CN105588941A - 一种检测肿瘤标志物dkk1 浓度的酶联免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒，由包被有型号为10C3的DKK1单克隆抗体1的多孔板、酶标记的型号为6E8的DKK1单克隆抗体2、显色底物和底物终止液组成；同时公开了上述酶联免疫试剂盒的制备方法及性能指标。本发明采用全国产化的试剂，制造了与大多数医院现有仪器相匹配的酶联免疫试剂盒，实现了对DKK1浓度极高灵敏、高特异和相对廉价的检测，有利于大规模地对肝细胞癌进行普查，尽早诊断，提高我国全民身体健康。

Description

一种检测肿瘤标志物DKK1 浓度的酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断技术领域，特别涉及一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒。

背景技术

在全世界范围内，肝细胞癌(HCC)是第六种最常见的恶性疾病和第三种与癌症相关的死因。而我国的肝细胞癌高风险人群，包括各种肝炎病毒长期携带者和肝硬化患者，高达1.5亿。肝细胞癌的5年总生存率仅为3-5％，这个极低的生存率的部分原因是因为缺乏一种及时和有效的诊断，导致在确诊肝细胞癌时已经有60-70％的患者错过了最佳治疗时机。

上海市肿瘤研究所发现的血清蛋白DKK1，是一个比现有肝细胞癌诊断标志物甲胎蛋白AFP性能更优秀的标志物。该所的研究结果显示，DKK1蛋白对肝细胞癌总体诊断的灵敏度为69.1％，特异度为90.6％；特别是对早期肝细胞癌和小肝癌的诊断灵敏度分别为70.9％和58.5％，特异性分别为90.5％和84.7％。另外，DKK1蛋白能够弥补AFP对肝细胞癌诊断能力的不足，对甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断灵敏度为70.4％、特异度为90％。同时，DKK1蛋白与AFP联合应用，可将肝细胞癌总体诊断率提高至88％。因此迫切需要发展一种能够快速、准确和相对廉价地检测DKK1蛋白的方法和产品，以便大规模地对肝细胞癌进行普查，尽早诊断，提高患者的生存率和全民身体健康。

对血清中DKK1浓度的检测主要采用针对DKK1的抗体，利用抗原-抗体的特异性反应，再加上特定的显色基团对反应量进行测量。而不同的显色基团和抗原-抗体反应的载体决定了每种检测方法的优缺点。目前国内并没有一种能够高灵敏、高特异和相对廉价地检测血清DKK1蛋白的方法和试剂盒。中国专利CN101398433公布了一种基于时间分辨荧光免疫分析方法的试剂盒，该方法需要用到大多数医院并不配备的时间分辨荧光免疫分析仪，并且该方法还需要用到较为昂贵的荧光标记物，不利于对DKK1的大规模普查。中国专利CN102507951公布了一种联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，由包被有神经元特异性烯醇化物酶(NSE)、细胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)和Dkkopf1(DKK1)单克隆抗体的多孔板，辣根过氧化物酶标的NSE、CYFRA21-1和DKK1，显色底物TMB和底物终止液组成；所述多孔板每孔包被NSE单克隆抗体1-4ug/ml；每孔包被CYFRA21-1单克隆抗体1-2ug/ml；每孔包被DKK1单克隆抗体1-2ug/ml；NSE、CYFRA21-1、DKK1三种检测性抗体按4:4:2比例加入多孔板孔中，总体积为100ul；该发明公布的试剂盒虽然可以同时检测两种或三种肿瘤相关抗原，但由于分散了每种抗原的检测精度及灵敏性，且针对DKK1抗原的检测仅采用了一种DKK1抗体，因而针对DKK1抗原的检测精度难以满足对肿瘤的快速、准确的检测。此外，国外虽然有检测DKK1蛋白的酶联免疫试剂盒(货号DKK100，R&DSystems公司，美国)，但是其价格昂贵(～￥6000/试剂盒)，不利于我国众多肝细胞癌高风险人群对DKK1大规模普查的需求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒，以匹配自动分析系统实现快速、准确和相对廉价地用于大规模临床检验肿瘤标志物DKK1。

本发明的另一目的在于提供一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒的制备方法及应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒，由包被有DKK1单克隆抗体1的多孔板、酶标记的DKK1单克隆抗体2、显色底物和底物终止液组成；其中，DKK1单克隆抗体1为10C3；DKK1单克隆抗体2为6E8；此处基于双抗体夹心法的原理，包被抗体和检测抗体选用不同抗体。本发明总共测试了8个不同的DKK1单克隆抗体，每两两配对为包被抗体和检测抗体，然后根据每组配对的灵敏性和特异性，选定我司与上海锐劲生物技术有限公司合作生产的灵敏性和特异性均优的10C3和6E8分别为包被抗体和检测抗体。

其中，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2的保护液由pH＝7.2的10mM磷酸盐缓冲液、0.5％的牛血清白蛋白、0.01％的硫柳汞和50％甘油组成。

其中，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2的存贮条件为-20℃，且浓度大于100ug/ml。

其中，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2的工作浓度稀释倍数为1:100-1:2500，优选1：400。

