질, 프로테오-다당류 및 그의 일부로 이루어진 군으로부터 선택된 탄수화물; 또는
(d) 바이오틴, 바이오틴 유도체, 스테로이드, 호르몬, 코팩터, 활성화제, 저해제, 약물, 알레르겐 또는 합텐으로 이루어진 군으로부터 선택된 저분자량 리간드.
표적(Target): 본 명세서에서 "표적"이라는 용어는 샌드위치형 분석에 있어서 피검물을 의미하거나 또는 경쟁형 분석법에 있어서 경쟁자(competitor)를 의미한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 고체상 기질 검출 시스템에서 시그널을 생성 및 국소화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은: 표적 물질 용액을 고체상 기질에 도포하고; 상기 표적 물질을 비촉매적 표지가 부착되어 있는 표적 물질에 특이적인 친화성 분자와 결합시킨 다음 (여기서 상기 비촉매적 표지는 복수개의 시그널 전구체 분자들을 포함하는 것임); 캐리어 매질을 상기 고체상 기질에 도포하여, 복수개의 시그널 전구체 분자들이 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환되도록 표지(label)를 처리(여기서 캐리어 매질은 비촉매적 표지를 용해시키기 위한 용매와 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들에 의해 생성된 시그널의 국소화를 일으키고, 상기 표적의 존재여부 및/또는 표적의 양을 가리키기 위한 농후제를 포함하여 이루어진다)하는 것을 포함하여 이루어진다.
몇몇 실시상태에서, 캐리어 매질은 시그널 전구체 분자를, 검출가능한 시그널을 생성시키는 상태로 변환시키는 물질인 시그널 발달 시약을 포함할 수도 있다. 이러한 실시상태에서, 시그널 생성 및 시그널 국소화는 동시적으로 일어난다.
또 다른 실시상태에서는, 복수개의 시그널 전구체 분자가 온도변화, pH 변화, 초음파 처리, 광조사 또는 마이크로웨이브 가열과 같은 물리적 수단에 의해 검출가능한 복수개의 시그널 생성 분자들로 전환되기 때문에, 시그널 발달 시약이 필요하지 않다. 좋기로는, 고체상 기질에 도포하는 단계와 비촉매적 표지를 처리하여 복수개의 시그널 전구체 분자들을 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키는 단게는 실제로 동시에 수행되는 것이 바람직하다. 실제로, 캐리어 매질을 고체상 기질에 적용하는 처리 단계에 간단한 방해가 있을 수 있거나, 또는 캐리어 매질 도포 후 처리 단계를 개시하는데 있어서 약간의 지연이 발생할 수 있다.
캐리어 매질은, 몇 가지 다른 방식으로 고체상 기질에 적용될 수 있다. 이것은 박막으로서 직접 적용될 수도 있는 매트릭스 겔의 형태일 수 있다. 별법으로, 이러한 매트릭스 겔은, 고체상 기질과 매트릭스 겔을 접촉시키고자 할 경우에는 제거되는 보호층에 의해, 고체상 기질로부터 분리될 수 있다. 매리어 매질이 액체이면, 분무에 의해 도포될 수 있다. 또 다른 별법은 고체상 기질을 캐리어 매질 내로 침지시키거나 또는 캐리어 매질을 고체상 기질 위에 점적하는 것이다. 또 다른 방법은 고체상 기질을 용기 중에서 고점도 액체 또는 매트릭스 겔 내로 침지시키는 것이다.
두번째 구체예에서, 본 발명은 유체 샘플 중에서 표적 물질을 검출하기 위한 검사 장치를 제공하는데, 상기 장치는:
유체 샘플을 샘플 적용 부위로부터 검출 부위로 이동시키기 위한 고체상 기질 검출 시스템;
상기 검출 부위로부터 멀리 떨어진 위치에 배치되며, 비촉매적 표지가 부착되어 있는 표적 물질에 대한 특이적인 친화성 분자 (상기 비촉매적 표지는 복수개의 시그널 전구체 분자들을 포함하여 이루어지고, 상기 시그널 전구체 분자는 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자로 변환가능한 것임);
비촉매적 표지를 용해시키기 위한 용매 및 상기 검출 부위에서 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들에 의해 생성된 시그널을 국소화시켜 상기 표적 물질의 존재여부 및/또는 양을 나타내기 위한 농후제를 포함하여 이루어진 캐리어 매질, 및
상기 복수개의 시그널 전구체 분자들을 상기 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위한 수단
상기 복수개의 시그널 전구체 분자들을 상기 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위한 수단
을 포함하여 이루어지며,
여기서 상기 캐리어 매질은 적어도 상기 검출 부위에서, 상기 검출가능한 물질에 접촉되도록 채택된다.
몇가지 실시상태에서, 캐리어 매질은 또한 복수개의 시그널 전구체 분자들을, 검출가능한 시그널을 생성하는, 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키는 물질인 시그널 발달 시약을 포함할 수도 있다. 다른 실시상태에서, 시그널 발달 시약은 필요하지 않은데, 이는 시그널 전구체 분자가 온도 변화, pH의 변화, 초음파 처리, 광조사 또는 마이크로웨이브 가열과 같은 물리적 수단에 의해 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 전환되기 때문이다.
