CN102636651A - 多项心肌标志物并行检测方法及系统、芯片试纸 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种多项心肌标志物并行检测方法及系统、芯片试纸，所述芯片试纸用以检测心肌标志物：cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；所述芯片试纸包括第一膜片、第二膜片；在第一膜片上设有各标志物的配体An，在第二膜片上吸附有信号标记物偶联的配基Bn；将与配体An和Bn形成夹心检测的被检测物质从加样孔加入后通过渗滤(或其他)作用力下移动分别与配体Bn和An结合形成第一膜片-配体An-被检测物-配体Bn-信号标记物的复合固定于第一膜片上形成复合物阵列，与捕获纤维膜同时装配，留检测孔。本发明提出的多项心肌标志物并行检测方法、系统及用到的芯片试纸，可以同时定量检测多项心肌标志物，并可提高检测的灵敏度，节约检测时间。

Description

多项心肌标志物并行检测方法及系统、芯片试纸

技术领域

本发明属于体外免疫分析技术领域，涉及一种标志物并行检测方法，尤其涉及一种多项心肌标志物并行检测方法；本发明还涉及一种多项心肌标志物并行检测系统；同时，本发明还涉及一种用于多项心肌标志物并行检测的芯片试纸。

背景技术

急性心肌损伤、慢性心力衰竭和动脉粥样硬化等心血管疾病是严重危害人类健康的常见疾病。从50年代以来，动态测定一些代谢酶活性一直是诊断急性心肌梗死(acute myocardialinfarction，AMI)的金标准。但这些酶并不是心肌所特有，在人体的其他器官和肌肉中也大量存在，除AMI外，因运动、炎症也可引起升高，而且这些心肌酶的分子量较大，从坏死组织进入血液较一些小分子物质慢，而且酶的活性时间短，其窗口时间也短，对临床诊断的帮助价值常因此而受到限制。由于酶活性检测对辅助诊断心肌损伤的敏感性和特异性较差，特别是当心电图(electrocardiogram，ECG)改变不明显或为无Q波的心肌梗死(MI)、不稳定心绞痛、心肌炎或中毒性心肌损伤及伴有肾功能衰竭、多器官功能不全或伴骨骼肌损伤等疾病时，更难以准确诊断。而对于心力衰竭患者而言，过去一直没有一项很好的实验室检测指标用于评价心力衰竭程度，而仅依赖心电图、超声心动图和心脏核磁共振等。由于心力衰竭的患病率和死亡率极高，且近年来一直呈上升趋势，早期发现和预防心力衰竭进一步加重具有非常重要的临床价值。近几年来，一些新的具有高度特异性和敏感性的心肌标志物检测指标已较为普遍地用于临床实验室诊断，如肌钙蛋白T或I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶(isoenzymeof creatine kinase containing M and B subunits，CK-MB)、B型尿钠肽、超敏C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)等。对这些新的心肌标志物的正确应用为临床准确诊断、鉴别诊断和判断治疗效果起到了革命性的作用。由于这些新的指标是近几年才开始在国内逐步普及应用，因此掌握与之相关的生物学特点，是临床对其合理运用和选择的前提条件。

心肌损伤标志物的类型及应用

1.心肌标志物的类型：心肌损伤标志物主要有肌钙蛋白T(troponin T)、肌钙蛋白I(troponinI)、肌酸激酶同工酶质量(CK-MB mass)和肌红蛋白(myoglobin)。肌钙蛋白由3个亚单位组成，它们各自有独立的结构和不同的调节作用，心肌肌钙蛋白在钙离子参与下调节介导肌动蛋白和肌球蛋白之间的相互反应，从而维持心肌的舒张与收缩。在心肌细胞膜完整时，心肌肌钙蛋白不会透出细胞膜进入血循环，只有当心肌细胞膜破坏时，肌钙蛋白才能释放入血。其血循环中肌钙蛋白的浓度与心肌受损的程序呈正比，且具有长达15d的半衰期，是回顾性检测的最佳指标。

CK为细胞内重要的能量代谢酶，分布广泛，以肌细胞中最多，由二个亚基组成二聚体；CK-MB主要存在于心肌细胞的外浆层，一直是临床诊断心肌损伤的心肌酶谱中最具特异性的酶，但长期以来用免疫抑制法测定酶活性的干扰因素很多，检测的敏感性、特异性均大受影响，现由美国心脏病协会和欧洲心脏病协会推荐用化学发光方法测定CK-MB的质量可不受酶活性的影响，直接检测CK-MB分子的浓度，可更加敏感、特异地为临床提供帮助。

肌红蛋白主要存于横纹肌(心肌、骨骼肌)细胞中，在细胞膜的氧化功能中具有重要作用。因其为小分子物质(相对分子质量17000～18000)，当心肌细胞发生损伤时，Mb是最早进入血液的生物的标志物，其扩散入血的速度比CK-MB mass或cTnI/cTnT更快。但因肌红蛋白在骨骼肌中也有表达，故骨骼肌损伤时也可有大量肌红蛋白释放，其不具有心肌特异性。

2.心肌损伤时心肌标志物的正确选择：美国纽约心脏病协会的建议认为，肌红蛋白是用于心肌损伤的最佳早期标志物。由于其为小分子物质，在急性心肌梗死(AMI)时可快速入血，故在AMI发生的1.5～6h内，通过动态检测二次血清肌红蛋白水平可早期诊断是否有急性心肌梗死发生。如第二次检测值明显高于第一次检测值，则具有极高的阳性预报价值；如动态检测二次测定值间无差异，则具有100％的阴性预报价值，排除急性心肌梗死的可能性。但应注意的是，严重休克、严重的广泛性创伤、终末期肾功能不全、心肌炎、急性感染、肌炎或肌病时肌红蛋白均可能升高。因而应注意与急性心肌梗死进行鉴别诊断。由于肌红蛋白的窗口时间最短，仅为3～4d，故在疾病发生后该指标不能用于回顾性分析。

cTnI/cTnT被美国和欧洲心脏病协会一致评为是诊断急性心肌梗死的高特异性和高敏感性的确诊标志物。在心肌细胞损伤早期，游离于胞浆内的cTnI/cTnT快速释放出来，血清/血浆中水平在4～6h升高。随着肌原纤维不断崩解破坏，以固定形式存在的cTn不断释放，血清/血浆中cTn水平在AMI发生后8～14h达高峰，1～2周后降至正常。由于cTnI/cTnT具用心肌特异性，胸痛发生4h后的患者，可直接采用cTnI/cTnT检测，其血清/血浆中水平升高具有诊断的特异性，AMI的早期诊断可为患者的治疗赢得宝贵时间。对于一直不能通过心电图改变，又能无临床典型症状的微小心肌损伤患者，cTnI/cTnT的检测是目前的最佳辅助诊断指标。cTnI/cTnT除了用于AMI的早期诊断外，尚可作为临床溶栓治疗后再灌注的监测指标。但也有学者建议，尽管溶栓治疗后血浆中的cTnI/cTnT水平因再灌注达到一个新的高峰值，但因其窗口时间较长，不利于区分损伤时的峰值与治疗后的峰值，故在溶栓治疗前后选用CK-MB mass或肌红蛋白的检测作为判断溶栓后治疗效果的实验室指标可能更佳。只要在溶栓治疗开始90min后，CK-MB mass或肌红蛋白值较治疗前升高4倍以上，提示治疗有效。因此，cTnI/cTnT在用于确定临床诊断急性用心肌损伤的准确性、对未及时应诊患者的后期回顾性诊断、区别同时有着骨骼肌和心肌损伤时的心肌损伤程度、溶栓治疗再灌注的疗效评估、心脏手术时对心肌损伤程度和修复的评估都是非常有用的、全新的确诊性指标。CK-MB mass检测的敏感性和特异性都大大高于CK-MB活性(activity)，故当没有开展cTnI或cTnT检测时，可用CK-MB mass协助临床诊断，其对于诊断急性冠脉综合征和评价心肌损伤程度，以及在敏感性和特异性方面都接近肌钙蛋白。

