CN113373156A

CN113373156A - 自身免疫性脑炎相关的nmdar重组蛋白、其编码序列、制法和应用

Info

Publication number: CN113373156A
Application number: CN202110735331.XA
Authority: CN
Inventors: 许敏; 黄敬双; 秦枫; 潘敬梅; 段继龙; 王健; 潘进海; 张伟; 曹长春; 赵婷
Original assignee: Sichuan Light Carrying Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Light Carrying Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2021-09-10

Abstract

本发明公开了自身免疫性脑炎相关的NMDAR重组蛋白、其编码序列、制法和应用，属于生物技术领域。本发明的自身免疫性脑炎相关的NMDAR重组蛋白的编码序列如SEQ ID NO.1所示；重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。重组蛋白的制备方法包括：将SEQ ID NO.1所示的编码序列连接重组载体，构建重组蛋白表达载体；转化进大肠杆菌的感受态细胞，培养，得到重组蛋白表达菌株；提取质粒，转染入CHO‑S细胞中培养；收集细胞上清，纯化，得到重组蛋白。本发明还提供了重组蛋白在制备抗NMDAR自身抗体检测材料中的应用、以及抗NMDAR自身抗体检测试剂盒。本发明的NMDAR重组蛋白通过异源重组表达NR1‑ATD，能被患者血液中的抗NMDAR自身抗体识别，且在体外大量表达，降低生产成本，并能实现定量检测。

Description

自身免疫性脑炎相关的NMDAR重组蛋白、其编码序列、制法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及自身免疫性脑炎相关的NMDAR重组蛋白、其编码序列、制法和应用。

背景技术

自身免疫性脑炎(Autoimmune Encephalitis，AE)是自身免疫机制介导的神经系统炎性疾病，可影响边缘系统、脑干和小脑，以急性或亚急性起病。典型的临床表现有记忆力下降、癫痫发作、精神异常和认知功能障碍等。自身免疫性脑炎起病初期症状不明显，但家人常因其怪异行为就诊于精神科，错过早期最佳诊断。另外，该病和感染性脑炎在病因、临床表现、诊断标准等方面均有许多类似和难区别的地方，最大不同在于AE患者血清或脑脊液中存在抗神经元抗原抗体。

AE主要包括抗细胞内抗原相关抗体脑炎(也称经典的副肿瘤性脑炎(PNDS))和抗细胞表面抗原或突触蛋白相关抗体脑炎等。其中，抗N-甲基D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartatereceptor，NMDAR)脑炎是目前最常见的AE类型，约占AE患者的80％左右，其发病率可能超过病毒性脑炎。NMDAR由不同的亚基构成异四聚体，亚基组成主要包括NR1(NDMAR1)、NR2和NR3。NR1是NMDAR必不可少的组成亚基，可结合甘氨酸，为该受体的功能单位。经研究表明，目前抗NMDAR脑炎诊断主要依据是NR1亚基IgG抗体(+)，NR1亚基IgG抗体在抗NMDAR脑炎患者脑脊液中阳性率为100％，抗NMDAR抗体检测对抗NMDAR脑炎的诊断具有非常高的敏感性和特异性。

目前实验室检测最常见的方法是免疫印迹法和间接免疫荧光法(IFA)，生产该检测试剂盒的均是欧洲和美国厂家，成本高昂，在临床实践中存在检测范围有限、难以实现自动化等实际问题，而且上述研究方法均属于定性检测范畴，无法真正实现自身抗体水平的早期发病、治疗和康复阶段的实时大量检测。

发明内容

为了避免上述不足，本发明提供了一种NMDAR重组蛋白，通过异源重组表达NMDAR蛋白，能被患者血液中的抗NMDAR自身抗体识别，且在体外大量表达，实现相应抗原生产的低成本和国产化，并且能实现定量检测。

本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的自身免疫性脑炎相关的NMDAR重组蛋白的编码序列，所述编码序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的编码序列编码的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明所述的一种重组蛋白表达载体，所述重组蛋白表达载体含有SEQ ID NO.1所示编码序列的质粒载体。

申请人发现，NR1亚基的细胞外氨基末端结构域(ATD：氨基酸1-561)是抗NMDAR脑炎患者自身抗体结合的主要抗原表位区，此外肽序列RNPSDK(氨基酸673–678)也是脑炎识别的关键抗原表位，它们对抗NMDAR脑炎患者自身抗体起主要识别作用。

本申请结合大量试验和文献调研，最终开创性实现了含部分抗原区域(ATD和跨膜结构M1/M2：氨基酸19-812)基因片段的异源表达，成功得到了高纯度、高灵敏度和高特异性的NMDAR重组蛋白。本发明最终表达DNA序列，是经过密码子偏好性优化的(优化前序列如SEQ ID NO.8所示，优化后的序列如SEQ ID NO.9所示)，并且本申请的信号肽是经过前期筛选和长期使用验证得到的针对CHO细胞的高效信号肽。

