JP4193499B2 - 組換え発光蛋白質およびその複合体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ末端領域にシステイン残基を導入した組換えカルシウム結合型発光蛋白質に関する。また、検出すべき物質に特異的に結合するリガンドを該システインを介して結合させた複合体、その複合体を発光性標識として用いる物質の検出方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カルシウム結合型発光蛋白質は、カルシウムと特異的に反応し、瞬間発光する蛋白質であり、現在イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボイン等が知られている。これらの発光蛋白質のカルシウムイオンに対する感受性は非常に高く、その発光感度もまた、市販の検出装置においての検出限界が１ピコグラム以下と非常に高いものである。このため、これらの発光蛋白質は、微量カルシウムイオンの検出・定量や細胞内カルシウムの動的変化のイメ−ジプローブとして用いられている。これらの発光蛋白質は、その発光がカルシウムイオンとの特異的結合による発光であるため、通常の化学発光で問題になるバックグランドがほとんどなく、且つ反応自体が瞬間発光で数秒以内に終了するため、短時間にＳ／Ｎ比のよいシグナルを得ることができるという利点を有する。
【０００３】
さらに、その発光反応系は、生物発光と呼ばれる酵素発光反応であり、全て生体内由来の成分で構成されているため、有害な化学物質等（例えばラジオアイソトープや発癌性化合物等）を含んでおらず安全性が高い。このため、当該発光蛋白質は診断薬等における標識としての応用が期待されている。
【０００４】
イクオリンをはじめとするカルシウム結合型発光蛋白質をイムノアッセイ等における標識として用いる場合、その標識を検出すべき物質と関連付けることが必要である。つまり、標識となる発光蛋白質を、検出すべき物質に直接結合させるか、または、何らかの物質を介して間接的に結合させる必要がある。本明細書においては、検出すべき物質と発光蛋白質（標識）を関連付ける物質であって、検出すべき物質に直接的に結合する物質、または、検出すべき物質に間接的に結合する物質を「リガンド」と称する。リガンドとしては、後で詳細に説明するように、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗原、抗体等があげられる。
【０００５】
カルシウム結合型発光蛋白質は比較的不安定であるため、リガンドとの結合の際にその発光活性が失活する可能性がある。また、より正確な分析・診断結果を得るためには、発光蛋白質とリガンドとの結合比率が１：１またはそれに近いことが所望される。もし、リガンドと発光蛋白質が結合比率１：１にて結合したリガンド−発光蛋白質からなる複合体が得られれば、迅速且つ正確な診断・検出系を確立することができる。
【０００６】
カルシウム結合型発光蛋白質の代表的なものは、オワンクラゲ(Aequorea aequorea)から得られたイクオリン(aequorin)である。イクオリンは、アポ蛋白質部分であるアポイクオリン（apoaequorin）と発光基質に相当するセレンテラジン（coelenterazine）と分子状酸素が複合体を形成した状態で存在している。イクオリン分子にカルシウムイオンが結合すると、青色（極大波長４６５nm）の瞬間発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミド（coelenteramide）、二酸化炭素を生成する。発光反応後、アポイクオリンは、ＥＤＴＡ等のキレート剤によりカルシウムイオンを除去し、還元剤、セレンテラジンおよび酸素の存在下にて低温にてインキュベーションすることによってイクオリンに再生することができる。イクオリンは、アポイクオリンをコードする遺伝子の解析により、１８９個のアミノ酸からなる蛋白質であることが知られている。そのアミノ酸配列は配列番号：１に示される。イクオリンは、カルシウム結合蛋白質のカルモジュリンと相同性があり、カルシウム結合のためヘリックス−ループ−へリックス構造であるＥＦハンドモチーフが３カ所あることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、Ｘ線結晶解析により、Ｃ末端付近の１８４番目のチロシン残基が発光基質であるセレンテラジン(coelenterazine)のペルオキシドの安定化に関与していることが示唆されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００７】