心力衰竭标志物的应用

各种心脏疾病最终均可发展到心力衰竭。由于心力衰竭的发展比较缓慢，心脏是在各种病症累积多年后，才渐渐失去其泵血能力和各方面功能的减弱及下降。而在心衰的早期，心脏功能的减退是依靠心脏所分泌的短肽激素来调节心脏的代偿功能，故在临床上往往不易出现症状。传统诊断心衰的指标为心脏超声诊断，以评价心脏左室的射血分数了解心脏功能。近几年，由美国和欧洲心脏病协会推荐使用的B型尿钠肽(B-type brain natriuretic peptide，B-BNP)，是目前唯一一个最好的用于评价心力衰竭的实验室检测指标，在欧洲心脏协会(European Society of Cardiology，ESC)2001年的心衰诊断指南中心，已将其作为实验室检测项目中的唯一指标。

B型尿钠肽又称脑尿钠肽(Brain natriuretic peptide，BNP)，是由心肌细胞合成的具有生物学活性的天然激素，主要在心室表达，同时也存在于脑组织中。当左心室功能不全时，由于心肌扩张而快速合成释放入血，有助于调节心脏功能。心肌细胞所分泌的BNP先以108个氨基酸组成的前体形式存在，当心肌细胞受到刺激时，在活化酶的作用下裂解为由76个氨基酸组成的无活性的直线多肽和32个氨基酸组成的活性环状多肽，释放入血循环，分别被称为NT-proBNP和BNP。

NT-proBNP的生物学半衰期为60～120min，而BNP仅为20min。B-BNP的释放与心衰程度密切相关，心衰程度加重，B-BNP的释放增加。B-BNP的主要生物学作用是参与钠调节，促进尿钠排泄和利尿，扩张血管，维持血压的动态平衡，同时拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统使心输出量增加。现已发表的研究资料显示，B-BNP水平与左心室射血分数有极好的负相关性，认为B-BNP可作为左心室射血分数的替代检测指标。

现有不同公司的检测方法问世，主要分为检测外周血中NT-proBNP水平，或检测BNP水平。无论是检测NT-proBNP还是BNP，在临床应用价值上都没有太大差异。由于正常人血清/血浆B-BNP水平极低，故B-BNP水平的升高具有极好的诊断价值。B-BNP主要用于诊断心力衰竭、监测病程进展、对疗效和预后进行评估，同时用于AMI患者在治疗后对其心室功能的恢复状况进行评估。当治疗有效时，BNP水平可明显下降，BNP水平的持续升高或持续不降低，通常提示患者的心衰未得到纠正或正进一步加重；在急诊室对呼吸急促患者的鉴别诊断，也可通过测定B-BNP水平准确筛选出非心衰患者引起的呼吸困难，由于其所具有的心肌特异性，B-BNP水平测定就具有很高的阴性预测价值；BNP在用于心脏外科手术患者的术前心脏功能评价，也是一项非常重要的指标。国外许多研究也显示，B-BNP用于对高危人群的筛查，具有重要的指导意义，如糖尿病、遗传性心脏病、高血压、既往心梗、风湿性心脏病已行换瓣手术患者，都应定期作B-BNP的检测，及时了解心脏功能状况。还有研究提示，B-BNP水平升高与高危患者的死亡率增加和再次住院治疗的风险均呈高度相关，并认为B-BNP检测值比左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和VO2峰值更具有预测价值。由于B-BNP是目前唯一最好的评价心衰的实验室检测指标，其检测快速、敏感、特异，检测该指标来帮助筛选是否需做超声心动图，从卫生经济学角度来讲，也是一个最好的节约方案。

超敏CRP在冠心病危险因素评价的作用

冠心病和动脉粥样硬化是一类严重危害人类健康、影响生活质量的常见心血管疾病。随着生活水平的提高，其发生率也日趋增长。对这类疾病进行早期预防和干预，是维护人类健康的一项重要任务，用于评价冠心病危险因素的指标很多，除了临床资料和遗传资料以外，尚有很多实验室指标，如载脂蛋白(apoprotein，APO)中的APO-A1、APO-B、HDL-C、VLDL-C、LDL-C等。近几年，随着检测技术的发展，一些新的检测指标也用于临床，其中最具代表性的指标为超敏CRP(hs-CRP)。CRP由肝细胞合成(相对分子质量为100000～144000)，正常情况下在血清/血浆中含量极低，而当炎症或组织损伤时CRP含量可成倍增加，被临床作为炎症及感染的最佳实验室指标。而hs-CRP水平用一般的免疫化学方法不能检测到，只能用超敏乳胶增强散射比浊法才能准确测定血浆中hs-CRP的浓度。国外学者研究发现，健康人血清/血浆中hs-CRP水平小于0.55mg/L，当有心血管疾病危险性者，其hs-CRP水平往往大于2.1mg/L。因此，欧美等发达国家已将hs-CRP作为预防心血管疾病的相对独立的一个新的筛查指标。大量的数据分析显示，当hs-CRP低于2mg/L时，发生心血管疾病的危险性很低，而当hs-CRP大于2.1mg/L时，发生心血管疾病的危险性增加。随着hs-CRP水平的进一步升高，发生冠脉综合征或心肌梗死的危险因素显著升高，如将hs-CRP与总胆固醇和HDL浓度的比率联合应用，评价高危人群患冠心病的危险因素更具有客观的应用价值。因此，hs-CRP主要用于冠心病危险因素的筛查。目前国内因受经济条件限制，尚不能作为常规项目，但可用于高危人群的筛查。但切记应全面评价冠心病的危险因素，不能将危险因素当作诊断指标，应恰如其分地评价危险因素的临床应用价值，才能有效地协助医生预防冠心病的发生发展。

综上所述，新的心肌标志物的应用为临床治疗提供了有力的实验室保障。但对这些新的心肌标志物特性的正确了解和掌握临床应用指标，只有正确分析各类心肌标志物检测方法的灵敏度、特异性与检测结果的关系，才能更好地为临床治疗提供可靠的实验数据和咨询，体现检验医学在临床医学中的作用，为保障人类健康做出贡献。

至上世纪70年代，发明酶标检测技术平台以来，免疫诊断行业已发生了翻天覆地的变化，使免疫检测领域得到了快速成长。但由于酶标检测体系检测时间长，中间过程操作烦琐，试剂检测范围窄，灵敏度低等缺点，因此该系统也慢慢的退出了临床检测的历史舞台。随之而来的相继又发明了胶体金标技术平台，化学发光，时间分辨荧光检测技术平台以及免疫芯片技术平台等。胶体金标技术在快速检测领域起到了重要作用，为病人的诊断赢得了时间，而且使用方便，已深得用户的喜欢；但由于检测灵敏度低，无法准确定量的瓶颈，导致其不能充分发挥其快速诊断的需求，继而不能与精准的化学发光等技术抗衡。化学发光，时间分辨荧光等技术平台使检测灵敏度得到了大大提高，并且通过全自动检测系统的辅助，使检测误差和检测效率都有了大大的提升；但是由于其检测时间还是比较长，而且仪器设备比较庞大，只能在中心实验室进行，从样本收集到医生得到检测结果还是需要很长的一段时间，同时一个检测只能得到一个标志物的结果，不能同时测出病人相关的多个生物标志物的结果，故此也大大限制了该技术平台的充分发展。随着芯片技术的发展，相继出现了膜芯片，液体芯片，玻璃芯片等技术平台，这为同一样品达到多项生物标志物同步测试的目的，为病人检测节约了时间和费用，同时节约了样本的采集量；但该平台技术还是存在烦琐的实验反应和操作增加了检测误差，同时仪器设备也比较庞大，也只能在中心实验室进行，从样本采集到医生拿到实验结果同样需要较长的时间因此也限制了其发展。限制了在免疫检测领域的进一步发展。都不能满足快速发展的免疫领域的需求。

