CN102460169B - 用于提高基于固相的生物测定中信号可读性的信号产生和信号定位的方法 - Google Patents

用于提高基于固相的生物测定中信号可读性的信号产生和信号定位的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于在固相基质检测系统中产生和定位信号的方法，包括：将靶物质的溶液施用于固相基质；将所述靶物质与该靶物质的特异性亲和分子结合，所述亲和分子连接有非催化性标记，所述非催化性标记包含多个信号前体分子；将载体介质施用于所述固相基质；及处理所述标记以将所述多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子；其中，所述载体介质包含用于溶解所述非催化性标记的溶剂，及用于引起由指示所述靶标的存在情况和/或量的所述多个可检测的信号产生分子所产生的信号的定位的增稠剂。在一些实施方案中，载体介质也可包含将多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子的信号显示剂。在其他实施方案中，信号显示剂并不是必需的，因为多个信号前体分子可通过物理方法转变为多个可检测的信号前体分子，物理方法例如温度变化、pH变化、声处理、光辐射或微波加热。还公开了一种用于检测流体样品中靶标的测试装置，及一种用于测定流体样品中靶标存在情况的部件的试剂盒。

Description

用于提高基于固相的生物测定中信号可读性的信号产生和信号定位的方法
本发明涉及例如体液等液体样品中的分析物的测定，分析物例如抗原。更具体而言，本发明涉及用于检测体液中分析物的非催化性方法，体液例如尿液、血液、血清、血浆、唾液或粪便的提取液，所述方法使用在使用固相平台的床旁(pointofcare，PoC)测试装置(例如侧流装置)中包含可检测物质的缀合物。本发明也可应用于非临床的情形，例如检测食物和水的污染物，或者用于兽医领域或军事。
本发明使用载体介质以携带用于测定中信号产生和信号定位的不同的试剂。载体介质包含：
(i)溶剂(例如，水溶液，包括缓冲液、盐溶液、水；有机溶剂，例如乙醇、丙醇等醇；醚，例如四氢呋喃(THF)，及极性非质子溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)；
(ii)增稠剂，其作为胶体混合物溶解在溶剂中，该胶体混合物形成赋予所得的从高粘度流体到凝胶的特性范围内的载体介质特性的内部结构。凝胶型载体介质具有固体外观，但是主要由溶剂组成。实例包括：聚合物，例如聚丙烯酰胺和聚异丁烯；多糖，例如淀粉、纤维素、获自褐藻的藻酸盐、琼脂、角叉菜胶、果胶；天然胶，例如槐树豆胶和瓜尔豆胶；蛋白质，例如胶原、白蛋白和明胶。
在一些实施方案中，载体介质也可包含信号显示剂，其是将信号前体分子转变为产生可检测信号的状态的物质。在其他实施方案中，信号显示剂并不是必需的，因为多个信号前体分子通过物理方法转变为多个可检测的信号分子，物理方法例如温度变化、pH变化、声处理(sonication)、光辐射或微波加热。
载体介质的功能为：
(i)阻止信号分子扩散，导致信号积累。
(ii)提高固相平台上信号的可读性(清晰度、信号保留时间的延长)，并从而提高灵敏度。
在一些实施方案中，其中多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子是由化学或生化方法所引起，载体介质具有第三种功能：
(iii)通过将多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子而产生信号。
对于使用可见光检测的测定，载体介质基本上为光学透明的。
许多类型的靶标-受体测定已经用于检测体液中各种靶物质的存在情况，体液例如尿液、血液、血清、血浆、唾液或粪便提取液。这些测定通常包括抗原抗体反应，带有放射性的、酶的、荧光的、发光的、化学发光的或视觉上可观察的金属标签的合成缀合物，并使用专门设计的反应室。在所有的这些测定中，存在对选择的靶标(例如抗原)特异的受体(例如抗体)，和用于检测靶标-受体反应产物的存在情况且通常是检测其量的工具。许多目前的测试设计为提供半定量或定量测定，但在许多情况下，所需要的是提供靶标物类存在情况的阳性或阴性表示的定性检测。这种定性测定的实例包括血型测定、大多数类型的尿分析和非常重要的作为直肠癌筛查测定的大便隐血测试。对于这些测试，优选视觉上可观察的指示，例如有色颗粒(例如金颗粒)的积累、存在凝集或者颜色改变。
然而，由于在测试液中受关注的靶标浓度常常低，定性测定必须是非常灵敏的。已开发夹心测定和使用金属溶胶或其他类型的有色颗粒的其他灵敏的检测方法。然而，这些技术并没有解决在快速检测法中遭遇的所有问题，且一直在寻求进一步的改进。
举例来说，在侧流夹心测定中，胶体金常常用作第一抗体(1)的标记，而另一抗体(2)固定在膜(例如硝酸纤维素膜)上的界限明确的检测部位。如果所述分析物存在于样品中，那么分析物与金标记抗体(1)反应并迁移至硝酸纤维素膜结合的抗体(2)。在此就形成夹心，然后将这些夹心复合物收集和浓缩在检测部位中。通过与银离子的另外反应，可使该部位更加可见至一定的程度(放大的)。
