JPH02500164A - 新規なイムノアツセイ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なイムノアッセイ方法 本発明はアポリボプロティンの検出または評価、特に血漿アポリボプロティン濃 度（レベル）の測定のためのイムノアッセイ方法に関する。

イムノアッセイ方法は体液検体中のプロティンを測定するのに広く用いられてい る。かかる方法が満足のいくものとなるには、多くの要件が満たされねばならな い＝（ａ）アッセイされるべきプロティンの１次標準を入手する必要がある。し ばしばかがるプロティンは、例えば凝集物を形成するためにあまり安定しておら ず、またこのことはそれらの標準としての信頼性に悪影響を及ぼす。

更にわずかにいくつかの例外はあるにせよ標準検体は面倒な分離方法、例えば血 漿分別により取得する必要がある。

（ｂ）プロティンは通常免疫学的方法によりアッセイされる。従って、アッセイ の特異性は抗原−抗体反応の特異性に依存する。かかる特異性は単クローン抗体 の使用により改善することができる。

（Ｃ）採用されるイムノアッセイの手順は、それが実際に存在する濃度で所要の プロティンを検出するのに十分な感度がなければならない、場合によっては、例 えばアポリボプロティンの場合は、正常時濃度と病態時濃度の差はあまり大きく ない、放射性同位元素の使用に依存するイムノアッセイ方法は現在使用されてい る最も鋭敏な方法の一つである。放射性同位元素の取り扱いは、安全上の配慮か ら特別な装置の使用を必要とし、一般には回避される。従って免疫酵素法（例え ばＥＬＩＳＡおよびＥＭＩＴ）が十分鋭敏であればそれらが好ましい。

（ｄ）イムノアッセイ方法は信頼するに十分な再現性を有していなければならな い、既述の如く、これは一部１次標準の安定性に依存する。それはまた実験手順 の他のパラメータにも依存する。

（ａ）広く用いられるべきイムノアッセイ方法は操ｆ？−が簡単で安価でなけれ ばならない、従ってヒト血漿の分別により得られる精製血漿プロティンなどとい った高価な試薬はできる限り避けるべきである。使用される試薬は安定で、貯蔵 し易く、また処分上も問題を生じないものとすべきである０作業者に危険が伴う べきではない。

（ｆ）自動操作に適した方法は、大規模使用が望ましい場合、例えば患者検体の ルーチン検索などの場合に明らかに有利である。

前述の如く、本発明は、血漿アポリボプロティン濃度の測定に特に重要である。

高脂血症に伴うと考えられる心血管系疾患への傾向を評価するためには、血漿コ レステロールおよびトリグリセライドだけでなく低密度リボズロテイン（例えば アポリボプロティンＢ）および高密度アポリボプロティン（例えばアポリボプロ ティンＡＩ）に関連するコレステロールのフラクションも測定できるのが望まし い、最近の研究によれば、アポリポプロティン＾Ｉ対アポリボプロティンＢの血 漿濃度比はコレステロールおよびトリグリセライド濃度の絶対値よりも心血管系 の危険の特異的かつ鋭敏な指標であることが示されている６本発明の方法は、こ の比を簡単かつ迅速に測定するのに特によく適している。

本発明の方法は、測定されるべきアポリボプロティンおよび標識プロティンの両 方からの配列を含み組換え口ＨＡ技術により生産される触合（ハイブリッド）プ ロティンの使用に基づいている。二種類のプロティンを順次コードする遺伝子の 生産にＤＮＡ技術を用いることは知られている。　ＷＱ　８７１′０２０６１は 、ペプチド活性成分と該活性成分の担体とを低密度リボプロプロチイン（ＬＤＬ ）受容体結合領域、例えばアポリボプロティンＢまたはアポリボプロティンＥの それに共有結合的に結合させた薬剤デリバリ−システムを開示している。そのデ リバリ−システムは［０［受容体結合領域およびペプチド活性成分をコードする ＤＮＡから発現される。

Ｗｏ　８６１′０６７４２は、標識プロティンβ−ガラクトシダーゼとプロティ ン例えばヒト界面活性アポプロティン、ヒト心房ナトリウム尿排泄充進因子また はインフルエンザウィルス内に含まれるヘマグルチンプロテインより成る融合プ ロティンを酵素イムノアッセイに用いることを開示している。しかしながらその プロティンをコードする遺伝子はオリゴヌクレオチドから全面的に合成により生 産され、また生産された配列は、例えば１２または２９個のアミノ酸、すなわち わずかにプロティンの小断片を含むにすぎない、このような配列ではアポリボプ ロティンなどの極めて大きなプロティンの場合に十分な正確さをもってアッセイ を行うことはできない、何故ならば、酵素標識プロティン断片とアッセイされる べきプロティンとが相互に十分類似していないからである。この問題は、アッセ イがアッセイされるべきプロティンの単純な溶液に対して行われるのではない： むしろアッセイされるべき素材は臨床検体、例えばアッセイを妨げる可能性のあ る多くの他の物質を含有するヒト血清である、ということによって複雑となる。

更に、プロティンの全配列が知られていない場合には、ヒト血清に対する信頼性 あるアッセイの実施を可能にするのに十分な程度天然アポリボプロティンＢに類 似しているアポリボプロティンＢの抗原性断片をコードする遺伝子をオリゴヌク レオチドから構築することは不可能である。

ハイブリッドプロティンはそれが少くとも、検出されるべきプロティンに特異的 な抗体、通常は単クローン抗体、と信頼性をもって反応するのに十分な検出され るべきプロティンを含有する限り、検出されるべきプロティンの全体を含む必要 はない、この遺伝子工学的に得られたハイブリッドプロティンは、本発明におい ては、該ハイブリッドプロティンが、固体支持体に結合された抗体に対して検出 されるべきプロティンと拮抗するイムノアッセイ法に用いられる。支持体に結合 される標識プロティンの割合は、検出されるべきプロティンの量と逆比例の関係 にある。このようにしてイムノアッセイ法を行う背景となる一般原理はよく知ら れている。より詳細には、本発明は、検出されるべきプロティンを標識プロティ ンに対し、検出されるべきプロティンが抗体と結合する能力、または標識プロテ ィンがそれ自体として例えば直接観察可能な効果例えば発色を生じる酵素として 働く能力をいずれも妨げないように接合するための簡単にしてかつ信頼性のある 手段を提供するハイブリッドプロティンを用いることにある。

