CN102692508B - 一种快速定量检测肌钙蛋白t的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡，纸条组件包括了试纸条和独立包装的铂卟啉标记特异抗体，该试纸条包括了底衬，粘附于底衬上的包被分析膜、粘附于底衬上且与硝酸纤维膜的其中一端接合的样品垫和粘附于底衬上且与硝酸纤维膜的另一端接合的吸水垫，包被分析膜上设有检测线和质控线；所述检测线包被抗肌钙蛋白T单克隆抗体，质控线包被兔IgG抗体，检测卡则将一卡盒和试纸条组件结合即可，应用本发明所提供的试纸条以及检测卡检测人血液、血清或血浆中肌钙蛋白T，操作简单、快速、灵敏和特异性好等特点，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种快速定量检测肌钙蛋白T(cTnT)的免疫荧光试纸条以及其制备与应用。
背景技术
冠心病已成为影响人群健康的主要疾病。急性心肌梗死则是造成冠心病人死亡的主要原因。如何及时地发现急性心肌梗死病人及其相应的治疗是挽救心肌梗死病人生命的关键所在。传统的诊断主要是根据典型的临床表现，心电图的改变及实验室酶学检查。但相当一部分心肌梗死病人临床表现不明显，早期心电图无明显改变。在这种情况下，心肌损伤特异性标志物的应用对心肌梗死的早期确诊就起到了关键的作用。肌钙蛋白T(Cardiac troponin T，cTnT)是一重要的心肌组织损伤特异性标识物，临床用于急性心肌梗死及其它心肌损伤性疾病的诊断。
肌钙蛋白是横纹肌的结构蛋白，由TnI、TnT和TNC三种亚单位组成。TnT是与原肌球蛋白结合的亚单位，Tnl是肌原纤维ATP酶的抑制性亚单位，TNC是钙离子结合亚单位。这三种亚单位与原肌球蛋白一起构成肌凝蛋白(Tm)—肌钙蛋白(Tn)复合体。在钙离子的诱导下，调节肌肉收缩和舒张的力量和速度。骨骼肌与心肌中的TnT和TnI是由不同的基因编码的，导致其氨基酸组成序列的差异，因此可以用免疫学的方法加以区分。TNC在骨船肌和心肌中则是相同的。
cTnT是仅存在于心肌细胞中的特异性调节蛋白，分两种形式存在：游离形式存在于细胞胞浆中，占6％～8％；结合形式存在于心肌收缩单位中肌纤维的细肌丝上，占92％～94％。当出现可逆性心肌缺血，心肌细胞尚未坏死，但细胞膜受到损伤，胞浆中的cTnT可短暂释放入血；当发生不可逆性心肌缺血，心肌细胞坏死，细肌丝降解，可导致结合池cTnT释放入血。因此不稳定型心绞痛(UAP)患者血液中cTnT仅短暂轻度升高随后恢复正常；而AMI患者血中cTnT可显著升高且维持较长时间。cTnT在心肌损伤后2～8小时释放入血，12～24小时达高峰，在血中可维持14天左右，所以它的最大有效诊断窗口宽至2小时～14天。在心肌损伤后，cTnT较cTnI更早释放入血，更易被检测到，血中浓度更高，对检测心肌损伤的价值也就可能更高。cTnT仅存在于心肌细胞中，可用免疫酶标定量法测得，对心肌损伤的诊断具高度敏感和特异性。虽然早期的测定方法不成熟，使cTnT与骨骼肌TnT有微量交叉反应，采用心脏特异和非心脏特异两种抗体测定cTnT，发现cTnT与骨骼肌TnT有1％～2％的交叉反应。检测方法改进后，采用两种均为心脏特异的单克隆抗体作为检测抗体测定cTnT时，与骨骼肌TnT的交叉反应阳性率<0.5％。对75名无心脏病的骨骼肌损伤患者(其中33名Duchenne病，42名运动员马拉松长跑后)用第二代检测方法检测cTnT，未发现1例假阳性反应。另据Rottbauer报道，用同样的方法检测横纹肌溶解症患者或健康人马拉松长跑后，虽然他们的CK可升至正常高限的300倍，却检测不到cTnT，另1例因乙醇中毒导致严重骨骼肌损伤的患者，虽CK达35000IU/L(正常高限是200IU/L)，而cTnT却阴性。
自1991年首次发表cTnT有诊断AMI价值的文章以来，全世界已经有十多个大型临床试验证实其对AMI有重要的诊断价值。Katus等人最早报道了cTnT对诊断AMI是高度敏感和特异的。他们选取387例因胸痛而怀疑AMI的患者测定cTnT，发现所有AMI患者cTnT均升高(>0.1ng/ml)，胸痛发作24小时内cTnT诊断AMI的敏感性和特异性分别为99％和93％，第2天敏感性和特异性均为100％，因cTnT的升高在血清中持续时间较长，故到第6天仍均达100％；而头24小时内CK和CK-MB的敏感性分别为99％和98％，特异性分别为75％和92％。cTnT的价值优于CK、CK-MB，在AMI后，cTnT升高幅度是CK-MB升高幅度的5倍，诊断AMI的绝对敏感窗(以症状发作后时间计)在cTnT也远较CK和CK-MB宽，cTnT为10.5～140小时，CK和CK-MB为9～31小时。cTnT诊断AMI的价值优于CK、CK-MB的可能原因有：(1)心肌中cTnT的含量较高，每克心室肌(湿重)含10－8mg的cTnT，cTnT总量中的6％～8％存在于胞浆中，而这胞浆中的cTnT量已经相当于心肌中CK的总量，所以cTnT在AMI后的升高幅度要远高于CK(cTnT可达30～40倍，而CK仅升高9倍)。(2)cTnT在心肌损伤后释放入血也较CK要早，它最早可在症状发作后1小时在血中检出，3～4小时其敏感性可达50％。(3)其在血中持续升高的时间较长。cTnT大部分(94％)以结合形式存在于心肌细胞收缩单位中，它从细肌丝的肌钙蛋白复合物中分离出来的过程是一个消耗时间的过程，且此过程不断进行，因此虽然cTnT在血浆中的半衰期只有120分钟，但却可在血中持续升高达2周左右。在10.5～140小时的绝对敏感诊断窗中，100％的AMI患者cTnT均升高，敏感性是CK的6倍。
