CN102608335A

CN102608335A - NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法

Info

Publication number: CN102608335A
Application number: CN2012101169268A
Authority: CN
Inventors: 董全文
Original assignee: UNION BIOTECHNOLOGIES (TIANJIN) Ltd
Current assignee: UNION BIOTECHNOLOGIES (TIANJIN) Ltd
Priority date: 2012-04-19
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2012-07-25

Abstract

本发明公开了一种NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，包括如下步骤：1)配制NT-proBNP校准品：用小牛血清将NT-proBNP抗原纯品稀释成系列浓度，每瓶装1个浓度点，所述NT-proBNP抗原纯品的纯度≥80％；2)制备NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板；3)制备铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体；4)配制洗涤液；5)配制增强液；6)配制分析缓冲液。用本发明的方法制备的试剂盒能定量检测人血清中NT-proBNP的含量，具有高灵敏，高特异，高通量，准确度高，性能稳定等特点。

Description

NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法

技术领域

本发明涉及一种免疫分析试剂盒的制备方法，特别是涉及一种NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法。

背景技术

心力衰竭是各种心血管疾病的终末阶段，具有较高的死亡率，相当于一些恶性肿瘤，研究显示心力衰竭的死亡率为43％，5年死亡率达90％，重度心力衰竭的死亡率更高。脑利钠肽(BNP)由于心室受到牵拉刺激或者张力升高而分泌，能够早期反映整体甚至局部心脏结构改变导致的功能变化。BNP来自心室肌细胞，最初合成的为前脑利钠肽原(pre-proBNP)，是由134个氨基酸组成的多肽链。pre-proBNP在心肌细胞中裂解为脑利钠肽原(proBNP，108个氨基酸)和信号肽(26个氨基酸)。proBNP进入血液后裂解为具有生理活性的BNP和氨基端-脑利钠肽原(NT-proBNP)，理论上两者是1∶1的关系。BNP是血管活性物质，NT-proBNP不具备生理功能。BNP经利钠肽受体、中性内肽酶(NEP)和其他未知机制清除，NT-proBNP清除机制尚不明了。

相对于BNP，NT-proBNP具有更长的血浆半衰期(60-120分钟)，BNP的血浆半衰期只有20分钟。NT-proBNP在血液中的分泌和存在具有累积作用，实际存在比BNP的浓度更高，更容易被检测到，即检测的敏感性提高，NT-proBNP更容易反映早期或者轻微心脏功能的变化。NT-proBNP具有更低的个体差异，不受个体生理性节律的影响。体外存放稳定性好，室温下可达3天，对标本运送、保存等非常重要。不受标本采集条件(卧、坐、运动后)限制，无论使用血清还是不同抗凝(肝素、EDTA)的血浆对测定结果都没有影响。另外，NT-proBNP与外源性BNP不存在交叉活性，使用BNP治疗时仍可用NT-proBNP监测治疗的效果。

NT-proBNP与临床心衰的严重程度成比例，心衰越严重，NT-proBNP就越高；而且NT-proBNP能够区分轻度心衰和心功能正常者。鉴于NT-proBNP优于BNP对心力衰竭的诊断特点，2000年左右，国际上已经认定是NT-proBNP测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。

通过非创伤影像技术(如超声心动图，胸部X线)只能对已发病患者进行心衰的诊断，不能对早期心衰进行预防和控制。而通过NT-proBNP的检测可以达到早期诊断的目的。

目前国内外已有商品化的NT-proBNP试剂盒，如美国罗氏生产的NT-proBNP免疫检测试剂盒通过了美国FDA得认证，用于对充血性心衰的辅助诊断，使用了电化学发光的方法，灵敏度和精密度，准确度都很好，但是试剂价格昂贵。国外另有一些公司生产的NT-proBNP试剂盒利用酶联免疫技术开发。国内一些公司的N端脑钠肽原检测试剂采用了胶体金的技术等，存在诸多缺点，如酶联免疫试剂不稳定，分辨率低，胶体金为定性检测或半定量检测等等。随着医学诊断技术向微量，高灵敏度，高特异性方向发展，酶联免疫，胶体金等技术已经出现不适应倾向。目前利用时间分辨技术开发的NT-proBNP试剂盒尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种成本相对较低的NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)配制NT-proBNP校准品：用小牛血清将NT-proBNP抗原纯品稀释成系列浓度，每瓶装1个浓度点，所述NT-proBNP抗原纯品的纯度≥80％；

2)制备NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板；

3)制备铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体；

4)配制洗涤液：取1.212g三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入氯化钠9g，加入吐温200.1mL，完全溶解；