従って、本発明は、検体中のアポリボプロティンに対する抗体を結合した固体支 持体を該アポリボプロティンを含有する検体と、そして該アポリボプロティンの 少くとも抗原性部分と標識プロティンとより成る融合（またはハイブリッド）プ ロティンと接触させ、次いで前記支持体に結合したまたは結合しない標識プロテ ィンを観察または測定することより成る検体中のアポリボプロティンの検出また は評価方法を提供する。既に説明したとおり、本明細書で用いる用語「融合プロ ティン」または「ハイブリッドプロティン」とは、（１）検出されるべきアポリ ボプロティンの少くとも抗原性配列をコードし、そしてアポリボプロティンのｃ ［ｌＮ＾から単離されたＤＮＡ配列と（２）標識プロティンをコードするＤＮＡ 配列を含む遺伝子の発現により生産されるプロティンを意味する。

「標識プロティン」という用語は、観察可能な効果、好ましくは定量測定され得 る効果を生じることによって抗体を介して固体支持体に結合したハイブリッドプ ロティンの量（あるいは固体支持体に結合されなかったハイブリッドプロティン の３１）の測定値を与えることができるプロティンを意味する。

本発明の方法は通常、検体中のプロティンとハイブリッドプロティンを支持体に 結合した抗体に対して拮抗させることによって行われるが、検体中のプロティン をまず支持体上の抗体に結合させ、次いで、該プロティンに接合しなかった抗体 の量を融合プロティンと反応させることにより測定することも可能でありかつ本 発明の範囲に包含される。この代替方法は、明らかに、支持体に結合した抗体の 量が検体中に存在する全プロティンと反応するのに十分な量よりら多いことに依 存している０通常は、拮抗式アラ七イ方法が好ましい０本発明者はこれを組換え 免疫酵素拮抗アラ七イ（ＲｅＣ０１ｂｉｎａｎｔ　ＩＩＩＩｌｕｎＯ−Ｅｎ−ｚ ｙｉａｔｉｃ　Ｃｏｌ１ｐｅｔｉｔｉｏｎ　Ａｓ５ａｙ　、　ＲＩＥＣＡ　）と 称している。

本発明は、組換えＤＮＡ技術によるハイブリッドプロティンの生産を伴う、いく つかのアポリボプロティン例えばアポＡ１＜ａｐｏ＾１）の対応ＤＮＡ配列は既 に知られている。

しかしながら、プロティンの構造がまだ知られていない場合例えばアポリボプロ ティンＤの場合であっても、そのプロティンをコードする遺伝子をクローン化し そしてそれを１ラスミド内に取り込むことにより、それを標準的な実験方法（例 えばＨａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈおよび５ａａｎｂ−ｒｏｏｋｅ、　” Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｎａｎｕ ａビ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９ｇ２ ）参照）を用いて適宜の微生物中で発現できるようにすれば、本発明を用いるこ とができる。Ｍ合プロティンを製造するのに適した方法の一つを以下詳述する。

ハイブリッドプロティンは更に標識プロティン、例えば酵素またはその他のプロ ティンでその存在を例えば螢光、発光、レーザー色素などにより、容易に検出ま たは測定できるものの配列を含んでいる。一般に、従来技術のイムノアッセイ法 において標識として用いられてきたものと同じプロティンを本発明に用いること ができる。

使用できる標識にはβ−ガラクトシダーゼホスファターゼおよびペルオキシダー ゼが包含される。

標準的な遺伝子工学的方法を用いて、任意の特定のプロティン、従って本発明の 場合には検出されるべきプロティンと標識プロティンの両者をコードするＤＮＡ 配列を単離し特徴付け、そしてそれら二つのプロティンをコードする二つの遺伝 子（ＤＮＡ配列）のハイブリッドを構築することができる０通常、ハイブリッド は、標識プロティンをコードする細菌遺伝子と検出されるべきプロティンをコー ドする真核遺伝子を含むが、二つの異なる細菌遺伝子または二つの異なる真核遺 伝子を含むハイブリッドを構築することもできる。Ｉｋ初の場合、真核遺伝子の 発現は通常細菌プロモーターの制御下にあるが、逆の状態とすることも可能であ る０両方の配列とも真核を起源としている場合には、そのハイブリッドは例えば 適宜のセルライン中で発現させることができる。各々の場合に、ハイブリッドＤ ＮＡ配列を制御するブロモ−ターはハイブリッドｎＲＮＡ、従って細菌および真 核配列（または二つの細菌または二つの真核配列）が融合したプロティンを産生 するように活性化することができる。

このようにして作られたハイブリッドプロティンを用いれば、本発明の方法に重 要な長所がもたらされる。より詳細には、細菌遺伝子が真核遺伝子に融合されて いる好ましいゲースでは、有意な細菌配列を含む融合プロティンは細菌１０テア ーゼによる分解可能性が低下する。

ハイブリッド遺伝子は、細菌遺伝子発現に必要な大部分の信号を含むように構築 することができ、またそれ故に効率的に転写し翻訳することができる。融合プロ ティンに対して用いられる精製手）頃は、その融合プロティンの細菌部分の生化 学的性質を用いることにより簡素化することができる。Ｍ後に、そして最も有意 義なことには、融合プロティンは、検出されるべきプロティンの抗原性またはそ の他の性質そして更に標識プロティンの酵素（またはその他の標識）活性をも実 質的に無変化のまま保有している。

より特定的には、β−ガラクトシダーゼの酵素活性と・アポリボプロティンＡＩ またはアポリボプロティンＢの抗原性および親水−疎水性とを組み合わせたハイ ブリッドβ−ガラクトシダーゼ−アポリポプロティンを製造した。

そのβ−ガラクトシダーゼ活性は例えば血清、血漿または全血などといった検体 中のアポリポプロティン濃度の測定のためのアッセイ法に用いることができる。

そのアポリポプロティンは、アポリボプロティンに対する特異単クローン抗体と 特異的に反応するその能力を保有している。単クローン抗体を用いるのが好まし いが、それは、そのようにすることによって、バックグラウンド交叉反応に起因 するあらゆる変動および多クローン抗体の使用に伴う生産物変動を除去できるか らである。