本发明所述的重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

S1.将SEQ ID NO.1所示的编码序列连接重组载体，构建重组蛋白表达载体；

S2.将重组蛋白表达载体转化进大肠杆菌的感受态细胞，培养，得到重组蛋白表达菌株；

S3.从重组蛋白表达菌株中提取质粒，将提取得到的重组质粒转染入CHO-S细胞中，进行大规模培养；

S4.收集细胞上清，纯化，得到重组蛋白。

本发明的部分实施方案中，所述重组载体包括pcDNA3.1(+)克隆载体。

本发明的部分实施方案中，所述S2中，还包括验证步骤：将重组蛋白表达载体转化进大肠杆菌的感受态细胞，培养，挑取转化后的单菌落进行PCR验证。

本发明的部分实施方案中，所述PCR验证时所用的正向引物为T7 promoterprimer，反向引物为BGH reverse primer。

本发明的部分实施方案中，所述重组载体为真核载体pcDNA3.1(+)。

本发明所述的重组蛋白在制备抗NMDAR自身抗体检测材料中的应用。

本发明所述一种抗NMDAR自身抗体检测试剂盒，包括上述的重组蛋白。

本发明的部分实施方案中，所述试剂盒中的重组蛋白与磁微粒偶联。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明设计科学，构思巧妙，本发明的自身免疫性脑炎相关的NMDAR重组蛋白，能灵敏、特异的识别相关抗体。本发明能提供自主高效异源表达体系，使其能在体外大量表达，实现相应抗原生产的低成本和国产化；提供磁微粒化学发光检测技术，结合该重组蛋白，能稳定、高效和自动化检测自免脑炎患者自身抗体，开发出高精准、定量、快速和高重复等特性的自免脑炎自身抗体体外诊断试剂盒套装及相应标准化检测流程。

附图说明

附图1为本发明的重组载体图；

附图2为本发明的重组载体多克隆位点信息图；

附图3为本发明实施例3的线性验证结果图。

附图4为本发明实施例4的统计结果图。

附图5为基因序列密码子偏好性优化前后的对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例公开了本发明的NMDAR重组蛋白的制备方法，具体为：

1.优化编码重组蛋白的核苷酸序列

为了提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的核苷酸序列转化为对应的核苷酸序列，得到优化后的如SEQ ID NO.9所示序列。优化前的核苷酸序列的CAI值为0.84，优化后的核苷酸序列的CAI值为0.94。结果如附图5所示。

2.采用经过密码子偏好性优化后的如SEQ ID NO.9所示的基因序列，连接信号肽、His标签和KozAk序列，合成得到如SEQ ID NO.1所示目的基因序列，该目的基因序列由擎科生物公司合成。

其中，信号肽序列为：

ATGGAAACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCTCTACAGGA，如SEQ IDNO.3所示；

His标签序列为：CACCACCACCACCATCAC，如SEQ ID NO.4所示；

KozAk序列为：GCCGCCACC，如SEQ ID NO.5所示。

3.重组载体的选择

选择真核载体pcDNA3.1(+)作为重组载体，其中pcDNA3.1(+)图谱如附图1所示，pcDNA3.1(+)的多克隆位点信息如附图2所示。

4.质粒构建与转化

将序列如SEQ ID NO.1所示的合成基因与经过限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切的pcDNA3.1(+)克隆载体按照3：1的摩尔比，加入含T4 DNA ligase的10μL连接体系中，混匀，在16℃连接1h。

将连接产物转化进感受态细胞E.Coli DH5α。具体步骤为：冰上融化感受态细胞DH5α；将10μL连接混合物加入到100μL感受态细胞，混匀，冰浴30min；42℃热激90s，勿摇动，热激后立马置于冰上2min；加入800μLLB液体培养基，置摇床，37℃，150rpm，60min；4000rpm,离心3min,用枪吸取600μL上清倒掉，将剩下的菌液重悬后涂在具有Amp抗生素的LB平板，37℃倒置培养过夜。

挑取转化后的单菌落进行PCR验证，正向引物为T7 promoter primer(TAATACGACTCACTATAGGG，如SEQ ID NO.6所示)，反向引物为BGH reverse primer(TAGAAGGCACAGTCGAGGC，如SEQ ID NO.7所示)。若扩增有目的片段，挑取单克隆培养，送菌液到擎科生物公司测序，验证正确的菌液加入甘油混匀，保存于-20℃。根据SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒说明书，提取正确重组质粒。