cTnT的测定始于20世纪90年代初，多采用双抗体竞争放射免疫法和竞争性ELISA测定法。有研究者将金标记或硒标记单克隆抗体与免疫层析技术相结合，用纸条法半定量床边检测cTnT浓度，最低检测值为0.1μg/L。目前cTnT的检测多采用化学发光法，用化学发光物质标记后作为检测抗体，大大提高了测定的精确性和敏感性，但需要昂贵的检测设备。目前的床旁检测方法(胶体金试纸法)，不能满足临床诊断准确定量的要求，无法对AMI的病程起到很好的疗效监测作用。因此，建立一种检测时间尽量缩短，并且检测除了能在实验室进行外，还要求能够进行床旁检测，同时能定量测定cTnT的检测方法，从而为临床提供准确的诊断依据，是十分必要的。
申请号200610130403.3公开了一种化学免疫分析检测心肌钙蛋白T的方法，主要是用辣根过氧化物酶促化学发光体系，采用双单抗夹心法和/或竞争法检测，该方法需要将样品和与酶的复合物(固化与固相载体上)置于在反应池内，再经过洗涤后加入酶的底物、氧化剂以及增强剂便可发光，这种方法的过程复杂，且耗时长。
发明内容
为克服现有cTnT检测技术的不足，本发明提供一种快速检测cTnT的试纸条组件，以及由该试纸条组件制成的检测卡。本发明根据免疫荧光技术特点和cTnT抗原抗体系统特点，设计新的原材料，试剂和工艺流程，应用本发明提供的试纸条检测cTnT水平，具有简单，快速，灵敏和特异性好等特点，可同时定量检测高值和低值样品，并且性价比高，适用于临床快速检测。
本发明提供的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的检测反应原理为固相双抗体夹心法的免疫荧光层析法。待测样品与适当比例的荧光标记抗体在液相均质介质中充分混和均匀，在此过程中样品中的cTnT能专一性地与荧光标记抗cTnT抗体充分结合，然后再转加到检测卡上，流经检测卡中的硝酸纤维膜(NC膜)时，其中所含的、已反应结合在一起的cTnT-抗cTnT荧光抗体复合物能为膜上检测线上固定的抗cTnT的另一个抗体特异性捕获，所发出的荧光可用专用仪器定量测定，荧光强度与样品中cTnT浓度成正比。
本发明采用如下技术方案：
一种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的铂卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬、依次接合在底衬上的吸水垫、包被分析膜及样品垫，该包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线包被的特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体，质控线包被的特异抗体为兔IgG抗体；铂卟啉标记特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体。
优选地，所述底衬一面涂覆黏胶或双面胶，用以固定所述的吸水垫、包被分析膜及样品垫，其中，硝酸纤维膜粘附在所述底衬的中间，两端分别与所述吸水垫和样品垫连接。
优选地，所述吸水垫为一种滤纸，为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫粘附在所述底衬上，同时吸水垫与硝酸纤维膜重叠1-2mm连接。
优选地，所述包被分析膜为硝酸纤维膜，且在所述包被分析膜上喷涂抗肌钙蛋白T单克隆抗体和兔IgG抗体。
优选地，所述样品垫为玻璃纤维膜，且用含0.01％-0.5％PEG聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液浸泡处理过，其中，磷酸盐缓冲液PH为7.2，浸泡处理后，放置在25-40℃温度下干燥过夜，所述样品垫与硝酸纤维膜重叠1-2mm连接。
优选地，所述的独立包装的铂卟啉标记特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含有如下组分的0.02M磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得：0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂。
优选地，所述独立包装的铂卟啉标记的激发光光源范围为390-420nm，发射光波长范围为600nm-700nm。
一种制备上述定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，包括以下步骤：
1)抗体的制备：
选用纯化的基因工程表达的抗肌钙蛋白T单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG；
2)包被分析膜的制备：
采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上画检测线和质控线，划线细致均匀，检测线与质控线间隔5mm；
用检测线包被缓冲液稀释抗肌钙蛋白T单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将抗肌钙蛋白T单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上；
用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体对应喷印在硝酸纤维膜的质控线上；
将喷膜后的硝酸纤维膜放入25-40℃的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用；
