CN105277690A - 全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒及方法,试剂盒包括生物素化抗原、磁分离试剂、碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、发光底物、校准品、质控品和清洗液,生物素化抗原为偶联有生物素的PR3抗原,磁分离试剂为表面具有亲和素活性基团的磁微粒悬浮液,发光底物为碱性磷酸酶的化学发光底物,采用此试剂盒对抗蛋白酶3抗体IgG进行全自动测定。通过上述方式,本发明是一种独立的、单人份的、一次性的用于磁微粒化学发光检测抗蛋白酶3抗体IgG的分析方法。通过这种方法可以更方便快捷的根据检测项目的使用需要进行相关的免疫学检测,为临床应用提供了更好的依据。
Description
技术领域
本发明涉及磁微粒化学发光免疫诊断技术领域,特别是涉及一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒及方法。
背景技术
蛋白酶3(Proteinase3,PR3)是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋白酶,分子量约为29KDa的糖蛋白。PR3能降解多种细胞外基质如弹性蛋白、血红蛋白、IV型胶原等多种组织成分。此外,蛋白酶3通过组织蛋白酶G促进血小板活化,并使C1抑制剂失活。
ANCA产生的荧光模式包括胞浆型(cANCA)、核周型(pANCA)。抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophilcytoplasmicantibodies.ANCA)是目前用于诊断原发性小血管炎最重要的血清学检测指标,蛋白酶3是cANCA的主要靶抗原在间接免疫荧光法检测用乙醇固定的中性粒细胞呈cANCA荧光模式,约占C-ANCA的80%~90%。
韦格纳肉芽肿(Wegener′sgranulomatosis,WG)是一种特殊类型的坏死性肉芽肿性血管炎。其临床的复杂性和诊治的困难性一直是困扰风湿病专科医师的问题。WG的诊断主要依据临床症状,而临床表现复杂多样、因人而异。抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是对WG最有诊断意义的自身抗体。
过去WG的诊断主要是根据典型的临床表现和病史,但有些患者,尤其是限局性的患者很难诊断,病检是确诊WG的重要手段。但一次或单部位病检阴性并不能排除WG。目前的研究认为大部分WG患者的ANCA特异性靶抗原是PR3,抗PR3抗体与WG的诊断和疾病活动密切相关。胞浆型ANCA(cytoplasmicANCA,cANCA)和抗PR3抗体对WG诊断意义有高度的敏感性和特异性。国外报道在活检证实为WG的患者中,抗PR3抗体特异性为90%以上。敏感性是与疾病的活动性有关。通常抗PR3抗体滴度与疾病活动一致,活动性WG患者在病变尚未影响到呼吸系统时抗PR3抗体敏感性是65%,当患者出现呼吸系统、肾脏损害时其灵敏度达90%以上。活动期滴度较高,部分缓解期滴度很低,完全缓解的患者多数测不到。缓解期抗PR3抗体滴度的升高可能预示着复发,并且有助于将感染和复发区分开。
对于此病的检测方法主要为间接免疫荧光法和酶联免疫吸附法,但这些方法都存在着不足之处。
一、间接免疫荧光法:该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后,继用间接荧光抗体,与前面的抗原抗体复合物结合,形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下,根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。该方法评价:由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多,发出的荧光亮度强,因而其敏感性强。但是其不足也是明显的:
(1)运用此法可能出现假阳性。
(2)在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别。
(3)操作相对复杂,需要价格较昂贵的荧光显微镜,在很多基层医院难以推广,也不太适用于标本量较多的实验室。
(4)荧光测定中的本底较高,荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。
(5)结果判定需要有经验的专业人员,分析结果的客观性不足。
二、酶联免疫吸附法:ELISA检测抗PR3抗体,简便易行,特异性高,与间接免疫荧光法联合检测,可为临床对WG的诊断和治疗提供更为客观的实验依据。但与其他生物检测或免疫检测比较,这种ELISA检测方法、技术、工具或产品仍有较多的不足而使其应用受限,这些不足主要包括以下几个方面:
(1)检测试剂在检测过程中为开放方式,容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果;
(2)ELISA方法多采用辣根过氧化物酶进行检测,其检测范围和灵敏度都较低。
(3)ELISA方法的检测时间通常反应是一件较长,完成一个测试所需的总时间一般在2个小时以上,不能完全满足临床上的快速诊断的需求。
(4)通常ELISA方法所用的试剂较多,通常在11种试剂左右,在临床检查过程中,极易出现试剂混用造成结果判读无效的情况。