5.细胞转染

根据脂质体转染试剂盒Lipofectamine 3000说明将步骤4提取的重组质粒转染入CHO-S细胞中。

(1)质粒准备：用质粒上多克隆单一位点HindIII进行目的质粒的线性化切割；然后加入1/10的3mol/L的乙酸钠(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，在-20℃放置30min沉淀DNA；离心去上清，接着用4倍体积的70％乙醇静置10min清洗；离心吸弃上清，室温静置10min，挥发残留乙醇，用ddH2O溶解线性化质粒，建议浓度1μg/μL，一次转染需要37.5μg线性化质粒。

(2)细胞培养：转染前大约24h，将细胞传代，接种密度为5-6×10⁵个细胞/mL。将培养瓶置于水平摇床上，120-135rpm，37℃，8％CO₂；转染当天，细胞密度应该在1.2-1.5×10⁶/mL，稀释细胞至1×10⁶/mL。为了确保高的转染结果，细胞的存活率必须高于95％。

(3)转染试剂稀释：将112.5μL lipofectamine 3000reagent轻轻加入到487.5μLM1培养基里进行稀释，轻轻吹打混匀，可标记为A管。室温放置2-5min。

(4)DNA稀释：将37.5μg线性化质粒DNA加入到487.5μL M1培养基(预热至室温)中，稍微混匀。再加入75μL的P3000 ragent至上述DNA稀释液中，使得最终体积为0.6mL，混匀，可标记为B管。

(5)转染：迅速将稀释好的DNA(B管溶液600μL)加入到稀释好的转染试剂溶液(A管溶液600μL)中，总体积1.2mL，并轻轻混匀。室温孵育DNA-lipo3000复合物10-15min，等待复合物形成。然后轻轻的将1.2mL混合物加入到125mL包含有细胞的摇瓶中，同时轻轻旋转摇瓶。在37℃，8％CO₂,135rpm孵育转染的细胞，6-7h内不需要更换或者补充培养基。

(6)转染后细胞恢复培养及筛选：转染48h后，取细胞检测密度，活率。离心更换M2培养基，此时M2培养基中可加入400μg/mL G418开始筛选。此后每48h传代一次，可按照5*10⁵接种，30mL培养。

6.重组蛋白的纯化

当细胞生长到合适的密度，收集细胞上清，采用亲和层析法进行纯化，纯化柱选用镍柱。

平衡：取适当镍柱子先用不含咪唑的Buffer清洗三至四次柱子去掉其中的酒精，将清洗最后一次的含有Buffer的镍柱子倒入洗脱柱上，待Buffer流尽。

上样：将上清倒入到洗脱柱子中，将第一次流出的液体再次上柱以便使目的蛋白与柱子结合充分。

清洗：用不含咪唑的Buffer洗脱柱子，此时可以用Brand buffer检测杂蛋白是否洗脱完全。接着用含有20mmol咪唑的Buffer洗脱直到检测无蛋白流出。

梯度洗脱：分别用含有50mmol、100mmol、150mmol和250mmol咪唑依次洗脱目的蛋白，洗脱至无蛋白流出后即可停止洗脱。(注：洗脱过程中，用1.5mL的EP管收集各洗脱组分，并做好标记)

SDS凝胶电泳分析：用SDS凝胶电泳分析各洗脱组分的蛋白含量，收集含目的条带的组分。

纯蛋白浓缩与透析：浓缩含目的条带的纯蛋白组分，用磷酸盐缓冲液进行透析去除咪唑。

重组蛋白的浓度与纯度测定：用Nonodrop2100测定目的纯蛋白的A280nm的吸光度，以目的蛋白的分子大小90.1kDA和消光系数114562进行校正，获取目的纯蛋白的浓度和纯度。

所得重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

本实施例公开了利用实施例1制得的NMDAR重组蛋白制备人血中抗NMDAR抗体定量检测试剂盒(磁微粒化学发光法)并检测抗原的免疫反应性。

将NMDAR重组蛋白与磁微粒偶联，步骤为取Tosyl磁珠原液2mL，用包被缓冲液清洗三次，然后依次加入包被缓冲液10mL，NMDAR重组蛋白500μL，3M硫酸铵5.25mL，在37℃反应16h。反应后取出磁珠，去上清，加入15.75mL的封闭液37℃反应9h。最后用封闭液洗两次，磁珠保护液洗1次后用磁珠保护液定容。

用NMDAR抗体按照1/100、1/400、1/1600、1/32000的比例稀释小样，然后将稀释后的样品分别与碱性磷酸酶标记的抗人IgG及发光底物AMPPD反应，利用Luminary 1600检测样本验证重组蛋白反应性，根据计算软件反算出梯度样本浓度，求均值，算NMDAR抗体的浓度。结果如下：

表1

结果证明，使用重组NMDAR蛋白偶联的磁珠，能特异性的识别NMDAR抗体，抗原与抗体之间具有免疫反应性，说明重组表达成功。且检测结果具有线性关系，重组的NMDAR蛋白能够应用于抗NMDAR抗体定量检测试剂盒的开发使用。

