CN101398433A - 检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测Dkk－1的时间分辨荧光免疫分析方法及其试剂盒。该方法包括下列步骤：①固相抗体制备；②铕离子标记抗体制备；③测定方法：基于双抗体夹心的免疫反应。本发明检测Dkk－1具有较高的灵敏度、特异度及稳定性；且分析系统高度自动化，可提高临床检验结果的速度，又可大幅度降低人为误差和增加检出结果的可靠性。

Description

检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种分泌型蛋白dickkopf l(Dkk-1)的免疫检测方法，特别涉及一种检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)及相应的试剂盒。

背景技术

Wnt信号途径是对控制胚胎发育有重要作用的、进化上保守的信号转导途径，其不恰当的激活参与了人类多种肿瘤的发生。最近的一些研究报道了参与这一信号途径的细胞内分子β-catenin、APC和AXIN的基因突变使细胞内β-catenin磷酸化水平降低和相应的泛素化降解削弱，致使稳定的β-catenin入核与TCF/LEF结合调控相关基因的表达，因而导致wnt信号途径的异常激活。分泌型蛋白dickkopf l(Dkk-1)在非洲爪蟾早期发育中发挥重要调控作用，抑制wnt诱导的轴的复制而参与头的形成。Dkk-1人类的同源物也作为一种抑制信号对Wnt信号途径起调控作用。目前的研究认为Dkk-1与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP 5/6)结合，在膜蛋白Kremen参与下引起LRP 5/6的内吞而抑制wnt信号。

最近有研究通过cDNA微阵列芯片技术比较肝细胞癌组织及邻近正常肝组织的基因表达差异，发现Dkk-1基因在肝细胞癌中高表达，该基因编码一个35kDa的分泌性蛋白——Dkk-1蛋白，以前对于该基因功能研究主要集中在胚胎期神经的发育。随后我们分别采用RT-PCR、Northern blot、荧光定量PCR、Western blot等技术均证实Dkk-1在人类多种肿瘤细胞系中有不同程度高表达。在今年3月出版的Cancer Research杂志上，日本学者TakumiYamabuki等报道了Dkk-1在肺癌和食道癌中的诊断作用，Dkk-1在非小细胞性肺癌的阳性率达70％，在小细胞性肺癌中的阳性率为69.4％，在食道癌中为63％，仅有4.8％的假阳性率。血清Dkk-1蛋白检测，各室验均运用ELISA原理自己建立检测方法，无商业化的试剂盒可用。ELISA方法存在稳定性差，批间差异大，灵敏度低的缺点，难以满足Dkk-1检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度、特异度及稳定性较佳，且适于产业化的检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)及其试剂盒。

为提高Dkk-1检测方法的灵敏度、特异度和/或稳定性，且能产业化利用，本发明人在现有诸多免疫方法中进行筛选，惊奇地发现TRFIA在灵敏度、特异度和稳定性方面均具有良好的效果。TRFIA是上世纪八十年代初发展起来的新的免疫测定技术。其原理是利用具有双功能基团结构的螯和剂，其一端和镧系元素，如铕(Eu)、铽(Te)、钐(Sm)、镝(Dy)等结合，另一端和抗体分子上的自由氨基联接，制成镧系元素标记抗体，它与待测样品中的抗原结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素，如Eu³⁺的荧光强度就能确定样品中抗原的量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强液(Enhancement solution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)重新形成微胶囊，在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用全自动TRFIA检测仪测定其荧光强度，即可确定样品中抗体的量，因此本发明采用TRFIA检测Dkk-1可提高临床检验结果的速度，又可大幅度降低人为误差，适于产业化检测。

可见，本发明可以通过下列技术方案解决上述问题。一种检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法，其可以包括下列步骤：

①固相抗体制备：将抗Dkk-1单克隆抗体用缓冲液稀释至1～10mg/L作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭；

