CN113969272B

CN113969272B - 一种突变型蛋白酶3和生物素的偶联物及其制备方法及应用

Info

Publication number: CN113969272B
Application number: CN202111440398.7A
Authority: CN
Inventors: 向乾银; 陈蕊; 于婷; 李伟甲; 秦枫; 赵婷; 王健; 孙雅静; 向雪花; 胡江鸿
Original assignee: Suzhou Lianchuang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Lianchuang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2041-11-30
Also published as: CN113969272A

Abstract

本发明提供一种突变型蛋白酶3和生物素的偶联物及其制备方法及应用。所述的突变型蛋白酶3的氨基酸序列的36位点、48位点或74位点的氨基酸突变为带有叠氮基团和炔基中的一者的非天然氨基酸，所述的生物素为具有炔基或叠氮基团中的另一者的生物素衍生物，所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物由所述的非天然氨基酸和所述的生物素衍生物发生点击化学反应而得。本发明可操作性强，反应效率高，条件温和，在提高了生物素标记效率的同时，增强了抗原抗体结合的反应性，提高了抗蛋白酶3抗体检测的灵敏度和准确性，在临床应用中具有广阔前景。

Description

一种突变型蛋白酶3和生物素的偶联物及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及一种突变型蛋白酶3和生物素的偶联物及其制备方法及应用。

背景技术

蛋白酶3(PR3)是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋白酶，分子量约为29Ka的糖蛋白。PR3能降解多种细胞外基质如弹性蛋白、血红蛋白、Ⅳ型或Ⅴ型胶原等多种组织成分。蛋白酶3还能通过组织蛋白酶G促进血小板活化，并使C抑制剂失活。PR3抗体是韦格拉肉芽肿病(恥G)的特异性抗体。尽管其发病机制不清，但是抗PR3抗体与韦格拉肉芽肿病发病机制具有一定的相关性。另外，PR3抗体浓度与其他疾病活性密切相关，可见于原发性系统性脉管炎、慢性炎性肠炎、感染(如HV和其他疾病。韦格纳肉芽肿患者经治疗病情稳定后，该抗体浓度可下降，常被作为判断疗效、估计复发的指标，从而指导临床治疗。PR3抗体对呼吸道有亲和性，致上下呼吸道坏死，肉芽肿形成。此外，蛋白酶3抗体(抗-PR3)在血管炎的发病中也起着重要作用，蛋白酶3抗体(抗-PR3)的检测结果在原发性小血管炎患者检测中具备较高的临床价值。

随着检测技术的发展，间接化学发光检测法已成为抗蛋白酶3抗体主要的检测手段。该方法的关键是将蛋白酶3偶联至纳米磁微粒，用于捕获样本中的抗蛋白酶3抗体。

在现有的技术中，将带有活性基团的磁珠与蛋白酶3表面的游离基团(-NH₂或-COOH)反应，获得包被了蛋白酶3的纳米磁微粒。由于蛋白酶3表面存在较多游离-NH₂或-COOH，因此蛋白酶3与磁微粒的偶联位点及摩尔比不能确定，一个蛋白分子可结合多个磁微粒，这些磁微粒可能直接与抗原表位结合或是在空间上遮蔽抗原表位，最终影响抗原抗体结合效果，降低检测信号值，导致试剂盒灵敏度不足，阳性率低的缺点，存在漏检或误检等风险。