有鉴于此，由于目前的检测方法存在检测时间长、快速检测不能定量、同一个检测只能得到一个标志物结果的问题，如今迫切需要一种新的检测方法，即可以快速准确检测、又可以同步检测多项心肌标志物制备，并且还便于携带，随时随地都可以使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种多项心肌标志物并行检测方法，可以同时定量检测多项心肌标志物，并可提高检测的灵敏度，节约检测时间。

本发明还提供一种多项心肌标志物并行检测系统，可以同时定量检测多项心肌标志物，并可提高检测的灵敏度，节约检测时间。

此外，本发明进一步提供一种用于多项心肌标志物并行检测的芯片试纸，可以同时定量检测多项心肌标志物，并可提高检测的灵敏度，节约检测时间。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种多项心肌标志物并行检测方法，用以检测心肌标志物：cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；所述方法包括如下步骤：

步骤S1：将上述被检测物质相应的捕获单抗固定在芯片试纸的第一膜片上，所述芯片试纸包括第一膜片、第二膜片；将与配体An和Bn形成夹心检测的被检测物质从加样孔加入后通过渗滤或虹吸或磁场或电场或重力场作用力下移动分别与配体Bn和An结合形成第一膜片-配体An-被检测物-配体Bn-信号标记物的复合固定于第一膜片上形成复合物阵列，与捕获第一膜片同时装配，留检测孔；

步骤S2：滴加样本血清，当滴加的样本血清中存在上述蛋白抗原物质时，层析过程中先于同时层析的第二膜片上的标记二抗结合，此结合物再被第一膜片上的捕获抗体截获；

步骤S3：将荧光信号固定在第一膜片上于荧光检测仪检测，荧光强度与样本血清中目的蛋白浓度成正比，荧光强度通过在检测仪中转换成数字信号，根据内标标准曲线直接用于计算蛋白浓度。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤S3包括：

所述荧光检测仪的激光发射器发出激光，该激光同时激发芯片试纸内的多种信号标记物，该些标记物受激光激发后发生能量跃迁，释放出另外一种变异的光波或者电子物质；

所述荧光检测仪的信号接收装置接收信号标记物释放出的光波或者电子传递物信号，并且把信号转化为数字信号，信号标记物释放信号的大小与数值大小正相关；然后荧光检测仪将处理过的接收的信号进行计算，然后转换为模拟信号，输出该模拟信号，该输出的模拟信号与进行模拟计算，最后输出被检测物质的浓度相对应。

作为本发明的一种优选方案，所述信号标记物包括：荧光素、荧光蛋白、纳米金、银、纳米荧光微球、量子点、稀土元素、放射元素、小分子化学物或色素中的一种或多种。

作为本发明的一种优选方案，所述荧光素包括FITC、Cy2 TM、Alexa TM 488、Cy3 TM、Alexa TM 546中的一种或多种。

作为本发明的一种优选方案，所述荧光蛋白包括GFP、R-PE、R-PC中的一种或多种。

一种用于多项心肌标志物并行检测的芯片试纸，所述芯片试纸用以检测心肌标志物：cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；

所述芯片试纸包括第一膜片、第二膜片；在第一膜片上设有各标志物的配体An，在第二膜片上吸附有信号标记物偶联的配基Bn；

将与配体An和Bn形成夹心检测的被检测物质从加样孔加入后通过渗滤或虹吸或磁场或电场或重力场作用力下移动分别与配体Bn和An结合形成第一膜片-配体An-被检测物-配体Bn-信号标记物的复合固定于第一膜片上形成复合物阵列，与捕获第一膜片同时装配，留检测孔。

作为本发明的一种优选方案，所述信号标记物包括：荧光素、荧光蛋白、纳米金、银、纳米荧光微球、量子点、稀土元素、放射元素、小分子化学物或色素中的一种或多种。

一种多项心肌标志物并行检测系统，用以检测心肌标志物：cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；所述系统包括：

芯片试纸，包括第一膜片、第二膜片；在第一膜片上设有各标志物的配体An，在第二膜片上吸附有信号标记物偶联的配基Bn；将上述被检测物质相应的捕获单抗固定在芯片试纸的第一膜片上；将与配体An和Bn形成夹心检测的被检测物质从加样孔加入后通过渗滤或虹吸或磁场或电场或重力场作用力下移动分别与配体Bn和An结合形成第一膜片-配体An-被检测物-配体Bn-信号标记物的复合固定于第一膜片上形成复合物阵列，与捕获第一膜片同时装配，留检测孔；滴加样本血清，当滴加的样本血清中存在上述蛋白抗原物质时，层析过程中先于同时层析的第二膜片上的标记二抗结合，此结合物再被第一膜片上的捕获抗体截获；

荧光检测仪，用以检测固定在第一膜片上的荧光信号，荧光强度与样本血清中目的蛋白浓度成正比，荧光强度通过在检测仪中转换成数字信号，根据内标标准曲线直接用于计算蛋白浓度。

作为本发明的一种优选方案，所述信号标记物包括：荧光素、荧光蛋白、纳米金、银、纳米荧光微球、量子点、稀土元素、放射元素、小分子化学物或色素中的一种或多种。

作为本发明的一种优选方案，所述荧光检测仪的激光发射器发出激光，该激光同时激发芯片试纸内的多种信号标记物，该些标记物受激光激发后发生能量跃迁，释放出另外一种变异的光波或者电子物质；

所述荧光检测仪的信号接收装置接收信号标记物释放出的光波或者电子传递物信号，并且把信号转化为数字信号，信号标记物释放信号的大小与数值大小正相关；然后荧光检测仪将处理过的接收的信号进行计算，然后转换为模拟信号，输出该模拟信号，该输出的模拟信号与进行模拟计算，最后输出被检测物质的浓度相对应。

本发明的有益效果在于：本发明提出的多项心肌标志物并行检测方法、系统及用到的芯片试纸，可以同时定量检测多项心肌标志物，并可提高检测的灵敏度，节约检测时间。

1、本发明系统使用方便，携带方便，电源使用方便可以是干电池，也可以是普通交流电源；

2、本发明适用于各种检测体系，可以是免疫反应，可以是核酸反应等符合配体-受体结合的反应；

3、该方法的检测反应非常快速，从样品采集到得到检测结果不到半小时即可完成，又叫床边检测；

4、该方法可以同时检测多种生物标志物；

5、该方法可以对生物标志物进行精确定量检测，也可以用于定性检测；

6、该方法还适合基因检测，和所有适合配体与受体形成亲和结合的反应。

附图说明

图1为本发明检测系统的组成示意图；

图2为本发明芯片试纸的结构示意图；

图3为本发明检测系统中检测仪的示意图；

图4为芯片试纸试用测试样本后的图示。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的优选实施例。

实施例一

请参阅图1，本发明揭示了一种多项心肌标志物并行检测系统，检测项目为心肌常见金标准型标志物：cTNI，cTNT，MYO，CK-MB，BNP，CRP，FABP；所述检测系统包括荧光检测仪1、试剂盒2。检测仪的控制系统10控制着检测仪的各种工作状态。

激光发射器11发出激光，该激光同时激发芯片试纸2内的多种信号标记物21，该些标记物受激光激发后发生能量跃迁21后，释放出另外一种变异的光波或者电子物质23。

同时检测仪1的信号接收装置12接收信号标记物释放出的光波或者电子传递物信号23，并且把信号23转化为数字信号13，信号标记物释放信号的大小与数值大小正相关。然后仪器的数据处理系统将处理过的接收的信号进行计算，然后转换为模拟信号15，该模拟信号通过控制装系统输出，该输出的模拟信号与进行模拟计算，最后输出被检测物质的浓度相对应。