通常测定蛋白酶3抗体IgG的方法为酶联免疫分析法,此方法采用的是辣根过氧化物酶系统,将待测样品中的待测抗蛋白酶3抗体IgG与高度纯化的人蛋白酶3抗原进行反应而形成第一免疫络合物,该第一免疫络合物与酶标记的第二抗体进行反应形成第二免疫络合物,将反应形成的第二络合物与显色底物进行显色对比分析,从而获得待测抗蛋白酶3抗体IgG的含量。本方法采用的辣根过氧化物酶的灵敏度相比某些酶的灵敏度低10倍左右,而且酶联免疫检测方法的反应时间较长,通常完成一个测试大概在2个小时左右。实验中操作比较繁琐。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒及方法,其节省时间、灵敏度高、结果准确、实现全自动测定。
为解决上述技术问题,本发明采用的一个技术方案是:提供一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒,包括生物素化抗原、磁分离试剂、碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、发光底物、抗PR3抗体校准品、抗PR3抗体质控品和清洗液,所述生物素化抗原为偶联有生物素的PR3抗原,所述磁分离试剂为表面具有亲和素活性基团的磁微粒悬浮液,所述发光底物为碱性磷酸酶的化学发光底物。
在本发明一个较佳实施例中,所述磁分离试剂的磁微粒的直径为0.1-0.5μm;所述磁分离试剂为磁珠原液用磷酸盐缓冲液洗涤后稀释浓度为0.4μg/mL。
在本发明一个较佳实施例中,所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体为将碱性磷酸酶与抗人IgG抗体偶联,用MES缓冲液稀释浓度为0.1μg/mL。
在本发明一个较佳实施例中,所述发光底物为AMPPD溶液。
提供一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的检测方法,包括步骤为:(1)往反应杯中依次加入生物素化抗原、磁分离试剂和血清样本进行孵育,再用清洗液在磁场作用下清洗;(2)往步骤(1)清洗后的反应杯中加入碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体孵育,再用清洗液在磁场作用下清洗;(3)往步骤(2)清洗后的反应杯中加入发光底物孵育,检测发光信号值,并通过拟合曲线计算血清样本中抗PR3抗体IgG的浓度。
在本发明一个较佳实施例中,所述生物素化抗原、所述磁分离试剂、所述血清样本、所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、所述发光底物的加入体积比为:5:5:2:13:18。
在本发明一个较佳实施例中,步骤(1)中所述血清样本与稀释液按照体积比1:19进行混合稀释。
在本发明一个较佳实施例中,步骤(1)中所述孵育是在37℃下温育15min,步骤(2)所述孵育是在37℃下温育15min,步骤(3)中所述孵育是在37℃下温育5min。
在本发明一个较佳实施例中,所述检测方法采用碱性磷酸酶系统,为全自动化检测。
本发明的有益效果是:本发明基于磁微粒化学发光检测的原理来实现抗蛋白酶3抗体IgG的免疫检测的方法,是一种独立的、单人份的、一次性的用于磁微粒化学发光检测抗蛋白酶3抗体IgG的分析方法。通过这种方法可以更方便快捷的根据检测项目的使用需要进行相关的免疫学检测,为临床应用提供了更好的依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图,其中:
图1是本发明中用试剂盒测定的样本浓度与样本理论浓度得到的回归曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一:
提供一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒,包括生物素化抗原、磁分离试剂、碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、发光底物、抗PR3抗体校准品、抗PR3抗体质控品和清洗液。
所述生物素化抗原试剂为将生物素与PR3抗原表面的-NH2反应得到。
所述磁分离试剂为表面具有亲和素活性基团的磁微粒悬浮液,所述磁微粒的直径为0.1-0.5μm,具有超顺磁性,表面含有亲和素基团。制备过程为将一定浓度的磁珠原液用0.01M的PBS缓冲液洗涤三次,在按照1:5比例稀释成0.4μg/mL的工作液浓度。
所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体为将碱性磷酸酶与抗人IgG抗体偶联,50mM的MES缓冲液稀释为0.1μg/mL的工作浓度。
所述发光底物为碱性磷酸酶催化发光底物AMPPD溶液。
所述质控品和校准品为:选取经灭活的人血清,用稀释液按一定比例稀释而成,所述校准品由含有抗PR3抗体的人血清配制而成,用于校准曲线,所述质控品由含有抗PR3抗体的人血清配制而成。所述清洗液由清洗浓缩液配制而成。
实施例二:
提供一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的检测方法,包括步骤为:
(1)在反应杯中,加入50μL生物素化抗原。
(2)在反应杯中,加入50μL表面具有亲和素活性基团的磁微粒悬浮液。
(3)在反应杯中,加入20μL稀释后的样本(样本按照1:20稀释,即50样本加入到950μL磷酸缓冲液中),在37℃孵育盘中温育15min。
(4)反应杯在清洗盘中,在磁场的作用下,加入500μL清洗液,清洗3次。
(5)在反应杯中加入130μL碱性磷酸酶标记抗人IgG抗体,在恒温孵育盘中温育15min。。
(6)在清洗盘中,使用清洗液500ul清洗反应杯3次。
(7)在反应杯中加入180μL反应底物,孵育盘中温育5min。
(8)在信号检测盘中检测信号值,并通过拟合曲线,计算血清样本中抗PR3抗体IgG的浓度。
所述抗PR3抗体磁分离化学发光免疫检测的工作原理是:本试剂盒采用磁微粒化学发光免疫分析法,利用间接法原理,通过免疫分析两步法实现对样本的检测。