然而，分析灵敏度并不显著并且此技术并不容易应用于某些测定，例如测定低(但诊断学上非常重要)的浓度范围内的促甲状腺激素(TSH)、前列腺特异性抗原(PSA)、肌钙蛋白I或肌钙蛋白T。
因此，为了使这些测定更有效，使用了其他标记(称为“信号放大前体分子”)，其在测定反应结束时能被放大，例如在夹心：抗体(2)固定的-分析物-{抗体(1)-标记}形成结束时。
如果放大标记是包含结晶荧光素二乙酸酯(FDA)的微胶囊(由数百万个FDA分子组成)，那么通过分解微胶囊和水解非发荧光的FDA分子为发荧光的荧光素分子在测定反应后完成放大。此放大在授权的欧洲专利号EP1309867中被充分地证实和描述，其公开内容通过引用结合到本文中。
通常，放大反应发生在释放剂的溶液中。由于稀释的因素，即释放的荧光素分子在释放剂的反应体积中变得稀释，这导致分析灵敏度较理想值有轻微下降。
遗憾的是，在某些情况下，放大的益处可被信号消散的缺点抵消或者甚至被超过。例如，如果检测或测定在膜上进行，例如在侧流测试条上，加入用于实现信号放大的释放剂的溶液导致放大的信号顺着膜扩散。释放的/放大的分子没有被定位，因此在放大后信号可能难以检测。在基础测试反应完成后，加入任何溶液均导致检测线、点或区域的扩大。扩散使检测部位扩大，并且可靠地测量检测部位的颜色强度是不可能的。
现有技术也包括标记可为具有高转换数的酶的实例，当它与它的底物反应时，该酶形成非常多的反应产物分子。同样，这是在水溶液中进行，更具体而言，在具有酶的特异性底物分子的缓冲溶液中。基于酶的系统的一个缺点是，由于它们有催化性，放大在发生底物转变时开始，且这是一个前进式过程。放大取决于底物浓度和对酶反应选择的时间。如果不加入终止剂，酶将在测量时间期间(及之后)起作用，因此没有一个恒定的信号。加入终止剂将增加稀释作用。
因此，本发明一个目的是通过阻止信号分子的扩散克服现有技术的限制，并藉此通过维持信号的清晰度和延长信号保留时间来提高信号的可读性，使得能够可靠地检测信号。本发明还一个目的在于提供一种用于检测流体样品(尤其体液样品)中的分析物的快速灵敏方法。另一个目的是提供一种与常规测定相比具有高灵敏度的测定。又一个目的是提供一种用于检测流体中低水平的分析物的测试装置。
定义
载体介质：载体介质阻止多个可检测的信号产生分子的扩散，引起信号积累。这导致提高在固相平台上的多个可检测的信号产生分子的可读性(清晰度、信号保留时间的延长)，并因此提高灵敏度。
载体介质包含：
(i)溶剂(例如，水溶液，包括缓冲液、盐溶液、水；有机溶剂，例如乙醇、丙醇等醇；醚，例如四氢呋喃(THF)，及极性非质子溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)；
(ii)增稠剂，其作为胶体混合物溶解在溶剂中，该胶体混合物形成赋予所得的从高粘度流体到凝胶的特性范围内的载体介质特性的内部结构。
对于需要化学或生化活化的信号前体分子，载体介质也包含：
(iii)信号显示剂，其是将信号前体分子转变为产生可检测信号的状态的物质。
增稠剂：这是用于使液体溶液、乳液和悬浮液增稠和稳定的物质。它们作为胶体混合物溶解在液相中，该胶体混合物形成赋予所得的从高粘度流体到凝胶的特性范围内的载体介质特性的内部结构。凝胶型载体介质具有固体外观，但是主要由液体组成。增稠剂的实例包括凝胶形成聚合物，例如聚丙烯酰胺和聚异丁烯；多糖，例如纤维素、淀粉、获自褐藻的藻酸盐、琼脂、角叉菜胶、果胶；天然胶，例如槐树豆胶和瓜尔豆胶；蛋白质，例如胶原、白蛋白和明胶。
信号前体分子：这是当与一种或多种其他试剂反应时产生可检测信号的分子。存在来自不同化学类别的非常多的不同物质，它们通过开始的反应产生可检测信号，例如荧光团及其衍生物、发光团及其衍生物、发色团及其衍生物、辅基或选自氧化还原介体、电极活性物质的氧化还原活性物质、生物发光蛋白和荧光蛋白、染色渗透液、荧光染料、生物发光物质或化学发光物质、电化学活性物质或磁性物质。信号前体分子为非催化性标记。
可检测信号可基于：
-荧光测定法
-发光测定法
-在紫外、可见和近红外范围内的颜色变化
-氧化还原电势的变化
-由复合物形成或沉淀所致的质量变化
-放射性衰变产物检测
-磁场检测
信号分子：在上下文并未要求它们具体为信号前体状态或信号产生状态之一时，本说明书中使用的术语信号分子表示信号前体分子和/或信号产生分子两者。它也用于信号前体分子和信号产生分子二者可同时并存的情况。
信号显示剂：信号显示剂(如果存在)是使信号前体分子能够产生可检测信号的物质。
信号显示剂可适于活化选自以下的荧光团：荧光素及其衍生物，包括荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二乙酸异硫氰酸酯(FDA-异硫氰酸酯)、荧光素二乙酸酯马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)、花青、碳花青、若丹明、呫吨、基于重氮染料的荧光物质以及小的荧光芳香和杂芳香分子。备选地，信号显示剂可活化选自以下的发色团：花青、吡唑啉酮、蒽醌、碳花青、若丹明、呫吨(xanthen)、类胡萝卜素和基于重氮及单偶氮、噁嗪、靛类或核黄素的染料物质。