3)样品垫的制备：
将玻璃纤维膜用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液浸泡，放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥后即成样品垫，取出密封备用；
4)铂卟啉标记特异抗体的制备：
将肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，分别加入30-50mg铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1小时，每隔15分钟混匀一次，最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的铂卟啉标记抗体，用0.02M磷酸盐缓冲液稀释混匀后于4℃保存；
5)免疫荧光试纸条的制备：
先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上，在包被分析膜一端粘附吸水垫，二者重叠1-2mm；在包被分析膜另一端粘附样品垫，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜、吸水垫和样品垫的底衬裁切成细条；，即成一种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸。
优选地，所述检测线包被缓冲液为含有0.8-1％的甲醇、1-1.5％海藻糖或者蔗糖、抗肌钙蛋白T单克隆抗体1mg/ml的50mM pH值为7.6的磷酸盐缓冲液或三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液。
优选地，所述质控线包被缓冲液为含0.7-1％的甲醇、0.5-0.8％的牛血清白蛋白、兔IgG抗体0.5mg/ml50mM的pH值为7.6磷酸盐缓冲液。
应用上述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的免疫荧光检测卡组件，所述检测卡组件包括试纸条组件、用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板组成的卡盒，所述背板包括放置所述试纸条的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可观测检测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔和用于与所述背板的卡齿结合的固定孔，所述试纸条通过所述卡齿与所述固定孔结合而嵌合在所述背板和所述盖板之间，其中，所述包被硝酸纤维膜正对所述检测窗，所述样品垫正对所述加样孔；另外，独立包装的铂卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。
制备上述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的方法，包括以下步骤：
1)背板和盖板的制备：
用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板和盖板，所述背板包括放置所述试纸条组件的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔以及用于与所述背板的卡齿结合的固定孔；
2)组装：
将试纸条放在所述背板的所述卡槽内，通过所述背板的卡齿与所述盖板的固定孔结合，将试纸条嵌合在背板和盖板之间，其中，包被分析膜正对所述检测窗，样品垫正对所述加样孔；
3)包装：
将1人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的铂卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存的进行保存。
本发明的有益效果：
本发明采用免疫荧光快速检测技术，利用荧光的高灵敏特点，且样品与荧光标记抗体在试剂瓶内反应后再加入检测卡。由于样品与荧光标记抗体在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，同时增加了样品的稀释倍数，去除了样品的基质效应，使定量结果有很好的可重复性，而且此方法省略了直接加样步骤，提高了定量结果的精密度和准确度，可满足同时检测高值和低值的临床诊断要求。
应用本发明提供的试纸条检测人体内cTnT水平，成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，只需要配套专用荧光检测仪，因此可广泛应用于各级医疗检验场所，尤其是基层医疗机构，包括乡镇卫生院等均可开展。本发明对于心脑血管事件发生的预防有极为重要的意义。
附图说明
图1为本发明的试纸条的结构示意图；
图2为本发明的检测卡结构示意图；
图3是铂卟啉发光材料的发射光谱曲线；
图4为本发明的反应方式示意图；
图5为本发明的检测结果示意图；
图6为本发明的肌钙蛋白T检测标准工作曲线。
附图标记：1：底衬；2：吸水垫；3：包被分析膜；4：检测线；5：质控线；6：样品垫；7：加样孔；8：检测窗；9:项目名称；10：固定孔；11：盖板；12：卡槽；13：背板；14：卡齿；15：铂卟啉标记抗体；16：肌钙蛋白T；17：检测线抗肌钙蛋白T单克隆抗体；18：质控线兔IgG抗体。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例一