イムノアッセイ等の一般的な診断検出系において、汎用される方法の一つがビオチン−アビジン（またはストレプトアビジン）であり、イクオリンのビオチン化が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。Zattaらのビオチン化イクオリンは、イクオリンの遊離のアミノ基（−ＮＨ2）をビオチン化したものである。Zattaらの方法により修飾される可能性のあるアミノ基は、アミノ末端のアミノ基１箇所と１５箇所のリジンのアミノ基であるが、どのアミノ基がどの程度の比率でビオチン化されるかは一定でない。また特定の部位のアミノ基のみを特異的に修飾する方法は確立されていない。すなわち、イクオリンの遊離のアミノ基を介してビオチンを結合させる方法によっては、高品質なビオチン化イクオリンは未だ提供されていない。
【０００８】
カルシウム結合型発光蛋白質には、分子内に３〜６個のシステイン残基が存在することがその遺伝子解析より明らかとなっている。また、イクオリンとオベリンはＸ−線による構造解析が行われており、全てのシステイン残基はジスルフィド結合を形成しておらず、フリーの状態で存在していることが明らかになっている。さらにイクオリンはシステインの−ＳＨ基への低分子化学修飾剤Ｎ−エチルマレイミドやヨード酢酸により、容易にその発光活性を失活することも知られている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００９】
本発明者らは、すでにイクオリンの分子内に存在する３個のシステイン残基をセリン残基に変換したシステインフリーの変異イクオリンが発光活性を有することを報告している（例えば、非特許文献５参照）。このシステインフリーの変異型イクオリンを構成するアポイクオリンの５番目のセリン、５３番目のグルタミン酸、７１番目のメチオニン、８４番目のグルタミン酸をシステインに置換したアポイクオリンを作り、そのシステインを介してチロキシンを結合させたチロキシン−アポイクオリン複合体を作り、これをチロキシン−イクオリン複合体に再生したことが報告されている（例えば、非特許文献６参照）。しかし、これは、天然型イクオリンが持つ３つのシステイン残基を全てセリンに置換し、新たに導入した唯一のシステインを修飾したものである。すなわち、これまで天然型イクオリンがもつ固有の３個のシステイン残基を保持したまま、新たに導入したシステイン残基の−ＳＨ基にリガンドを結合させてなお発光活性を維持しているものは得られていない。
【００１０】
アポイクオリンを修飾してからイクオリンに再生するLweis等の方法では、再生されたイクオリンを修飾する場合に比較して収率が低い。また、イクオリンへの再生機構を考慮すると、修飾されたイクオリンを再生する方法では、修飾に用いられる化合物は再生過程に影響の少ない特定の化合物に限定される。一方、再生されたイクオリンを修飾する場合には、リガンド分子が特定されることはない。さらに、Lweis等の方法では、リガンド−イクオリン複合体、リガンド−アポイクオリン複合体、未修飾イクオリン、未修飾アポイクオリンの分離が行われていない。したがって、イクオリンに導入したシステイン−ＳＨ基を介してリガンドを結合させた均一なリガンド−イクオリン複合体で、実際の分析に応用できるものは未だに提供されていない。
【００１１】
【非特許文献１】
Inouye et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(1985): 3154〜3158
【非特許文献２】
Head et al., Nature 405 (2000): 372〜376
【非特許文献３】
Zatta et al., Anal. Biochem. 194(1991): 185〜191
【非特許文献４】
Shimomura et al., Biochemistry 13(1974): 3278-3286
【非特許文献５】
K. Kurose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989): 80-84