请参阅图2，为本发明用于多项心肌标志物并行检测的芯片试纸的结构如图2所示；其中5为纤维膜(纤维膜作为第一膜片，第一膜片还可以为硅晶片或硅片或塑料薄片或塑料膜片或金属片)，51为玻璃纤维(玻璃纤维作为第二膜片，第二膜片还可以为玻璃纤维或者硅土纤维或者金属纤维或者有机纤维或者高分子纤维)，52为配基Bn-信号标记物，53为加样孔，54为配基An。所述芯片试纸用以检测心肌标志物：cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；将与配体An和Bn形成夹心检测的被检测物质从加样孔加入后通过渗滤(或虹吸、磁场、电场、重力场)作用力下移动分别与配体Bn和An结合形成纤维膜-配体An-被检测物-配体Bn-信号标记物的复合固定于纤维膜上形成复合物阵列，与捕获纤维膜同时装配，留检测孔。将与纤维膜上单抗配对形成夹心检测的被检测物质的检测单抗分别标记信号标记物，然后固定于玻璃纤维，与捕获纤维膜同时装配，留检测孔。

请参阅图3所示，2为芯片试纸，在芯片试纸2上设有纤维膜，在纤维膜上设有配体21为An，该配体21为枝状，该配体An上固定有生物标志物22为n，在标志物n上有配体24为Bn，多种被检测物质与固相配基形成亲和结合，在配体的周围或项部为一个以上信号标记物23。

其中n＝1，2，3，4，5......复合物。该复合物(n种)在上述检测仪上检测其信号物质的强弱并且转化为相应物质的浓度，即可检测出被检测生物标志物(n种)的浓度大小或者强弱。以此对疾病进行辅助判断达到快速诊断的目的。

前述的标记物23为：荧光素(荧光素有：FITC，Cy2 TM，Alexa TM 488，Cy3 TM，Alexa TM546常规荧光素)、荧光蛋白(GFP，R-PE，R-PC)、纳米金、银、纳米荧光微球、量子点、稀土元素、放射元素、小分子化学物或色素。

前述的标记物23释放信号的大小与数值大小为正关联。前述的标记物23受激光激发后释放出的光波或电子物质不同于标记物本身的光波或电子物质。前述的被检测物质物中的生物标志物n、信号标记物-配基Bn复合物在固相支持物上的运动作用力为层析、虹吸、渗滤、电泳、磁泳或重力方式等。

前述的纤维膜可以为PV膜、玻片、塑料板或凝胶板。前述的信号标记物23为荧光素(荧光素有：FITC，Cy2 TM，Alexa TM 488，Cy3 TM，Alexa TM 546常规荧光素)、荧光蛋白(GFP，R-PE，R-PC)、纳米金(可以是纳米金，纳米银，纳米铜等)、纳米荧光微球、量子点、稀土元素、放射元素、小分子化学物或色素。

快速检测仪器特点包括：体积小，携带方便，可以使用普通电源和干电池电源，可以同时检测多点荧光。

上述免疫反应原理为：

试纸上进行的免疫反应原理是：配基Bn-信号标记物(配基Bn可以是抗体，抗原，生物素-亲和素，配体，核酸，凝集素等，可以是同种物质或者不同种物质中的一种或者多种)，与样品中的被检测物质在运动过程中形成复合物即：标记信号物-配基Bn-被检测物n；配基An(可以是抗体，抗原，生物素-亲和素，配体，核酸，凝集素等，可以是同种物质或者不同种物质中的一种或者多种)是被固定在固体支持物上的，同时与运动中的标记信号物-配基Bn-被检测物n形成亲和结合，这样就在试纸固体支持物上形成：配基An-被检测物质n-配基Bn-信号标记物质的复合物。

采用虹吸(或者电泳，磁场等)技术让样品在纤维膜(或者塑料板，胶板，玻璃板等)载体上运动，在运动过程中生物标志物与放置在载体上的标记配体23(包括：抗体，抗原，核酸，凝集素等)结合，并且一起运动到固定在载体上的配体24(配体24可以是通过吸附，或者共价偶联等方式固定，该固定可以是点状，线条状等)

检测仪(多功能快速芯片试纸检测仪)是一种非常灵活的多功能检测技术平台。其原理是针对不同检测物的蛋白(如抗原，抗体)以微整列形式结合到特定的固体支持物(如玻片，纤维膜，凝胶等)上，然后与被检测物(被测物可以是体液或者血清中的抗原、抗体、药物小分子，核酸或酶等)结合，同时被检测物还与信号标记物(可以是荧光素，量子点，纳米金、银颗粒，或荧光蛋白分子等)标记的蛋白结合，形成配基A-被检测物质n-配基B-标记信号物的复合物。仪器通过发射固定波长的激光扫描照射这个反应结合有多种荧光标记的微整列复合物上的信号标记物；标记物被激光激发后释放出另一种变异的固定波长的光量子，这个光量子依次被仪器的接收器捕获，并且转化为数字信号；相应复合物的数值信号通过数据处理软件计算而得出相应复合物的浓度，依次计算出被检测物的各种生物标志物的浓度。

芯片试纸的制作方法：

配基An微整列芯片的制作：配基An是针对被检测生物标志物n(生物标志物n可以是抗原，抗体，药物，化学小分子，核酸，多肽)能够形成特异结合的物质(配基An可以是蛋白分子中的抗原、抗体，核酸，药物小分子，多肽，酶等(n＝1、2、3、4...))。将针对不同被检测物的配基An用生物缓冲液按一定浓度(可以是1ng-10mg)配制，然后用点样仪把配基An以微整列的方式依次点在固体支持物(固体支持物可以是硝酸纤维膜，凝胶，玻片，塑料板等，其形状可以是长条形，方形，圆心等)上，在经过一定的化学和物理的方法处理使配基An保持应有的生物活性。另外微整列上还有相应检测物的内控点(或者内标)和样品正常反应与否的质控点。

配基Bn标记信号物质的制备：配基Bn的来源和种类同配基An(n＝1、2、3、4...)，标记信号物质可以是荧光染料(荧光染料有FITC，Cy2 TM，Alexa TM 488，Cy3 TM，Alexa TM546等常规荧光素)，荧光蛋白(GFP，R-PE，R-PC等)，纳米金(可以是纳米金，纳米银，纳米铜等)，量子点，稀土元素，放射元素，小分子化学物或色素。配基Bn和标记信号物质通过其相应的物理化学性质采用相应的物理、化学或生物学方法将两种物质连接在一起使其稳定存在即可。

芯片试纸的制作：芯片试纸根据其流体学方法可以有各种形状，其基本构成要素包括，样品加样孔，配基Bn标记物存放位置，配基An微阵列及支持物，样品流动驱动力装置(可以是吸水纸，渗滤纸，虹吸槽，毛细管或电磁场等)。

可用本发明方法检测的样品没有特别限制，可以是任何含有生物标志物的样品，代表性的例子包括血液样品、血清样本、尿液样本、唾液样本、体液样品；各种食品蔬菜洗涤液，浸泡液；核酸抽提物，PCR扩增产物等。

样品检测时用移液器量取一定体积的样品滴加在芯片试纸的加样孔中，样品进入加样孔后在流体力学或者外加作用力下依次流经配基Bn标记信号物质材料并且与配基Bn发生亲和结合形成信号物质-配基Bn-生物标志物n的三元符合物；此三元复合物在流体或者外加作用力下继续向前移动到配基An微整列芯片支持物上，同时与固定在支持物上的配基An发生亲和结合，形成配基An-生物标记物n-配基Bn-信号标记物质的四元复合物，并且被捕获在支持物上，形成含有多种生物标记物n的复合物信号标记物小点。此反应过程在2-15mins里完成。