实施例3

按照实施例2的方法，将NMDAR重组蛋白与磁微粒偶联，制备人血中抗NMDAR抗体定量检测试剂盒(磁微粒化学发光法)，并对试剂进行性能评估，验证检测试剂的最低检测限、线性和精密度。

1.最低检测限验证

用零浓度校准品与相邻浓度校准品，根据计算软件反算出最低检测限，结果如下表所示：

表2

测定结果表明，最低检测限为0.0295RU/mL，符合行业不高于0.50RU/mL的规定。

2.线性验证

用临床高值样本梯度稀释，验证线性相关性，根据计算软件反算出样本浓度，结果如下表及附图3所示：

表3

样本稀释倍数	样本理论浓度	样本计算浓度
			0	352.36	352.36
1/2	176.18	197.96
			1/4	88.09	108.77
1/8	44.05	55.49
			1/16	22.02	26.68
1/32	11.01	13.14

检测结果表明，将样本梯度稀释，所得理论浓度与试剂检测浓度的相关系数r＞0.997，符合检验标准(r＞0.99)。

3.精密度验证：检测低值、中值样本，验证试剂精密度：

表4

试剂检测低值、中值样本，各10个测试，浓度结果变异系数CV＜3％，符合标准(CV＜10％)。

实施例4

按照实施例2的方法，将NMDAR重组蛋白与磁微粒偶联后，检测200例血清样本(正常人血清)，根据计算软件反算出样本浓度，即NMDAR抗体的浓度。结果如下：

表5

观察200份临床样本的浓度值无离群值，绘制发布图(图4)，该批数据不服从正态分布，因此采用百分数法确定95％位数的参考限，参考值约为20RU/ml(四舍五入，取整数)，故参考区间为﹤20RU/mL。

综合以上结果表明，将NMDAR重组蛋白与磁微粒偶联，制备人血中抗NMDAR抗体定量检测试剂盒(磁微粒化学发光法)，其最低检测限验证、精密度验证、样本线性检测结果都符合相关标准，参考区间为﹤20RU/mL。本发明的NMDAR重组蛋白可以应用于人血中抗NMDAR抗体定量检测。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川携光生物技术有限公司

<120> 自身免疫性脑炎相关的NMDAR重组蛋白、其编码序列、制法和应用

<130> 20210626

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2484

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggatccgccg ccaccatgga aaccgacacc ctgctgctgt gggtgctgct gctgtgggtg 60