【非特許文献６】
Lewis et al., Bioconjugate Chem. 11(2000): 65-70 & 140-145
【非特許文献７】
Nomura et al., FEBS Lett. 295(1991): 63-66
【非特許文献８】
Inouye et al., J. Biochem., 105(1989): 473-477
【非特許文献９】
Inouye et al., Protein Expression and Purification 2(1991):
122-126
【非特許文献１０】
Shimomura et al., Biochem. J. 296(1993): 549〜551
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質にシステインを導入し、その−ＳＨ基を介してリガンドと１：１またはそれに近い結合比率で結合させることによって、発光活性のあるリガンド−発光蛋白質の複合体を提供することを目的とする。また、その複合体をイムノアッセイ等において標識として使用することも本発明の目的である。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、カルシウム結合型発光蛋白質としてイクオリン、リガンドとしてビオチンを用いて、発光蛋白質−リガンドの複合体について検討した。その結果、カルシウム結合型発光蛋白質を構成するアポ蛋白質に、一つのシステインをＮ−末端領域、特に天然型発光蛋白質のＮ−末端から４番目のアミノ酸残基までの領域に導入することにより元の発光蛋白質と同じ発光活性のある蛋白質が製造できること、それをリガンドと結合させると結合比率が１：１もしくはそれに近い複合体を製造しうること、その複合体が標識として使用できることを見出した。
【００１４】
前述のように、天然型イクオリンに存在するシステインに修飾を施すとその発光活性が低下するので、システインを介してリガンドを結合させるためには、新たにシステインを導入することが必要である。既にＣ末端領域あるいはＣ末端のアミノ酸を変更すると発光活性が低下することが知られている（例えば、非特許文献７参照）ので、Ｃ末端領域にシステインを導入することは適当でない。このため、イクオリン自身の安定性、アポイクオリンからイクオリンへの再生効率、システイン残基の導入によるイクオリンの高次構造への影響等を考慮した。その結果、天然型のアポイクオリンのＮ−末端から４番目のアミノ酸残基以内にシステイン残基の導入を試みた。その結果、驚くべきことに、得られたイクオリンは発光活性の低下がないこと、本来存在する３個のシステインに何らの影響がなく導入されたシステインのみにリガンドを結合させ得ること、そのようにして得られたリガンド−イクオリンが元の発光活性を維持していることが判明した。導入されたシステインのみにリガンドが導入され、固有の３個のシステインにリガンドが導入されないのは、（１）導入されたシステインはＮ−末端付近にあって、蛋白分子の表面に露出している（２）固有の３個のシステインが蛋白分子の内部に存在する（３）リガンドを結合させるための−ＳＨ基修飾試薬が蛋白分子内部に入り難い大きさであったことに起因すると考えられる。
【００１５】
カルシウム結合型発光蛋白質は、（１）セレンテラジンを基質とする（２）アポ蛋白質とセレンテラジンと酸素が結合して発光蛋白質を構成する（３）その発光蛋白質がカルシウムイオンの作用によって発光しアポ蛋白質とセレンテラミド（セレンテラミンの酸化物）および二酸化炭酸を発生する点で共通し、そのアミノ酸配列において類似性が高い。したがって、このイクオリンについて得られた結果は、他のカルシウム結合型発光蛋白質にも応用できる。
【００１６】