参照附图1，一种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的铂卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬1、依次接合在底衬1上的吸水垫2、包被分析膜3及样品垫6，该包被分析膜上3设有检测线4和质控线5，检测线4包被的特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体，质控线5包被的特异抗体为兔IgG抗体；铂卟啉标记特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体。
其中，底衬1一面涂覆黏胶或双面胶，用以固定吸水垫2、包被分析膜3及样品垫6，其中，包被分析膜3附在底衬1的中间，两端分别与吸水垫2和样品垫6连接。
吸水垫2为一种滤纸，为吸水纸或滤油纸；吸水垫2粘附在底衬1上，同时吸水垫2与包被分析膜3重叠1-2mm连接。
包被分析膜3为硝酸纤维膜。
样品垫6为玻璃纤维膜，且用含0.01％-0.5％PEG(聚乙二醇)、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液浸泡处理过，其中，磷酸盐缓冲液PH为7.2，浸泡处理后，放置在25-40℃温度下干燥过夜，样品垫6与硝酸纤维膜3重叠1-2mm连接。
独立包装的铂卟啉标记特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含有如下组分的0.02M磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得：0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂。
制备上述定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，包括以下步骤：
1)抗体的制备：
选用纯化的基因工程表达的抗肌钙蛋白T单克隆抗体和纯化的兔IgG。
2)包被分析膜3的制备：
取硝酸纤维膜，调试BIO-DOT喷膜机，膜液量为25ul/35cm，机器划线，检测线与质控线间隔5mm，划线细致均匀；
用检测线包被缓冲液稀释抗肌钙蛋白T单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用BIO-DOT喷膜机将抗肌钙蛋白T单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上；其中：
检测线包被缓冲液的制备：50mM pH7.6PBS缓冲液，含甲醇1％、海藻糖1％、牛血清白蛋白0.5％、抗肌钙蛋白T单克隆抗体1mg/ml。
用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG至浓度为10-20ug/ml，采用BIO-DOT喷膜机将纯化的兔IgG分别对应喷印在硝酸纤维膜的和质控线上；其中：
质控线包被缓冲液的制备：50mM pH7.6PB缓冲液，含甲醇1％、牛血清白蛋白0.8％、兔IgG抗体0.5mg/ml。
将喷印好的硝酸纤维膜放置25℃-37℃真空干燥箱处理1小时，装袋密封备用。
3)样品垫6的制备：
将玻璃纤维膜用含0.2％PEG、2.5％牛血清白蛋白、0.03％表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液浸泡，放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥3小时后，即成样品垫6，取出密封备用；
4)铂卟啉标记特异抗体的制备：
将抗cTnT单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入30mg铂卟啉铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1小时，每隔15分钟混匀一次。最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的铂卟啉标记抗体，用含0.01％-0.5％PEG、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂的0.02M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。
5)免疫荧光试纸条的制备：
先将包被分析膜粘附在底衬1中间位置上，在包被分析膜3一端粘附吸水垫2，二者重叠1-2mm；在包被分析膜3另一端粘附样品垫6，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜3、吸水垫2和样品垫6的底衬1裁切成细条；即成一种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸。
参照附图2，一种应用上述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的免疫荧光检测卡组件，包括试纸条组件、用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板11和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板13组成的卡盒，背板13包括放置试纸条的卡槽12和用于与盖板11结合的卡齿14，盖板11包括可观测检测结果的检测窗8、可滴加样品的加样孔7和用于与背板的卡齿14结合的固定孔10，试纸条通过卡齿14与固定孔10结合而嵌合在背板13和盖板11之间，其中，包被硝酸纤维膜3正对检测窗8，样品垫6正对加样孔7；另外，独立包装的铂卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。