利用叠氮和炔基的点击化学反应在生物分子体系中进行修饰是近年来研究的热门领域。CN112147335A专利公开了一种基于点击化学的标记配体组合物，其通过叠氮基团与叠氮反应基团之间的点击化学反应实现蛋白偶联标记。该专利选用表面带有羧基、氨基和巯基等其他具有化学活性的功能基团的蛋白，通过这些功能基团与提供叠氮反应基团或叠氮基团的第一点击化学试剂偶联，其蛋白表面将会偶联较多叠氮反应基团或叠氮基团，因此无法实现定点标记，还可能会遮蔽蛋白的抗原表位，影响抗原抗体结合能力，而由于蛋白表面与多个叠氮基团或叠氮反应基团结合，因此在与磁珠偶联时，一个蛋白分子可能结合多个链霉亲和素磁珠，同样会导致抗原表位被遮蔽，且提高了制备成本。另外，采用化学反应将点击化学试剂与目的蛋白偶联的步骤较多，耗时较长，影响蛋白活性，甚至导致蛋白变性。因此，该方法不适合蛋白酶3与生物素的偶联。

因此，亟需开发一种能够避免偶联过程中生物素遮蔽蛋白酶3的抗原表位，能够简化传统生物素标记抗原蛋白过程，具有较高的抗体结合能力，并且可明显提高抗体体外检测的灵敏度和准确性的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗体结合能力好、可明显提高抗体体外检测的灵敏度和准确性的突变型蛋白酶3和生物素的定点偶联物。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种突变型蛋白酶3和生物素的偶联物，所述的突变型蛋白酶3的氨基酸序列的36位点、48位点或74位点的氨基酸为带有叠氮基团和炔基中的一者的非天然氨基酸，所述的生物素为具有炔基或叠氮基团中的另一者的生物素衍生物，所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物通过炔基和叠氮基团之间形成的化学键相连。

优选地，所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物通过炔基和叠氮基团成环相连。

优选地，所述的非天然氨基酸为侧链带有叠氮基或炔基的苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、精氨酸衍生物、赖氨酸衍生物。

优选地，所述的生物素衍生物为分子量为400～500，臂长为的长臂生物素的衍生物。

进一步优选地，所述的生物素衍生物为分子量为420～480。

根据一些具体实施方式，所述的生物素衍生物为分子量为457.6，臂长为的长臂生物素的衍生物。

优选地，所述的非天然氨基酸带有叠氮基团，所述的生物素衍生物为带有炔基的生物素衍生物。

进一步地，所述的非天然氨基酸为

进一步地，所述的生物素衍生物为

本发明第二方面还提供一种所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物的制备方法，所述的突变型蛋白酶3和所述的生物素衍生物在硫酸铜存在的条件下进行点击化学反应，然后使用乙二胺四乙酸终止反应，得到所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物。

优选地，所述的点击化学反应在中性PBS缓冲液中进行。

优选地，所述的点击化学反应的反应温度为2～6℃。

优选地，所述的突变型蛋白酶3在反应体系中的初始浓度为4～8mM。

优选地，所述的生物素衍生物在反应体系中的初始浓度为12～18mM。

优选地，所述的硫酸铜在反应体系中的浓度为0.8～1.5mM。

优选地，所述的乙二胺四乙酸在反应体系中的浓度为0.8～1.5mM。

具体地，所述的制备方法还包括利用正交tRNA及氨酰tRNA合成酶蛋白质翻译系统将所述的非天然氨基酸定点插入蛋白酶3肽链中得到所述的突变型蛋白酶3。

本发明第三方面还提供一种磁微粒化学发光检测试剂，所述的磁微粒化学发光检测试剂为所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物包被的链霉亲和素磁珠。

优选地，将所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物与所述的链霉亲和素磁珠在中性PBS缓冲液中于20～45℃下反应得到所述的磁微粒化学发光检测试剂。

本发明第四方面还提供一种用于检测蛋白酶3抗体的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物或所述的磁微粒化学发光检测试剂。

本发明第五方面还提供一种所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物或所述的磁微粒化学发光检测试剂或所述的试剂盒在蛋白酶3抗体检测中的应用。