本発明方法を実施する好ましい方法は、一般的に次のとおりである。単クローン 抗体をまず適当な固体支持体、例えば微量定量プレートのウェル、または適当な プラスチック材料、多糖類マトリクス、ペーパー、まタハＣｅ−Ｃｅ−１１ｏな どに吸着させる０次に、過剰のハイブリッドプロティンと検査対象の血漿、血清 または全血の都合よく希釈された検体を用いて、吸着された単クローン抗体に対 する拮抗反応を行う、未結合試薬を除去した後、固体支持体に結合したβ−ガラ クトシダーゼとそれに対して特異的な色素原基質の間の酵素反応を開始する。都 合よくは、その酵素反応は、例えば４０５　ｎｎで、分光光度測定的に測定でき る色を生じる。その場合、測定されたβ−ガラクトシダーゼ活性と検体中のアポ リポプロティン濃度との間には定量的逆比例関係がある。

単クローン抗体は、被覆されたＥＬＩＳＡウェル、例えば、５ｅｐｈａｒｏｓｅ 　、アガロースまたは適当なグラフトコポリマーなどの被覆されたビーズ、例え ばポリアミド、ニトロセルロースまたはセルロースアセテートなどの被覆された カラムまたは膜に固定することができる。

単一の固体支持体、例えば微量定量プレートの単一ウェルを用いて多重的測定を 行うことができる０例えば、そのようなウェルをそれぞれａｐｏ−ＡＩおよびａ ｐｏ　Ｂの両者に対して特異的な単クローン抗体で被覆することができ、次いで 、二種類のハイブリッドプロティン、すなわち、ある酵素に結合したａｐｏ　Ａ ｌを取り込んだものと異なる酵素に結合しなａｇｏ　Ｂを取り込んだ第２のもの とを甲いて拮抗反応を同時に行うことができる。それら二種類の酵素は、異なる 波長で測定できる呈色反応を生じることができる、すなわち二つの拮抗反応を別 々に測定できるように選択される。所望によっては、一方の酵素は呈色反応を生 じ、そして他方は異なる種類の反応、例えば螢光生成物の生産を生じるようにす ることもできる。

本発明は５．抗体、好ましくは単クローン抗体を結合した固体支持体と本発明に 特有のハイブリッドプロティンとより成る新規方法実施のためのテストキットを 包含する。希釈、洗浄などを行うための通常の試薬も取り込んでもよい。

新規方法の実施について以下に詳述する。

プラスミドＤＬＩＲＡＩの構築 プラスミドｐｕＲＡＩは、β−ガラクトシダーゼとそれに続く成熟（ｍａｔｕｒ ｅ）ヒトアポリボプロティンＡＩとより成るハイブリッドプロティンをコードす る。　Ａｐｏ　Ａｌ配列はｃＤＨＡクローンから得（Ｓｈａｒｐｅ　ｅｔ　ａｌ 、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ。

（１９８４）　ｏｏ　３９１７−３９３２）　、そこからシグナルペプチドをコ ードする配列を除去した。その配列を活性β−ガラクトシダーゼをコードする発 現ベクターｐＵＲ２９１（Ｒｕｔｈｅｒ旦旦、　ＥＨＢＯＪ、　（１９８４）　 ２　、　Ｄｏ、　１７９１−４　）に挿入した。

ａｐｏ　Ａｌ配列は正しいフレームでβ−ガラクトシダーゼポリペ１チドをコー ドする配列の連続部分として挿入した。

従って、プラスミドＤＵＲＡＩは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で増殖させるとβ− ｇａｌ酵素活性とａｐｏ　Ａｌ抗原特性を有するハイブリッドプロティンを産生 することができる。

バイブ１ツドプロテイン　−ガラクトシダーゼ−アポリボプローインの　および 精 細菌の増殖およびβ−ｇａｌプロモーターの誘導のための標準１０トコールに従 って、ハイブリッドβ−ｇａｌａｐｏ　ＡＴプロティンを産生じた（ＬＯｒｅｎ Ｚｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｔ、　ＦＥＢＳＬｅｔｔ、　（１９８６）胆ムｐｐ３４３ −６参照）、ハイブリッドプロティンは細菌ペレットから抽出し、そして標準プ ロトコールに従って分別した［Ｈａｒｓｔｏｎ、ＢｉｏｃｈｅＩｌ、Ｊ、　２４ ０．１−１２　（１９８６）　；　Ｃｈｅｎｇ、ＢｉｏｃｈｅｒＡ、Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ＋１ｎｕｎ。

１１１　１０４−１１１　（１９８３）；およびＳｃｈｏｅｍａｋｅｒ　ｅｔ　 ａｌ　ＥＨＢＯｊ、ユ、７７５−７８０　（１９８５）参照１０回収されたβ− ｇａｌ活性は１．４５＾１０７単位／′ｌｊ（超音波抽出液）であった。

ｐＵＲＡＩと同じ方法によりハイブリッドプロティンをコートする更なるプラス ミドを製造した。

プラスミドＤＩＳＨＡＩ　（ｌ５ｔ４ＡＩ）ヲｐＵＲＡｌ　ト同り方法テ作製し たが、Ｉ）ＩＳＨＡＩの構築を第１図に示す、同じ方法を用いて、ｃＤＮＡりｏ −ンｐＡＢＦおよびｐχ８２（にｎｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８ ６）　３２３　ｐ、７３４）およびｐＢ４　（Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ　ｅｔ　ａｔ 　Ａｒ−ｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　（１９８５）　５８０．２７７）から 誘導されるアポリボプロティンＢ−１００ＤＮＡをコードする配列を適宜の発現 ベクターでクローン化して第２図に示されるようなグラスミドｐ１５１４Ｂ１、 Ｉ）ｌｓＨＢ２、ＤＩＳＨＢ３、ｐｌｓＨＢ４　オヨＵｐＴｓＨＢ５ヲ得り、　 ｐｌｓＨＢｌ　（ＩＳＨＢＩ）ニ、Ｊ：、　’）Ｑ現すｈ；Ｅ、ハイブリッドプ ロティンだけが、ウェスタンブロッティングによる判定によれば、使用ａｐｏ　 Ｂ単りローン抗体との免疫学的反応性を有する。