5)配制增强液：取1000mL双蒸水，加入3.6mL冰醋酸，0.5g醋酸钠，0.002～0.01gβ-萘甲酰三氟丙酮，0.01～0.05g三辛基氧化膦，1～2mL Triton X-100，混匀；

6)配制分析缓冲液：取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入10g牛血清白蛋白，完全溶解。

优选的是NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板是用下述方法制成：将NT-proBNP单克隆抗体溶解于包被稀释液中，使其浓度为5ug/mL，加入微孔板中，使200μl/孔，37℃放置24小时，用包被稀释液250微升/孔洗板1次，再用质量百分浓度为2％牛血清白蛋白溶液封闭4小时，倒掉溶液，室温干燥，所述包被稀释液是用下述方法制成：取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入10g牛血清白蛋白，完全溶解，所述2％牛血清白蛋白溶液的溶剂为所述包被稀释液。

优选的是所述铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体是用下述方法制成：将50～100μg另一种NT-proBNP单克隆抗体溶于50μl 0.01M pH＝8.5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100μl双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在4℃反应12-18小时，将反应液转移到预先用0.05M pH＝7.8 Tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex G50柱上层析分离，以0.05M pH＝7.8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个峰，得到铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体。

用本发明的方法制备的试剂盒能定量检测人血清中NT-proBNP的含量，具有高灵敏，高特异，高通量，准确度高，性能稳定等特点。

附图说明

图1为实施例9所制备的试剂盒中的校准品线形图(双对数标准曲线)。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域的技术人员更全面的理解本发明，但并不以任何方式限制本发明。

本发明使用时间分辨荧光免疫分析法，其基本原理是：用三价镧系稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物质；当免疫反应发生后，根据镧系稀土离子螯合物的荧光光谱的特点(特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长)，用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。铕是镧系稀土元素中的一种，异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠是三价镧系稀土离子螯合物。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1 NT-proBNP校准品的制备

用小牛血清将NT-proBNP抗原(纯度≥80％)稀释成系列浓度，浓度分别是：0pg/mL，50pg/mL，100pg/mL，500pg/mL，1000pg/mL，5000pg/mL；共6瓶，每瓶装0.5mL，备用。

实施例2 NT-proBNP单克隆抗体包被微孔板的制备方法

配制包被稀释液：取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用0.1M盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入10g牛血清白蛋白，完全溶解，备用。

将NT-proBNP单克隆抗体溶解于包被稀释液中，使其浓度为5ug/mL，加入微孔板中，使200μl/孔，37℃放置24小时，用包被稀释液250微升/孔洗板1次，再用质量百分浓度为2％牛血清白蛋白溶液封闭4小时，倒掉溶液，室温干燥。2％牛血清白蛋白溶液的溶剂为所述包被稀释液。

实施例3铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体的制备方法

将80μg另一种NT-proBNP单克隆抗体溶于50μl 0.01M pH＝8.5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100μl双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在4℃反应14小时，将反应液转移到预先用0.05M pH＝7.8 Tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex G50柱上层析分离，以0.05M pH＝7.8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个大峰，得到铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体，加入防腐剂备用。实施例4铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体的制备方法

将50μg另一种NT-proBNP单克隆抗体溶于50μl 0.01M pH＝8.5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100μl双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在4℃反应12小时，将反应液转移到预先用0.05M pH＝7.8 Tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex G50柱上层析分离，以0.05M pH＝7.8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个大峰，得到铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体，加入防腐剂备用。实施例5铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体的制备方法

将100μg另一种NT-proBNP单克隆抗体溶于50μl 0.01M pH＝8.5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100μl双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在4℃反应18小时，将反应液转移到预先用0.05M pH＝7.8 Tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex G50柱上层析分离，以0.05M pH＝7.8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个大峰，得到铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体，加入防腐剂备用。

实施例6 NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒，由下述成分组成：

1)NT-proBNP校准品，制备方法同实施例1；

2)NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板，制备方法同实施例2；

3)铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体，制备方法同实施例3；

4)洗涤液，用下述方法制成：取1.212g三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入氯化钠9g，加入Tween200.1mL，完全溶解；

5)增强液，用下述方法制成：取1000mL双蒸水，加入3.6mL冰醋酸，0.5g醋酸钠，0.005gβ-萘甲酰三氟丙酮，0.03g三辛基氧化膦，1mL Triton X-100，混匀；

6)分析缓冲液，用下述方法制成：取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入10g牛血清白蛋白，完全溶解。

实施例7 NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)配制NT-proBNP校准品，同实施例1；