本发明中的含有非天然氨基酸的抗原蛋白通过炔基和叠氮基团与生物素定点偶联，避免生物素对蛋白表面多个氨基酸进行修饰影响抗原表位。

叠氮或炔基生物素与定点突变后的蛋白质在含有Cu⁺的温和条件下发生点击化学反应，实现生物素定点修饰，并且反应条件温和，操作简单。

本发明中所用的生物素衍生物为长臂生物素，增加了磁珠与抗原的距离，进一步降低了磁珠对抗原的空间位阻，提高抗原蛋白稳定性、链霉亲和素与生物素结合效率以及抗原抗体反应性。

本发明与现有技术相比具有如下优势：

本发明通过非天然氨基点突变的蛋白酶3与生物素衍生物发生点击化学反应，将生物素衍生物与点突变的蛋白酶3定点偶联，得到的生物素衍生物修饰的抗原蛋白只能结合一个链霉亲和素磁珠，并且位置固定，避免了磁珠遮蔽抗原蛋白的抗原表位；我们发现蛋白酶3分子表面的3个氨基酸残基位点(36R、48H、74R)进行点突变，能够显著提高抗蛋白酶3抗体检测性能。本发明可操作性强，反应效率高，条件温和，在提高了生物素标记效率的同时，增强了抗原抗体结合的反应性，提高了抗蛋白酶3抗体检测的灵敏度和准确性，在临床应用中具有广阔前景。

附图说明

附图1为实施例中的突变型蛋白酶3的结构示意图；

附图2为蛋白酶3的突变位点及抗原表位示意图；

附图3为实施例1和对比例1的磁微粒化学发光检测试剂在4℃条件下的稳定性实验结果示意图；

附图4为实施例1和对比例1的磁微粒化学发光检测试剂在37℃条件下的稳定性实验结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

现有技术中生物素修饰抗原蛋白的位点不固定，导致抗原蛋白与磁珠偶联的位点不固定，一个抗原蛋白表面可能同时与多个磁珠连接，抗原位点容易被遮蔽，影响抗原抗体结合，最终影响检测，因此迫切需要一种能够定点偶联抗原与磁珠的方法，同时针对连接位点进行研究，开发一种能够显著提高蛋白酶3抗体的检测效率的蛋白酶3-磁珠偶联物。

近年来随着遗传密码扩展技术的迅速发展，利用琥珀终止密码子为有义编码子，通过引入相应的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最终可以将设计好的非天然氨基酸定点引入蛋白质中，根据非天然氨基酸的性质，可以赋予蛋白质特殊的功能。到目前为止这一技术已经将几十种非天然氨基酸成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中，涉及的非天然氨基酸包括炔基和叠氮等，实现蛋白质定点修饰。

正交tRNA及氨酰tRNA合成酶蛋白质翻译系统使非天然氨基酸定点插入到蛋白酶3中，从而得到定点突变的蛋白酶3(图1)，将上述突变后的蛋白酶3与含有叠氮或炔基生物素衍生物反应(图2)，实现蛋白酶3定点修饰，再偶联至链霉亲和素修饰的磁珠端。

本发明利用点突变型蛋白酶3和生物素衍生物发生点击化学反应得到生物素衍生物和突变型蛋白酶3的定点偶联物，所述的突变型蛋白酶3的氨基酸序列的36位点、48位点或74位点的氨基酸为带有叠氮基团和炔基中的一者的非天然氨基酸，所述的生物素为具有炔基或叠氮基团中的另一者的生物素衍生物，再通过生物素衍生物将突变型蛋白酶3偶联至链霉亲和素修饰的磁珠端。