测试装置：本文件中使用的术语测试装置用于表示包含固相基质的装置。固相基质可选自：膜、微量滴定板、珠(磁性和非磁性的)、管和玻片。测试装置可适用于不用测定形式，包括侧流、垂流、试管、微量滴定板、花瓣盘(petal)等。固相基质的材料和形式可为：多孔膜，例如硝酸纤维素、尼龙；非多孔的平坦表面，例如玻璃、聚苯乙烯、金属、碳；试管或微量滴定板内壁；球体，例如磁珠或非磁性珠。
检测膜：检测膜由反应膜组成，例如附着有不同垫(例如缀合垫、样品垫、吸收垫)的硝酸纤维素条，有些垫带有试剂。带抗体或抗原的反应部位(检测部位、对照部位)包被在反应膜上界限明确的位置。反应部位的包衣可被动地吸附到反应膜上，它们可共价结合，或它们可免疫化学结合，例如通过链霉亲和素(链霉亲和素包被的←生物素化抗体)或通过物种特异性抗体(山羊抗小鼠抗体←小鼠抗体)。
亲和分子：亲和分子可为选自以下组物质的生物识别分子：
(a)肽或蛋白质，选自抗体、遗传修饰抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、受体、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和变应原或其部分；
(b)核酸，选自DNA、RNA、寡核苷酸、适配体及其部分；
(c)碳水化合物，选自单糖、寡糖和多糖、糖脂、蛋白多糖及其部分；或
(d)低分子量配体，选自生物素、生物素衍生物、类固醇、激素、辅因子、活化剂、抑制剂、药物、变应原或半抗原。
靶标：本说明书中使用的术语“靶标”意指在夹心型测定中的分析物或竞争型测定中的竞争剂二者。
发明详述
本发明提供一种用于在固相基质检测系统中产生和定位信号的方法，所述方法包括：将靶物质的溶液施用于固相基质；将所述靶物质与用于该靶物质的特异性亲和分子结合，所述亲和分子连接有非催化性标记，所述非催化性标记包含多个信号前体分子；将载体介质施用于所述固相基质；和处理所述标记以将所述多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子，其中，载体介质包含用于溶解非催化性标记的溶剂，和用于引起由指示所述靶标的存在情况和/或量的多个可检测的信号产生分子所产生的信号的定位的增稠剂。
在一些实施方案中，载体介质也可包含信号显示剂，其为将信号前体分子转变为产生可测信号的状态的物质。在这些实施方案中，信号产生和信号定位同时发生。
在其他实施方案中，信号显示剂并不是必需的，因为多个信号前体分子通过物理方法转变为多个可检测的信号产生分子，物理方法例如温度变化、pH变化、声处理、光辐射或微波加热。优选地，将载体介质施用于固相基质的步骤和处理非催化性标记以将多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子的步骤基本上同时进行。在实践中，可存在处理步骤的短暂中断，以将载体介质施用于固相基质，或者在施用载体介质后开始处理步骤可有少许的延迟。
载体介质可以许多不同的方法施用于固相基质。它可为基质凝胶的形式，其可直接作为薄膜施用。备选地，基质凝胶可通过保护层与固相基质分离，当需要时，可除去该保护层以使固相基质与基质凝胶接触。如果载体介质是液体，其可通过喷涂施用。另一种备选方法是将固相基质浸入载体介质中或将载体介质滴于固相基质上。又一种备选方法是在容器中将固相基质浸没到高粘度液体或基质凝胶中。
在第二个方面，本发明提供一种用于检测流体样品中靶物质的测试装置，所述装置包括：
固相基质检测系统，其包括用于将流体样品从样品施用部位转运至检测部位的部件；
设置在远离所述检测部位的位置的该靶物质的特异性亲和分子，该亲和分子连接有非催化性标记，所述非催化性标记包含多个信号前体分子，所述信号前体分子可转变为多个可检测的信号产生分子；
载体介质，其包含用于溶解非催化性标记的溶剂，和用于引起由指示所述靶物质的存在情况和/或量的所述多个可检测的信号产生分子在所述检测部位所产生的信号的定位的增稠剂；和
用于将所述多个信号前体分子转变为所述多个可检测的信号产生分子的部件；
其中，所述载体介质适于使其至少在所述检测部位与所述可检测物质接触。
在一些实施方案中，载体介质也可包含信号显示剂，其为将多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子的物质，信号产生分子产生可检测信号。在其他实施方案中，信号显示剂并不是必需的，因为多个信号前体分子可通过物理方法转变为多个可检测的信号产生分子，物理方法例如温度变化、pH变化、声处理、光辐射或微波加热。
本发明还提供一种用于测定流体样品中靶物质存在情况的部件的试剂盒，所述试剂盒包括：
固相基质检测系统，其包括将流体样品从样品施用部位转运至检测部位的部件；
设置在远离所述检测部位的位置的该靶物质的特异性亲和分子，该亲和分子连接有非催化性标记，所述非催化性标记包含多个信号前体分子，所述信号前体分子可转变为多个可检测的信号产生分子；和
用于将所述多个信号前体分子转变为所述多个可检测的信号产生分子的部件。