ccaggctcta caggaagggc agcatgcgac ccaaagatcg tgaacatcgg agcagtgctg 120

agcacaagga agcacgagca gatgttcagg gaggcagtga accaggccaa caagagacac 180

ggaagctgga agatccagct gaatgcaacc tccgtgaccc acaagcctaa tgccatccag 240

atggccctgt ccgtgtgcga ggacctgatt tcctcccagg tgtatgccat cctggtcagt 300

caccccccca cccctaacga ccacttcacc cccacccccg tctcctacac cgccggattc 360

tatcggattc ctgtcctggg cctgaccacc cgcatgtcta tctactccga caagtccatc 420

cacctgtcct tcctgcggac cgtcccccct tactcccacc agtcctccgt gtggttcgag 480

atgatgcgcg tgtactcctg gaaccacatt atcctgctgg tgtccgacga ccacgagggc 540

cgtgctgctc agaagaggct ggagaccctg ctggaagaac gtgagagtaa agccgagaag 600

gtgctgcagt tcgaccccgg cacaaagaac gtgacagccc tgctgatgga ggctaaagaa 660

ctggaggcaa gggtgatcat cctgtccgcc agcgaagatg atgccgcaac cgtgtacagg 720

gccgccgcta tgctgaatat gaccggcagt ggctacgtgt ggctggtggg agaaagggaa 780

atctccggaa atgccctgag gtacgcccct gacgggattc tgggactgca gctgatcaac 840

ggaaagaacg aaagcgctca catttccgac gccgtgggtg tggtggccca ggctgtgcat 900

gagctgctgg agaaggagaa cattaccgac cccccccggg gatgcgtcgg aaataccaac 960

atctggaaga caggccccct gttcaagaga gtgctgatgt ccagtaaata tgctgacggc 1020

gtcactggaa gagtggaatt taacgaggac ggcgacagga agtttgcaaa ctactccatc 1080

atgaacctgc agaaccggaa gctggtgcag gtggggatct acaacggcac ccacgtgatt 1140

cccaatgaca ggaagatcat ctggccaggc ggcgaaaccg agaagcccag gggttaccag 1200

atgtccacaa gactgaagat cgtgacaatc caccaggagc ccttcgtgta cgtgaagccc 1260

accctgagcg acggcacctg caaagaggag ttcaccgtga atggcgaccc cgtgaaaaag 1320

gtcatctgca ccggccccaa tgacacctcc cccggatcac ccagacacac cgtgccccag 1380

tgctgctatg gcttctgtat cgacctgctg atcaagctgg ccaggaccat gaacttcacc 1440

tacgaggtgc acctggtggc cgacggcaag ttcggcaccc aggaaagggt gaacaactcc 1500

aataagaaag agtggaacgg aatgatgggc gaactgctga gcggacaggc cgacatgatc 1560

gtggcccccc tgaccatcaa caacgaaaga gcccagtaca tcgagttcag caaacccttc 1620

aagtaccagg gcctgaccat cctggtgaaa aaggaaatcc cccgctccac cctggactcc 1680

ttcatgcagc ccttccagag caccctgtgg ctgctggtgg gactgtccgt gcacgtcgtg 1740

gccgtcatgc tgtacctgct ggataggttc agccccttcg gcaggttcaa ggtgaactcc 1800

gaggaggaag aggaggatgc actgaccctg tcttctgcta tgtggttttc ctggggggtg 1860

ctgctgaata gcggcatcgg cgagggcgcc cctaggtcct tttccgcaag gatcttggga 1920

atggtgtggg ccggatttgc catgattatc gtggcttcct acaccgctaa cctggctgcc 1980

ttcctggtgc tggacaggcc cgaggagagg atcaccggca tcaacgaccc caggctgagg 2040

aatccttccg acaagtttat ctacgccacc gtgaagcagt cctccgtcga catttacttt 2100

aggaggcagg tggagctgag tacaatgtac aggcacatgg agaaacacaa ctacgagtcc 2160

gccgccgagg ccatccaggc agtgagagac aacaaactgc acgcctttat ctgggacagc 2220

gcagtgctgg agttcgaggc aagccagaag tgcgacctgg tcaccaccgg cgaactgttc 2280

ttcaggagtg gcttcggaat cggaatgagg aaggactccc cctggaagca gaacgtgagt 2340

ctgagcattc tgaagagtca cgaaaacggc tttatggagg acctggataa gacctgggtg 2400

aggtaccagg agtgcgacag caggagcaac gctccagcca ccctgacctt cgagaaccac 2460

caccaccacc atcactgaga attc 2484

<210> 2

<211> 800

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Arg Ala Ala Cys Asp Pro Lys Ile Val Asn Ile Gly Ala Val Leu Ser