バイブ１ツドプロテインｌ５ＨＡＩおよびｌ５ＨＢＩのアンピシリン（１ｏｏμ ｇ／′ｎｊ）を含有スルＩＩＩｊノ滅菌［Ｂプロス（１０ｇ７’ｊ　Ｂａｃｔｏ 　Ｔｒｙｏｔｏｎｅ　、５　ｇ／ｊＢａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔお よびｉｏｇ／ｊ　Ｎａｃオ）に単一大腸菌コロニーを導入しそして３７゛ｃで６ 時間増殖させる。

次にこの予備培養液を１００ｉｊの新鮮滅Ｓｔａブロス＋アンピシリン１００μ ｇｉ’ｌｌｊに希釈し、そして軌道プラットホーム（ｏｒｂｉｔａｌ　ｐｌａｔ ｆｏｒｌｌ）上テ３７℃で−夜増Ｎ：ｌ’ｅる。この第２予備培養液を、発酵槽 （Ｃｈｅｎａｐ　）中、シュリスカルディティラド＜　５ｕｒｒｉｓｃａｌｄａ ｔｅｄ）スチームにより系内で滅菌され、Ｉ　ＩＩｊの消泡剤を補給した１０ｊ のＥ８プロス＋アンピシリン１００μｇ７′ｔａｊで希釈する。

Ｆｕｎｄａ　ＩＵＸ装置により測定される培地の濁度が培養が対数期後期にある ことを示すまで（２〜３時間）、細菌を３７℃で増殖させる。

この時点で、１０ＩＩＪの１Ｍイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド ＜　ＩＰＴＧ　−Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｎ、Ｃｏ、　）をブロスに添加して（最終 的に１ｎＮ）を添加してグロティン合成を誘導する：増殖を更に２時間続ける。

最後にプロスを水冷し、そして５ｏｒｖａｌｌ冷却式遠心分離器（ローターＨＧ ４Ｌ）を用いて４０００ｒｏｎ　、４℃で３０分間遠心分離する。

細菌ペーストを緩衝液Ｔｒｉｓ　ＨＣｊ　４０ＩＩＮ　、　ｐＨ８、Ｈａｔ　Ｅ ＤＴ八〇へ５１１８．　ＨＱＣＩ！ｘ　１１１８．　ＤＴＴ　Ｉ　ＩＤＨ，ＰＭ ＳＦ　１０　ｎｔｉ’１に再懸濁し＆浄後、Ｆａｌｃｏｎチューブに入れて遠心 分離し、そして−８０℃で貯蔵する。

１に脂肪り 菌体ペーストを１０ｎｊ／ｇ（菌体）ノ緩衝ＪＡ（０，ＩＨＴｒｉｓ　ＨＣ４’ 、ＤＨ７，８，１１１８ＨＱＣ７２，０，５ｎＨＥＤＴＡ、　０．ＩＨＮａＣｊ ！　（０，１８Ｌ−アルギニン塩酸塩を含有）　、　１０ｑ／’ｊＰＨＳＦおよ び７０　ｉＨ２−メルカプトエタノールを同時に添加する）に再懸濁する。

リゾチームを最終濃度が０．５　ｒｕｒｌ’　ＩＮとなるように添加し、そして その混合物をＯ’Ｃで２０分間放置する０次に菌体を超音波により水上で８０ワ ツトで５分間（１分間ずつ）破砕した。

原抽出液を１００００八ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を捨て、ベレット を等容の抽出緩衝液（７０ｎＨ２−メルカプトエタノールおよび０．５％Ｔｒｉ ｔｏｎ　Ｘ−１００を含有する緩衝液Ａ）に再懸濁した。

その懸濁液を４℃で３０分間わずかな撹拌状態におき、次いで１００００　ｘ　 ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、そのベレットを捨て、そして夾雑プロティンを １１４ｇ／’ｊの無水硫酸アンモニウム（２０％飽和度）を上清に徐々に添加す ることによって沈殿させる。その懸濁液を４℃で２時間平衡させ、次いで１１０ ００八ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。そのベレットを捨て、そしてその上清 を２ｊの１００１１１４燐酸ナトリウム緩ａｊ液、ｐＨ７、に対して透析する。

凝集物を遠心分離によって除き、そして上滑を少量のアリコートに分け、そして １％グリシンおよび１％マルトースを用いて凍結乾燥する。

極ｌ二」針」− 菌体ペーストを１０　ｉｊ／’ｇ　（菌体）の超音波処理緩衝液（０，ＩＨＬ− アルギニン塩酸塩を含有するＭ衝液Ａ、０、ＩＨＴｒｉｓ　ＨＣｊ　、　ＤＨ？ 、８．１　ｍＨＨＱＣｈ、０．５１１ＨＥＤＴＡ、０、　ＩＮ　ＮａＣｊ　、１ ０ｒａｔ／’Ｊ！　ＰＭＳＦ、７０ｉＨ２−メルカプトエタノールを同時に添加 する）に再懸濁する。

リゾチームを０．５■／′ＩＩｊの最終濃度となるように添加し、そしてその混 合物を０℃で２０分間放置する。

次に菌体を氷上で、８０ワツトで５分間（１分間ずつ）超音波処理することによ り破砕する。

原抽出液を１００００　Ｘ　ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を捨て、ベレ ットを等容の抽出緩衝液（７０ｎＨ２−メルカプトエタノールおよび０．５％Ｔ ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有する緩衝液Ａ）に再懸濁した。

その懸濁液を４℃で３０分間わずかな撹拌状態におき、次いで１００００　Ｘ　 ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上滑を捨含有する緩衝液Ａ）に再懸濁した。

この懸濁液を４℃で３０分間ゆっくり攪拌しながらインキュベートし、次いで１ １０００　八ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。

そのベレットを捨て、上清を緩衝液Ａで２倍希釈し、そして５■、’ｊ　ＰＨ５ Ｆおよび１．２５ｉＨ還元型グルタチオンおよび０．２５ｉＨａ化型グルタチオ ンを含有する同じＭ衝液２１に対して透析する。透析後、懸濁液を遠心分離して すべての不溶性凝集物を除き、次いでそれを少量のアリコートに分け、そして１ ％グリシンおよび１％マルトースを用いて凍結乾燥する。