2)制备NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板，同实施例2；

3)制备铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体：同实施例4；

4)洗涤液的制备方法：取1.212g三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入氯化钠9g，加入Tween200.1mL，完全溶解；

5)增强液的制备方法：取1000mL双蒸水，加入3.6mL冰醋酸，0.5g醋酸钠，0.002gβ-萘甲酰三氟丙酮，0.01g三辛基氧化膦，2mL Triton X-100，混匀；

6)分析缓冲液的制备方法：取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入10g牛血清白蛋白，完全溶解。

实施例8NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)配制NT-proBNP校准品，同实施例1；

2)制备NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板，同实施例2；

3)制备铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体：同实施例5；

5)增强液的制备方法：取1000mL双蒸水，加入3.6mL冰醋酸，0.5g醋酸钠，0.002gβ-萘甲酰三氟丙酮，0.05g三辛基氧化膦，2mL Triton X-100，混匀；

实施例9本发明NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的使用方法

1、样本要求

每次检测至少需要120微升人血清样本。用静脉穿刺法采集静脉血，让其凝结，用离心法分离出血清。样品在+2℃到+8℃可以保存2天，如果需要长期保存，请将其置于-20℃，避免反复冻融。含有EDTA或柠檬酸盐的血清不能用来检测，因为它们对Eu元素具有螯合作用；含有肝素的血清对检测结果不产生影响；严重溶血的血清对测定结果有影响。

2、检测方法

2.1试剂的准备

铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体(标记物)的稀释

须在使用前半小时配制。每条反应孔需将15ul标记物和1.5mL的分析缓冲液混匀(按照

分析缓冲液∶标记物＝100∶1稀释)，备用。稀释后的标记物应在1小时内使用并一次用完。

2.2从密封袋中取出NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板，取下所需数量的微孔条，将其固定于支架上，余下的微孔条放入密封袋中。

2.3加样步骤如下：

(1)每孔加100μl的NT-proBNP校准品或样品，室温振荡孵育1小时。

(2)用洗涤液300μL/孔冲洗4次，轻轻拍干。

(3)加入100μl以分析缓冲液稀释的标记物，室温振荡孵育1小时。

(4)用洗涤液300μL/孔冲洗6次，轻轻拍干。

(5)每孔加增强液200μl。(加入增强液之前，吸头应使用增强液洗两次，加入过程中应避免碰到小孔边缘或其底部，以免产生污染)。

(6)室温振荡孵育5分钟后，用时间分辨荧光仪测量，测量前保证每个样品板条平稳地放到测量架中。

2.4以校准品浓度的Log值为横坐标，时间分辨荧光仪读数的Log值为纵坐标绘制标准曲线，以待测血清的读数在标准曲线上查出该血清中NT-proBNP的浓度。见图1。

实施例10本发明试剂盒的方法学鉴定

1、灵敏度

试剂盒的灵敏度不高于10pg/mL。

2、特异性

与其它相关物质无明显交叉反应。

3、测量范围

试剂盒的测量范围0-5000pg/mL。

4、线性相关系数

在试剂盒的测量范围内，剂量-反应曲线线性相关系数(r)应不低于0.99。

5、测定准确性

以NT-proBNP标准品为对照品，试剂盒校准品的实测效价与标定效价的比值应该在0.90～1.10之间。

6、测量精密度

试剂盒的批内不精密度(CV％)应不超过10.0％；批间不精密度(CV％)应不超过15.0％。

7、质控品测定值

质控品测定值应在允许范围内。

8、稳定性

将本发明试剂盒放置37℃±0.5℃7天后检测上述1～7各项，结果应符合各项目规定的要求。

Claims

1.NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

2)制备NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板；

3)制备铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体；

2.根据权利要求书1所述的制备方法，其特征在于所述NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板是用下述方法制成：将NT-proBNP单克隆抗体溶解于包被稀释液中，使其浓度为5ug/mL，加入微孔板中，使200μl/孔，37℃放置24小时，用包被稀释液250微升/孔洗板1次，再用质量百分浓度为2％牛血清白蛋白溶液封闭4小时，倒掉溶液，室温干燥，所述包被稀释液是用下述方法制成：取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入10g牛血清白蛋白，完全溶解，所述2％牛血清白蛋白溶液的溶剂为所述包被稀释液。

3.根据权利要求书1所述的制备方法，其特征在于所述铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体是用下述方法制成：将50～100μg另一种NT-proBNP单克隆抗体溶于50μl 0.01MpH＝8.5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100μl双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在4℃反应12-18小时，将反应液转移到预先用0.05M pH＝7.8Tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex 650柱上层析分离，以0.05M pH＝7.8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个峰，得到铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体。