본 발명은 또한 유체 샘플 중에서 표적 물질의 존재 여부를 판정하기 위한 부품 키트(kit of parts)도 제공하는데, 여기서 상기 키트는:
유체 샘플을 샘플 적용 부위로부터 검출 부위로 이동시키기 위한 수단을 포함하는 고체상 기질 검출 시스템;
상기 검출 부위로부터 멀리 떨어진 위치에 배치되며, 비촉매적 표지가 부착되어 있는 표적 물질에 대한 특이적인 친화성 분자 (상기 비촉매적 표지는 복수개의 시그널 전구체 분자들을 포함하여 이루어지고, 상기 시그널 전구체 분자는 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자로 변환가능한 것임);
상기 복수개의 시그널 전구체 분자들을 상기 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위한 수단
을 포함하여 이루어진다.
키트는 또한 비촉매적 표지를 용해시키기 위한 용매와 상기 검출 부위에서 검출가능한 시그널을 생성하는 복수개의 분자들에 의해 생성된 시그널을 국소화시키기 위한 농후제를 포함하는 캐리어 매질을 형성하기 위한 성분을 추가로 포함할 수도 있다. 복수개의 시그널 전구체 분자들을 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위한 수단은 캐리어 매질 중에 포함되는 시그널 발달 시약일 수 있다. 키트 중의 시그널 전구체 물질은 플루오로포어와 그의 유도체, 루미노포어 및 그 유도체, 크로모포어 및 그 유도체, 보결 원자단(prosthetic groups), 또는 레독스 매개체로부터 선택된 레독스 활성 물질, 전극 활물질, 생물발광 및 형광발광 단백질, 가시 염료, 형광 염료, 생물발광성 또는 화학발광성 물질, 또는 자성 물질을 포함할 수 있다.
의심의 여지를 없애기 위하여, 비촉매적(non-catalytic)이라는 문구에는 비효소적이라는 의미도 포함되는데, 본 발명은 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환되는 복수개의 시그널 전구체 분자들을 포함하는 시그널 전구체 물질을 사용하는 것에 기반한다. 따라서, 표적 분자들이, 복수개의 시그널 전구체 분자들을 포함하는 비촉매적 표지가 부착되어 있는 표적 물질용의 특이적인 친화성 분자에 결합될 경우, 각각의 표적 분자들이 복수개의 시그널 전구체 분자들과 연계되게 되기 때문에, 검출가능한 시그널의 내재적 또는 잠재적 증폭이 일어나게 된다. 달리 말해서, 측정 반응이 일어난 경우, 시그널 전구체 물질이 "활성화"되어 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환될 수 있는 것이다.
예를 들어서, 표적 물질이 항원이고 표적 물질에 특이적으로 결합하는 친화성 분자가 컨쥬게이트된 비촉매적 표지가 플루오레신 디아세테이트의 결정(FDA, 즉 시그널 전구체 분자의 결정)을 함유하는 마이크로캡슐에 결합된 검출자(detector), 항체인 경우를 상정해보자. 항원/검출자 항체가 검출 부위에서 포획되면 (예컨대, 고체 지지체 상에서 포획 항원에 의해), 용매에 의한 FDA 결정의 용해 및 FDA의 플루오레신으로의 전환(예컨대, KOH에 의한 처리에 의해) 에 의해 각각의 표적 항원에 대해 수백만 수억개의 형광 분자들이 방출된다.
본 발명은 검출 부위에서의 선(line), 점(dot), 스팟(spot) 또는 대역(zone) 확장의 기술적 해결책을 제시하며, 특히 PoC 검사 장치에 있어서 컨트롤선(control line)과 검사의 판독성을 개선시킨다. 확장(broadening)은 정상적으로 발생하며 수용액 중에서 요구되는 방출 시약의 첨가에 의해 개시된다. 검출 부위는 날카로운 반응선은 아니며 흐릿해져서 번지게 되어 용액 중에 물질의 확산을 통해 불명료하게 된다. 본 발명에 있어서, 시그널을 그의 형성 위치에 국소화시키고자 하는 필요성은 이제 만족된다.
후술하는 설명에서, 상대적으로 공간에 관한 용어인 "후방(back)", "좌측", "우측" 등은 숙련자들의 편의를 위해 사용된 용어로서 도면에 도시된 바와 같이, 검사 장치 및 이들의 구성 부품의 방향성을 나타내기 위해 사용된 것이다. 본 발명에서의 이들 용어의 사용으로 인해, 본 발명품의 구성 부품의 제조시, 선적시, 보관시 또는 판매시 어떠한 사용상의 제약을 가하거나 또는 다른 장치와 조합 사용시 어떠한 제약을 가하는 것은 아니다.
도 1은 통상적인 측면 유동 검사 스트립의 평면도(도 1a)와 측면도 (도 1b)의 개략적인 다이아그램이다. 레퍼런스 번호 10은 다공성 성분들을 함께 지지하기 위한 후방 라미네이트(back laminate)를 나타낸다. 그 상단에는 사용되는 샘플이 적용되는 샘플 로딩 패드 12가 위치한다. 그 옆에는 니트로셀룰로스 막 16이 담지하는 유체 샘플에서 검사 스트립을 따라 통과함에 따라 표적과 반응하는 프로브 또는 검출자 물질(detector material)을 함유하는 컨쥬게이트 패드 14가 있다. 도면에 도시된 바와 같이 좌측에서 우측으로의 유동 방향에서, 검출 부위 18은 검사 스트립의 폭을 따라 적용되는 포획 프로브 선(line)이고, 컨트롤 선 20은 검출 부위 18로부터 검사 스트립의 하유의 폭을 따라 적용되는 물질의 또 다른 선이다. 컨트롤 부위는 샘플 중에서 아무것도 검출하지 않고 단지 그 스트립이 제대로 습윤되었는지, 그리고 검사 성분들 모두가 기능하는지를 가리킨다. 컨트롤 부위는 심지어 검출가능한 표적을 전혀 함유하지 않는 샘플에 대해서 조차도 검사가 제대로 수행되었는지를 입증하기 위해 항상 육안관찰가능한 시그널을 생산해야하며, 따라서 검출 부위에서는 아무런 시그널도 내지 않는다. 과량의 유체는 흡입 패드 22에 의해 흡수된다.