将生物素标记的PR3抗原分别与待测样本中特异性IgG抗体(也包括IgA和IgM)及包被有链霉亲和素(SA)的磁微粒混合;经洗涤后加入酶标记抗人IgG二抗,形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物,通过洗涤,未被结合的酶标抗体以及其它物质被去除。加入发光底物,酶标抗体上的酶催化发光底物发射光子。使用仪器测量这些光子,光子的数量与样本中特异性的抗体的含量成正比。
本发明采用了全自动的测定方法,在临床检测中,从样本稀释到信号检测实现了全自动化,只需要对相关软件进行设置和相关试剂进行放置即可。本发明采用的是碱性磷酸酶系统,大大提高了检测灵敏度,同时由于本发明采用的是全自动磁微粒化学发光检测方法,具有稳定性好、灵敏度高、重复性好等优点。同时大大缩短了检测时间,而且简易方便,完成一个测试所需的总时间在50分钟以内,实现了检测全自动化。
实施例三:
本发明中所述试剂盒的性能评估:
(1)阴、阳性复合率:本发明试剂盒对214例血清进行临床检测,并与国外知名公司进口试剂盒进行临床比对,比对结果见下表。说明本试剂盒临床符合率高。
(2)灵敏度:本检测试剂盒的LOD为0.162RU/mL,而酶联免疫法的灵敏度为1RU/mL。
(3)线性:将一份高值血清按照一定比例稀释,比例为:1/2、1/8、1/20、1/80、1/200,用试剂盒检测稀释样本,以稀释比例和检测浓度做回归曲线。求出相关系数R,R=0.99906,以理论浓度和实际测定浓度做回归曲线见图1。
(4)准确度:通过加样回收评估其准确度。以一份高值血清、一份中值血清、一份低值血清按照1:9添加到两份基础血清中,计算其浓度。血清加样回收率在85%-115%之间。加样回收率=添加后样板值/(0.1*样本A+0.9样本B)*100%。
(5)精密度:对三种浓度的质控品进行检测,每种才测定80次,计算变异系数,结果表明变异系数在10%以内。
(6)稳定性:将试剂盒37℃放置7天后,测定高、中、低,结果在质控范围内。表明试剂盒稳定好,复合临床要求。
(7)特异性:对高、中、低不同浓度值的血清添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、类风湿因子、脂、RF、HAMA检测结果显示,添加物质对本试剂盒检测结果没有影响。
本发明的有益效果是:
一、此种方法的总反应时间为50min,相比ELISA节约时间;
二、此种方法采用的是碱性磷酸酶系统,相比辣根过氧化物酶系统的灵敏度高10倍;
三、采用全自动磁微粒化学发光法,结果准确,相比免疫荧光不会出现结果误读;
四、全自动磁微粒化学发光的反应步骤相比ELISA的反应步骤要精简,而且实现了全自动化。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其它相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒,其特征在于,包括生物素化抗原、磁分离试剂、碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、发光底物、抗PR3抗体校准品、抗PR3抗体质控品和清洗液,所述生物素化抗原为偶联有生物素的PR3抗原,所述磁分离试剂为表面具有亲和素活性基团的磁微粒悬浮液,所述发光底物为碱性磷酸酶的化学发光底物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述磁分离试剂的磁微粒的直径为0.1-0.5μm;所述磁分离试剂为磁珠原液用磷酸盐缓冲液洗涤后稀释浓度为0.4μg/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体为将碱性磷酸酶与抗人IgG抗体偶联,用MES缓冲液稀释浓度为0.1μg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述发光底物为AMPPD溶液。
5.一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的检测方法,其特征在于,包括步骤为:(1)往反应杯中依次加入生物素化抗原、磁分离试剂和血清样本进行孵育,再用清洗液在磁场作用下清洗;(2)往步骤(1)清洗后的反应杯中加入碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体孵育,再用清洗液在磁场作用下清洗;(3)往步骤(2)清洗后的反应杯中加入发光底物孵育,检测发光信号值,并通过拟合曲线计算血清样本中抗PR3抗体IgG的浓度。
6.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于,所述生物素化抗原、所述磁分离试剂、所述血清样本、所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、所述发光底物的加入体积比为:5:5:2:13:18。
7.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于,步骤(1)中所述血清样本与稀释液按照体积比1:19进行混合稀释。
8.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于,步骤(1)中所述孵育是在37℃下温育15min,步骤(2)所述孵育是在37℃下温育15min,步骤(3)中所述孵育是在37℃下温育5min。
9.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于,所述检测方法采用碱性磷酸酶系统,为全自动化检测。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160127 |