其中，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2所采用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)，但不仅限于HRP，以满足优异的酶标记效果为佳。

基于上述结构的酶联免疫试剂盒，本发明又提供了一种用于上述检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒的制备方法，包括如下步骤：①制备包被有DKK1单克隆抗体1的多孔板：用pH＝7-8的磷酸缓冲液将DKK1单克隆抗体1稀释，然后将稀释后的DKK1单克隆抗体1溶液加入到多孔板的孔中，37℃孵育2小时；包被后用磷酸盐缓冲液洗板拍干；用5％牛血清白蛋白溶液加入到多孔板各孔，37℃封闭1小时；封闭后用磷酸盐缓冲液洗板拍干，将其保存于4℃。②制备酶标记的DKK1单克隆抗体2：将5mg/ml的HRP(辣根过氧化物酶)加入0.2ml的0.1M高碘酸钠NaIO4溶液中，室温避光搅拌20分钟；将上述溶液对1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液4℃透析过夜；透析后，加20μl0.2MpH9.5的碳酸盐缓冲液，然后立即加入10mgDKK1单克隆抗体2，室温避光搅拌2小时；加入0.1ml新配的4mg/mlNaBH4溶液，混匀，4℃放置2小时；将上述溶液对10mMpH7.2PBS缓冲液4℃透析过夜；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1小时；3000rpm离心半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量10mMpH7.2的PBS中；将上述溶液对酶标抗体保护液4℃透析过夜，10000rpm离心30分钟去除沉淀后分装冷冻保存。

通过上述技术方案，本发明提供的一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒，采用全国产化的试剂，包括优质的DKK1单克隆抗体1及DKK1单克隆抗体2(两种抗体均采购至上海锐劲生物技术有限公司，其中DKK1单克隆抗体1的型号为10C3，DKK1单克隆抗体2的型号为6E8)，制造了与大多数医院现有仪器相匹配的酶联免疫试剂盒，实现了对DKK1浓度极高灵敏、高特异和相对廉价的检测，有利于大规模地对肝细胞癌进行普查，尽早诊断，提高我国全民身体健康。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例所公开的酶联免疫法检测DKK1的原理示意图；

图2为本发明实施例所公开的本发明与进口试剂盒的相关性示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明中的抗体来源说明：作为包被抗体的DKK1单克隆抗体1为采购至上海锐劲生物技术有限公司的型号为10C3的抗体，DKK1单克隆抗体2为采购至上海锐劲生物技术有限公司的型号为6E8的抗体。

实施例1：

基于图1所示的酶联免疫法检测DKK1的原理示意图，本发明提供了一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒，由包被有DKK1单克隆抗体1的多孔板、酶标记的DKK1单克隆抗体2、显色底物(TMB)和底物终止液组成；其中，DKK1单克隆抗体1为10C3；DKK1单克隆抗体2为6E8；其中，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2的保护液由pH＝7.2的10mM磷酸盐缓冲液、0.5％的牛血清白蛋白、0.01％的硫柳汞和50％甘油组成；所述酶标记的DKK1单克隆抗体2的存贮条件为-20℃，且浓度大于100ug/ml；酶标记的DKK1单克隆抗体2的工作浓度稀释倍数为1：400，酶标记的DKK1单克隆抗体2所采用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)。

实施例2：

一种用于检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒的制备方法，具体包括如下步骤：

①制备包被有DKK1单克隆抗体1的多孔板：用pH＝7-8的磷酸缓冲液将DKK1单克隆抗体1稀释，然后将稀释后的DKK1单克隆抗体1溶液加入到多孔板的孔中，37℃孵育2小时；包被后用磷酸盐缓冲液洗板拍干；用5％牛血清白蛋白溶液加入到多孔板各孔，37℃封闭1小时；封闭后用磷酸盐缓冲液洗板拍干，将其保存于4℃。②制备酶标记的DKK1单克隆抗体2：将5mg/ml的HRP(辣根过氧化物酶)加入0.2ml的0.1M高碘酸钠NaIO4溶液中，室温避光搅拌20分钟；将上述溶液对1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液4℃透析过夜；透析后，加20μl0.2MpH9.5的碳酸盐缓冲液，然后立即加入10mgDKK1单克隆抗体2，室温避光搅拌2小时；加入0.1ml新配的4mg/mlNaBH4溶液，混匀，4℃放置2小时；将上述溶液对10mMpH7.2PBS缓冲液4℃透析过夜；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1小时；3000rpm离心半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量10mMpH7.2的PBS中；将上述溶液对酶标抗体保护液4℃透析过夜，10000rpm离心30分钟去除沉淀后分装冷冻保存。

实施例3：

本发明对DKK1的极高灵敏度检测：将DKK1标准品做梯度稀释，即0.0125ng/ml、0.0625ng/ml、0.03125ng/ml、0.015625ng/ml……用本试剂盒测量其吸光值5次，并计算平均值和标准差。同时测量DKK1零参考标准品5次，计算其吸光均值和标准差。用“t检验”检验稀释标准品与零参考标准品的之间显著差异性，结果见表1。经测定本发明对DKK1的检测极限小于0.015625ng/ml(p<0.01)。