将反应好的芯片试纸放入检测仪上，仪器将自动获取四原复合物上信号标记物质的信号，并且将其转换为数字信号再通过数据处理软件内部计算，即可检测出被检测样品里的n种生物标志物的浓度。同时通过数据输出形式(或者打印输出形式)记录检测结果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下为具体实施例：

有关芯片试纸检测仪的实施方式：

请参阅图4所示，该检测仪包括：激光器31、滤镜组32、滤光片33、双向色镜38、反光镜35、第一物镜34、第二滤光片36、第二物镜37、光栏40和芯片试纸39，以及PMT(光电倍增管)元件，AMP(信号放大器)元件，转换器A/D(信号数据转换器)元件，CD芯片，输出打印设备，主板和电源设备(图中未示)。

检测仪的组装和测试

按照设计图示，依次将光学元件，连接在仪器箱里面，并且分配好电源及控制主板，并且依次检测各段线路和元件的工作情况，考察是否符合要求。在完全符合后接通主板控制程序和电源，测试系统工作情况。

检测仪按以下指标进行调试：

激发波长532nm或者635nm；发射波长570nm或者675nm(可根据客户需要扩充至6种)；激光强度1％-100％连续可调PMT 450-950连续可调；分辨率5μm、10μm、20μm、40μm灵敏度0.1个荧光分子/μm2；线性度R2＞0.99；重复性95％以上；扫描速度30sec/cm2(10μm分辨率)；焦距深度±250μm。

该仪器在芯片试纸插孔里面可以添加电场和或磁场，可以使芯片试纸上的带电或磁性物质在相应的作用力下发生定向运动，以达到被检测物质的运动作用力。

有关芯片试纸的实施方式：

芯片试纸材质可以为NC膜或玻璃片或塑料片等，芯片点阵为5X6或其它排列(根据具体产品确定)，间距为1mm，点直径大小为10um-500um，试纸总体宽度为3-30mm，长度范围：30-100mm。外观包括加样孔，芯片照射窗，密封卡，定位标志等。芯片试纸内部结构包括：滤样纸，信号标记物配体所在的玻璃纤维，配体点阵(包括测试点、校准品点和质控点)等。

芯片试纸检测仪根据以上设计和生产测试，完全符合其快速，灵敏，定量检测，多项联检，携带方便等优点。是一款未来应用及其广泛的产品，将为未来临床检测的发展起到推动作用。

实施例二

多项心肌标志物芯片检测试纸

(快速荧光免疫定量检测芯片试纸法)

实验材料

cTNI，cTNT，MYO，BNP，CRP，FABP抗体对为LINC-BIO和Hytest公司提供；

CK-MB，抗体对为Medix公司提供

MYO，CK-MB，抗原为LINC-BIO公司提供；

BNP，cTNI，cTNT，CRP抗原也是LINC-BIO公司提供；

兔抗小鼠IgG为自制；

常规试剂为市售品。

实验方法

1.准备

11分别将六个项目的一抗用50Mm Tris-HCl PH7.5配制为1-5mg/ml浓度。

1.2将兔抗小鼠IgG用50Mm Tris-HCl PH7.5配制为1-5mg/ml浓度。

1.3准备硝酸纤维素膜(NC膜，Whatman公司货号：BA85)20mmX5mm大小。

1.4准备玻璃纤维和吸水纸(3M公司)。

2.实验操作

2.1七个项目的一抗和兔抗小鼠IgG点膜，采用GeSim Nano-Plotter TM 2.1芯片点样系统将准备好的七种一抗和兔抗小鼠IgG分别点在NC膜上，每点喷点10-200nl，分别排成3排，兔抗小鼠IgG在左上角和右下角，加上七个项目的一抗分为三排，每排三点，点间距1mm，排间距为2mm。并且将点好样品的膜条放入真空干燥箱中风干保存备用。

2.2七个项目的二抗用藻红蛋白标记：

2.2.1用25mM CBS PH9.6缓冲液配制藻红蛋白为0.1mg/ml；

2.2.2将待标记二抗装入透析袋中，扎好透析袋，并且将待标记抗体透析袋放入上述配制的藻红蛋白溶液中4℃透析搅拌过夜；

2.2.3将标记过夜的透析袋取出再放入20mM PBS PH7.4缓冲液中4℃透析搅拌透析4hours换液一次，共3次即可；

2.2.4将处理好的藻红蛋白的抗体取出测定浓度备用。

2.3藻红蛋白标记抗体的玻璃纤维固定：

2.3.1将标记好的抗体七个项目的二抗用20mM PBS PH7.4缓冲液，配制成5-30ug/ml的浓度的混合溶液；

2.3.2将玻璃纤维浸泡在2.3.1藻红蛋白标记抗体缓冲液中4℃过夜；

2.3.2取出浸泡好的玻璃纤维放入真空风干箱中风干保存备用。

3.芯片试纸的组装

3.1材料准备

3.1.1吸水纸准备，将吸水纸剪切为5mmX10mm大小备用；

3.1.2将固定好藻红蛋白标记好二抗的玻璃纤维剪切为5mmX5mm大小备用。

3.2组装

3.2.1将吸水纸和玻璃纤维及点有抗原抗体的NC膜固定在一起，吸水纸在上，玻璃纤维在中间，NC膜在下面，并且NC膜抗体端在玻璃纤维连接处；

3.2.2再在NC膜抗原端固定一段吸水纸；

3.2.3使用塑料卡将固定好的芯片试纸封装在塑料卡里面，吸水纸的一端放在留有加样孔的下面；

3.2.4将生产好的芯片试纸卡片放入铝箔袋中密封保存备用，并且加印好名称和使用方法。

4.定量曲线的制定

4.1原料准备和抗原标准品的配制，将购买的cTNI，cTNT，CK-MB，MYO，BNP，CRP，FABP抗原用50％的小牛血清缓冲液，根据标识浓度分别配制为：cTNI抗原浓度为：0，0.5，2.5，12.5，25，50ng/ml六个梯度，体积各3ml备用；cTNT抗原浓度为：0，0.5，2.5，12.5，25，50ng/ml六个梯度，MYO抗原浓度为：0，10，50，250，1000，4000ng/ml六个梯度，BNP抗原浓度为：0，1，5，20，100，200ng/ml六个梯度，CRP抗原浓度为：0，0.01，0.3，0.9，3，9ug/ml六个梯度，CK-MB抗原浓度为：0，2.5，10，50，200，500ng/ml六个梯度，FABP抗原浓度为：0，2，10，50，100，200ng/ml六个梯度，体积各3ml备用。并且每种梯度配制3批。

4.2测试实验，取出生产好的心肌标志物六项联检芯片试纸；分别取配制的心肌标志物六项梯度100ul，依次加入一个试纸的加样孔，并且将芯片试纸插入芯片试纸检测仪(LincxMAP平台)器插孔中接通磁场电源，让其在磁场中运动(即样品先进入芯片试纸加样空，经过样品滤纸，进入玻璃纤维层，样品中的六项抗原分别与磁性量子荧光标记的抗体结合，形成磁性量子荧光-抗体2-抗原复合物，磁性量子点在仪器磁场下运动，当运动到固定有抗心肌标志物六项的抗体点时，复合物被固定的抗体捕获，形成：磁性量子荧光-抗体2-抗原-抗体1的复合物，并且复合物不能继续运动，而其他的未被捕获的物质继续流动到顶端的吸水纸上)反应约5mins后，芯片试纸检测仪(Linc xMAP平台)器读取复合物上的的荧光信号，并且每批的每个样品重复测试20次记录其相应的荧光信号值。