制备上述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的方法，其特征在于：包括以下步骤
1)制成背板13和盖板11：
用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板13和盖板11，背板13包括放置所述试纸条组件的卡槽12和用于与盖板11结合的卡齿14，盖板11包括可测结果的检测窗8、可滴加样品的加样孔7以及用于与背板的卡齿14结合的固定孔10；
2)组装：
将试纸条放在背板13的卡槽12内，通过背板13的卡齿14与盖板11的固定孔10结合，将试纸条嵌合在背板13和盖板11之间，其中，包被分析膜3正对检测窗8，样品垫6正对加样孔7；
3)包装：
将1人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的铂卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存的进行保存。
本发明的检测原理：
参照附图3，对铂卟啉发光材料的发射光谱曲线进行分析，发现铂卟啉所具有的特征光谱的激发光光源范围为390-420nm，发射光波长范围为600-700nm。由于铂卟啉发光标记物的特点，使得以其作为标记物的免疫荧光试纸条可与仪器结合，使得基于铂卟啉发光技术的免疫层析试纸条可进行灵敏度极高的多重分析、且对目标被检测物进行灵敏度极高的精确定量检测。
另外，本发明的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条及检测卡，利用荧光的高灵敏特点，使待测样品与铂卟啉标记先在试剂瓶内反应，由于待测样品与铂卟啉标记在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，同时增加了待测样品的稀释倍数，去除了待测样品的基质效应，使定量结果有很好的可重复性；而且铂卟啉标记上的特异抗体与待测样品充分结合形成一复合物，然后将复合物转加到检测卡的加样孔7的样品垫6上，实现铂卟啉发光材料与免疫层析技术相结合从而检测人体内肌钙蛋白T水平。如图4所示，当复合物加到检测卡的加样孔7的样品垫6上后，在吸水垫2的吸力下铂卟啉标记抗体15流经到检测卡中的包被分析膜3上，如果该复合物具有肌钙蛋白T，其能被检测线4上的肌钙蛋白T单克隆抗体17捕获，在绿色光照射下以红外光光信号的形式表现出来，所发出的荧光可用专用仪器定量测定，荧光强度与样品中肌钙蛋白T的浓度成正比。如果复合物中肌钙蛋白T低于最低检测标准，则检测线4不会发出荧光。另外，参阅图5的a、b、c所示，试纸条有效的情况下，检测线4上的抗肌钙蛋白T单克隆抗体17与质控线5上的兔IgG抗体18均会与复合物反应发出荧光，即检测线4与质控线5均发光，试纸条检测结果呈阳性；只有质控线5发光，试纸条检测结果呈阴性；两条线均未发光，试纸条检测结果无效。
标准工作曲线的绘制：
首先，将提纯的肌钙蛋白T标准品用1:10稀释的正常人血清(采用pH7.20.02M PB缓冲液稀释)作为稀释液配制系列浓度标准品，浓度为：0ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份样品。其次，每个样品分别用10个肌钙蛋白T试纸条检测10次，10次检测仪器判读的样品检测T值和对照C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出每个浓度对应的T/C结果，列于表1。
表1、不同浓度下的T/C值
以T/C值作为X坐标，以肌钙蛋白T浓度作为Y坐标绘制标准工作曲线，经统计拟合标准工作曲线的表达式为：Y＝0.6938X+0.8965，拟合系数的平方为R2＝0.9993。结果见附图6：肌钙蛋白T检测标准工作曲线。
实施例2：
本实施例与实施例一基本相同，不同点在于：
检测线包被缓冲液制备方法是：20mM pH7.6的三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液(TAPS缓冲液)，含甲醇0.8％、蔗糖1.5％、牛血清白蛋白0.6％、抗cTnT单克隆抗体1mg/ml。质控线包被缓冲液的制备：50mM pH7.6磷酸盐缓冲液(PB缓冲液)，含甲醇0.7％、牛血清白蛋白0.5％、兔IgG0.5mg/ml。包被膜的制备：调试BIO-DOT喷膜机，膜液量为20ul/40cm，机器划线，检测线与质控线间隔5mm，划线细致均匀，放置25℃-37℃真空干燥箱处理1.5小时，装袋密封备用。
实施例3：
本实施例与实施例一基本相同，不同点在于：
将抗cTnT单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入40mg铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1.5小时，每隔15分钟混匀一次。最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的铂卟啉标记抗体，用含0.01％-0.5％PEG、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂的0.02M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。