本発明は、天然型アポ蛋白質のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入された天然型または変異型のアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質である。ここで変異型の蛋白質とは、導入したシステインを維持し発光活性を損なわない範囲で、１〜５個のアミノ酸を失欠、置換、付加することによって改変した蛋白質である。蛋白質の改変においては、導入したシステインのみならず天然型発光蛋白質が有する全てのシステインを維持することが望ましい。何故ならば、天然型イクオリンが有する３個のシステインをセリンに変換した場合には、アポイクオリンからイクオリンへの再生に要する時間が３時間から２４時間に増加するからである（例えば、非特許文献５参照）。また、カルシウムとの結合のための構造、発光基質の安定化に必要な部位に変更を加えてはならない。カルシウム結合型発光蛋白質としては、イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインが挙げられる。システイン導入カルシウム結合型蛋白質は、システイン導入アポ蛋白質を発光基質であるセレンテラジンと酸素の存在下で処理することによって製造される。発光基質としては、セレンテラジンの外に発光活性を有するセレンテラジンのアナログ化合物を用いることもできる。
【００１７】
天然型アポイクオリンのアミノ酸配列は、配列番号：１に示される。システインは、アミノ末端のValから４番目のThrまで領域に導入される。したがって、本発明のカルシウム結合型発光蛋白質の１態様は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入された天然型または変異型のアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質である。配列番号：１のアミノ酸配列のＮ−末端のValとＮ−末端から２番目のLysの間、２番目のLysと３番目のLeuの間、３番目のLeuと４番目のThrの間にシステインを挿入することができる。また、Ｎ−末端のVal、Ｎ−末端から２番目のLys、３番目のLeu、４番目のThrのいずれかをシステインで置換することができる。特に好ましくは、３番目のLeuと４番目のThrの間にシステインを挿入する。
【００１８】
アポイクオリンは、遺伝子組換え法によって生産される。アポイクオリンを遺伝子組換え法で製造するに当たって、大腸菌（E. coli）の外膜タンパクＡ(ompA)遺伝子をアポイクオリン遺伝子と融合させてそれを大腸菌で発現させると高効率でアポイクオリンが生産される。その生産物は、天然型アポイクオリンのＮ−末端のValがAla-Asn-Ser-で置換されているが、カルシウム結合活性、発光活性において天然型アポイクオリンと同等である（例えば、非特許文献８および非特許文献９参照）。このＮ−末端にAla-Asn-Ser-を有する変異型アポイクオリンをセランテラジンおよび酸素と結合させたイクオリンが市販されている。この変異型イクオリンにおいては、Ｎ−末端から６番目（天然型Ｎ−末端から４番目）のThrまでの領域のどこにでもシステインを導入することができる。すなわち、この変異型イクオリンのＮ−末端のAlaから６番目のThrまでの領域にどこかにシステインを導入することができる。好ましい例は、５番目のLeuと６番目のThrの間にシステインを導入した変異型イクオリンであり、そのアミノ酸配列は配列番号：２に示されている。また、このシステイン導入変異型イクオリンは、６番目のシステインを維持し発光活性を維持する範囲で１〜５個のアミノ酸を失欠、置換、付加することによって改変することができる。したがって、本発明の好ましい他の態様は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するアポ蛋白質、または配列番号：２に示されるアミノ酸配列の６番目のシステインを維持し発光活性を維持する範囲で１〜５個のアミノ酸を失欠、置換、付加することによって改変したアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質である。
【００１９】
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、検出すべき物質に特異的なリガンドと結合し複合体を形成する。本発明は上記の組換えカルシウム結合型発光蛋白質に、該システインを介して、検出すべき物質に特異的なリガンドが１：１の比率で結合する複合体に関する。この発光蛋白質とリガンドの結合比率１：１は、１：１またはその近い比率を意味しており、厳格に解釈されるものではない。
【００２０】