试剂盒可进一步包括用于形成载体介质的成分，载体介质包含用于溶解非催化性标记的溶剂和用于引起由多个可检测的信号产生分子在所述检测部位所产生的信号的定位的增稠剂。用于将多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子的部件可以是包含在载体介质内的信号显示剂。试剂盒中的信号前体物质可包括：荧光团及其衍生物、发光团及其衍生物、发色团及其衍生物、辅基或选自氧化还原介体、电极活性物质的氧化还原活性物质、生物发光蛋白和荧光蛋白、染色渗透液、荧光染料、生物发光物质或化学发光物质或者磁性物质。
为避免疑问，词语非催化性的也包括非酶的，本发明基于包含可转变为多个可检测的信号产生分子的多个信号前体分子的信号前体物质的使用。因此，当靶物质与连接有非催化性标记的该靶物质的特异性亲和分子结合时，该非催化性标记包含多个信号前体分子，由于每个靶标分子与多个信号前体分子关联，所以存在可检测信号的固有或潜在的放大。换句话说，当测定反应已发生时，信号前体物质能够被活化并且转变为多个可检测的信号产生分子。
例如，考虑这样的情形：其中靶物质是抗原，且与特异性结合靶物质的亲和分子缀合的非催化性标记是与包含荧光素二乙酸酯晶体(FDA，即信号前体分子晶体)的微胶囊结合的检测抗体。当抗原/检测抗体在检测部位被捕获时(例如，通过在固相支持体上的捕获抗体)，溶剂溶解FDA晶体和将FDA转变为荧光素(例如，通过用KOH处理)为每个靶抗原释放千百万个荧光分子。
本发明提供在检测部位线、点、斑点或区域扩大的问题的技术解决方案，并且带来了特别是在PoC测试装置中测试线和对照线的可读性的提高。扩大通常因将所需的释放剂加入水溶液中而引起或开始。检测部位不是清晰的反应线，且通过溶液中物质的扩散而变得模糊、扩散和不明确。通过本发明，在其形成位置定位信号的需要现在得到满足。
下面仅通过实施例并非限制性地参照附图描述本发明，附图中：
图1为显示已知侧流测试条结构的示意图；
图2概略性显示在使用中的现有技术侧流测试条的两个视图；视图(a)显示使用直接(即，未放大)标记的测试条，而视图(b)显示使用现有技术的溶液技术以放大标记的测试条；
图3为显示本发明施用载体介质薄膜以定位信号的测试条的另一示意图；
图4显示使用常规释放溶液产生的信号(左侧条)和使用本发明的基质凝胶定位的信号(右侧条)在不同时间间隔的荧光信号变化；
图5为多重检测平台的示意图；和
图6为具有负载有基质凝胶的光学透明盖子的测试条的示意图，盖子用于在测定反应完成后置于测试条上以进行可见信号的定位。
在以下的描述中，相关空间术语(例如“背面”、“左”、“右”等)用于方便熟练的阅读者，是指附图中所示测试装置及其组成部分的方向。在本发明的使用中，在其制造、运输、保管或出售过程中，或在其组成部分的装配过程中，或在并入其他设备或与其他设备结合时，使用这些术语并非意在造成限制。
图1为以平面图(视图(a))和侧视图(视图(b))显示常规侧流测试条的示意图。标号10表示用于将多孔组分保持在一起的背面层压板。在它的顶部放置有加样垫12，在使用时将样品施用于此。与之相邻的是缀合垫14，其包含当靶标在硝酸纤维素膜16携带的流体样品中沿测试条而经过时与靶标反应的检测物质或探针。在如图中描述的从左向右的流动方向上，检测部位18为跨越测试条宽度施用的捕获探针线，在该处捕获靶标/检测剂复合物，而对照部位20为检测部位18下游的跨越测试条宽度施用的另一条物质线。对照部位不检测样品中的任何物质，但是指示条已正确地湿润且所有的测试组分都是有功能的。对照部位应总是产生可见信号以证实测试已经正确进行，甚至对于未包含任何可检测的靶标并因此在检测部位不产生信号的样品也是如此。过量流体由吸收垫22吸收。
现在转到图2，其显示在使用中的两个侧流测试条的示意图。在视图(a)中，使用直接标记显示测试条，其中不需要将信号前体分子转变为信号产生分子；在检测部位和对照部位的检测线都是清晰的和界限明确的。视图(b)为测试条的图示，其中在测定反应发生后，加入信号显示剂的溶液体以开始将信号前体分子转变为可检测的信号产生分子。在此，在检测部位和对照部位的检测线不是界限明确的；由于信号产生分子通过用于施用信号显示剂的溶液的扩散，检测线扩散开来。
在本发明中，阻止了这样的扩散。其使信号前体分子转变为可检测的信号产生分子能够进行，同时维持检测部位和对照部位界限明确的检测线。这是通过使用最小化信号分子扩散和分布的载体介质而达成。在一些实施方案中，载体介质可包含将信号前体分子转变为可检测的信号产生分子的信号显示剂，但载体介质不是允许快速扩散通过检测膜的形式。
载体介质是基于具有“基质结合水”的增稠剂的发展，其中溶剂和在一些实施方案中的信号显示剂在凝胶状态形成前已经溶解在溶胶状态中。在凝胶状态下，基质使支持在检测膜上的多个可检测的信号产生分子的扩散最小化。
图3为类似图1中所示条的测试条的另一示意图，其中视图(b)显示依据本发明将载体介质24的薄层施用在检测膜16的上表面，以便引起通过将多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子而产生信号和定位多个可检测的信号产生分子。合宜地，载体介质可为切成薄条膜的基质凝胶，该薄条膜优选地与检测膜暴露的上表面尺寸相匹配。