表1

浓度(ng/ml)	1	2	3	4	5	均值(ng/ml)	标准差
								0.125	0.116	0.123	0.115	0.119	0.124	0.1194	0.004037
0.0625	0.094	0.087	0.086	0.084	0.091	0.0884	0.004037
								0.03125	0.06	0.057	0.06	0.063	0.065	0.061	0.003082
0.015625	0.054	0.044	0.051	0.05	0.057	0.0512	0.004868
								0	0.028	0.036	0.043	0.039	0.035	0.0362	0.005541

实施例4：

本发明对DKK1的高特异度检测：将同源蛋白DKK2、DKK3、DKK4、DKKL1和DKK1梯度稀释至相同浓度，用本试剂盒进行测定，结果见表2。此结果表明，本发明能够高特异度地测定DKK1。

表2

	DKKL1	DKK2	DKK3	DKK4	DKK1	浓度
							A	0.094	0.09	0.089	0.088	3.004	4ng/ml
B	0.089	0.089	0.083	0.082	2.265	2ng/ml
							C	0.106	0.105	0.107	0.113	1.636	1ng/ml
D	0.096	0.093	0.092	0.089	0.995	0.5ng/ml
							E	0.094	0.093	0.089	0.088	0.612	0.25ng/ml
F	0.111	0.109	0.105	0.103	0.384	0.125ng/ml
							G	0.105	0.108	0.101	0.106	0.201	0.0625ng/ml
H	0.102	0.104	0.102	0.098	0.081	空白

实施例5：

准确度测试：采用回收法评价本发明的准确性，选择合适浓度的血清样本，分成体积相同的3份，在其中2份加入不同浓度的待回收DKK1标准蛋白，制成不同加入浓度的待回收分析样本；在另一份血清中加入相同体积的无待测物的溶剂，制成基础样本；分别测定和计算基础样本和待回收分析样本中DKK1的浓度，结果见表3；

表3

	测定浓度ng/ml	加入浓度ng/ml	回收浓度ng/ml	回收率％
					基础样本	8.72	\	\	\
分析样本1	14.61	5.0	5.89	117.8
					分析样本2	18.36	10.0	9.64	96.4

其中：平均回收率＝(117.8％+96.4％)/2＝107.1％。

实施例6：

精密度(批内差)测试：选取高、中、低3份不同浓度的DKK1标准品，用同一批次的试剂盒进行测定，每份标准品分别测定10次，结果见表4。此结果表明，本发明的批内差小于15％，与进口试剂盒(货号DKK100，R&DSystems公司，美国)的批内差相当。

表4

实施例7：

稳定性测试：将本发明试剂盒存放于37℃环境中保存，定期对不同浓度DKK1标准品进行检测，结果见表5。将本发明的酶标抗体放于37℃环境中保存，定期对不同浓度DKK1标准品进行检测，结果见表6。常认为在37℃存放一天相当于4-10℃存放1.5个月，此结果表明，本发明试剂盒在37℃恒温下保持9天，对各浓度的DKK1标准品测量均无显著变化，相当于可在4℃恒温下保存13.5个月以上；本发明的酶标抗体在37℃恒温下保持6天，对各浓度的DKK1标准品测量均无显著变化，相当于可在4℃恒温下保存9个月以上。

表5

表6

实施例8：

本发明与进口试剂盒的相关性测试：将本试剂盒与进口试剂盒(货号DKK100，R&DSystems公司，美国)同时对348份血清进行定量测定，结果见图2。此结果表明，本发明与进口试剂盒的测定值高度相关(r＝0.903，p<0.0001)，可以替代进口试剂盒。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒，其特征在于，由包被有DKK1单克隆抗体1的多孔板、酶标记的DKK1单克隆抗体2、显色底物和底物终止液组成；其中，DKK1单克隆抗体1为10C3；DKK1单克隆抗体2为6E8。

2.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2的保护液由pH＝7.2的10mM磷酸盐缓冲液、0.5％的牛血清白蛋白、0.01％的硫柳汞和50％甘油组成。

3.根据权利要求2所述的一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2的存贮条件为-20℃，且浓度大于100ug/ml。

4.根据权利要求3所述的一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2的工作浓度稀释倍数为1:500-1:2500。

5.根据权利要求1至4任一项所述的一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：①制备包被有DKK1单克隆抗体1的多孔板：用pH＝7-8的磷酸缓冲液将DKK1单克隆抗体1稀释后加入到多孔板的孔中，37℃孵育2小时进行包被；包被后用磷酸盐缓冲液洗板拍干；用5％牛血清白蛋白溶液37℃封闭1小时；封闭后用磷酸盐缓冲液洗板拍干，将其保存于4℃；②制备酶标记的DKK1单克隆抗体2：用高碘酸钠NaIO₄将酶表面的糖分子氧化成醛基；醛化后的酶再与DKK1单克隆抗体2上的氨基相反应，形成Schiff碱；并进一步用NaBH₄还原生成稳定的酶标记检测单克隆抗体；酶标后的抗体通过硫酸铵沉淀进行纯化，最后对保护液进行低温透析以便长期贮存待用。