本発明に言う、リガンドとは 、検出すべき物質に直接的に結合する物質、または、検出すべき物質に間接的に結合する物質である。例えば、イムノアッセイで抗原部位や抗原量を検出する場合の１次抗体である。イクオリンが結合した１次抗体は、検出すべき抗原に結合するので、イクオリンの発光を測定することにより抗原の部位や量が検出できる。この場合は１次抗体がリガンドとなる。
【００２１】
感度を高めるために２次抗体を使う方法も周知である。ビオチンを結合させた２次抗体を用い、イクオリンを結合させたアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる方法である。この際、アビジンおよびストレプトアビジンがリガンドとなる。この場合に、１分子のアビジンおよびストレプトアビジンが、４分子のビオチンと結合する性質を利用することが出来る。すなわち、イクオリンをビオチンと結合させ次いでそのビオチンを介してアビジンまたはストレプトアビジンに結合させるものである。この場合はビオチンがリガンドとなる。
【００２２】
リセプターを検出する場合においては、リセプターに結合するシグナルペプチド（インシュリンのようなホルモン、サイトカイン、ＴＮＦ、Ｆａｓリガンド等）がリガンドとなる。シグナルペプチドを検出する場合にはレセプターを構成するタンパクがリガンドとなる。薬物のレセプターを検出する場合には薬物がリガンドとなり、薬物を検出する場合は薬物レセプターがリガンドとなる。
【００２３】
酵素を検出する場合にはその基質がリガンドとなり、酵素の基質を検出する場合には酵素がリガンドとなる。核酸に対して特異的に結合する他の核酸を検出する場合には、相補的な核酸がリガンドとなる。多糖類に対して特異的に結合する他の物質を検出する場合には、多糖類がリガンドとなる。血液凝固因子と特異的に結合しうるレクチンや転写因子等のＤＮＡ結合性蛋白質等もリガンドとなり得る。
【００２４】
上記の複合体は、システインを導入したアポ蛋白質を遺伝子工学的に生産し、これを酸素の存在下において、セレンテラジンで処理してカルシウム結合型発光蛋白質に再生し、ついで導入されたシステインを介して検出すべき物質に特異的なリガンドを１：１、またはその近くの比率で結合させて製造することができる。このようにアポ蛋白質カルシウム結合型蛋白質として再生した後にリガンドと結合することによって、如何なるリガンドとも結合させることができる。
【００２５】
上記の複合体は、検出すべき物質と特異的に結合し、カルシウムイオンによって発光するので、イムノアッセイ等における標識としての使用できる。したがって、本発明は上記複合体を用いるリガンドに特異的な物質の測定方法、および測定のためのキットに関する。
【００２６】
他の態様において、本発明はまた、そのアミノ末端の４アミノ酸残基内にシステインを導入したアポ蛋白質をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換え発現ベクター、および組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞に関する。
【００２７】
他の態様において、本発明は前記組換え発現ベクターまたは組換え宿主細胞を用いることを特徴とする、本発明のアポ蛋白質の製造方法に関する。具体的には、前記組換え発現ベクターを用いてインビトロ発現を実施または宿主細胞を培養し、産生したアポ蛋白質を単離・精製することからなる。さらに、そのアポ蛋白質を酸素の存在下でセレンテラジンと処理して発光蛋白質に再生し、その発光蛋白質をリガンドと結合させて複合体とする製造法に関する。
【００２８】
【発明の実施の態様】
発光蛋白質のＮ−末端へのシステインの導入は、天然型のＮ−末端から１〜４番目のアミノ酸のいずれかをシステインで置換する方法、１〜４番目のアミノ酸の間にシステインを挿入する方法のいずれかによって導入することができる。アミノ酸を挿入する方法が好ましい。システインの導入は、当該技術分野において周知の技術、例えばＰＣＲ法を用いて発光蛋白質をコードする遺伝子にシステインのコドンを導入することにより実施することができる。次いで、得られたシステイン導入型アポ蛋白質遺伝子を含む組換え発現ベクターを調製し、これを用いて適する宿主細胞内でシステイン導入型アポ蛋白質を発現させる。
【００２９】