②铕离子标记抗体制备：选用抗Dkk-1多克隆抗体进行Eu³⁺标记，抗Dkk-1多克隆抗体与Eu³⁺标记物Eu³⁺-DTTA的重量比为1:0.2～0.5；

③测定方法：测定的基础是基于双抗体夹心的免疫反应，包括在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔依次加入Dkk-1标准品或待测样品，加入反应缓冲液室温振荡反应，洗涤液洗涤后加入用反应缓冲液以体积比为1：100稀释的步骤②制得的标记抗体100-200ul；室温振荡反应后用洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测。

其中，步骤①中所述的缓冲液优选50mmol/L、pH 9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，包被过程包括在96或48孔微孔板中加入100μl包被液，4℃放置过夜，弃去包被液，用洗涤液冲洗4次，加200μl含0.2w/v％明胶和2w/v％蔗糖的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干。如不立即使用，可将其密封后置-20℃冷冻保存。

根据本发明，步骤②铕离子标记方法可参照Eu³⁺标记试剂盒说明书。其中抗Dkk-1多克隆抗体与Eu³⁺标记物Eu³⁺-DTTA的重量比本发明优选1:0.2～0.5，这样可获得标记率在7-8的最住标记效果(抗体/Eu³⁺-DTTA，摩尔比)。标记率太高，影响被标记抗体的免疫活性；标记率太低，信号强度不够，降低检测灵敏度。

较佳地，步骤③中所述的反应缓冲液为含有8mmol/L NaCl、0.1w/v％明胶、0.2w/v％IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

而步骤③中所述的洗涤液优选含有14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

根据本发明，所述的Dkk-1标准品浓度分别为：0ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml。

根据本发明，所述的Dkk-1待测样品通常是体液，如血清以及心包积液、胸腔积液、腹腔积液、尿液等。

本发明检测方法的基础是双抗体夹心的免疫反应：同现有其它标记免疫反应相似，铕标记抗体、Dkk-1抗原和反应板上的固化抗体经过振荡反应形成夹心复合物，反应后经洗涤去除游离的未与固化抗体反应的Dkk-1、铕标记的Dkk-1抗体和/或Dkk-1与铕标记抗体形成的复合物。加增强液振荡反应后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪器测定其荧光强度。荧光强度与样品中的Dkk-1浓度成正比，对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。

本发明要解决的另一技术问题是提供一种相应于上述TRFIA检测Dkk-1的试剂盒。该检测Dkk-1的TRFIA试剂盒包括包被抗Dkk-1单克隆抗体的固相抗体微孔板、反应缓冲液、洗涤液、Eu³⁺标记的抗Dkk-1多克隆抗体、增强液和Dkk-1标准品。

其中，所述的包被抗Dkk-1单克隆抗体的固相抗体微孔板如上述步骤①。而所述的反应缓冲液、洗涤液也同上述。

所述的增强液可选用现已知的Eu³⁺增强液：含有15μmol/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、50μmol/L三正辛基氧化膦和1ml/L曲拉通X-100的pH3.2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。

本发明检测Dkk-1具有较高的灵敏度、特异度及稳定性；且分析系统高度自动化，可提高临床检验结果的速度，又可大幅度降低人为误差和增加检出结果的可靠性。通过对人体体液中Dkk-1含量的检测，可作为临床肿瘤诊断的辅助指标。

附图说明

图1为本发明Dkk-1-TRFIA标准曲线及精密度图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

其中，下列实施例中的抗Dkk-1单克隆抗体(Catalog Number：MAB1096)，多克隆抗体(Catalog Number：AF1096)和重组人Dkk-1蛋白标准品(Catalog Number：1096-DK)购自Biodesign公司；96、48孔微孔板为labsystem公司产品；Eu³⁺标记盒PerkerElmer公司产品，Sephadex G-50为Amersham产品；其他试剂均为国产分析纯；全自动TRFIA检测仪(AutoDELFIA 1235)为Wallac产品。

试剂的配制

1)标准品配制：系列标准品为冻干品，共6瓶，用前用1ml蒸馏水溶解成：0ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml。

2)反应缓冲液8mmol/L NaCl、0.1w/v％明胶、0.2w/v％IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液；