1 5 10 15

Thr Arg Lys His Glu Gln Met Phe Arg Glu Ala Val Asn Gln Ala Asn

20 25 30

Lys Arg His Gly Ser Trp Lys Ile Gln Leu Asn Ala Thr Ser Val Thr

35 40 45

His Lys Pro Asn Ala Ile Gln Met Ala Leu Ser Val Cys Glu Asp Leu

50 55 60

Ile Ser Ser Gln Val Tyr Ala Ile Leu Val Ser His Pro Pro Thr Pro

65 70 75 80

Asn Asp His Phe Thr Pro Thr Pro Val Ser Tyr Thr Ala Gly Phe Tyr

85 90 95

Arg Ile Pro Val Leu Gly Leu Thr Thr Arg Met Ser Ile Tyr Ser Asp

100 105 110

Lys Ser Ile His Leu Ser Phe Leu Arg Thr Val Pro Pro Tyr Ser His

115 120 125

Gln Ser Ser Val Trp Phe Glu Met Met Arg Val Tyr Ser Trp Asn His

130 135 140

Ile Ile Leu Leu Val Ser Asp Asp His Glu Gly Arg Ala Ala Gln Lys

145 150 155 160

Arg Leu Glu Thr Leu Leu Glu Glu Arg Glu Ser Lys Ala Glu Lys Val

165 170 175

Leu Gln Phe Asp Pro Gly Thr Lys Asn Val Thr Ala Leu Leu Met Glu

180 185 190

Ala Lys Glu Leu Glu Ala Arg Val Ile Ile Leu Ser Ala Ser Glu Asp

195 200 205

Asp Ala Ala Thr Val Tyr Arg Ala Ala Ala Met Leu Asn Met Thr Gly

210 215 220

Ser Gly Tyr Val Trp Leu Val Gly Glu Arg Glu Ile Ser Gly Asn Ala

225 230 235 240

Leu Arg Tyr Ala Pro Asp Gly Ile Leu Gly Leu Gln Leu Ile Asn Gly

245 250 255

Lys Asn Glu Ser Ala His Ile Ser Asp Ala Val Gly Val Val Ala Gln

260 265 270

Ala Val His Glu Leu Leu Glu Lys Glu Asn Ile Thr Asp Pro Pro Arg

275 280 285

Gly Cys Val Gly Asn Thr Asn Ile Trp Lys Thr Gly Pro Leu Phe Lys

290 295 300

Arg Val Leu Met Ser Ser Lys Tyr Ala Asp Gly Val Thr Gly Arg Val

305 310 315 320

Glu Phe Asn Glu Asp Gly Asp Arg Lys Phe Ala Asn Tyr Ser Ile Met

325 330 335

Asn Leu Gln Asn Arg Lys Leu Val Gln Val Gly Ile Tyr Asn Gly Thr

340 345 350

His Val Ile Pro Asn Asp Arg Lys Ile Ile Trp Pro Gly Gly Glu Thr

355 360 365

Glu Lys Pro Arg Gly Tyr Gln Met Ser Thr Arg Leu Lys Ile Val Thr

370 375 380

Ile His Gln Glu Pro Phe Val Tyr Val Lys Pro Thr Leu Ser Asp Gly

385 390 395 400

Thr Cys Lys Glu Glu Phe Thr Val Asn Gly Asp Pro Val Lys Lys Val

405 410 415

Ile Cys Thr Gly Pro Asn Asp Thr Ser Pro Gly Ser Pro Arg His Thr

420 425 430

Val Pro Gln Cys Cys Tyr Gly Phe Cys Ile Asp Leu Leu Ile Lys Leu

435 440 445

Ala Arg Thr Met Asn Phe Thr Tyr Glu Val His Leu Val Ala Asp Gly

450 455 460

Lys Phe Gly Thr Gln Glu Arg Val Asn Asn Ser Asn Lys Lys Glu Trp

465 470 475 480

Asn Gly Met Met Gly Glu Leu Leu Ser Gly Gln Ala Asp Met Ile Val

485 490 495

Ala Pro Leu Thr Ile Asn Asn Glu Arg Ala Gln Tyr Ile Glu Phe Ser

500 505 510

Lys Pro Phe Lys Tyr Gln Gly Leu Thr Ile Leu Val Lys Lys Glu Ile

515 520 525

Pro Arg Ser Thr Leu Asp Ser Phe Met Gln Pro Phe Gln Ser Thr Leu

530 535 540

Trp Leu Leu Val Gly Leu Ser Val His Val Val Ala Val Met Leu Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Asp Arg Phe Ser Pro Phe Gly Arg Phe Lys Val Asn Ser Glu

565 570 575

Glu Glu Glu Glu Asp Ala Leu Thr Leu Ser Ser Ala Met Trp Phe Ser

580 585 590

Trp Gly Val Leu Leu Asn Ser Gly Ile Gly Glu Gly Ala Pro Arg Ser

595 600 605

Phe Ser Ala Arg Ile Leu Gly Met Val Trp Ala Gly Phe Ala Met Ile

610 615 620

Ile Val Ala Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala Phe Leu Val Leu Asp

625 630 635 640

Arg Pro Glu Glu Arg Ile Thr Gly Ile Asn Asp Pro Arg Leu Arg Asn

645 650 655

Pro Ser Asp Lys Phe Ile Tyr Ala Thr Val Lys Gln Ser Ser Val Asp

660 665 670

Ile Tyr Phe Arg Arg Gln Val Glu Leu Ser Thr Met Tyr Arg His Met

675 680 685

Glu Lys His Asn Tyr Glu Ser Ala Ala Glu Ala Ile Gln Ala Val Arg

690 695 700

Asp Asn Lys Leu His Ala Phe Ile Trp Asp Ser Ala Val Leu Glu Phe

705 710 715 720

Glu Ala Ser Gln Lys Cys Asp Leu Val Thr Thr Gly Glu Leu Phe Phe

725 730 735

Arg Ser Gly Phe Gly Ile Gly Met Arg Lys Asp Ser Pro Trp Lys Gln

740 745 750

Asn Val Ser Leu Ser Ile Leu Lys Ser His Glu Asn Gly Phe Met Glu

755 760 765

Asp Leu Asp Lys Thr Trp Val Arg Tyr Gln Glu Cys Asp Ser Arg Ser

770 775 780

Asn Ala Pro Ala Thr Leu Thr Phe Glu Asn His His His His His His

785 790 795 800

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atggaaaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccagg ctctacagga 60

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

caccaccacc accatcac 18

<210> 5

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gccgccacc 9

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

taatacgact cactataggg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tagaaggcac agtcgaggc 19