依次加入一个试纸的加样孔，让其反应5mins后放入Linc xMAP检测仪器读取四个点的荧光信号，并且每批的每个样品重复测试3次记录其相应的荧光信号值。

4.3数据处理和标准曲线方程的生成，将3批720次测定的360个数据输入电脑数据分析软件，分别模拟出心肌标志物六项的函数曲线方程。

5.样品临床检测实验

5.1样品收集，分别收集3家三甲医院检验科的当天样本共270例，其中心肌标志物六项阳性样本各30例，正常样本60例，心肌标志物六项检测两项以上同时阳性的30例。

5.2将270例样本同时与roche电化学发光试剂作为对照。

6.数据处理

6.1原始数据

6.2处理数据结果

实施例三

四项(cTNI，MYO，BNP，CK-MB)心肌标志物芯片检测试纸

(快速荧光免疫定量检测芯片试纸法)

实验材料

cTNI，MYO，BNP抗体对为LINC-BIO和Hytest公司提供；

CK-MB，抗体对为Medix公司提供

MYO，CK-MB，抗原为LINC-BIO公司提供；

BNP，cTNI抗原也是LINC-BIO公司提供；

兔抗小鼠IgG为自制；

常规试剂为市售品。

实验方法

1.准备

1.1分别将四个项目的一抗用50Mm Tris-HCl PH7.5配制为1-5mg/ml浓度。

1.2将兔抗小鼠IgG用50Mm Tris-HCl PH7.5配制为1-5mg/ml浓度。

1.3准备硝酸纤维素膜(NC膜，Whatman公司货号：BA85)20mmX5mm大小。

1.4准备玻璃纤维和吸水纸(3M公司)。

2.实验操作

2.1四个项目的一抗和兔抗小鼠IgG点膜，采用GeSim Nano-Plotter TM 2.1芯片点样系统将准备好的四种一抗和兔抗小鼠IgG分别点在NC膜上，每点喷点10-200nl，分别排成3排，兔抗小鼠IgG在第一排，加上四个项目的一抗分为两排，每排两点，点间距3mm，排间距为2mm。并且将点好样品的膜条放入真空干燥箱中风干保存备用。

2.2四个项目的二抗用藻红蛋白标记：

2.2.1用25mM CBS PH9.6缓冲液配制藻红蛋白为0.1mg/ml；

2.2.2将待标记二抗装入透析袋中，扎好透析袋，并且将待标记抗体透析袋放入上述配制的藻红蛋白溶液中4℃透析搅拌过夜；

2.2.3将标记过夜的透析袋取出再放入20mM PBS PH7.4缓冲液中4℃透析搅拌透析4hours换液一次，共3次即可；

2.2.4将处理好的藻红蛋白的抗体取出测定浓度备用。

2.3藻红蛋白标记抗体的玻璃纤维固定：

2.3.1将标记好的抗体四个项目的二抗用20mM PBS PH7.4缓冲液，配制成5-30ug/ml的浓度的混合溶液；

2.3.2将玻璃纤维浸泡在2.3.1藻红蛋白标记抗体缓冲液中4℃过夜；

2.3.2取出浸泡好的玻璃纤维放入真空风干箱中风干保存备用。

3.芯片试纸的组装

3.1材料准备

3.1.1吸水纸准备，将吸水纸剪切为5mmX10mm大小备用；

3.1.2将固定好藻红蛋白标记好二抗的玻璃纤维剪切为5mmX5mm大小备用。

3.2组装

3.2.1将吸水纸和玻璃纤维及点有抗原抗体的NC膜固定在一起，吸水纸在上，玻璃纤维在中间，NC膜在下面，并且NC膜抗体端在玻璃纤维连接处；

3.2.2再在NC膜抗原端固定一段吸水纸；

3.2.3使用塑料卡将固定好的芯片试纸封装在塑料卡里面，吸水纸的一端放在留有加样孔的下面；

3.2.4将生产好的芯片试纸卡片放入铝箔袋中密封保存备用，并且加印好名称和使用方法。

4.定量曲线的制定

4.1原料准备和抗原标准品的配制，将购买的cTNI CK-MB，MYO，BNP，抗原用50％的小牛血清缓冲液，根据标识浓度分别配制为：cTNI抗原浓度为：0，0.5，2.5，12.5，25，50ng/ml六个梯度，体积各3ml备用；MYO抗原浓度为：0，10，50，250，1000，4000ng/ml六个梯度，BNP抗原浓度为：0，1，5，20，100，200ng/ml六个梯度；CK-MB抗原浓度为：0，2.5，10，50，200，500ng/ml六个梯度，，体积各3ml备用。并且每种梯度配制3批。

4.2测试实验，取出生产好的心肌标志物六项联检芯片试纸；分别取配制的心肌标志物六项梯度100ul，依次加入一个试纸的加样孔，并且将芯片试纸插入芯片试纸检测仪(LincxMAP平台)器插孔中接通磁场电源，让其在磁场中运动(即样品先进入芯片试纸加样空，经过样品滤纸，进入玻璃纤维层，样品中的六项抗原分别与磁性量子荧光标记的抗体结合，形成磁性量子荧光-抗体2-抗原复合物，磁性量子点在仪器磁场下运动，当运动到固定有抗心肌标志物六项的抗体点时，复合物被固定的抗体捕获，形成：磁性量子荧光-抗体2-抗原-抗体1的复合物，并且复合物不能继续运动，而其他的未被捕获的物质继续流动到顶端的吸水纸上)反应约5mins后，芯片试纸检测仪(Linc xMAP平台)器读取复合物上的的荧光信号，并且每批的每个样品重复测试20次记录其相应的荧光信号值。

依次加入一个试纸的加样孔，让其反应5mins后放入Linc xMAP检测仪器读取四个点的荧光信号，并且每批的每个样品重复测试3次记录其相应的荧光信号值。

4.3数据处理和标准曲线方程的生成，将3批720次测定的360个数据输入电脑数据分析软件，分别模拟出心肌标志物六项的函数曲线方程。

5.样品临床检测实验

5.1样品收集，分别收集3家三甲医院检验科的当天样本共270例，其中心肌标志物六项阳性样本各30例，正常样本60例，心肌标志物四项检测两项以上同时阳性的30例。

5.2将270例样本同时与roche电化学发光试剂作为对照。

6.数据处理

6.1原始数据

6.2处理数据结果

实施例四

CtnI/BNP/CRP三项心肌标志物芯片检测试纸

(快速荧光免疫定量检测芯片试纸法)

实验材料

cTNI，CRP，BNP抗体对为LINC-BIO和Hytest公司提供；

BNP，CtnI，，CRP抗原也是LINC-BIO公司提供；

兔抗小鼠IgG为自制；

常规试剂为市售品。

实验方法

1.准备

1.1分别将三个项目的一抗用50Mm Tris-HCl PH7.5配制为1-5mg/ml浓度。

1.2将兔抗小鼠IgG用50Mm Tris-HCl PH7.5配制为1-5mg/ml浓度。

1.3准备硝酸纤维素膜(NC膜，Whatman公司货号：BA85)20mmX5mm大小。

1.4准备玻璃纤维和吸水纸(3M公司)。

2.实验操作

2.1三个项目的一抗和兔抗小鼠IgG点膜，采用GeSim Nano-Plotter TM 2.1芯片点样系统将准备好的七种一抗和兔抗小鼠IgG分别点在NC膜上，每点喷点10-200nl，分别排成2排，兔抗小鼠IgG在左上角，加上三个项目的一抗分为一排，每排两点，点间距1mm，排间距为2mm。并且将点好样品的膜条放入真空干燥箱中风干保存备用。