ハイブリッドプロティンｌ５ＨＡおよびｌ５ＨＢＩの発酵・精■ １０ｊ容発酵槽中でのＩＳＨ＾およびｌ５ＨＢ１組換え大腸菌株の標準的培養物 からは、通常、約５０ｇの菌体（湿重量）が得られる。

精製方法により、発酵１回あたり約１０００■のハイブリッドプロティンを０． ５■凍結乾燥アリコートとして得ることができ、そしてそれらをＰＢＳに再懸濁 するとｌ５ＨＡＩについては１■／ＩＩｊ、またｌ５ＨＢ１については２■／− のプロティン濃度を有する懸濁液が得られる。

これらの懸濁液は均質でなく、またハイブリッドプロティンはｌ５ＨＡＩについ ては約８０％そして１ｓＨ８１については約６０％を表わすことを指摘しておく 必要がある。

しかしながら、それらをアッセイに用いるにはそれ以上の精製工程は不要である 。各測定（検体および標準曲線）には、約５μｇのハイブリッドプロティンが必 要である。従って各発酵から、約２００．０００回の測定分のハイブリッドプロ ティンが得られる。

通常１００回中１ｏ回分の測定は標準曲線およびブランクに用いられる。従って より正確には発酵１回あたり１８０．０００回分の一重測定または９０，０００ 回分の二重測定が可能となる。

アポ１ボブローイン＾１＊ｆ−はアポＳボブロチインＢに対る単クローン　体 本発明のイムノアッセイ方法は好ましくは、生産されたハイブリッドプロティン と対応する天然血漿アポリボプロティンに対して同様の親和性を有する単クロー ン抗体（ＨＡｂ）を必要とする。この要件を満たす単クローン抗体の生産には様 々な方法を入手できる８例えばＧａ１ｆｒｅおよびＨｉｌｓｔｅｉｎ、”Ｐｒｅ ｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏ−。

ｄｉｅｓ、　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　”　、　 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ−Ｚｙ１１０＋００Ｙ　（１９８１）　、　７３　 ＤＤ　１−４６．およびＲｅａｄｉｎｇ　Ｃ，Ｌ、。

Ｊ、Ｉｍｇ＋ｕｎｏ１．Ｈｅｔｈｏｄｓ　（１９８２）　、　５３　ＤＯ２６１ −２９１参照。

十分特異的であれば商業的に入手可能なＨＡｂを使用してもよい、＋４Ａｂを商 業的に入手し得ないときは、所望の性質を有するＨＡｂを次の方法により得るこ とができる。

マウスを天然抗原（アポリボ１０テインＡＩ）で免疫後、ハイブリッドプロティ ンで追加免疫する（あるいは、プロティンの投与順序は逆であってもよい）、免 疫された牌細胞を次いで常法により、適当なマウスミエローマセルラインの細胞 と融合する。得られた融合細胞のライブラリーを次いでハイブリッドプロティン の酵素活性を用いてＡｐｏ　Ａｌおよびハイブリッドプロティンに対するＨＡｔ ｌについて検索する。アポリボプロティンＡＩに代えてアポリボプロティンＢを 用いてこの方法を行えば、アポリボプロティンＢに対する基クローン抗体を生産 することができる。このアッセイ方法は、ａｐｏ　Ａｌおよびａｐｏ　Ｂの相対 量を示すのに特に有用であることから、それらアポリボプロティンのうちの一方 には特異的であるが他方に対しては交叉反応性を示さない基クローン抗体を選択 するのが好ましい。

抗原−抗体複合体の形成におけるハイブリッドプロティンｌ５ＨＡＩおよびＩＳ ＭＢＩの反応速度論は第３図の飽和曲線により示されている。これらの結果は、 以下を行うことにより得られたニ ー０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）で１　、　ｉｏ。

希釈された基クローン抗体、抗ａｐｏ　Ａｌまたは抗ａｐ。

Ｂを用いて９６マイクロウエルプレートを３７℃で１８時間コーティング。

−０，０２％Ｔｗｅｅｎ−２０による洗浄工程。

−室温で１時間１％ＢＳＡで飽和。

−ｌ５ＨＡＩまたはＩＳｌ’ｌＢ１をＰＢＳに希釈。

−各希釈検体を二重にプレートに移す（５０μｇ／ウェル）。

−ＩＳＨＡＩについては３７℃で１時間、そしてｌ５ＨＢ１については３７℃で １／２時間インキュベーション。

−０，０２％Ｔｗｅｅｎ−２０による洗浄工程。

−β−ガラクトシターゼ色素原基質０ＮＰＧを１００μｍ／ウェル添加。

一３７℃で１５分間インキュベーション。

−酵素停止溶液、１Ｍ炭酸ナトリウムを１００μｊ／ウエル添加。

−４０５ｎ１ｍにおける吸光度を測定。

１０μｇ／ｌＩｊの最終濃度に希釈された対応する基クローン抗体で基クローン 抗体でマイクロプレートをコーティングすれば両プロティンについての典型的飽 和曲線が得られる。

”’ＩＨＤ１オヨヒ１２’ＩＬＤＬヲソｈ　ソｈ　ｌ５ＨＡＩ　オよびＴＳ１４ Ｂ１の代わりに用いても、同様の結果が得られる。

この比較は、コーティングされた基クローン抗体が、ハイブリッドプロティンの アポリボプロティン部分および対応する天然アポリボプロティンの両方と反応で きることを示している。

これらのデータは、コーティングされた基クローン抗体に対する結合に関する血 清アポリボ１０テインおよび対応する融合プロティンの間の拮抗アッセイにより 確認される。

ａｐｏ　Ａｌおよびａｐｏ　Ｂについての典型的な拮抗曲線を第４図に示す、こ れらの結果は以下を行うことにより得られたニ ー０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）で１　：　１００希釈され た基クローン抗体を用いて９６マイクロウエルプレートを３７℃で１時間コーテ ィング。