好ましいアポ蛋白質は、アポイクオリンである。アポイクオリンは配列番号：１で表される天然型アポイクオリンであっても、その変異体であっても良い。その変異体としては、天然型アポイクオリンのＮ−末端のValがAla-Asn-Ser-で置換されているものが好ましい。システインは、天然型アポイクオリンの４番目のアミノ酸であるThrまでの領域に導入することができる。Ｎ−末端がAla-Asn-Ser-で置換されている変異体の場合は、Ｎ−末端のAlaから６番目のThrまでの間のどこかにシステインを導入することができる。本発明の最も好ましいシステイン導入型アポイクオリンは、該変異体の５番目のLeuと６番目のThrの間にシステインが導入されたものであり、そのアミノ酸配列は配列番号：２に示される。
【００３０】
本発明において、前記発光蛋白質を発現させるために用いるベクターには、無細胞発現系（インビトロ トランスクリプション−トランスレーション）に、および宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物培養細胞を用いる蛋白質発現系に適するベクターとすることができ、そのようなベクターは市販されているかまたは公知のベクターから容易に作製することができる。例えば、インビトロトランスレーションおよび動物培養細胞における発現に用いるベクターは、ヒトサイトメガロウイルスのimmeadiate−early エンハンサー／プロモター領域を組込み、その下流域にＴ７のプロモター配列／マルチクローニング部位を有するｐＴａｒｇｅｔＴベクターやＳＶ４０エンハンサーとＳＶ４０のｅａｒｌｙプロモターを有するｐＳＩベクター（プロメガ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ−ＴａｇおよびｐＢＫ−ＲＳＶ（ストラタジーン社）などである。また、大腸菌、酵母などの微生物宿主における発現に適するベクターは、例えば大腸菌系のＴ７のプロモターを有するｐＥＴシリーズベクター発現システム（例えばｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ２７ｂ（＋）、ｐＥＴ２８ａ（＋）；ノバジェン社）、および酵母系においてはアルコールオキシダーゼのプロモターを有するピチア発現系ベクターｐＩＣシリーズベクター（例えばｐＰＩＣ９Ｋ、ＰＩＣ３.５Ｋ；インビトロゲン社）などである。
【００３１】
システイン導入型アポイクオリン遺伝子を含む組換え発現ベクターを用いて適する宿主細胞を形質転換し、当該宿主細胞を培養し、次いで発現した所望のアポ蛋白質を単離する。得られたシステイン導入型アポイクオリンを、酸素の存在下においてセレンテラジンと処理して、システイン導入型イクオリンへ再生する。さらに、発光基質であるセレンテラジンの代わりに、セレンテラジン誘導体（アナログ化合物）を用いることにより、発光活性を有する半合成イクオリンを製造することも可能である。半合成イクオリンは、天然イクオリンに比べて、カルシウムに対するレスポンスの異なるもの、Ｓ／Ｎ比が改善された性質をもつものが報告されている（例えば、非特許文献１０参照）。再生されたイクオリンを例えば疎水性クロマトグラフによって精製することにより、未精製アポイクオリンを含まない、高純度システイン導入型イクオリンとすることができる。
【００３２】
システイン導入型イクオリンは、導入したシステイン残基の−ＳＨ基を介して、特異的リガンドと結合させることができる。特異的リガンドとの結合手段は、リガンドの物理化学的特性等により異なるが、イクオリン分子サイズおよびリガンドとの立体障害を考慮して、直接的にまたはリンカーもしくはスペーサーを介して結合させる。
【００３３】
本発明において用いるリンカーもしくはスペーサーは、−ＳＨ基と特異的に反応しうるものであれば特に限定されないが、２０オングストローム以上の長さを有するものが好ましい。リンカーもしくはスペーサーとして使用しうる種々の−ＳＨ基修飾試薬は市販されており、これらを適宜利用することができる。システイン導入型イクオリンにリガンドを結合させる反応は、３０℃以下、好ましくは２５℃以下、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６〜７.５で行うのが望ましい。
【００３４】
イクオリンを発光蛋白質の代表例とし、実施例にて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
【実施例】
実施例１ システイン挿入アポイクオリン発現ベクターの構築