도 2를 참조하면, 이 도면은 사용 중의 2개의 측면 유동 검사 스트립을 나타내는 개략도면이다. 도 2(a)에서, 검사 스트립은 시그널 전구체 분자들을 시그널 생성 분자들로 변환할 필요가 없는 직접 표지(direct label)을 이용하여 도시된 검사 스트립을 나타낸 것으로서; 검출 위치와 컨트롤 위치에서의 검출 선(detection line)은 두가지 모두 날카롭고 잘 정의되어 있다. 도 2(b)는 측정 반응이 일어난 후, 시그널 전구체 분자들의 검출가능한 시그널 생성 분자들로의 변환을 개시하기 위해 시그널 발달 시약 용액이 첨가되어 있는 검사 스트립을 도시한 도면이다. 여기서, 검출 부위와 컨트롤 부위에 있어서의 검출선은 잘 정의되어 있지 않다; 이들은 시그널 발달 시약의 적용을 위해 사용된 용액을 통한 시그널 생성 분자들의 확산으로 인하여 확산된 것이다.
본 발명에서는 이러한 확산이 방해된다. 본 발명은 시그널 전구체 분자들의 검출가능한 시그널 생성 분자로의 변환을 가능케 해주는 한편 검출 부위와 컨트롤 부위에서의 잘 정의된 선명한 검출선을 유지시켜준다. 이것은 시그널 분자들의 확산과 분포를 최소화시키는 캐리어 매질을 이용함으로써 달성된다. 몇 가지 실시상태에서, 캐리어 매질은 시그널 전구체 분자들을 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키는 시그널 발달 시약을 포함할 수 있지만, 캐리어 매질은 검출막을 통한 급속한 확산을 가능하게 하는 형태로 존재하지는 않는다.
캐리어 매질은 용매와 몇몇 실시 상태에서는 시그널 발달 시약 역시도 겔 상태가 형성되기 전, 졸 상태로 용해되어 있는 "매트릭스-결합수"가 구비된 농후제의 발달에 기초한다. 겔 상태에서 매트릭스는 검출막 상에 지지된 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들의 확산을 최소화한다.
도 3은 도 1에 도시된 스트립과 유사한 검사 스트립의 또 다른 개략도인데, 여기서 도면 (b)는, 본 발명에 따라 복수개의 시그널 전구체 분자들을 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키고 복수개의 검출 가능한 시그널 생성 분자들을 국소화시키기 위하여 검출막 16의 상단 표면에 캐리어 매질 24의 박층을 적용시키는 것을 보여주는 도면이다. 간편히 설명하자면, 캐리어 매질은 좋기로는 검출막의 노출된 상당 표면에 알맞는 크기를 갖는 박막 스트립으로 절단되어진 매트릭스 겔일 수 있다.
도 4는 통상적인 방출 용액을 이용하여 생성된 시그널 (좌측 스트립)과 매트릭스 겔 형태의 시그널 발달 시약을 함유하는 캐리어 매질을 이용하여 생성된 시약 (우측 스트립)에 대한 여러 시간 간격에서의 형광 시그널 변화를 나타낸 사진이다. 통상적인 방출 용액을 적용하여 플루오레신 디아세테이트 시그널 전구체 분자들로부터 플루오레신을 방출한 직후 또는 본 발명에 따른 매트릭스 겔을 적용한 직후에 스트립 쌍들의 사진을 찍었다. 이어서 동일한 스트립 쌍들을 다음의 연속적인 시간 간격을 두고 다시 사진찍었다: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 12 및 15분. 매트릭스 겔을 이용하여 시그널이 생성된 스트립에서는 15분이 지난 후에도 선명하게 정의된 선이 유지되었으나, 방출 용액을 이용하여 통상적으로 생성된 시그널의 경우에는 최초의 구간에서조차 사인이 흐릿한 것으로 나타났다. 15분 후, 이들 종래기술에 따른 스트립들은 선이 너무 번져서 사실상 반복적으로 판독하는 것이 실제로 불가능하였다.
도 5는 매트릭스 겔 실시상태가 다중 검출 플랫폼에 어떻게 적용될 수 있는지를 보여주는 개략도이다. 도 (a)에서는 소정의 위치에서 코팅된 여러가지 포획 프로브들을 갖는 광학적으로 투명한 용기가 도시되어 있다; 여기서 서로 다른 포획 프로브들은 특정 표적에 대하여 특이적인 것들이다. 도 (b)에서는 포획 프로브가 복수개의 표적을 함유하는 샘플에 노출되어 있는데 이 표적들은 포획 프로브들 중 어느 하나에 특이적으로 결합하게 된다. 도 (c)에서는 포집된 표적이 표적 물질들에 대하여 특이적인 친화성 항체들과 더 결합하며, 여기서 이들 항체에는 비촉매적 표지가 부착되어 있는데, 상기 비촉매적 표지는 시그널 전구체 분자들로서 FDA로 구성되어 있다. 도 (d)에서는, FDA에 대한 시그널 발달 시약을 갖는 매트릭스 겔이 용기에 첨가되며 국소화된 형광 시그널이 이 부위에서 생성되며 여기서 표적이 각각의 포획 프로브에 결합되게 된다.