−０，０２％Ｔｗｅｅｎ−２０による洗浄工程。

−室温で１時間１％ＢＳＡで飽和。

−ａｐｏ　Ａｌまたはａｐｏ　Ｂ標準血清をＰＢＳに希釈、そして飽和量のｌ５ ＨＡＩ　（１２，５ｇ　／’霧」）またはｌ５ＨＢＩ　（５０ｇ／ｍｌ）の添加 。

一各希釈検体を二重にプレートに移す（Ｓｏｊ／ウェル）−３７℃でｌ５ＨＡＩ については１時間またはｌ５ＨＢ１については３０分間インキュベーション。

−０，０２％Ｔｗｅｅｎ−２０による洗浄工程。

−β−ガラクトシダーゼ色素原基質０ＮＰＧを１００　ｊ　ｙ’ウェル添加。

一３７℃で１５分間インキュベーション。

−酵素停止溶液、１Ｍ炭酸ナトリウムを１００　ｊ　／’ウェル添加。

−４０５ｎ１１における吸光度を測定。

第５図は、抗ａｐｏ　Ａｌ抗体を１　：　１００ではなく　ｉ　：　ｉｏｏ。

希釈した場合の拮抗曲線を示す、単クローン抗体濃度の最適値を１００μｇ／　 １ｊ−０，１μｇ／Ｉｌｊの範囲で試験し、そして最良の飽和・拮抗曲線は、コ ーティングＭ衝液として０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム（ＤＨ９，５）を用いた場 合、基クローン抗体、抗ａｐｏ　Ａ１および抗ａｐｏ　Ｂの両方について、１０ μｇ、’＋ｕの濃度を用いたときに得られた。

抗原−抗体複合体の形成は、ＩＳＨ＾１については１時間、そして］５ＨＢＩに ついては３０分間内の間、直線的に吸光度を増加させる。従って、これらの反応 時間を拮抗・飽和手順に用いた。

アッセイの為の　手１ アポリボプロティンＡＩ　（ａｐｏ　ＡＩ）に対する基クローン抗体をアッセイ のニーズに従って、０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９，６）に１００〜１０ ００倍希釈した。それらを室温で２時間または４℃で一夜ＥＬＩＳＡプレートに ５０μｊ　／’ウェルとして吸着させた。吸着後、それらウェルをＰＢＳ（０， ５Ｎ、　ｐＨ７，２）中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０で洗浄した。それらウェ ルをＰＢＳ中の１％ＢＳ＾で、室温で１時間飽和させて非特異的結合によるバッ クグラウンドを低下させた。これに引き続いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０で ２回洗浄し、モしてＰＢＳで１回洗浄した。並行的に、検体（例えば血清、血漿 または血液）をＰＢＳで５０倍希釈し、そして１００μｍの希釈液を等容のＤＵ ＲＡＩかち得られたβ−ｇａｌ　−ａｐｏ　ＡＴハラスチックに吸着されたすべ ての単クローン抗体分子を飽和するのに十分である（第３図）、５０μｍ／ウェ ルを用いて、単クローン抗体に対する、血清アポリボプロティンとβ−ｇａｌ　 −ａｐｏ　Ａｌ組換えプロティンの間の拮抗反応を３７℃で１時間行う、これに 引き続いてＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０で３回洗浄しく２００　、ｃ ｚｊ　／ウェル）、そして最後にＰＢＳで洗浄する。

ａｐｏ　Ａｌを介してＨａｂに結合したβ−ガラクトシダーゼ活性を次のとおり 測定した：この酵素の基質（０ＮＰＧ、　。

−ニトロフェニルーＤ−ガラクトピラノシド）を１＋１８ＨＱＣ１ｉ含有Ｎａホ スフ工−トＭＷＩ液（ＤＨ７）に７５０ｏｕｒ／ｊ濃度となるように溶解した。

この溶液をメルカプトエタノールに関し０．１Ｈとし、そしてこのインキュベー ション混合物（１００μｍ）を微量定量ウェルに添加し、そして３７℃で１５分 間インキュベートした。この時点で１００μｍの停止’ＭＮ　（Ｉ　ＨＮａｚＣ Ｏｓ　）を添加し、モしてウェル内溶液の比色吸光度を４０５ｔｖ　１−Ｈｕｌ ｔｉｓｃａｎ　Ｔｉｔｒｅｔｅｃｈ分光光度計を用いて読み取った。ミリ吸光度 （ＩＩＡｂｓ）単位で表わされる吸光度値からアポリボプロティン濃度を標準曲 線から読むことができる。多量のβ−ｇａｌ　−ａｇｏ　Ａｌハイブリッドが保 持されていることは血清中のａｐｏ　Ａｌが低濃度である。ことを意味するので 、ａｐｏ　Ａｌ濃度はその吸光度に逆比例する。第６図は、精製ＨＯ［３、すな わちゾーン超遠心により得られた高密度リボプロティン３、を用いて得られた標 準曲線の一例を示す、　ａａｔｓｃｈ射、虹、、Ｊ、Ｂｌｏ−１ｏａｉｃａｌ　 Ｃｈｅｗ、　（１９８０＞　２５５．　ＤＯ３１７ｇ−３１８５ａｎｄ　Ｇｒｏ ｏｔｅｉ　ａｌ、Ｊ、Ｌ！Ｄ！ｄ　Ｒｅｓ、（１９ｇ２）、　２３０ｐ　１３４ ２　１３５３参照。

検体は次のとおり調製した： 血清、血漿または全血検体　２０μｊ　４０μｍＰＢＳ　＋　９８０μｊ　＋９ ６０μｍ１曙１の　Ｉ　Ｉｌｊの 希釈液Ａ　希釈液Ｂ １００μｊ　１００μｍ β　−ｇａｌ−ａｐｏ　Ａｌ　パイプ”ＪＩＦ＜７０ｔＬｇ７　１ｊ　）　１０ ０　ｕｊ　ｔｏｏ　μｊ２００　μｊＡ２００　μｊＢ 最終希釈検体　１　：　１ｏｏ　１　：　５０最終濃度β−ｇａｌ−ａｐｏ　Ａ ｌ ハイブリッド　３５μＱ　ｔ’　ｒａｅ　３　Ｓμｇ／ｗｅａｐｏ　Ａｌ濃度は 出発材料として血清、血漿または全血を用いて同じ個体について測定した。アリ コートの検体を４℃、−２０℃および一８０℃で貯蔵径測定を繰り返して同一結 果を得た。得られた結果は次のとおりであった：血清ａｐｏ　Ａｌ濃度を異なる 個体についても測定し、そして新規方法を現在臨床的に用いられている免疫拡散 法（Ａｐｏｐｌａｔｅ−Ｄａｉｃｈｉｉ）　（Ｈａｎｃｉｎｉ　ｅｔ　ａｔ、　 １＋ｕｕｎｏｃｈｅｎｉｓ−ｔｒｙ　（１９６５）　２．　２３５“Ｑｕａｎｔ ｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｂｙｒａｄｉａｌ　１ｉＩＩｕｎｏ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ”に基づ（；　Ｃａｒｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ　。

Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、Ａｃｔａ　（１９８２）　１２４　ｐｐ　１６３−１７８ およびｔｅｅ　ｅｔａ！、、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　（１９７４）　 １９０Ｏ５０１−５２０も参照）と比較した。

Ｄａｉｃｈｉｉ法を用いた場合には、視覚による評価または密度計を用いた評価 しか可能とならないことに留意すべきである。それら方法は次のとおり比較する ことができる。

本　日　Ｄａｉｃｈｉｉ　’４ 特異性　＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋　（０，０１−＞１．５γｌ′ウエル）　（３−＞１２γ／ウエル）＋ ＋＋＋　＋ 再現性　十＋＋＋ コスト　低　高 操作簡易度　＋＋＋＋ 所要試験時間　４時間　４８時間 自動化　十＋＋＋ 標準の入手可能性　細菌発酵または　ヒト血漿分別真核細胞生産 融通性および更な る発展の可能性　＋＋＋＋ 伊：全血、血゛および血漿に　るａｐｇ　Ａｌ−ａｏｏ　Ｂと淀 検体調製 健常人または異常脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｌｃ）患者から断食後に採血した 血液を１　ｎＨＥＤＴＡに集めた。血漿および血清検体は標準的方法に従って調 製した。

アッセイ手順は４℃で検体を２４時間貯蔵している間に全血、血漿および血清に 対して行った。

ａｐｏ＾１およびａｐｏ　Ｂ測定に対しては、検体をＰＢＳで１：１００希釈し て最終容量を２　ｓｊとした。

乙ヱ丸工土亙 ９６ウエルプレートを０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）で１； １００希釈された５０μｍ／ウェルの特異的単クローン抗体でコーティングして ０．５μｇ／ウェルの最終１度とした。

３７℃で１８時間インキュベーション後、プレートヲＰＢＳ中の０．０２％Ｔｗ ｅｅｎ−２０溶液で２回洗浄した。

プレートをＰＢＳ中の１％牛血清アルブミン溶液で室温で１時間飽和し、次いで ＰＢＳ中ｆ）　０．０２％ＴＷｅｅｎ−２０溶液を用いて洗浄工程を３回行った 。

２００μ」の各検体を新しいチューブに移し、そしてＰＢＳで１＝２希釈された １０μｍのハイブリッドプロティン（ＩＳＨＡＩ　、１ｍ／　Ｉｊ；　ｌ５ＨＢ １．２Ｍ／　ＩＩＪ　）を各検体におよび検量線の各濃度点に添加した。５０μ 」のこれら検体を各ウェルに二重に分注しモして３７°Ｃで１時間（ＩｓＨ＾１ ）または３０分間（ＩＳＨＢｌ）インキュベートした。ウェルをＰＢＳ中の０． ０２％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液で３回洗浄した。

１００μＪ／ウエルの色素原基質０−ニトロ−フェニル−ガラクトシダーゼ（Ｏ ＮＰＧ）を、ｌ　ＩＮ　ＨＱＣ７２を含有する０、１Ｈ（ｇ酸ナトリウム緩ｒｉ Ｉ液（ｐＨ７）　ニア５Ｍ／’　１００ｎｊ　＜７）濃度で添加することにより β−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。

３７℃で１５分間インキュベートし、そして１００μｊ／ウエルのｌ　ＨＮａ２ ＣＯａを添加することにより酵素反応を停止した。

マイクロプレート・リーダーを用いて４０５ｎｉにおける吸光度を測定した。

出発材料として血清、血漿または全血を用いて同じ個体についてａｐｏ　Ａｌ濃 度を測定した。

Ａ　２０６　２０２　１９０ この測定において、得られた値は検体容量に関する希釈ファクターに対して補正 される。

血清　Ｉ　Ｉｌｌ　Ａｐｏ　Ａｌｘ　１−ＡｐＯＢ　Ｘ　１血漿　１．２＋１Ｊ 　ＡＤＯ＾ｌｘ　１．２−ＡＤＯＢ　×１．２全血　２　ｌ１ｊＡｐＯＡｌｘ２ −ＡＤＯＢ　＾２ＡＤＯＡＴの測　におけるアッセイ　１動率（ｃｖ％ＡＤＯＡ ｌ測定、１検体（検体Ｂ）を１つのマイクロプレートで８４回アッセイ。

ａｏｏ　Ａｔ　１０１１２１１２３１０８１１４１０７１０９１２０１２０１１ ０ｗ／ｄＪ　１１８１１２１０６１１４１２０１２０１２１　１１２１１５１１ ｇ１０８１２４１１４１２７１１７１１１　１０６１１８１１？　１１６平均値 ：　１１８．６９＋ａｒ／ｄＪ Ｓ、Ｄ　：　７．９９ アッセイ内Ｃ０ｖ％二６．７ ＡＰＯＡＩ゛３　（Ａ　Ｂ、Ｃ）を゛ノｊ、序テマイクロプレートに　２ Ａ　Ａ　ＣＣＢ　Ｂ　Ｂ　Ｂ　ＣＣＣＣ１３０，１３２，５９，６３，１２５， １２４，１０５゜１０８．７０，６０，６８．６２ Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｂ　Ｂ　Ａ　Ａ　ＣＣＢ　Ｂ　１６７．１７２，１７３，１７ ９，１３０，１２４゜１４５、１６０．７０，７４，１２３．１２Ｂ　Ｂ　Ａ　 Ａ　１１８，１１７，１４８，１５０検体Ａ平均値：　１５５．６５■／ｄｊＳ 、ロ　：　１７．１８ アッセイ内Ｃ３ｖ％：　１１．０４ 検体Ｂ平均値二１２０■／ｄｊ ５．０：８ アッセイ内Ｃ９ｖ％二６．７ 検体Ｃ平均値：６５．７■／ｄｊ Ｓ、〇二５．４ アッセイ内Ｃ１ｖ％二８．３ すべてのａｐＯＡｌ値は第７図の検量線を用いて算出される。