<210> 8

<211> 2382

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cgtgccgcgt gcgaccccaa gatcgtcaac attggcgcgg tgctgagcac gcggaagcac 60

gagcagatgt tccgcgaggc cgtgaaccag gccaacaagc ggcacggctc ctggaagatt 120

cagctcaatg ccacctccgt cacgcacaag cccaacgcca tccagatggc tctgtcggtg 180

tgcgaggacc tcatctccag ccaggtctac gccatcctag ttagccatcc acctaccccc 240

aacgaccact tcactcccac ccctgtctcc tacacagccg gcttctaccg catacccgtg 300

ctggggctga ccacccgcat gtccatctac tcggacaaga gcatccacct gagcttcctg 360

cgcaccgtgc cgccctactc ccaccagtcc agcgtgtggt ttgagatgat gcgtgtctac 420

agctggaacc acatcatcct gctggtcagc gacgaccacg agggccgggc ggctcagaaa 480

cgcctggaga cgctgctgga ggagcgtgag tccaaggcag agaaggtgct gcagtttgac 540

ccagggacca agaacgtgac ggccctgctg atggaggcga aagagctgga ggcccgggtc 600

atcatccttt ctgccagcga ggacgatgct gccactgtat accgcgcagc cgcgatgctg 660

aacatgacgg gctccgggta cgtgtggctg gtcggcgagc gcgagatctc ggggaacgcc 720

ctgcgctacg ccccagacgg catcctcggg ctgcagctca tcaacggcaa gaacgagtcg 780

gcccacatca gcgacgccgt gggcgtggtg gcccaggccg tgcacgagct cctcgagaag 840

gagaacatca ccgacccgcc gcggggctgc gtgggcaaca ccaacatctg gaagaccggg 900

ccgctcttca agagagtgct gatgtcttcc aagtatgcgg atggggtgac tggtcgcgtg 960

gagttcaatg aggatgggga ccggaagttc gccaactaca gcatcatgaa cctgcagaac 1020

cgcaagctgg tgcaagtggg catctacaat ggcacccacg tcatccctaa tgacaggaag 1080

atcatctggc caggcggaga gacagagaag cctcgagggt accagatgtc caccagactg 1140

aagattgtga cgatccacca ggagcccttc gtgtacgtca agcccacgct gagtgatggg 1200

acatgcaagg aggagttcac agtcaacggc gacccagtca agaaggtgat ctgcaccggg 1260

cccaacgaca cgtcgccggg cagcccccgc cacacggtgc ctcagtgttg ctacggcttt 1320

tgcatcgacc tgctcatcaa gctggcacgg accatgaact tcacctacga ggtgcacctg 1380

gtggcagatg gcaagttcgg cacacaggag cgggtgaaca acagcaacaa gaaggagtgg 1440

aatgggatga tgggcgagct gctcagcggg caggcagaca tgatcgtggc gccgctaacc 1500

ataaacaacg agcgcgcgca gtacatcgag ttttccaagc ccttcaagta ccagggcctg 1560

actattctgg tcaagaagga gattccccgg agcacgctgg actcgttcat gcagccgttc 1620

cagagcacac tgtggctgct ggtggggctg tcggtgcacg tggtggccgt gatgctgtac 1680

ctgctggacc gcttcagccc cttcggccgg ttcaaggtga acagcgagga ggaggaggag 1740

gacgcactga ccctgtcctc ggccatgtgg ttctcctggg gcgtcctgct caactccggc 1800

atcggggaag gcgcccccag aagcttctca gcgcgcatcc tgggcatggt gtgggccggc 1860

tttgccatga tcatcgtggc ctcctacacc gccaacctgg cggccttcct ggtgctggac 1920

cggccggagg agcgcatcac gggcatcaac gaccctcggc tgaggaaccc ctcggacaag 1980

tttatctacg ccacggtgaa gcagagctcc gtggatatct acttccggcg ccaggtggag 2040

ctgagcacca tgtaccggca tatggagaag cacaactacg agagtgcggc ggaggccatc 2100

caggccgtga gagacaacaa gctgcatgcc ttcatctggg actcggcggt gctggagttc 2160

gaggcctcgc agaagtgcga cctggtgacg actggagagc tgtttttccg ctcgggcttc 2220

ggcataggca tgcgcaaaga cagcccctgg aagcagaacg tctccctgtc catcctcaag 2280

tcccacgaga atggcttcat ggaagacctg gacaagacgt gggttcggta tcaggaatgt 2340

gactcgcgca gcaacgcccc tgcgaccctt acttttgaga ac 2382

<210> 9

<211> 2382

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

agggcagcat gcgacccaaa gatcgtgaac atcggagcag tgctgagcac aaggaagcac 60

gagcagatgt tcagggaggc agtgaaccag gccaacaaga gacacggaag ctggaagatc 120

cagctgaatg caacctccgt gacccacaag cctaatgcca tccagatggc cctgtccgtg 180

tgcgaggacc tgatttcctc ccaggtgtat gccatcctgg tcagtcaccc ccccacccct 240