实施例4：
本实施例与实施例一基本相同，不同点在于：
步骤3中，将抗cTnT单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入50mg铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育2小时，每隔15分钟混匀一次。最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的铂卟啉标记抗体，用含0.01％-0.5％PEG、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂的0.02M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。
实施例5：
本实施例与实施例一基本相同，不同点在于：
步骤4中，用含0.4％PEG、1.8％牛血清白蛋白、0.02％表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液，将浸泡后的样品垫放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥4小时后取出密封备用。
对实施例1-5的试纸条进行性能方面的测定，最低检测限为0.01ng/ml。同时对临床样品进行检测。将58例收集自医院的C-反应蛋白临床样品(其中阳性37份，阴性21份)同时用胶体金免疫层析试纸与本系统进行双盲法检测：
胶体金免疫层析试纸法——31份阳性，27份阴性(即6份阳性漏检)；
铂卟啉试纸与仪器法——37份阳性，21份阴性，与实际结果完全吻合。同时，与胶体金免疫层析试纸的定性检测相比，铂卟啉试纸与仪器法给出了每份样品的最终准确浓度。
将此58例收集自医院的肌钙蛋白T临床样品，同时与某公司肌钙蛋白T化学发光法试剂检测进行相关性分析，以化学发光检测结果作为X坐标，铂卟啉试纸与仪器法结果作为Y坐标绘制相关性分析曲线，表达式为Y＝0.9993X-2.6157，相关性系数为r＝0.9988。按照统计学分析，r>95％，P<0.01，具有正相关关系。
在批内精密度方面，利用实施例1-5的试纸条，对含量分别为高值、中值和低值的样品，连续进行至少10次检测，计算变异系数(CV)。对于肌钙蛋白T含量高值(200ng/ml)、中值(90ng/ml)、低值(15ng/ml)样品各一份分别测定10次，根据其测定的数据，采用SPSS统计方法分析，以测定结果均值±标准差表示，高值201.8±2.7ng/ml，CV2.3％；中值89.6±1.3ng/ml，CV5.2％；低值15.1±1.2ng/ml，CV7.9％；检测结果CV值均小于15％。
在批间精密度方面，利用实施例1-5的试纸条，对一份肌钙蛋白T临床阳性样品用pH7.20.02M PB缓冲液稀释10倍，连续进行至少10次检测，结果列于表2。计算该份样品重复检测的变异系数(CV)为1.83％。
表2为本发明的实施例的检测值
由上述检测可见，本发明检测方法具有更高的灵敏度，且在实现批内、批间精确定量检测的同时具有很好地重复性。
Claims (15)
1.一种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：
包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的铂卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬(1)、依次接合在底衬(1)上的吸水垫(2)、包被分析膜(3)及样品垫(6)，该包被分析膜上(3)设有检测线(4)和质控线(5)，检测线(4)包被的特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体，质控线(5)包被的特异抗体为兔IgG抗体；铂卟啉标记特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体；
其中所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的制备方法包括以下步骤：
1)抗体的制备：
选用纯化的基因工程表达的抗肌钙蛋白T单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG；
2)包被分析膜(3)的制备：
采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上画检测线(4)和质控线(5)，划线细致均匀，检测线(4)与质控线(5)间隔5mm；
用检测线包被缓冲液稀释抗肌钙蛋白T单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将抗肌钙蛋白T单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线(4)上；
用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体对应喷印在硝酸纤维膜的质控线(5)上；
将喷膜后的硝酸纤维膜放入25-40℃的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用；