도 6은 육안관찰 가능한 시그널을 국소화하기 위해, 측정 반응 완결 후 검사 스트립 위에 놓일 매트릭스 겔 24가 로딩된 광학적으로 투명한 덮개 26이 있는 검사 스트립을 나타낸 개략도이다. 이 덮개는 별도 아이템일 수도 있지만, 이 도면에서는 리빙 힌지 28 수단에 의해 다공성 성분을 지지하는 백 라미네이트 10에 부착되어 있다.
본 발명은 다음과 같은 기존 방법의 문제점과 한계점을 극복한다:
● 형광, 발광 또는 흡광은 시그널 생성 분자 수단의 확산으로 인해 측정 영역에 초점을 맞출 수 없으므로 신뢰성있게 측정할 수 없다.
● 분석 감도 저하가 발생한다. 확산이란 형광, 발광 또는 흡광이 잘 정의된 선명한 부위로 고정되지 않고 검출 부위로 의도되지 않은 막의 다른 부위로 분산되는 것을 의미한다. 이로 인하여 검출가능한 시그널 생성 분자들의 형성 부위로부터의 플럭스에 의해 검출가능한 시그널 생성 분자들의 손실이 야기되고 따라서 분석 감도의 저하가 발생된다.
● 반정량법으로서 측면 유동 장치가 상정된 경우, 몇가지 항체 (2) 라인이 막에 제공된다. 검출가능한 시그널 생성 분자들은 선들 사이 또는 선들 다음에서 번지고/퍼져서 결과를 판독할 수 없다.
본 발명은 확산 플럭스(diffusive flux)를 다루는, 익히 알려진 Fick의 제1법칙과 제2 법칙의 확산계수의 점도 변형에 기초하여 전술한 문제점들을 해결한다. Fick은 고농도 지점으로부터 저농도 지점으로 플럭스가 이동하며, 그 세기는 농도 구배에 비례(dc/dx) 한다고 추론하였다. 하나의 공간 크기에서 이 방정식은:
J= -D * (dc/dx)
식 중:
● J는 단기간 동안 좁은 영역을 통하여 흐르는 물질량의 척도인 확산 플럭스이다. 본 발명에서는 J 값이 최소일 것이 요망된다.
● D는 포어 크기, 그의 분포 및 특히 "액체" 점도에 따라 달라지는 "결합된(bound)" 겔-워터의 확산 계수이다.
● c는 농도로서; 여기서는 예컨대 형성된 플루오레신의 농도이다.
● x는 위치 또는 형성 위치로부터의 거리를 나타내며; 여기서는 검출 부위로부터의 거리를 의미한다.
확산 계수 (D)는 확산 입자의 속도 제곱에 비례하는데, 이것은 유체의 온도, 점도 및 입자 크기에 의존한다. 묽은 수용액에서는, 대부분의 이온의 확산 계수는 비슷하며 주로 0.6x10-9 내지 2x10-9 m2/s의 범위이다. 생물학적 분자의 경우, 확산 계수는 일반적으로 10-11 내지 10-10 m2/s의 범위이다.
본 발명은 시그널 분자의 국소화에 필요한 시약을 포함하는 캐리어 물질을 사용한다. 전술한 바와 같이, 몇가지 실시상태에서 캐리어 매질은 시그널 전구체 분자들을 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변화시키는, 시그널 발달 시약을 포함할 수도 있다. 다른 실시상태에서, 이러한 변환은 온도 변화, pH 변화, 초음파처리, 광조사 또는 마이크로웨이브 가열과 같은 물리적 수단에 의해 달성된다. 수성 겔의 경우, 겔 상태가 그의 졸 상태로부터 형성된 후, 물이 겔의 매트릭스에 단단히 결합/고정되어 있다. 확산은 겔 중의 액체(물)이 다소 "응고"됨에 따라 눈에 띠게 방해된다. 높은 전단 모듈러스를 갖는 액체의 경우, 용매는 시그널 분자의 확산을 방해한다. 전단 모듈러스가 높은 액체의 경우, 그 용매는 시그널 분자의 확산을 저해한다.
핵심 시약을 함유하는 겔은 이 시약을 졸 상태의 겔 형성 화합물에 용해시킴으로써 쉽게 제조할 수 있다. 시약을 졸 내로 병합한 후, 소정 시간 후에 겔 상태로 졸의 형태가 변환되거나 또는 이러한 형태 변환은 온도 변화에 의해 유도될 수 있다(예컨대, 한천-한천은 고온에서 액체(졸 상태)이고 저온에서는 고체(겔 상태)이다).
졸 상태와 겔 상태의 두 가지 상태 모두로 존재하는 물질들은 많이 있다. 물의 경우 겔 상태와 졸 상태는, 졸 상태에서는 겔 형성 물질 - 농후제 - 가 물에 콜로이드적으로 분산되는 반면, 겔 상태에서는, 농후제의 겔 형성 네트워크 중에 물이 분산된다는 것으로 특징지을 수 있다.
바람직한 특정 실시상태에서, 본 발명은 유럽특허 제 EP 1309867호에 개시된 이론을 이용하는데, 여기서는 하나의 반응 파트너 표지가 비플루오레신 FDA-분자 수백만개가 통합된 FDA 결정이다. 이들은 검출 부위에서 가수분해되어 수백만개의 플루오레신 분자가 된다. 캐리어 매질에 병합된 농후제 덕분에, 이렇게 형성된 플루오레신 분자들은 검출 부위로부터 확산되지 않게 된다.