2.2三个项目的二抗用藻红蛋白标记：

2.2.1用25mM CBS PH9.6缓冲液配制藻红蛋白为0.1mg/ml；

2.2.2将待标记二抗装入透析袋中，扎好透析袋，并且将待标记抗体透析袋放入上述配制的藻红蛋白溶液中4℃透析搅拌过夜；

2.2.3将标记过夜的透析袋取出再放入20mM PBS PH7.4缓冲液中4℃透析搅拌透析4hours换液一次，共3次即可；

2.2.4将处理好的藻红蛋白的抗体取出测定浓度备用。

2.3藻红蛋白标记抗体的玻璃纤维固定：

2.3.1将标记好的抗体三个项目的二抗用20mM PBS PH7.4缓冲液，配制成5-30ug/ml的浓度的混合溶液；

2.3.2将玻璃纤维浸泡在2.3.1藻红蛋白标记抗体缓冲液中4℃过夜；

2.3.2取出浸泡好的玻璃纤维放入真空风干箱中风干保存备用。

3.芯片试纸的组装

3.1材料准备

3.1.1吸水纸准备，将吸水纸剪切为5mmX10mm大小备用；

3.1.2将固定好藻红蛋白标记好二抗的玻璃纤维剪切为5mmX5mm大小备用。

3.2组装

3.2.1将吸水纸和玻璃纤维及点有抗原抗体的NC膜固定在一起，吸水纸在上，玻璃纤维在中间，NC膜在下面，并且NC膜抗体端在玻璃纤维连接处；

3.2.2再在NC膜抗原端固定一段吸水纸；

3.2.3使用塑料卡将固定好的芯片试纸封装在塑料卡里面，吸水纸的一端放在留有加样孔的下面；

3.2.4将生产好的芯片试纸卡片放入铝箔袋中密封保存备用，并且加印好名称和使用方法。

4.定量曲线的制定

4.1原料准备和抗原标准品的配制，将购买的cTNI，CRP，BNP，抗原用50％的小牛血清缓冲液，根据标识浓度分别配制为：cTNI抗原浓度为：0，0.5，2.5，12.5，25，50ng/ml六个梯度，体积各3ml备用；CRP抗原浓度为：0，0.01，0.3，0.9，3，9ug/ml六个梯度，BNP抗原浓度为：0，1，5，20，100，200ng/ml六个梯度；C六个梯度，，体积各3ml备用。并且每种梯度配制3批。

4.2测试实验，取出生产好的心肌标志物六项联检芯片试纸；分别取配制的心肌标志物六项梯度100ul，依次加入一个试纸的加样孔，并且将芯片试纸插入芯片试纸检测仪(LincxMAP平台)器插孔中接通磁场电源，让其在磁场中运动(即样品先进入芯片试纸加样空，经过样品滤纸，进入玻璃纤维层，样品中的六项抗原分别与磁性量子荧光标记的抗体结合，形成磁性量子荧光-抗体2-抗原复合物，磁性量子点在仪器磁场下运动，当运动到固定有抗心肌标志物六项的抗体点时，复合物被固定的抗体捕获，形成：磁性量子荧光-抗体2-抗原-抗体1的复合物，并且复合物不能继续运动，而其他的未被捕获的物质继续流动到顶端的吸水纸上)反应约5mins后，芯片试纸检测仪(Linc xMAP平台)器读取复合物上的的荧光信号，并且每批的每个样品重复测试20次记录其相应的荧光信号值。

依次加入一个试纸的加样孔，让其反应5mins后放入Linc xMAP检测仪器读取四个点的荧光信号，并且每批的每个样品重复测试3次记录其相应的荧光信号值。

4.3数据处理和标准曲线方程的生成，将3批720次测定的360个数据输入电脑数据分析软件，分别模拟出心肌标志物六项的函数曲线方程。

5.样品临床检测实验

5.1样品收集，分别收集3家三甲医院检验科的当天样本共270例，其中心肌标志物六项阳性样本各30例，正常样本60例，心肌标志物六项检测两项以上同时阳性的30例。

5.2将270例样本同时与roche电化学发光试剂作为对照。

6.数据处理

6.1原始数据

6.2处理数据结果

实施例五

五项(cTNI，MYO，BNP，CK-MB，FABP)心肌标志物芯片检测试纸

(快速量子荧光免疫定量检测芯片试纸法)

实验材料

cTNI，MYO，BNP，FABP抗体对为LINC-BIO和Hytest公司提供；

CK-MB，抗体对为Medix公司提供

MYO，CK-MB，抗原为LINC-BIO公司提供；

BNP，cTNI抗原也是LINC-BIO公司提供；

兔抗小鼠IgG为自制；

量子荧光为50nm量子点，吸收波长为532nm，激发光波长为757nm，购自英俊生物。

常规试剂为市售品。

实验方法

1.准备

1.1分别将五个项目的一抗用50Mm Tris-HCl PH7.5配制为1-5mg/ml浓度。

1.2将兔抗小鼠IgG用50Mm Tris-HCl PH7.5配制为1-5mg/ml浓度。

1.3准备硝酸纤维素膜(NC膜，Whatman公司货号：BA85)20mmX5mm大小。

1.4准备玻璃纤维和吸水纸(3M公司)。

2.实验操作

2.1五个项目的一抗和兔抗小鼠IgG点膜，采用GeSim Nano-Plotter TM 2.1芯片点样系统将准备好的五种一抗和兔抗小鼠IgG分别点在NC膜上，每点喷点10-200nl，分别排成2排，兔抗小鼠IgG在左上角，加上五个项目的一抗分为两排，每排3点，点间距2mm，排间距为3mm。并且将点好样品的膜条放入真空干燥箱中风干保存备用。

2.2五个项目的二抗用量子荧光标记：

2.2.1用25mM CBS PH9.6缓冲液配制量子荧光为0.1mg/ml；

2.2.2将待标记二抗装入透析袋中，扎好透析袋，并且将待标记抗体透析袋放入上述配制的量子荧光溶液中4℃透析搅拌过夜；

2.2.3将标记过夜的透析袋取出再放入20mM PBS PH7.4缓冲液中4℃透析搅拌透析4hours换液一次，共3次即可；

2.2.4将处理好的量子荧光的抗体取出测定浓度备用。

2.3量子荧光标记抗体的玻璃纤维固定：

2.3.1将标记好的抗体四个项目的二抗用20mM PBS PH7.4缓冲液，配制成5-30ug/ml的浓度的混合溶液；

2.3.2将玻璃纤维浸泡在2.3.1量子荧光标记抗体缓冲液中4℃过夜；

2.3.2取出浸泡好的玻璃纤维放入真空风干箱中风干保存备用。

3.芯片试纸的组装

3.1材料准备

3.1.1吸水纸准备，将吸水纸剪切为5mmX10mm大小备用；

3.1.2将固定好藻红蛋量子荧光标记好二抗的玻璃纤维剪切为5mmX5mm大小备用。

3.2组装

3.2.1将吸水纸和玻璃纤维及点有抗原抗体的NC膜固定在一起，吸水纸在上，玻璃纤维在中间，NC膜在下面，并且NC膜抗体端在玻璃纤维连接处；

3.2.2再在NC膜抗原端固定一段吸水纸；

3.2.3使用塑料卡将固定好的芯片试纸封装在塑料卡里面，吸水纸的一端放在留有加样孔的下面；

3.2.4将生产好的芯片试纸卡片放入铝箔袋中密封保存备用，并且加印好名称和使用方法。

4.定量曲线的制定

4.1原料准备和抗原标准品的配制，将购买的cTNI，CK-MB，MYO，BNP，FABP抗原用50％的小牛血清缓冲液，根据标识浓度分别配制为：cTNI抗原浓度为：0，0.5，2.5，12.5，25，50ng/ml六个梯度，体积各3ml备用；MYO抗原浓度为：0，10，50，250，1000，4000ng/ml六个梯度，BNP抗原浓度为：0，1，5，20，100，200ng/ml六个梯度；CK-MB抗原浓度为：0，2.5，10，50，200，500ng/ml；FABP抗原浓度为：0，2，10，50，100，200ng/ml六个梯度，，体积各3ml备用。并且每种梯度配制3批。