图4为显示使用常规释放溶液产生的信号(左侧条)和使用基质凝胶形式的包含信号显示剂的载体介质产生的信号(右侧条)在不同的时间间隔荧光信号变化的照片。紧接着在施用常规释放溶液以从荧光素二乙酸酯信号前体分子释放荧光素之后或紧接着在施用本发明基质凝胶之后，对成对的条进行拍照。然后在以下连续的时间间隔：1、2、3、4、5、7、9、12和15分钟再次对相同的条对拍照。使用基质凝胶产生信号的条甚至在15分钟后仍维持界限明确的线，而常规使用释放溶液产生信号的条甚至在第一个间隔就开始显示扩散的迹象。在15分钟后，这些常规条显示非常扩散的线，这些线在实际中是几乎不可能可重复地解读的。
现在转到图5，这是如何将基质凝胶实施方案施用于多重检测平台的示意图。在视图(a)中，显示具有不同的捕获探针包被在预定位置的光学透明的容器；不同的捕获探针对特定靶标特异。在视图(b)中，将捕获探针暴露于包含多种与具体一种的捕获探针所结合的靶标的样品。在视图(c)中，捕获的靶标进一步与靶物质的特异性亲和抗体结合，抗体具有连接的非催化性标记，所述非催化性标记由作为信号前体分子的FDA组成。在视图(d)中，将具有用于FDA的信号显示剂的基质凝胶加入容器中，并且在靶标与各自的捕获探针结合的部位产生定位的荧光信号。
图6为具有负载有基质凝胶24的光学透明的盖子26的测试条的示意图，该盖子26用于在测定反应完成后放置于测试条上用于进行可见信号的定位。盖子可为分离的部件，但在此处显示其通过活动的铰链28连接到支持多孔组分的背面层压板10。
本发明解决现有方法的以下问题和限制：
●荧光、发光或吸光度因为信号产生分子的扩散不能可靠地被测定，意味着测量不能集中于测量区域。
●发生分析灵敏度的下降。扩散意味着荧光、发光或吸光度不固定于界限明确的区域，反而分布越过不打算作为检测部位的膜的部分。这导致可检测的信号产生分子由于从其形成位置流出而损失，及因此发生分析灵敏度的下降。
●如果侧流装置设计为半定量装置，那么在膜上提供若干抗体(2)线。因为可检测的信号产生分子在线之间及之后模糊/分布，故结果不能被理解。
本发明解决这些问题是基于改变菲克的著名的处理扩散流量的第一和第二定律的扩散系数的粘度项。菲克假定流量从高浓度区域进入低浓度区域，其大小与浓度梯度(dc/dx)成比例。在一个空间维度上，该公式为：
J＝-D*(dc/dx)
其中
●J是扩散流量，其是在短时间间隔期间流经小区域的物质的量的量度。在本发明中，期望J为最小值。
●D是取决于孔径、其分布和尤其“液体”粘度的“结合”凝胶-水中的扩散系数。
●C为浓度；在此，例如，形成的荧光素的浓度。
●X是距离形成位置的位置或距离；在此是与检测部位的距离。
扩散系数(D)与扩散颗粒的速度平方成比例，该速度取决于温度、液体粘度和颗粒的尺寸。在稀释的水溶液中，大多数离子的扩散系数是相似的，并具有范围通常为0.6x10-9-2x10-9m2/s的值。对于生物分子，扩散系数的范围一般为10-11-10-10m2/s。
本发明使用包含信号分子的定位所必需的试剂的载体介质。如前所讨论，在一些实施方案中，载体介质也可包含用以将信号前体分子转变为可检测的信号产生分子的信号显示剂。在其他实施方案中，该转变通过物理方法完成，物理方法如温度变化、pH变化、声处理、光辐射或微波加热。在水凝胶的情况中，在已从其溶胶状态形成凝胶状态后，水紧紧地结合/固定在凝胶的基质中。因为凝胶中的液体(水)或多或少是“固化的”，扩散变得明显受阻。在具有高剪切模量的液体的情形下，溶剂阻止信号分子的扩散。
包含关键试剂的凝胶可通过将试剂溶解于凝胶形成复合物的溶胶状态中容易地产生。在试剂包含到溶胶中后，在特定量的时间后溶胶转化为凝胶状态，或可通过温度引起转化(例如琼脂在较高温度为液体(溶胶状态)，而在较低温度为固体(凝胶状态)。
有许多物质以溶胶和凝胶状态存在。带水的凝胶和溶胶状态可表征为：在溶胶状态，凝胶形成物质增稠剂以胶态分散于水中，然而，在凝胶状态，水分散于增稠剂的凝胶形成网络中。
在一个特别的优选实施方案中，本发明使用在欧洲专利号EP1309867中公开的原理，其中一个反应伙伴的标记是包含数百万的非荧光FDA分子的FDA晶体。在反应区域，它们水解为数百万的荧光素分子。由于包含在载体介质中的增稠剂，故阻止了由此形成的荧光素分子从反应部位扩散离开。
在此过程中，DMSO和NaOH是包含于载体介质中的溶剂和信号显示剂。信号定位作用通过DMSO和NaOH部分扩散出载体介质(即从高浓度的DMSO和NaOH溶液的区域流出到较低浓度区域)至检测膜表面而说明。FDA晶体溶解在DMSO中并被NaOH水解为发荧光的荧光素。因为水强烈地结合在载体介质中，载体介质由于增稠剂的作用而可视为交联的三维网络，所以小分子量的物质仅仅扩散通过具结合液态水的载体介质并迅速与检测膜接触。该过程不花费超过约30秒。
因为未加入具有非结合水的水溶液，所以荧光素分子不会发生由检测膜的吸收垫协助的扩散和分布。因此，定位荧光素分子，并可在不损失分析灵敏度的条件下测量。如果在半定量测定中存在更多的检测线，也不会有可读性的消减。
对于特定的检测平台，载体介质可为作为大的薄片产生的基质凝胶形式，其然后被切成合适尺寸的部分以放置在检测膜上。在可行性研究中，利用镊子进行这一放置。