이 과정에서, DMSO와 NaOH는 캐리어 매질 내로 병합되는 용매와 시그널 발달 시약이다. 시그널 국소화 효과는 DMSO와 NaOH가 캐리어 매질로부터 (즉, 고농도의 DMSO 및 NaOH 용액 부분으로부터 저농도 부분으로) 검출막 표면으로 부분 확산되는 것에 의해 설명된다. DMSO에 용해된 FDA-결정은 NaOH에 의해 가수분해되어 플루오레신이 된다. 물은 캐리어 매질에 강력하게 결합되어 있기 때문에 (가교 결합으로 추정되며, 농후제의 작용에 의한 3차원 네트워크로 여겨진다), 저분자량의 물질만이, 물과 결합된 캐리어 물질을 통과하여 검출막과 신속히 접촉할 수 있게 되는 것이다. 이러한 과정은 약 30초 이내에 일어난다.
물이 결합되지 않은 수용액은 첨가되지 않기 때문에, - 검출막의 흡착 패드에 의해 도움을 받은 - 플루오레신 분자의 확산과 분산은 일어나지 않는다. 따라서, 플루오레신 분자들은 국소화되어 분석 감도를 잃지 않은 채로 측정될 수 있다. 또한 반정량 측정법에서 추가의 검출선이 존재하면 판독성이 저하되지 않는다.
특정 검출 플랫폼의 경우, 캐리어 매질은 커다란 얇은 시트로서 생산되는 매트릭스 겔 형태로 있을 수 있는데, 이것을 검출막 상에 놓기에 알맞는 적당한 크기로 자른다. 적합성 연구에서, 겸자를 이용하여 올려놓는다.
또 다른 접근방법은 캐리어 매질을, 측정 반응 완료 후 닫힐 때, 캐리어 매질을 검출막과 접촉시키도록 고안된 별도의 투명 커버 디바이스 내로 통합시키는 것이다. 이 경우, 검출 장치는 박스 형태의 2 조각으로 이루어져 있다. 검출 장치(박스)를 열고, 검출막이 달린 박스 하부에서 측정 반응을 수행한다. 이어서 박스를 캐리어 매질이 통합되어 있는 커버로 닫는다. 커버를 너무 빨리 닫음으로 인해서, 시그널 전구체 분자들과 캐리어 매질 간의 예기치 않은 접촉을 방지하기 위해, 캐리어 매질에 방출가능한 박막 필름의 보호 커버를 가질 수 있으며, 이것은 측정 반응이 수행된 후 제거된다. 그 후 캐리어 매질은 검출막 상에서 검출 부위와 접촉된다.
캐리어 매질의 제조/생산
캐리어 매질의 형성은 일반적으로 용매, 시그널 발달 시약(존재하는 경우) 및 농후제를 혼합함으로써 실시할 수 있다. 농후제의 선택에 따라서는 가열과 냉각이 요구될 수 있다. 서로 다른 농후제 또는 농후제 혼합물을 캐리어 매질 형성 공정에 사용할 수 있다. 각각의 농후제 유형에 있어서, 검출가능한 시그널 생성 분자의 국소화를 달성하기 위한 적절한 농후제의 농도는 결합수의 함량, 겔의 전단 특성, 응고 과정 중의 수축, 병합된 반응 파트너의 확산 상수, 조밀화, 광학 투명도, 안정성 및 온도 변화에 대한 견뢰도에 따라 최적화되어야 한다.
매트릭스 겔 형태인 경우의 캐리어 매질의 점도를 SDS-PAGE에 사용된 폴리아크릴아미드 겔의 점도와 비교할 수 있다. 겔의 농도(백분율)가 낮은 경우 그다지 되지 않을 것이므로 분무에 의해 검출막 표면에 적용할 수 있을 것이다. 코팅된 페탈이 겔에 침지되어 국소화된 시그널을 발달시키게 되는 특정한 다중 검출 플랫폼에는 겔의 농도(백분율)가 높은 편이 보다 적합하다. 겔의 백분율은 매질 총 중량에 대하여 0.05 내지 50 중량% 범위일 수 있고; 좋기로는 0.1 내지 20%인 것이 바람직하다. 다른 실시상태에서, 겔의 비율의 하한값은 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% 및 0.5% 중 어느 하나이고; 겔의 비율의 상한값은 3%, 4%, 5%, 10%, 20% 및 50% 중 어느 하나일 수 있다. 따라서 겔의 비율 범위는 전술한 하한 중 어느 하나의 값과 전술한 상한 중 어느 하나의 값의 조합일 수 있다.
캐리어 매질의 전단 모듈러스는 첨가되는 농후제의 양을 달리함으로써 조절가능하다. 물론, 고점도 용액은 확산 속도가 느리지만, 시그널 체류 시간은 응고 형태를 이용하여 얻은 것보다는 짧아질 것이다.
매트릭스 겔이 최적화되면, 실험 결과에 기초하여 도 4에 도시된 바와 같이검출 부위의 위치에서의 국소화된 반응선(시그널 선)이 얻어진다. 도 4는 시그널 생성 및 시그널 국소화에 수용액이 아닌 매트릭스 겔이 사용된 경우, 검출 부위의 형상에 있어서 확연한 차이를 다시 한번 보여준다.