4.2测试实验，取出生产好的心肌标志物六项联检芯片试纸；分别取配制的心肌标志物六项梯度100ul，依次加入一个试纸的加样孔，并且将芯片试纸插入芯片试纸检测仪(LincxMAP平台)器插孔中接通磁场电源，让其在磁场中运动(即样品先进入芯片试纸加样空，经过样品滤纸，进入玻璃纤维层，样品中的六项抗原分别与磁性量子荧光标记的抗体结合，形成磁性量子荧光-抗体2-抗原复合物，磁性量子点在仪器磁场下运动，当运动到固定有抗心肌标志物六项的抗体点时，复合物被固定的抗体捕获，形成：磁性量子荧光-抗体2-抗原-抗体1的复合物，并且复合物不能继续运动，而其他的未被捕获的物质继续流动到顶端的吸水纸上)反应约5mins后，芯片试纸检测仪(Linc xMAP平台)器读取复合物上的的荧光信号，并且每批的每个样品重复测试20次记录其相应的荧光信号值。

依次加入一个试纸的加样孔，让其反应5mins后放入Linc xMAP检测仪器读取四个点的荧光信号，并且每批的每个样品重复测试3次记录其相应的荧光信号值。

4.3数据处理和标准曲线方程的生成，将3批720次测定的360个数据输入电脑数据分析软件，分别模拟出心肌标志物六项的函数曲线方程。

5.样品临床检测实验

5.1样品收集，分别收集3家三甲医院检验科的当天样本共270例，其中心肌标志物六项阳性样本各30例，正常样本60例，心肌标志物四项检测两项以上同时阳性的30例。

5.2将270例样本同时与roche电化学发光试剂作为对照。

6.数据处理

6.1原始数据

6.2处理数据结果

综上所述，本发明提出的多项心肌标志物并行检测方法、系统及用到的芯片试纸，可以同时定量检测多项心肌标志物，并可提高检测的灵敏度，节约检测时间。

这里本发明的描述和应用是说明性的，并非想将本发明的范围限制在上述实施例中。这里所披露的实施例的变形和改变是可能的，对于那些本领域的普通技术人员来说实施例的替换和等效的各种部件是公知的。本领域技术人员应该清楚的是，在不脱离本发明的精神或本质特征的情况下，本发明可以以其它形式、结构、布置、比例，以及用其它组件、材料和部件来实现。在不脱离本发明范围和精神的情况下，可以对这里所披露的实施例进行其它变形和改变。

Claims (10)

1.一种多项心肌标志物并行检测方法，其特征在于，用以检测心肌标志物：cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；所述方法包括如下步骤：

步骤S1：将上述被检测物质相应的捕获单抗固定在芯片试纸的第一膜片上，所述芯片试纸包括第一膜片、第二膜片；将与配体An和Bn形成夹心检测的被检测物质从加样孔加入后通过渗滤或虹吸或磁场或电场或重力场作用力下移动分别与配体Bn和An结合形成第一膜片-配体An-被检测物-配体Bn-信号标记物的复合固定于第一膜片上形成复合物阵列，与捕获第一膜片同时装配，留检测孔；

步骤S2：滴加样本血清，当滴加的样本血清中存在上述蛋白抗原物质时，层析过程中先于同时层析的第二膜片上的标记二抗结合，此结合物再被第一膜片上的捕获抗体截获；

步骤S3：将荧光信号固定在第一膜片上于荧光检测仪检测，荧光强度与样本血清中目的蛋白浓度成正比，荧光强度通过在检测仪中转换成数字信号，根据内标标准曲线直接用于计算蛋白浓度。

2.根据权利要求1所述的多项心肌标志物并行检测方法，其特征在于：

所述步骤S3包括：

所述荧光检测仪的激光发射器发出激光，该激光同时激发芯片试纸内的多种信号标记物，该些标记物受激光激发后发生能量跃迁，释放出另外一种变异的光波或者电子物质；

所述荧光检测仪的信号接收装置接收信号标记物释放出的光波或者电子传递物信号，并且把信号转化为数字信号，信号标记物释放信号的大小与数值大小正相关；然后荧光检测仪将处理过的接收的信号进行计算，然后转换为模拟信号，输出该模拟信号，该输出的模拟信号与进行模拟计算，最后输出被检测物质的浓度相对应。

3.根据权利要求1所述的多项心肌标志物并行检测方法，其特征在于：

所述信号标记物包括：荧光素、荧光蛋白、纳米金、银、纳米荧光微球、量子点、稀土元素、放射元素、小分子化学物或色素中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的多项心肌标志物并行检测方法，其特征在于：

所述荧光素包括FITC、Cy2 TM、Alexa TM 488、Cy3 TM、Alexa TM 546中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的多项心肌标志物并行检测方法，其特征在于：

所述荧光蛋白包括GFP、R-PE、R-PC中的一种或多种。

6.一种用于多项心肌标志物并行检测的芯片试纸，其特征在于，所述芯片试纸用以检测心肌标志物：cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；

所述芯片试纸包括第一膜片、第二膜片；在第一膜片上设有各标志物的配体An，在第二膜片上吸附有信号标记物偶联的配基Bn；

将与配体An和Bn形成夹心检测的被检测物质从加样孔加入后通过渗滤或虹吸或磁场或电场或重力场作用力下移动分别与配体Bn和An结合形成第一膜片-配体An-被检测物-配体Bn-信号标记物的复合固定于第一膜片上形成复合物阵列，与捕获第一膜片同时装配，留检测孔。

7.根据权利要求6所述的用于多项心肌标志物并行检测的芯片试纸，其特征在于：

所述信号标记物包括：荧光素、荧光蛋白、纳米金、银、纳米荧光微球、量子点、稀土元素、放射元素、小分子化学物或色素中的一种或多种。

8.一种多项心肌标志物并行检测系统，其特征在于，用以检测心肌标志物：cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；所述系统包括：

芯片试纸，包括第一膜片、第二膜片；在第一膜片上设有各标志物的配体An，在第二膜片上吸附有信号标记物偶联的配基Bn；将上述被检测物质相应的捕获单抗固定在芯片试纸的第一膜片上；将与配体An和Bn形成夹心检测的被检测物质从加样孔加入后通过渗滤或虹吸或磁场或电场或重力场作用力下移动分别与配体Bn和An结合形成第一膜片-配体An-被检测物-配体Bn-信号标记物的复合固定于第一膜片上形成复合物阵列，与捕获第一膜片同时装配，留检测孔；滴加样本血清，当滴加的样本血清中存在上述蛋白抗原物质时，层析过程中先于同时层析的第二膜片上的标记二抗结合，此结合物再被第一膜片上的捕获抗体截获；

荧光检测仪，用以检测固定在第一膜片上的荧光信号，荧光强度与样本血清中目的蛋白浓度成正比，荧光强度通过在检测仪中转换成数字信号，根据内标标准曲线直接用于计算蛋白浓度。

9.根据权利要求8所述的多项心肌标志物并行检测系统，其特征在于：

所述荧光检测仪包括：激光器、滤镜组、滤光片、双向色镜、反光镜、第一物镜、第二滤光片、第二物镜、光栏和芯片试纸，以及光电倍增管PMT元件，信号放大器AMP元件，转换器A/D元件，CD芯片，输出打印设备，主板和电源设备。

10.根据权利要求8所述的多项心肌标志物并行检测系统，其特征在于：

所述荧光检测仪的激光发射器发出激光，该激光同时激发芯片试纸内的多种信号标记物，该些标记物受激光激发后发生能量跃迁，释放出另外一种变异的光波或者电子物质；

所述荧光检测仪的信号接收装置接收信号标记物释放出的光波或者电子传递物信号，并且把信号转化为数字信号，信号标记物释放信号的大小与数值大小正相关；然后荧光检测仪将处理过的接收的信号进行计算，然后转换为模拟信号，输出该模拟信号，该输出的模拟信号与进行模拟计算，最后输出被检测物质的浓度相对应。

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