3)样品垫(6)的制备：
将玻璃纤维膜用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液浸泡，放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥后即成样品垫(6)，取出密封备用；
4)铂卟啉标记特异抗体的制备：
将肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，分别加入30-50mg的铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1小时，每隔15分钟混匀一次，最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的铂卟啉标记抗体，用0.02M磷酸盐缓冲液稀释混匀后于4℃保存；
5)免疫荧光试纸条的制备：
先将包被分析膜粘附在底衬(1)中间位置上，在包被分析膜(3)一端粘附吸水垫(2)，二者重叠1-2mm；在包被分析膜(3)另一端粘附样品垫(6)，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜(3)、吸水垫(2)和样品垫(6)的底衬(1)裁切成细条,即成一种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸。
2.根据权利要求1所述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述底衬(1)一面涂覆黏胶或双面胶，用以固定所述的吸水垫(2)、包被分析膜(3)及样品垫(6)，其中，包被分析膜(3)粘附在所述底衬(1)的中间，两端分别与所述吸水垫(2)和样品垫(6)连接。
3.根据权利要求1或2所述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述吸水垫(2)为一种滤纸，为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫(2)粘附在所述底衬(1)上，同时吸水垫(2)与包被分析膜(3)重叠1-2mm连接。
4.根据权利要求1或2所述的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述样品垫(6)为玻璃纤维膜，且用含0.01％-0.5％PEG聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液浸泡处理过，其中，磷酸盐缓冲液pH为7.2，浸泡处理后，放置在25-40℃温度下干燥，所述样品垫(6)与包被分析膜(3)重叠1-2mm连接。
5.根据权利要求1所述的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述的独立包装的铂卟啉标记特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含有如下组分的0.02M磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得：0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂。
6.根据权利要求1所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述独立包装的铂卟啉标记的激发光波长范围为390-420nm，发射光波长范围为600nm-700nm。
7.一种制备权利要求1所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)抗体的制备：
选用纯化的基因工程表达的抗肌钙蛋白T单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG；
2)包被分析膜(3)的制备：
采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上画检测线(4)和质控线(5)，划线细致均匀，检测线(4)与质控线(5)间隔5mm；
用检测线包被缓冲液稀释抗肌钙蛋白T单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将抗肌钙蛋白T单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线(4)上；
用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体对应喷印在硝酸纤维膜的质控线(5)上；
将喷膜后的硝酸纤维膜放入25-40℃的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用；
3)样品垫(6)的制备：
将玻璃纤维膜用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液浸泡，放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥后即成样品垫(6)，取出密封备用；
4)铂卟啉标记特异抗体的制备：
将肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，分别加入30-50mg的铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1小时，每隔15分钟混匀一次，最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的铂卟啉标记抗体，用0.02M磷酸盐缓冲液稀释混匀后于4℃保存；