본 발명을 이하에 실시예와 도면을 들어 보다 구체적으로 설명하나, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
도 1은 공지의 측면 유동 검사 스트립의 구축을 나타내는 개략도이다;
도 2는 사용 중인 종래기술에 따른 측면 유동 검사 스트립의 2가지 개략도로서, 도 2(a)는 직접 표지(즉, 미증폭 표지)를 이용한 도면이고, 도 2(b)는 표지를 증폭시키기 위해 종래 기술에 따른 용액 기술을 이용한 검사 스트립을 나타낸 도면이다;
도 3은 본 발명에 따른 시그널 국소화용 캐리어 매질의 박막 적용을 나타내는 검사 스트립의 또 다른 개략도이다;
도 4는 종래의 방출 용액을 이용하여 생성된 시그널(좌측 스트립)과 본 발명에 따른 매트릭스 겔을 이용하여 국소화된 시그널(우측 스트립)의 여러가지 시간 간격에서의 형광 시그널의 변화를 도시한 도면이다;
도 5는 다중 검출 플랫폼(multiplex detection platform)의 개략도이다;
도 6은 육안관찰가능한 시그널을 국소화하기 위한 측정 반응의 완결 후 검사 스트립 상에 위치시키기 위한 매트릭스 겔이 로딩된 광학적으로 투명한 덮개를 갖는 검사 스트립의 개략도이다.
실시예
이하에 다양한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 이들 실시예 범위로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
실시예 1:
FDA -결정 기반 시그널 시스템을 위한 DMSO -기반 캐리어 매질의 제조
FDA의 캐리어 매질은 DMSO, NaOH 및 폴리소르베이트 20으로 구성되고, 여기서 DMSO의 사용 목적은 FDA를 용해시키는 것이고 NaOH는 용해된 FDA를 가수분해하기 위하여 사용된다. 폴리소르베이트 20은 겔 형성에 있어서 활성 성분이다. 구체적으로, 이들 성분들을 한데 혼합하고 (예컨대, 1 ml의 DMSO + 1 ml의 1M NaOH + 50㎕의 폴리소르베이트 20) 실온에서 5-10분간 방치하여 응고시킨다.
표 1은 조성물의 최적화 및 매트릭스 겔 형상의 특정 캐리어 매질의 외관과 그 조성의 최적화를 나타낸다.
실시예 2:
FDA -결정 기반 시그널 시스템을 위한 이소프로판올( IPA )-기반 캐리어 매질의 제조
FDA용의 IPA 기반 캐리어 매질은 IPA, NaOH 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)로 이루어지며, 여기서 IPA의 사용 목적은 FDA를 용해시키는 것이고 NaOH는 용해된 FDA를 가수분해시키기 위해 사용된다. PVP는 캐리어 매질의 점도를 증가시키기 위해 사용된다. 구체적으로, 이들 성분들을 한데 혼합한다 (예컨대, 1 ml의 IPA + 1 ml의 1M NaOH + 0.2g의 PVP).
Figure pct00001
실시예 3:
마이크로타이터 플레이트에 기반한 검사에 있어서의 캐리어 매질의 적용
1 ㎍의 Gt-α-MIgG를 직경 1 mm의 마이크로시린지 펌프를 이용하여 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 위치된 나일론 막 상에 도트(dot)로서 코팅시켰다. 이어서 이 플레이트를 진공 하에 2 시간 동안 건조시켯다. 그 후, 플레이트를 세척 완충액[10 mM PBS, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) 폴리소르베이트-20]을 이용하여 5회 세척하였다. 이어서 웰을 100 μL의 1% BSA 용액을 이용하여 37℃에서 30분간 블로킹시켰다. 25 μL의 MIgG (100 ㎍/L)과 25 μL의 바이오틴-Gt--MIgG를 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 5회의 세척 사이클을 수행한 후, FDA 나노결정과 컨쥬게이트된 아비딘을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이션시켰다. 5회의 세척 사이클을 수행하고, 실시예 2에 설명된 바와 같은 캐리어 매질을 각각의 웰에 첨가하였다. UV 광 조사 하에 형광 도트가 즉시 관찰되었다. 이 과정은 다중-표적 검출과 관련하여 앞에서 도 5에 대해 설명된 바 있는데, 여기서 서로 다른 포획 항체들은 마이크로타이터 플레이트 내부에 놓인 나일론 막 상에서 도트로서 코팅되어 있다.

Claims (45)

  1. (a) 표적 물질 용액을 고체상 기질에 적용하는 단계,
    (b) 상기 표적 물질을, 복수개의 시그널 전구체 분자를 포함하는 비촉매적 표지가 부착된, 상기 표적 물질에 특이적인 친화성 분자와 결합시키는 단계,
    (c) 상기 고체상 기질에 캐리어 매질을 적용하는 단계, 및
    (d) 복수개의 시그널 전구체 분자들을 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위해 표지를 처리하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 고체상 기질 검출 시스템에서 시그널을 생성 및 국소화시키는 방법으로서,
    여기서 상기 캐리어 매질은 비촉매적 표지를 용해시키기 위한 용매와, 상기 검출가능한 시그널 생성 분자들에 의해 생성된 시그널을 국소화시켜서 상기 표적의 존재 여부 및/또는 양을 나타내는 농후제를 포함하여 이루어지는 것인,
    고체상 기질 검출 시스템에서 시그널을 생성 및 국소화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 고체상 기질에 캐리어 매질을 적용하는 상기 단계 (c) 및 복수개의 시그널 전구체 분자들을 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위해 표지를 처리하는 상기 단계 (d)는 상기 복수개의 시그널 전구체 분자들을 상기 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위한 시그널 발달 시약을 포함하는 캐리어 매질을 적용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 시그널 발달 시약은 플루오레신 및 그의 유도체, 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트), 플루오레신 디아세테이트 말레이미드(FDA-말레이미드), 시아닌, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 디아조-염료 기반 형광 물질, 및 소형 형광 방향족 및 헤테로방향족 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 플루오로포어를 활성화시키는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 시그널 발달 시약은 시아닌, 피라졸론, 안트라퀴논, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 카로티노이드 및 디아조- 및 모노아조, 옥사진, 인디고이드 또는 리보플라빈 기반 염료 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 크로모포어를 활성화시키는 것인 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 시그널 발달 시약은 염기 또는 에스테라제인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 복수개의 시그널 전구체 분자들을 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위해 표지를 처리하는 상기 단계 (d)는 물리적 수단에 의해 수행되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 물리적 수단은 온도 변화, pH 변화, 초음파 처리, 광조사 또는 마이크로웨이브 가열 중에서 선택되는 것인 방법.