另一方法是将载体介质整合至单独的透明盖装置中，当在测定反应完成后将其关闭时，该装置适于使载体介质与检测膜接触。在这种情况下，测试装置由两个盒子形式的部分组成。打开检测装置(盒子)，在带检测膜的盒子的下部进行检测反应。随后，用其中整合有载体介质的盖子关闭盒子。为避免由于盖子过早关闭而引起信号前体分子与载体介质之间的疏忽接触，载体介质可有可释放薄膜的薄片的保护盖，在检测反应完成后将其移除。之后载体介质才能与检测膜上的检测部位接触。
制备/产生载体介质
载体介质的形成一般可通过混合溶剂、信号显示剂(如果存在)和增稠剂来进行。取决于选择的增稠剂，可能需要加热和冷却。
不同的增稠剂或增稠剂混合物可用于载体介质的形成过程。对于每种类型的增稠剂，必须考虑结合水含量、凝胶的剪切特性、固化过程中的收缩、整合的反应伙伴的扩散常数、稠化、光学透明度、稳定性和对于温度变化的稳健性，优化用于实现可检测的信号产生分子的定位的增稠剂的合适浓度。
当为基质凝胶形式时，载体介质的粘度可与用于SDS-PAGE中的聚丙烯酰胺凝胶的粘度相比。低百分比的凝胶，可能不是非常粘稠，可以通过喷涂施用于检测膜的表面。高百分比的粘稠的凝胶更适合特定的多重检测平台，其中包被的花瓣盘浸没到凝胶中以显示定位的信号。凝胶百分比的范围可为基于介质总重量的0.05％-50％重量；更优选的范围为0.1％-20％。在其他实施方案中，凝胶比例的下限可为以下任一值：0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％和0.5％；凝胶比例的上限可为以下任一值：3％、4％、5％、10％、20％和50％。因此，凝胶比例的范围可为任一上述下限与任一上述上限的组合。
载体介质的剪切模量可通过改变加入的增稠剂的量而调整。当然，高粘度的溶液也可减缓扩散，但信号保留时间将比使用固化形式所获得的时间短。
如果优化基质凝胶，那么得到在检测部位的位置的定位的反应线(信号线)，如基于实验结果的图4中所示。图4再次显示如果使用基质凝胶而非水溶液用于信号产生和定位，那么检测部位的形状显著不同。
实施例
下面参照不同实施例详细描述本发明，但是应理解这些实施例并非限制性的。
实施例1：
制备用于基于FDA晶体的信号系统的基于DMSO的载体介质
用于FDA的载体介质由DMSO、NaOH和聚山梨醇酯20组成，其中DMSO的用途是溶解FDA，而NaOH用于水解溶解的FDA。聚山梨醇酯20是用于凝胶形成的活性组分。具体而言，将这些成分一起混合(例如，混合1ml的DMSO+1ml的1MNaOH+50μl的聚山梨醇酯20)并室温静置持续5-10分钟以固化。
表1显示基质凝胶形式的特定载体介质的组合物和外观的优化。
实施例2：
制备用于基于FDA晶体的信号系统的基于异丙醇(IPA)的载体介质
用于FDA的基于IPA的载体介质由IPA、NaOH和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)组成，其中IPA的用途是溶解FDA，而NaOH是用于水解溶解的FDA。PVP用于增加载体介质的粘度。具体而言，将这些成分一起混合(例如，混合1ml的IPA+1ml的1MNaOH+0.2g的PVP)。
*Tween20为聚山梨醇酯20的市售形式-Tween为注册商标
实施例3：
施用载体介质于基于微量滴定板的测试
通过直径1mm的微量注射器泵，在放置于微量滴定板各孔内部的尼龙膜上以点的方式包被1μgGt-α-MIgG。然后将板真空干燥2小时。此后，用洗涤缓冲液[10mMPBS、0.1％(w/v)BSA、0.5％(w/v)聚山梨醇酯-20]洗涤板5次。然后在37℃用100μL1％的BSA溶液封闭各孔30分钟。向每个孔内加入25μLMIgG(100μg/L)和25μL生物素-Gt-α-MIgG，并于37℃温育1小时。在5个洗涤循环后，向每个孔内加入与FDA纳米晶体缀合的抗生物素蛋白，并于37℃再次温育1小时。在5个洗涤循环后，向每个孔内加入如实施例2中所描述的载体介质。在UV光下立刻观察到荧光点。上文参照图5描述了该用于多靶标检测的方案，其中以点的形式将不同捕获抗体包被在微量滴定板内部放置的尼龙膜上。

Claims (69)

1.一种用于检测流体样品中的靶物质的测试装置，所述装置包括：
固相基质检测系统，其包括将流体样品从样品施用部位转运至检测部位(18)的部件；
设置在远离所述检测部位的位置(14)的与该靶物质的特异性亲和分子缀合的非催化性标记，所述非催化性标记包含多个信号前体分子，所述信号前体分子可转变为多个可检测的信号产生分子；和
载体介质(24)，其包含用于溶解所述非催化性标记的溶剂，及用于引起指示所述靶物质的存在情况和/或量的所述多个可检测的信号产生分子在所述检测部位所产生的信号的定位的增稠剂；
其特征在于，所述测试装置为还包括负载有所述载体介质(24)的光学透明盖子(26)的侧流测试条，所述光学透明盖子用于在测定反应完成后放置于所述测试条上，所述载体介质适于使其至少在所述检测部位与所述信号产生分子接触。
2.权利要求1的测试装置，其中，所述光学透明盖子(26)与用于保持所述装置的多孔组分的背面层压板(10)铰接。