3)洗涤液：14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液；

4)增强液：1升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液，含15μmolβ-萘甲酰三氟丙酮，50μmol三正辛基氧化膦和1ml曲拉通X-100。

实施例1

试剂盒：每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下：

1)1×96或48孔板(8或4条×12孔，可以拆分为单孔)包被有抗Dkk-1单克隆抗体的微孔反应板；

2)6×Dkk-1标准品，冻干品，用前用1ml蒸馏水溶解，浓度分别为0ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml。

3)1×铕标记抗Dkk-1多克隆抗体冻干品，用时用0.5ml蒸馏水溶解。

4)1×增强液，15ml。

5)1×洗涤液，30ml，用时以蒸馏水1∶25稀释。

6)1×反应缓冲液，30ml。

其中：

Dkk-1标准品制备

取市购重组人Dkk-1抗原用含0.2％BSA、0.1％NaN₃，50mmol/L、pH7.8的Tris-Hcl缓冲液配制成0ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml系列标准品共6瓶，制成冻干粉，使用前加1ml蒸馏水溶解。

微孔反应板制备

用50mmol/L pH 9.6 Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液将抗Dkk-1单克隆抗体稀释至5μg/mL作为包被液，96或48孔微孔板各加入100μl，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗四次，加200μl含0.2％明胶和2％蔗糖的50mmol/L pH7.2的Tris-HCl缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

Eu³⁺标记抗Dkk-1抗体制备

参照Eu³⁺标记试剂盒说明书操作。具体为：取1mg抗Dkk-1多克隆抗体溶于0.25mol/L NaHCO₃液200μl中，加入0.3mg Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)充分混匀，4℃反应24小时。反应液用Sephadex G-50柱(1×20cm)层析，A280监测收集蛋白峰，合并峰管，定出蛋白含量，稀释分装备用。同时用PerkinElmer公司Eu³⁺标准液测定合并峰的Eu³⁺浓度。所得的标记率(Eu³⁺mol/IgG mol)是7.34，蛋白回收率为82％。

具体检测步骤如下：

取包被有抗Dkk-1单克隆抗体的微孔反应板，加50μl不同浓度的Dkk-1标准品至各自的微孔中，每个标准品必须使用新的吸头，加100μl反应缓冲液，室温振荡反应1小时。用洗涤液洗涤4次后再加200μl以反应缓冲液作稀释剂，1:100稀释的铕标记的抗Dkk-1抗体，25-37℃振荡反应1小时，用洗涤液洗涤6次，加增强液200μl振荡5分钟后测量荧光强度，从标准曲线计算样品中的Dkk-1含量。

1.Dkk-1 TRFIA标准曲线

以浓度值的对数为横坐标，荧光计数值的对数为左纵坐标，右纵坐标为CV％值，可见标准曲线线性好(r＝0.997)，各浓度值的变异系数小于均6％。见图1。

2.灵敏度和线性范围

以零参考标准品当作样品测量20次，计算其荧光均值及标准差。以该点荧光测定平均值加2倍标准差所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出的浓度值为其灵敏度，经测定本试验灵敏度为0.03ng/ml。将标准品抗原稀释成不同浓度进行测定，测得标准曲线线性范围为0.03～5000ng/ml。

3.方法的特异性

将Dkk-4，Kremen-2，Kremen-1和LRP-6/Fc Chimera当作样品稀释至一定浓度当作样品用本方法进行测定，结果见表1。

表1 Dkk-1-TrFIA检测特异性

4.精密度

采用本方法对三个浓度值的标本进行测定，各设10个复孔。本方法的批内变异系数和批间变异系数均小于10％(见表2)，符合试剂盒规定要求。

表2 精密度

5.准确度(回收试验)

按常规方法对本法进行回收试验。见表3。

表3 回收试验

^*Mean±SD＝99.56％±0.04，n＝15.