  8. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시그널 전구체 분자는 플루오로포어 및 그 유도체, 루미노포어 및 그 유도체, 크로모포어 및 그 유도체, 보결 원자단(prosthetic groups), 또는 레독스 매개체로부터 선택된 레독스 활성 물질, 전극 활물질, 생물발광 및 형광발광 단백질, 가시 염료, 형광 염료, 생물발광성 물질 또는 화학발광성 물질, 전기화학적 활성 물질 또는 자성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 시그널 전구체 분자는 비촉매적 표지인 것인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 시그널 전구체 분자는 플루오레신 및 그의 유도체, 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트), 플루오레신 디아세테이트 말레이미드(FDA-말레이미드) 중에서 선택되는 것인 방법.
  11. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 친화성 분자는:
    (a) 항체, 유전적으로 변형된 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 수용체, 항원, 렉틴, 아비딘, 올리고펩타이드, 지질단백질, 당단백질, 펩타이드 호르몬 및 알레르겐 또는 그의 일부로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질;
    (b) DNA, RNAs, 올리고뉴클레오타이드, 앱타머 및 그의 일부로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산;
    (c) 단당류, 올리고당류, 다당류, 당지질, 프로테오-다당류 및 그의 일부로 이루어진 군으로부터 선택된 탄수화물; 또는
    (d) 바이오틴, 바이오틴 유도체, 스테로이드, 호르몬, 코팩터, 활성화제, 저해제, 약물, 알레르겐 또는 합텐으로 이루어진 군으로부터 선택된 저분자량 리간드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 농후제는 겔 형성 폴리머, 다당류, 단백질, 천연검, 계면활성제, 전분, 펙틴, 한천-한천, 아가로스 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 캐리어 매질은 박막 형태로 고체상 기질에 적용되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 박막은 제거가능한 보호층에 의해 고체상 기질로부터 분리되며, 상기 방법은 상기 보호층을 제거하여 고체상 기질을 캐리어 매질과 접촉시키는 것을 포함하여 이루어지는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 분무에 의해 캐리어 매질을 고체상 기질에 적용시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 캐리어 매질은 고체상 기질을 캐리어 매질에 침지(dipping)시킴으로써 고체상 기질에 적용시키는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 캐리어 매질은 용기 중의 고점도 액체 또는 매트릭스 겔에 고체상 기질을 함침(immersing)시킴으로써 고체상 기질에 적용시키는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 캐리어 매질은 점적(dropping)에 의해 고체상 기질에 적용시키는 것인 방법.
  19. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 플루오로포어 및 그 유도체, 루미노포어 및 그 유도체, 크로모포어 및 그 유도체, 보결 원자단, 레독스 매개체로부터 선택된 레독스 활성 물질, 전극 활물질, 생물발광 및 형광발광 단백질, 가시 염료, 형광 염료, 생물발광성 물질 또는 화학발광성 물질, 전기화학적 활성 물질 또는 자성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 시그널 전구체 분자들을 활성화시키는 것을 포함하여 이루어지는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 시그널 발달 시약을 사용하여 플루오로포어를 활성화시키는 것을 포함하여 이루어지는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 플루오로포어는 플루오레신 및 그의 유도체, 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트), 플루오레신 디아세테이트 말레이미드(FDA-말레이미드), 시아닌, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 디아조-염료 기반 형광 물질, 및 소형 형광 방향족 및 헤테로방향족 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 시그널 발달 시약을 사용하여 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트), 플루오레신 디아세테이트 말레이미드(FDA-말레이미드)를 가수분해하는 것을 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 발달 시약은 염기 또는 에스테라제인 것인 방법.
  24. 제19항에 있어서, 시그널 발달 시약을 사용하여 크로모포어를 활성화시키는 것을 포함하여 이루어지는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 크로모포어는 시아닌, 피라졸론, 안트라퀴논, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 카로티노이드 및 디아조- 및 모노아조, 옥사진, 인디고이드 또는 리보플라빈 기반 염료 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  26. 제2항에 있어서, FDA에 대한 용매, 시그널 발달 시약 및 농후제를 함유하는 캐리어 매질을 사용하는 것을 포함하여 이루어지는, 플루오레신 디아세테이트(FDA)의 결정으로부터 플루오레신 분자들을 방출시키기 위한 방법.
  27. 제26항에 있어서, 캐리어 매질은 디메틸 설폭사이드, 수산화나트륨 수용액 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 것인 방법.
  28. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 캐리어 매질 중의 농후제를 매질의 총 중량에 대하여 0.05 내지 50 중량%의 비율로 사용하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 캐리어 매질 중의 농후제의 비율은 매질 총 중량에 대하여 0.1 내지 20 중량%인 것인 방법.