优选地，所述的非天然氨基酸带有叠氮基团，所述的生物素为带有炔基的生物素衍生物。

根据一些实施例，所述的非天然氨基酸为所述的非天然氨基酸为(Phe-azido)或/>(Lys-azido)。

根据一些实施例，所述的生物素衍生物的结构式为：

反应式为：

具体实施方案如下：

利用网站Immunomedicine Group的在线工具Antigenic Peptide Prediction预测抗原蛋白的抗原表位。

利用在线软件phyre2预测或从蛋白质结构公共数据库PDB获取抗原蛋白结构，分析上述预测的抗原表位所在位置。

于抗原表位所在氨基酸的远端选定非天然氨基酸插入位点(R36，R74，H48，S115)，将对应核酸序列突变为琥珀密码子TAG，构建表达质粒。将表达质粒与正交tRNA及氨酰tRNA合成酶蛋白质翻译系统转化至表达菌株或细胞中。向蛋白表达培养基中加入非天然氨基酸，表达纯化定点引入了非天然氨基酸的蛋白酶3。

4℃条件下，向PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.0)中加入终浓度为5mM的突变后的蛋白酶3，15mM含有炔基的生物素衍生物，1mM硫酸铜，垂直混悬30min，反应结束后加入终浓度为1mM EDTA结束反应，获得生物素定点修饰的蛋白酶3。

采用透析、超滤等方法去除未反应的生物素衍生物，并浓缩，获得长臂生物素定点修饰后的蛋白酶3。

利用上述长臂生物素修饰蛋白酶3包被链霉亲和素磁珠，条件如下：

取10mg/mL的链霉亲和素磁珠200μL，加入1mL PBS缓冲液(pH＝7.0)清洗三遍，加入20μg上述长臂生物素修饰蛋白酶3，室温下垂直混悬反应30min，加入1mL PBS缓冲液(pH＝7.0)清洗三遍。最后加入5ml PBS缓冲液，混合均匀，获得0.4mg/mL的蛋白酶3包被的磁珠。

进一步地，实施例中还使用上述长臂生物素修饰抗原蛋白包被的链霉亲和素磁珠制备自身免疫抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。

以下实施例中使用的非天然氨基酸、生物素衍生物及其他试剂均可通过市售获得。

实施例一、

(一)定点突变的抗原蛋白表达质粒的构建

1.突变位点的选择

利用网站Immunomedicine Group的在线工具Antigenic Peptide Prediction预测蛋白酶3的抗原表位。

从PDB数据库下载蛋白酶3的晶体结构，选取位于蛋白晶体结构表面、且不属于抗原表位的氨基酸位点作为突变位点，这些氨基酸位点突变为非天然氨基酸后，叠氮或炔基可直接接触溶剂。具体的突变位点见表1。

表1.蛋白酶3突变位点

2.表达质粒获得

根据NCBI Gene Bank公布的蛋白酶3的基因序列，通过全基因合成获得全长的DNA片段，将其构建于pET28a表达质粒中，获得pET28a-PR3表达质粒。

3.定点突变

采用PCR法对pET28a-PR3质粒进行定点突变，所用引物如表2所示。将PCR产物回收后，采用内切酶DpnI处理产物，37℃，3h。将处理后的产物转化至大肠杆菌DH5α中，最终提取质粒，测序验证，获得4个定点突变的表达质粒。

蛋白酶3表达质粒pET28a-PR3的突变克隆命名为：

pET28a-PR3-R36，pET28a-PR3-H48，pET28a-PR3-R74，pET28a-PR3-S115。

表2.pET28a-PR3突变引物

(二)非天然氨基酸修饰的蛋白酶3的表达和纯化

将实施案例1中获得的表达质粒及正交tRNA和tRNA合成酶的蛋白质翻译系统质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21-DE3中，于LB培养基中37℃培养12h，按照1：500转接至含有1L LB培养基的锥形瓶中，37℃培养4-6h左右，待OD＝0.6-0.8后，加入Lys-azido至终浓度为2mM，继续培养20min，加入0.6mM终浓度的IPTG以及终浓度为0.25mM的阿拉伯糖，16℃诱导表达28h，收集菌体。

将收集的菌体采用lysis buffer重悬，采用高压均质机破碎细胞，高速离心去除细胞碎片及包涵体，采用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白，获得纯化后的蛋白酶3突变体蛋白，分别标记为PR3-R36-1、PR3-H48-1、PR3-R74-1、PR3-S115-1。