aacgaccact tcacccccac ccccgtctcc tacaccgccg gattctatcg gattcctgtc 300

ctgggcctga ccacccgcat gtctatctac tccgacaagt ccatccacct gtccttcctg 360

cggaccgtcc ccccttactc ccaccagtcc tccgtgtggt tcgagatgat gcgcgtgtac 420

tcctggaacc acattatcct gctggtgtcc gacgaccacg agggccgtgc tgctcagaag 480

aggctggaga ccctgctgga agaacgtgag agtaaagccg agaaggtgct gcagttcgac 540

cccggcacaa agaacgtgac agccctgctg atggaggcta aagaactgga ggcaagggtg 600

atcatcctgt ccgccagcga agatgatgcc gcaaccgtgt acagggccgc cgctatgctg 660

aatatgaccg gcagtggcta cgtgtggctg gtgggagaaa gggaaatctc cggaaatgcc 720

ctgaggtacg cccctgacgg gattctggga ctgcagctga tcaacggaaa gaacgaaagc 780

gctcacattt ccgacgccgt gggtgtggtg gcccaggctg tgcatgagct gctggagaag 840

gagaacatta ccgacccccc ccggggatgc gtcggaaata ccaacatctg gaagacaggc 900

cccctgttca agagagtgct gatgtccagt aaatatgctg acggcgtcac tggaagagtg 960

gaatttaacg aggacggcga caggaagttt gcaaactact ccatcatgaa cctgcagaac 1020

cggaagctgg tgcaggtggg gatctacaac ggcacccacg tgattcccaa tgacaggaag 1080

atcatctggc caggcggcga aaccgagaag cccaggggtt accagatgtc cacaagactg 1140

aagatcgtga caatccacca ggagcccttc gtgtacgtga agcccaccct gagcgacggc 1200

acctgcaaag aggagttcac cgtgaatggc gaccccgtga aaaaggtcat ctgcaccggc 1260

cccaatgaca cctcccccgg atcacccaga cacaccgtgc cccagtgctg ctatggcttc 1320

tgtatcgacc tgctgatcaa gctggccagg accatgaact tcacctacga ggtgcacctg 1380

gtggccgacg gcaagttcgg cacccaggaa agggtgaaca actccaataa gaaagagtgg 1440

aacggaatga tgggcgaact gctgagcgga caggccgaca tgatcgtggc ccccctgacc 1500

atcaacaacg aaagagccca gtacatcgag ttcagcaaac ccttcaagta ccagggcctg 1560

accatcctgg tgaaaaagga aatcccccgc tccaccctgg actccttcat gcagcccttc 1620

cagagcaccc tgtggctgct ggtgggactg tccgtgcacg tcgtggccgt catgctgtac 1680

ctgctggata ggttcagccc cttcggcagg ttcaaggtga actccgagga ggaagaggag 1740

gatgcactga ccctgtcttc tgctatgtgg ttttcctggg gggtgctgct gaatagcggc 1800

atcggcgagg gcgcccctag gtccttttcc gcaaggatct tgggaatggt gtgggccgga 1860

tttgccatga ttatcgtggc ttcctacacc gctaacctgg ctgccttcct ggtgctggac 1920

aggcccgagg agaggatcac cggcatcaac gaccccaggc tgaggaatcc ttccgacaag 1980

tttatctacg ccaccgtgaa gcagtcctcc gtcgacattt actttaggag gcaggtggag 2040

ctgagtacaa tgtacaggca catggagaaa cacaactacg agtccgccgc cgaggccatc 2100

caggcagtga gagacaacaa actgcacgcc tttatctggg acagcgcagt gctggagttc 2160

gaggcaagcc agaagtgcga cctggtcacc accggcgaac tgttcttcag gagtggcttc 2220

ggaatcggaa tgaggaagga ctccccctgg aagcagaacg tgagtctgag cattctgaag 2280

agtcacgaaa acggctttat ggaggacctg gataagacct gggtgaggta ccaggagtgc 2340

gacagcagga gcaacgctcc agccaccctg accttcgaga ac 2382

Claims

1.自身免疫性脑炎相关的NMDAR重组蛋白的编码序列，其特征在于，所述编码序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的编码序列编码的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组蛋白表达载体，其特征在于，所述重组蛋白表达载体含有SEQ ID NO.1所示编码序列的质粒载体。

4.权利要求2所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S4.收集细胞上清，纯化，得到重组蛋白。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述S2中，还包括验证步骤：将重组蛋白表达载体转化进大肠杆菌的感受态细胞，培养，挑取转化后的单菌落进行PCR验证。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述PCR验证时所用的正向引物为T7promoter primer，反向引物为BGH reverse primer。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述重组载体为真核载体pcDNA3.1(+)。

8.权利要求2所述的重组蛋白在制备抗NMDAR自身抗体检测材料中的应用。

9.一种抗NMDAR自身抗体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的重组蛋白。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白与磁微粒偶联。