  30. 유체 샘플 중에서 표적 물질을 검출하기 위한 검사 장치로서, 상기 장치는:
    유체 샘플을 샘플 적용 부위로부터 검출 부위로 이동시키기 위한 고체상 기질 검출 시스템;
    상기 검출 부위로부터 멀리 떨어진 위치에 배치되어 있고, 표적 물질에 대한 특이적인 친화성 분자와 컨쥬게이트되어 있는 비촉매적 표지 (상기 비촉매적 표지는 복수개의 시그널 전구체 분자들을 포함하여 이루어지고, 상기 시그널 전구체 분자들은 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자로 변환가능한 것임);
    비촉매적 표지를 용해시키기 위한 용매 및 상기 검출 부위에서 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들에 의해 생성된 시그널을 국소화시켜 상기 표적 물질의 존재여부 및/또는 양을 나타내기 위한 농후제를 포함하여 이루어진 캐리어 매질, 및
    상기 복수개의 시그널 전구체 분자들을 상기 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위한 수단
    을 포함하여 이루어지며,
    여기서 상기 캐리어 매질은 적어도 상기 검출 부위에서, 상기 분자와 접촉되는 것인, 유체 샘플 중에서 표적 물질을 검출하기 위한 검사 장치.
  31. 제30항에 있어서, 상기 복수개의 시그널 전구체 분자들을 상기 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위한 상기 수단은 상기 캐리어 매질 중에 함유되어 있는 시그널 발달 시약을 포함하는 것인 검사 장치.
  32. 제31항에 있어서, 시그널 발달 시약은 플루오레신 및 그의 유도체, 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트), 플루오레신 디아세테이트 말레이미드(FDA-말레이미드), 시아닌, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 디아조-염료 기반 형광 물질, 및 소형 형광 방향족 및 헤테로방향족 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 플루오로포어를 활성화시키는 것인 검사 장치.
  33. 제31항에 있어서, 시그널 발달 시약은 시아닌, 피라졸론, 안트라퀴논, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 카로티노이드 및 디아조- 및 모노아조, 옥사진, 인디고이드 또는 리보플라빈 기반 염료 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 크로모포어를 활성화시키는 것인 검사 장치.
  34. 제31항에 있어서, 상기 시그널 발달 시약은 염기 또는 에스테라제인 것인 검사 장치.
  35. 제30항에 있어서, 복수개의 시그널 전구체 분자들을 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위한 상기 수단은 물리적 수단인 것인 검사 장치.
  36. 제35항에 있어서, 상기 물리적 수단은 온도 변화, pH 변화, 초음파 처리, 광조사 또는 마이크로웨이브 가열을 일으키는 것인 검사 장치.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 측면 유동 검사 장치, 수직 유동 검사 장치, 시험관 또는 다중 검출 플랫폼 중에서 선택된 것인 검사 장치.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고체상 기질은 니트로셀룰로스, 나일론을 비롯한 다공성 막; 유리, 폴리스티렌, 금속, 카본을 비롯한 비다공성 플랫 기질; 시험관 또는 마이크로타이터 플레이트의 내벽; 자성 또는 비자성 비드를 비롯한 구체(spheres)로부터 선택되는 것인 검사 장치.
  39. 제30항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 캐리어 매질은 고체 형상을 갖는 매트릭스 겔인 것인 검사 장치.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 검사 장치는 측면 유동 검사 스트립이고 측정 반응 완결 후 테스트 스트립 위에 놓이도록 상기 캐리어 매질이 로딩된 광학적으로 투명한 덮개를 추가로 포함하는 것인 검사 장치.
  41. 제40항에 있어서, 광학적으로 투명한 덮개는 상기 장치의 다공성 성분들을 지지하기 위한 백 라미네이트에 부착되어 있는 것인 검사 장치.
  42. 유체 샘플 중에서 표적 물질의 존재 여부를 판정하기 위한 부품 키트(kit of parts)로서 여기서 상기 키트는:
    유체 샘플을 샘플 적용 부위로부터 검출 부위로 이동시키기 위한 고체상 기질 검출 시스템;
    상기 검출 부위로부터 멀리 떨어진 위치에 배치되어 있고, 표적 물질에 대한 특이적인 친화성 분자와 컨쥬게이트되어 있는 비촉매적 표지 (상기 비촉매적 표지는 복수개의 시그널 전구체 분자들을 포함하여 이루어지고, 상기 시그널 전구체 분자들은 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자로 변환가능한 것임); 및
    상기 복수개의 시그널 전구체 분자들을 상기 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위한 수단
    을 포함하여 이루어지는 것인, 유체 샘플 중에서 표적 물질의 존재 여부를 판정하기 위한 키트.
  43. 제42항에 있어서, 비촉매적 표지를 용해시키기 위한 용매 및 상기 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들에 의해 생성된 시그널을 상기 검출 부위에서 국소화시키기 위한 농후제를 포함하여 이루어지는 캐리어 매질의 형성을 위한 성분들을 추가로 포함하는 것인 키트.
  44. 제43항에 있어서, 상기 복수개의 시그널 전구체 분자들을 상기 복수개의 검출가능한 시그널 생성 분자들로 변환시키기 위한 상기 수단은 상기 캐리어 매질 내에 포함되는 시그널 발달 시약을 포함하여 이루어지는 것인 키트.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시그널 전구체 분자들은 형광 염료, 가시 염료, 생물발광성 또는 화학발광성 물질, 전기화학적 활성 물질 또는 자성 물질을 포함하는 것인 키트.
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