实施例二、

与实施例1基本相同，不同之处在于：所用非天然氨基酸为Phe-azido，纯化后的蛋白酶3突变体蛋白，分别标记为PR3-R36-2、PR3-H48-2、PR3-R74-2、PR3-S115-2。

实施例三、抗蛋白酶3抗体检测试剂的制备

(一)将实施例一和实施例二中获得的突变体蛋白分别与长臂炔基生物素通过铜催化的点击化学反应偶联，反应体系如下：

Cu丝小段。

反应条件如下：4℃，垂直混悬30min，反应后加入终浓度1mM的EDTA终止反应，获得长臂生物素与蛋白酶3偶联物。

(二)将生物素标记突变体蛋白包被链霉亲和素磁珠

取10mg/mL的链霉亲和素磁珠200μL，加入1mL PBS缓冲液(pH＝7.0)，通过磁分离器清洗三遍，加入点突变蛋白酶3分子20μg，室温下垂直混悬反应30min，加入1mL PBS缓冲液(0.1M，pH＝7.0)，通过磁分离器清洗三遍。最后加入5ml PBS缓冲液，混合均匀，获得0.4mg/mL的蛋白酶3包被的磁珠。

(三)碱性磷酸酶(ALP)标记的鼠抗人IgG二抗制备

1)将鼠抗人IgG二抗碳酸缓冲液装入合适截留量的透析袋中置于透析液中进行透析，其中，透析液为碳酸缓冲液；

2)往步骤1)透析好的溶液中加入碱性磷酸酶进行反应；其中，温育的温度25～37℃，温育的时间：8～12h；

3)将步骤2)得到的反应液通过G-25凝胶柱进行纯化，收集出现峰值的溶液，得到碱性磷酸酶(ALP)标记的鼠抗人IgG二抗溶液；

4)将步骤3)得到的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgG二抗溶液加入BSA保护液，待用。

对比例一、

使用的蛋白酶3抗原为野生型蛋白(SEQ ID No.9)，并采用N-羟基琥珀酰亚胺活化生物素标记，步骤如下：

1)将2mg的蛋白酶3抗原与0.5mg经N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素混合，在25℃下混匀反应30min；

2)加入20uL的物质的量浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在30℃下混匀反应30min，再加入600uL甘油，获得生物素化的蛋白酶3，在-20℃保存备用；

3)用pH为7.5、物质的量浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液将生物素化的蛋白酶3稀释成浓度为1ug/mL的混合溶液。

抗蛋白酶3抗体检测试剂的制备同实施例三。

实施例四、抗蛋白酶3抗体检测

检测步骤如下：

利用各实施例和对比例的蛋白酶3包被的磁珠、碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgG二抗溶液、3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷(AMPPD)形成检测检测试剂盒，检测样本中的抗蛋白酶3抗体。该检测方法基于磁微粒化学发光检测原理。

检测步骤如下：

a)将待测样本与蛋白酶3包被的磁珠混合反应10min。

b)经洗涤后加入碱性磷酸酶标记的抗人IgG反应10min，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，通过洗涤，未被结合的酶标抗体以及其它物质被去除。

c)加入化学发光底物AMPPD，检测信号值。

各实施例和对比例制备的蛋白酶3包被的磁珠的性能对比如下：

表3.试剂盒信噪比对比

上述结果表明，实施例1(PR3-R36-1)的试剂盒检测信噪比最高(14.16)，优于其它各组。

阴、阳性符合率：

采用上述的试剂盒检测320例临床血清抗蛋白酶3抗体的含量，并与国外知名公司同类产品进行临床比对。将检测结果转化为阴阳性符合情况，制作阴阳性符合表(表3)。

表3阴阳性符合情况

表3显示：

实施例1中：PR3-R36-1试剂盒阴阳性符合率为100％，PR3-H48-1试剂盒的阳性符合率为93.8％、阴性符合率为96.1％，PR3-R74-1试剂盒阳性符合率为94.7％、阴性符合率为92.3％，PR3-S115-1试剂盒阳性符合率为77.9％、阴性符合率为78.3％。