6.倍比稀释试验

把高含量的Dkk-1血清样品经1:2～32稀释后用本方法测定结果见表4。

表4 倍比稀释试验

经相关回归分析计算各组的斜率，截距，r值。样本1分别0.9038，0.3375和0.9334；样本2分别为：1.054，-0.0017和d0.9833；样本3分别为：1.0155，-3.935和0.9892。

综上可见，用时间分辨荧光免疫分析技术建立的Dkk-1检测方法具有高度的特异性，检测灵敏度达0.03ng/mL，试剂盒稳定性好，批内批间差异均小于6％，整体性能优于传统的ELISA方法。

应用实施例1 临床应用

试剂盒：同实施例1。

实验分组：

直结肠癌62例，取自上海交通大学医学院附属仁济医院普外科手术确诊病人。抽取患者的静脉血2ml置试管内待测。

正常对照组101例，为近期来上述医院体检的健康体检者，经检测各项目指标均正常。抽取静脉血2ml置试管内待测。

具体检测步骤：取包被有抗Dkk-1单克隆抗体的微孔反应板，加50μlDkk-1标准品或血清样品至各自的微孔中，每个标准品和样品必须使用新的吸头，加100μl反应缓冲液，室温振荡反应1小时。用洗涤液洗涤4次后再加200μl以反应缓冲液作稀释剂，1:100稀释的铕标记的抗Dkk-1抗体，25-37℃振荡反应1小时，用洗涤液洗涤6次，加增强液200μl振荡5分钟后测量荧光强度，从标准曲线计算样品中的Dkk-1含量。

结果示健康体检人员为11.5ng/ml±6.9ng/ml，直结肠癌患者为35.3ng/ml±12.1ng/ml，经t检验分析，p<0.001。以20ng/ml为临界值，阳性率为31％。

Claims (10)

1、一种检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法，其包括下列步骤：

①固相抗体制备：将抗Dkk-1单克隆抗体用缓冲液稀释至1～10mg/L作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭。

②铕离子标记抗体制备：选用抗Dkk-1多克隆抗体进行Eu³⁺标记，抗Dkk-1多克隆抗体与Eu³⁺标记物Eu³⁺-DTTA的重量比为1:0.2～0.5。

③测定方法：在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔依次加入Dkk-1标准品或待测样品，加入反应缓冲液室温振荡反应，洗涤液洗涤后加入用反应缓冲液以体积比为1:100稀释的步骤②制得的标记抗体100-200ul；室温振荡反应后用洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测。

2、如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于步骤①中所述的缓冲液为50mmol/L、pH 9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，96或48孔微孔板加入100μl包被液，4℃放置过夜，弃去包被液，用洗涤液冲洗4次，加200μl含0.2w/v％明胶和2w/v％蔗糖的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干。

3、如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于步骤③中所述的反应缓冲液为含有8mmol/L NaCl、0.1w/v％明胶、0.2w/v％IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

4、如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于步骤③中所述的洗涤液为含有14.5mmol/LNaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

5、如权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的Dkk-1标准品浓度分别为：0ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml。

6、一种检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析的试剂盒，其包括包被有抗Dkk-1单克隆抗体的固相抗体微孔板、反应缓冲液、洗涤液、Eu³⁺标记的抗Dkk-1多克隆抗体、增强液和Dkk-1标准品。

7、如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的包被抗Dkk-1单克隆抗体的固相抗体微孔板可以通过下列方法制得：用50mmol/L pH 9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液将抗Dkk-1单克隆抗体稀释至1～10mg/L作为包被液，96或48孔微孔板加入100μl包被液，4℃放置过夜，弃去包被液，用洗涤液冲洗4次，加200μl含0.2w/v％明胶和2w/v％蔗糖的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干。

8、如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的反应缓冲液为含有8mmol/L NaCl、0.1w/v％明胶、0.2w/v％IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

9、如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的洗涤液为含有14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

10、如权利要求6～10任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的增强液为含有15μmol/L β-萘甲酰三氟丙酮、50μmol/L三正辛基氧化膦和1ml/L曲拉通X-100的pH3.2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。

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