3.权利要求1或2的测试装置，其中，所述测试装置还包括覆盖所述载体介质的可除去的保护层。
4.权利要求1或2的测试装置，其中，所述固相基质选自：多孔膜或非多孔的平坦表面。
5.权利要求4的测试装置，其中所述多孔膜包括硝酸纤维素或尼龙。
6.权利要求4的测试装置，其中所述非多孔的平坦表面包括玻璃、聚苯乙烯、金属或碳。
7.权利要求1或2的测试装置，其中，所述亲和分子选自：
(a)选自以下的肽或蛋白质：抗体、受体、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素、变应原，或其部分；
(b)选自以下的核酸：DNA、RNA、寡核苷酸、适配体，及其部分；
(c)选自以下的化合物：单糖、寡糖、多糖、糖脂、蛋白多糖及寡糖、多糖、糖脂、蛋白多糖的部分；或
(d)选自以下的低分子量配体：生物素、生物素衍生物、激素、辅因子、活化剂、抑制剂、药物、变应原和半抗原。
8.权利要求7的测试装置，其中所述抗体为遗传修饰抗体、单克隆抗体或多克隆抗体，半抗原是类固醇。
9.权利要求1的测试装置，其中，所述测试装置还包括用于将所述多个信号前体分子转变为所述多个可检测的信号产生分子的在所述载体介质中包含的信号显示剂。
10.权利要求9的测试装置，其中，所述信号显示剂为碱或酯酶。
11.权利要求1或2的测试装置，其中，所述信号前体分子选自：发光团及其衍生物、发色团及其衍生物、辅基、或选自氧化还原介体的氧化还原活性物质、染色渗透液、荧光染料、生物发光物质或化学发光物质、电化学活性物质或磁性物质。
12.权利要求11的测试装置，其中所述电化学活性物质是电极活性物质。
13.权利要求11的测试装置，其中所述发色团及其衍生物是荧光蛋白；所述荧光染料是荧光团及其衍生物。
14.权利要求11的测试装置，其中所述生物发光物质是生物发光蛋白。
15.权利要求11的测试装置，其中，所述信号前体分子为非催化性标记。
16.权利要求11的测试装置，其中，所述信号前体分子为选自以下的荧光团：荧光素及其衍生物、基于重氮染料的荧光物质。
17.权利要求16的测试装置，其中所述信号前体分子是荧光素。
18.权利要求16的测试装置，其中，所述信号前体分子选自：荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二乙酸异硫氰酸酯(FDA-异硫氰酸酯)和荧光素二乙酸酯马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)。
19.权利要求11的测试装置，其中所述信号前体分子选自碳花青和呫吨。
20.权利要求11的测试装置，其中所述信号前体分子选自小的荧光芳香和杂芳香分子。
21.权利要求11的测试装置，其中所述信号前体分子选自花青和若丹明。
22.权利要求16的测试装置，其中，所述测试装置还包括用于荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二乙酸异硫氰酸酯(FDA-异硫氰酸酯)或荧光素二乙酸酯马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)的信号显示剂。
23.权利要求11的测试装置，其中，所述信号前体分子是荧光素二乙酸酯(FDA)，所述载体介质包含用于FDA的溶剂、信号显示剂和增稠剂。
24.权利要求23的测试装置，其中，所述载体介质包含二甲基亚砜、氢氧化钠水溶液和聚山梨醇酯20。
25.权利要求11的测试装置，其中，所述信号前体分子为选自以下的发色团：花青、吡唑啉酮、蒽醌、若丹明、呫吨、类胡萝卜素和基于重氮、单偶氮、噁嗪、靛类或核黄素的染料物质。
26.权利要求25的测试装置，其中花青是碳花青。
27.权利要求1或2的测试装置，其中，所述增稠剂选自：凝胶形成聚合物和表面活性剂。
28.权利要求27的测试装置，其中所述凝胶形成聚合物是多糖、蛋白质或天然胶。
29.权利要求28的测试装置，其中所述多糖是淀粉、果胶、琼脂或琼脂糖。
30.权利要求28的测试装置，其中所述凝胶形成聚合物是明胶。
31.权利要求1或2的测试装置，其中，增稠剂在所述载体介质中的比例为基于所述载体介质总重量的0.05%-50%重量。
32.权利要求31的测试装置，其中，所述增稠剂选自：凝胶形成聚合物和表面活性剂。
33.权利要求32的测试装置，其中所述凝胶形成聚合物是多糖、蛋白质或天然胶。
34.权利要求33的测试装置，其中所述多糖是淀粉、果胶、琼脂或琼脂糖。
35.权利要求33的测试装置，其中所述凝胶形成聚合物是明胶。
36.一种使用测试装置检测流体样品中的靶物质的方法，所述测试装置包括：固相基质检测系统，其包括将流体样品从样品施用部位转运至检测部位(18)的部件；设置在远离所述检测部位的位置(14)的与该靶物质的特异性亲和分子缀合的非催化性标记，所述非催化性标记包含多个信号前体分子，所述信号前体分子可转变为多个可检测的信号产生分子；所述测试装置为还包括负载有载体介质(24)的光学透明盖子(26)的侧流测试条，所述载体介质(24)包含用于溶解所述非催化性标记的溶剂，及用于引起指示所述靶物质的存在情况和/或量的所述多个可检测的信号产生分子在所述检测部位所产生的信号的定位的增稠剂；所述方法包括：