实施例2中：PR3-R36-2试剂盒阳性符合率为97.3％、阴性符合率为97.6％，PR3-H48-2试剂盒的阳性符合率为93.8％、阴性符合率为97.6％，PR3-R74-2试剂盒阳性符合率为97.3％、阴性符合率为96.6％，PR3-S115-2试剂盒阳性符合率为80.5％、阴性符合率为67.6％。

对比例1试剂盒阳性符合率为95.6％、阴性符合率为95.2％。

线性：

选取理论浓度为1.86，20.43，51.08，204.31，408.62RU/mL的样本。按上述检测步骤进行测定，对每一浓度的样本均重复测定3次，计算其平均值，将结果的平均值和对应理论浓度用线性回归进行拟合计算，见表4。

表4

空白限对比：

具体实验方法如下：重复测定零浓度校准品(S0)20次，记录20次测试的相对发光强度(RLU)。计算20次测试的相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，代入试剂盒工作曲线，对应的浓度值即空白限。

表5.空白限对比

/>

由上述数据可以看出，实施例1中PR3-R36-1、PR3-H48-1和PR3-R74-1的空白限优于其它各组。

稳定性对比：

具体地，将对比例1(野生型蛋白酶3)及实施例1(PR3-R36-1)的对应磁珠取一部分放到4℃和37℃放置15天，用于检测样本得到发光值，根据发光信号的变化，比较不同方法的磁珠稳定性。发光信号保留比例随放置条件和时间的变化曲线图见图3和图4。

图3显示，4℃放置15天后，实施例1(PR3-R36-1)的信号保留率为92％左右，而对比例1降至80％左右。图4显示，37℃放置15天后，实施例1(PR3-R36-1)的信号保留率为82％左右，而对比例1降至60％左右。可见，实施例1(PR3-R36-1)磁珠稳定性明显优于对比例1(野生型蛋白酶3)。

以上结果说明，与传统偶联方法相比较，采用非天然氨基酸突变实现抗原定点偶联磁珠后，磁珠稳定性(信号保留率)优于传统偶联方法组。并且突变位点R36优于H48和R74，而当突变位点位选择S115时，试剂盒检测性能显著下降，不能满足要求；另外，从实施例1与实施例2的数据结果中可以看出，使用Lys-azido的效果优于Phe-azido。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州携创生物技术有限公司

<120> 一种突变型蛋白酶3和生物素的偶联物及其制备方法及应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(rengomgxulie)

<400> 1

gttcccctac atctgcaggg aggccatgta g 31

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(rengomgxulie)

<400> 2

tccctgcaga tgtaggggaa cccgggcagc cacttctg 38

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(rengomgxulie)

<400> 3

agcacgaagc tgggctagat caaggtgcct ccgcagaagt g 41

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(rengomgxulie)

<400> 4

aggcaccttg atctagccca gcttcgtgct gacggccgcg cac 43

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(rengomgxulie)

<400> 5

gtgggctcct gcgtctacac gttgtgggct ccgagcac 38

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(rengomgxulie)

<400> 6

gagcccacaa cgtgtagacg caggagccca cccagcag 38

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(rengomgxulie)

<400> 7

gcgacggagg cctagaggtt ggctgggctg ctcag 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(rengomgxulie)

<400> 8

cagccaacct ctaggcctcc gtcgccacag tccag 35

<210> 9

<211> 244

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Ser Gly Ala Ala Arg Ala Ala Glu Ile

1 5 10 15

Val Gly Gly His Glu Ala Gln Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala Ser

20 25 30

Leu Gln Met Arg Gly Asn Pro Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Thr Leu