ＡＤＯＢの測　におけるアッセイ　６動率（ｃｖ％）同様の手順により八〇〇　 ＡＴのアッセイ内変動率（ＣＶ％）を測定したところ、Ａｐｏ　Ｂ　４度につい ての平均測定値（ｎ＝８４）は８９．２５　ｗ、”ｄｉであり、そしてアッセイ 内Ｃν％は８．８であった。

＾ｐｏ＾】およびＡＤＯＢの測　におけるアッセイ間・動率（ＣＶ％） ＡＤＯＡｌ７ｙ７（＝イ間ＣＶ％＝９．４Ａｐｏ　Ｂ　アッセイ間ＣＶ％＝９． ７（注）　両ｙセイ間Ｃｖ％測定について、同じ検体を４つの異なる時点で二重 に試験した。

＾ｏＡ１およびＡＤＯＢアッセイ、庁の渉ＡＤＯＡｌ−ＡＤＯＢ標準血清の連続 希釈液を用いて、Ａｐ。

Ａｌ測定について測定された最高感度値はｌμｇ／ｌ＊ｊであり、そして１回の 測定を二重に行うのに必要な最少検体容量は２μｍである。

Ａｐｏ　Ｂ測定については最高感度値は１．２μｇ／ｒｒｊであり、また、この 場合にも、１回の測定を二重に行うため・の最少検体容量は２μ」である。

他の７；ｆ？！Ｊボア０＋４　ン（ＡＩＩ、Ａ■、ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩ、Ｄ、Ｅ ）の測定に同じ手順を用いることができる。

それらの血漿濃度および割合の算出は、現在の高脂血症の指標よりも価値のある 、心血管系の危険のインジケーターである。

ａ）全ヒトアポリボプロティンＡ１をコードするＩ）ＮＡ配列ｂ）引き続きβ− ガラクトシダーゼをコードする配列に正しい翻訳読み取り枠で融合されるＣＤＮ Ａ由来配列、アミノ酸類基が示される。

Ｃ）ハイブリッドプロティンＡｐｏＡ１−β−ガラクトシダーゼ（ＩＳＭＡＩ） をコーＥするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターｐＩＳＭＡＩ。

ａ）全ヒトアポリボプロティント１００をコードするＤＮＡ配列。

するＤＮＡ配列を含有する発現ベクターｐｌｓＭＢ１゜Ｆｉｇ、３．　ｌ５ＭＡ ｌ　飽和臼ｔｓｒｓ阿Ｂ１　飽和曲線 ＩＳＭ８１　ｍ度μｇ／ｍ［ ｆｉｇ、　４．　１５ＭＡｌ　拮抗曲線ＩＳＭＢＩ　拮抗曲線 Ａｐｏ８８１１　ｍ９１” Ａｐｏ　Ａ１（再構成血清または精製ＨＤＬ３粒子中に存在する）と組換えハイ ブリッドプロティンβ−ｇａｌ−Ａｐｏ　Ａ１との間Ｏ−■丁）ＩＯＬ　３］ ｏ−ｏい”　”３　再２Ｎ成’ｆｆｌ清（＆ｌＦＡ乾燥物＋　ＨｚＯ）　Ｊ：　 ”）　／　γ／ｍｌ夷験条件 一抗Ａｐｏ　Ａｌ　ｍＡｂ　（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を０．０５Ｍ　ＮＡ ＣＯＪ（＋）８９．６）に１：１（１００希釈したものでコーティング−過剰β −ｇａｌ−Ａｐｏ　Ａｌハイブリッド（最終濃度３５１Ｚｇ／ｍ１）ＡｐｏＡ１ 濃度　ｍｇ／ｄｔ　Ｅ４０５　ｎｍ、ｍＡｂｓ国際調査報告 ｌ１Ｉ１．１．．１．−Ａ工１１．　ＰのノＧ３８８７００６１６国際調査報告 ＧＢ　８ＢＯＯ６１６ ＳＡ　２３４７７ Ｐａｇｅ　２ ＳＡ　２３４７７

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．検体中のアポリポプロテインに対する抗体を結合した固体支持体を該アポリ ポプロテインを含有する検体と、そして該アポリポプロテインの少くとも抗原性 部分と標識プロテインとより成る本明細書中に定義された融合プロテインと接触 させ、次いで前記支持体に結合したまたは結合しない標識プロテインを観察また は測定することより成る検体中のアポリポプロテインの検出または評価方法。
2. ２．融合プロテイン中のアポリポプロテインの抗原性配列が１５０個以上のアミ ノ酸より成る請求項１に記載の方法。
3. ３．アポリポプロテインがアポリポプロテインＡＩである請求項１または２に記 載の方法。
4. ４．アポリポプロテインがアポリポプロテインＢである請求項１または２に記載 の方法。
5. ５．固体支持体がアポリポプロテインＡＩおよびアポリポプロテインＢの両方に 対する抗体を結合し、そして融合プロテインがアポリポプロテインＡＩの抗原性 部分および第１標識プロテインより成る第１融合プロテインと、アポリポプロテ インＢの抗原性部分および第１標識プロテインとは異なる第２標識プロテインよ り成る第２融合プロテインとより成る、請求項１または２に記載の方法。
6. ６．融合プロテインが細菌遺伝子および真核遺伝子より成る遺伝子によりコード される前記の請求項各項のいずれかに記載の方法。
7. ７．細菌遺伝子が標識プロテインをコードし、そして真核遺伝子が検出されるべ きアポリポプロテインをコードする請求項６に記載の方法。
8. ８．標識プロテインがペルオキシダーゼである前記の請求項各項のいずれかに記 載の方法。
9. ９．抗体を結合した固体支持体およびハイブリツドプロテインより成る前記の請 求項各項のいずれかに記載の方法を実施するためのテストキツト。