(a)将疑似含有靶物质的溶液施用于固相基质；
(b)将靶物质与连接有所述非催化性标记的特异性亲和分子结合；
(c)处理所述标记以将所述多个信号前体分子转变为多个可检测的信号产生分子；和
(d)将所述载体介质施用于所述固相基质；
其特征在于，所述将所述载体介质施用于所述固相基质的步骤(d)包括将所述光学透明盖子(26)关闭到所述测试条上，以使所述载体介质至少在所述检测部位与所述信号产生分子接触。
37.权利要求36的方法，其中，保护层覆盖所述载体介质(24)，所述将所述载体介质施用于所述固相基质的步骤(d)包括在将所述光学透明盖子(26)关闭到所述测试条上之前除去保护层。
38.权利要求36或37的方法，其中，所述固相基质选自：多孔膜或非多孔的平坦表面。
39.权利要求38的测试装置，其中所述多孔膜包括硝酸纤维素或尼龙。
40.权利要求38的测试装置，其中所述非多孔的平坦表面包括玻璃、聚苯乙烯、金属或碳。
41.权利要求36或37的方法，其中，所述亲和分子选自：
(a)选自以下的肽或蛋白质：抗体、受体、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素、变应原，或其部分；
(b)选自以下的核酸：DNA、RNA、寡核苷酸、适配体，及其部分；
(c)选自以下的化合物：单糖、寡糖、多糖、糖脂、蛋白多糖及寡糖、多糖、糖脂、蛋白多糖的部分；或
(d)选自以下的低分子量配体：生物素、生物素衍生物、激素、辅因子、活化剂、抑制剂、药物、变应原和半抗原。
42.权利要求41的方法，其中所述抗体为遗传修饰抗体、单克隆抗体或多克隆抗体，半抗原是类固醇。
43.权利要求36的方法，其中，所述载体介质(24)还包含用于将所述多个信号前体分子转变为所述多个可检测的信号产生分子的信号显示剂。
44.权利要求43的方法，其中，所述信号显示剂为碱或酯酶。
45.权利要求36或37的方法，其中，所述信号前体分子选自：发光团及其衍生物、发色团及其衍生物、辅基或选自氧化还原介体的氧化还原活性物质、染色渗透液、荧光染料、生物发光物质或化学发光物质、电化学活性物质或磁性物质。
46.权利要求45的方法，其中所述电化学活性物质是电极活性物质。
47.权利要求45的方法，其中所述发色团及其衍生物是荧光蛋白；所述荧光染料是荧光团及其衍生物。
48.权利要求45的方法，其中所述生物发光物质是生物发光蛋白。
49.权利要求45的方法，其中，所述信号前体分子为非催化性标记。
50.权利要求45的方法，其中，所述信号前体分子为选自以下的荧光团：荧光素及其衍生物和基于重氮染料的荧光物质。
51.权利要求50的方法，其中所述信号前体分子是荧光素。
52.权利要求50的方法，其中，所述信号前体分子选自：荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二乙酸异硫氰酸酯(FDA-异硫氰酸酯)和荧光素二乙酸酯马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)。
53.权利要求45的方法，其中所述信号前体分子选自碳花青和呫吨。
54.权利要求45的方法，其中所述信号前体分子选自小的荧光芳香和杂芳香分子。
55.权利要求45的方法，其中所述信号前体分子选自花青和若丹明。
56.权利要求52的方法，其中，所述方法还包括用于荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二乙酸异硫氰酸酯(FDA-异硫氰酸酯)或荧光素二乙酸酯马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)的信号显示剂。
57.权利要求45的方法，其中，所述信号前体分子为荧光素二乙酸酯(FDA)，所述载体介质(24)包含用于FDA的溶剂、信号显示剂和增稠剂。
58.权利要求57的方法，其中，所述载体介质(24)包含二甲基亚砜、氢氧化钠水溶液和聚山梨醇酯20。
59.权利要求45的方法，其中，所述信号前体分子为选自以下的发色团：花青、吡唑啉酮、蒽醌、若丹明、呫吨、类胡萝卜素和基于重氮、单偶氮、噁嗪、靛类或核黄素的染料物质。
60.权利要求59的方法，其中花青是碳花青。
61.权利要求36或37的方法，其中，所述增稠剂选自：凝胶形成聚合物和表面活性剂。
62.权利要求61的方法，其中所述凝胶形成聚合物是多糖、蛋白质或天然胶。
63.权利要求62的方法，其中所述多糖是淀粉、果胶、琼脂或琼脂糖。
64.权利要求62的方法，其中所述凝胶形成聚合物是明胶。
65.权利要求36或37的方法，其中，增稠剂在所述载体介质中的比例为基于所述载体介质总重量的0.05%-50%重量。
66.权利要求65的方法，其中，所述增稠剂选自：凝胶形成聚合物和表面活性剂。
67.权利要求66的方法，其中所述凝胶形成聚合物是多糖、蛋白质或天然胶。
68.权利要求67的方法，其中所述多糖是淀粉、果胶、琼脂或琼脂糖。
69.权利要求67的方法，其中所述凝胶形成聚合物是明胶。
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