35 40 45

Ile His Pro Ser Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Arg Asp Ile

50 55 60

Pro Gln Arg Leu Val Asn Val Val Leu Gly Ala His Asn Val Arg Thr

65 70 75 80

Gln Glu Pro Thr Gln Gln His Phe Ser Val Ala Gln Val Phe Leu Asn

85 90 95

Asn Tyr Asp Ala Glu Asn Lys Leu Asn Asp Val Leu Leu Ile Gln Leu

100 105 110

Ser Ser Pro Ala Asn Leu Ser Ala Ser Val Ala Thr Val Gln Leu Pro

115 120 125

Gln Gln Asp Gln Pro Val Pro His Gly Thr Gln Cys Leu Ala Met Gly

130 135 140

Trp Gly Arg Val Gly Ala His Asp Pro Pro Ala Gln Val Leu Gln Glu

145 150 155 160

Leu Asn Val Thr Val Val Thr Phe Phe Cys Arg Pro His Asn Ile Cys

165 170 175

Thr Phe Val Pro Arg Arg Lys Ala Gly Ile Cys Phe Gly Asp Ser Gly

180 185 190

Gly Pro Leu Ile Cys Asp Gly Ile Ile Gln Gly Ile Asp Ser Phe Val

195 200 205

Ile Trp Gly Cys Ala Thr Arg Leu Phe Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val

210 215 220

Ala Leu Tyr Val Asp Trp Ile Arg Ser Thr Leu Arg Arg Val Glu Ala

225 230 235 240

Lys Gly Arg Pro

Claims

1.一种突变型蛋白酶3和生物素的偶联物，其特征在于，所述的突变型蛋白酶3是在野生型蛋白酶3的基础上，氨基酸序列的36位点、48位点或74位点的氨基酸突变为带有叠氮基团和炔基中的一者的非天然氨基酸，所述的野生型蛋白酶3的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示的氨基酸序列，所述的生物素为具有炔基或叠氮基团中的另一者的生物素衍生物，所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物通过炔基和叠氮基团之间形成的化学键相连。

2.根据权利要求1所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物，其特征在于，所述的非天然氨基酸为侧链带有叠氮基或炔基的苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、精氨酸衍生物、赖氨酸衍生物；

和/或，所述的生物素衍生物为分子量为400～500，臂长为的长臂生物素的衍生物。

3.根据权利要求1所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物，其特征在于，所述的非天然氨基酸为

和/或，所述的生物素衍生物为

4.一种如权利要求1至3中任一项所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物的制备方法，其特征在于，所述的突变型蛋白酶3和所述的生物素衍生物在硫酸铜存在的条件下进行点击化学反应，然后使用乙二胺四乙酸终止反应，得到所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的点击化学反应在中性PBS缓冲液中进行；和/或，所述的点击化学反应的反应温度为2～6℃；和/或，所述的突变型蛋白酶3在反应体系中的初始浓度为4～8mM；和/或，所述的生物素衍生物在反应体系中的初始浓度为12～18mM；和/或，所述的硫酸铜在反应体系中的浓度为0.8～1.5mM；和/或，所述的乙二胺四乙酸在反应体系中的浓度为0.8～1.5mM。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括利用正交tRNA及氨酰tRNA合成酶蛋白质翻译系统将所述的非天然氨基酸定点插入蛋白酶3肽链中得到所述的突变型蛋白酶3。

7.一种磁微粒化学发光检测试剂，其特征在于，所述的磁微粒化学发光检测试剂为权利要求1至3中任一项所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物包被的链霉亲和素磁珠。

8.根据权利要求7所述的磁微粒化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于，将所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物和所述的链霉亲和素磁珠在中性PBS缓冲液中于20～45℃下反应得到所述的磁微粒化学发光检测试剂。

9.一种用于检测蛋白酶3抗体的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1至3中任一项所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物或权利要求7所述的磁微粒化学发光检测试剂。