5)免疫荧光试纸条的制备：
先将包被分析膜粘附在底衬(1)中间位置上，在包被分析膜(3)一端粘附吸水垫(2)，二者重叠1-2mm；在包被分析膜(3)另一端粘附样品垫(6)，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜(3)、吸水垫(2)和样品垫(6)的底衬(1)裁切成细条,即成一种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸。
8.根据权利要求7所述的一种制备权利要求1所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，所述检测线包被缓冲液为含有0.8-1％的甲醇、1-1.5％海藻糖或者蔗糖、抗肌钙蛋白T单克隆抗体1mg/ml的50mM pH值为7.6的磷酸盐缓冲液或三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液。
9.根据权利要求7所述的一种制备权利要求1所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，所述检测线包被缓冲液为含甲醇0.8％、蔗糖1.5％、牛血清白蛋白0.6％、抗肌钙蛋白T单克隆抗体1mg/ml的20mM pH值为7.6的三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液。
10.根据权利要求7所述的一种制备权利要求1所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，所述检测线包被缓冲液为含含甲醇1％、海藻糖1％、牛血清白蛋白0.5％、抗肌钙蛋白T单克隆抗体1mg/ml的50mM pH值为7.6的磷酸盐缓冲液。
11.根据权利要求7所述的一种制备权利要求1所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，所述质控线包被缓冲液为含0.7-1％的甲醇、0.5-0.8％的牛血清白蛋白、兔IgG抗体0.5mg/ml50mM的pH值为7.6磷酸盐缓冲液。
12.根据权利要求7所述的一种制备权利要求1所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，所述质控线包被缓冲液为含甲醇1％、牛血清白蛋白0.8％、兔IgG抗体0.5mg/ml的50mM pH值为7.6磷酸盐缓冲液。
13.根据权利要求7所述的一种制备权利要求1所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，所述质控线包被缓冲液为含甲醇0.7％、牛血清白蛋白0.5％、兔IgG0.5mg/ml的50mM pH值7.6的磷酸盐缓冲液。
14.一种应用权利要求1所述的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的免疫荧光检测卡组件，其特征在于：所述检测卡组件包括试纸条组件、用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板(11)和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板(13)组成的卡盒，所述背板(13)包括放置所述试纸条的卡槽(12)和用于与所述盖板(11)结合的卡齿(14)，所述盖板(11)包括可观测检测结果的检测窗(8)、可滴加样品的加样孔(7)和用于与所述背板的卡齿(14)结合的固定孔(10)，所述试纸条通过所述卡齿(14)与所述固定孔(10)结合而嵌合在所述背板(13)和所述盖板(11)之间，其中，所述包被分析膜(3)正对所述检测窗(8)，所述样品垫(6)正对所述加样孔(7)；另外，独立包装的铂卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。
15.权利要求14所述的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的制备方法，其特征在于：包括以下步骤
1)制成背板(13)和盖板(11)：
用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板(13)和盖板(11)，所述背板(13)包括放置所述试纸条组件的卡槽(12)和用于与所述盖板(11)结合的卡齿(14)，所述盖板(11)包括可测结果的检测窗(8)、可滴加样品的加样孔(7)以及用于与所述背板的卡齿(14)结合的固定孔(10)；
2)组装：
将试纸条放在所述背板(13)的所述卡槽(12)内，通过所述背板(13)的卡齿(14)与所述盖板(11)的固定孔(10)结合，将试纸条嵌合在背板(13)和盖板(11)之间，其中，包被分析膜(3)正对所述检测窗(8)，样品垫(6)正对所述加样孔(7)；
3)包装：
将1人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的铂卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存的进行保存。
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