天然型アポイクオリンのＮ−末端のValがAla-Asn-Serで置換された変異型アポイクオリンの発現ベクターpiP-HE（例えば、非特許文献８参照）から、アポイクオリン遺伝子のＮ−末端近傍にある制限酵素部位EcoRIをＰＣＲ法で欠失したpiP-HEΔEを構築した。変異型アポイクオリンのＮ−末端より６番目）（天然型アポイクオリンのＮ−末端より４番目）にシステイン残基をＰＣＲ法で導入することにより、システイン挿入イクオリン遺伝子発現ベクターpiP-HE-Cys4を構築した。具体的に、その構築手順を示す（図１）。
０.１μgのpiP-HEプラスミドをテンプレートとして、各１μgのＰＣＲプライマーOmpA1-XbaI（5'TGG-AAC-TCT-AGA-TAA-CGA-GGG-CAA-AAA 3', SEQ ID NO：3）およびOmpA1-HindIII（5'TCC-AAG-CTT-GGA-GTT-CGC-GGC-CTG 3', SEQ ID NO：4）を用いた。DNA Thermal Cycler（Perkin-Elmer社製）およびAmpli Taq DNAポリメラーゼを含むGeneAmp ＰＣＲ試薬キット（宝酒造社製）を用いて所望のフラグメントをＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）でフラグメントを分離、制限酵素XbaIとHindIIIで消化を行い、制限酵素部位EcoRIを欠失したXbaI-HindIIIフラグメントを取得した。一方、piP-HEプラスミドを制限酵素XbaIとHindIIIで消化し、アポイクオリン遺伝子を含むベクター部分をＤＮＡ精製キット（キアゲン社製）で単離した。これを増幅したXbaI-HindIIIフラグメントと連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ８３株を形質転換した。形質転換体の中から、EcoRI部位を欠失したpiP-HEΔEプラスミドを単離した。遺伝子配列の確認は、Taq DyeDeoxy Termintor Cycle sequencing Kit（Applied Biosytems 社製）およびＤＮＡ ３７７ シークエンサー（Applied Biosytems 社製）を用いて決定した。EcoRI部位のみが欠失し、アミノ酸配列はもとの変異型と同一であった。
【００３６】
次に０.１μgのpiP-HEΔEプラスミドをテンプレートとして、各１μgのＰＣＲプライマーCys4-AQ (5'GGC-AAG-CTT-TGT-ACT-AGT-GAC-TTC-GAC-AAC-CCA-AGA-TGG 3', SEQ ID NO：5)および630EcoRI-AQ (5'GCC-GAA-TTC-ATC-AGT-GTT-TTA-TTC-AAA 3', SEQ ID NO：6) を用いて、GeneAmp PCR 試薬キット（宝酒造社製）により所望のフラグメントをＰＣＲ増幅した後、精製キット（キアゲン社製）でフラグメントを分離し、次いで制限酵素HindIIIとEcoRIで消化して、変異型アポイクオリン遺伝子のＮ−末端から６番目（天然型アポイクオリン遺伝子のＮ−末端から４番目に）にシステインを有するHindIII-EcoRIフラグメントを取得した。一方、piP-HEΔEプラスミドを制限酵素HindIIIとEcoRIで消化した後、プロモーターおよびOmpAシグナルペプチドを含むベクター側を単離した。次いで、これをHindIII-EcoRIフラグメントと連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ８３株を形質転換した。形質転換体の中から、Ｎ−末端から６番目にシステインが挿入された変異型アポイクオリン発現するpiP-HE-Cys4プラスミドを単離した。塩基配列を、Taq DyeDeoxy Termintor Cycle sequencing Kit (Applied Biosytems 社製)およびＤＮＡ ３７７ シークエンサー（Applied Biosytems 社製）を用いて決定し、システイン挿入アポイクオリン（Ｃｙｓ４−アポイクオリン）遺伝子を確認した。Ｃｙｓ４−アポイクオリンのアミノ酸配列は配列番号：２で示される。
【００３７】
実施例２ システイン挿入型アポイクオリン生産株の分離
宿主として大腸菌ＷＡ８０２株を使用し、実施例１で作製した組換えプラスミドpiP-HE-Cys4を発現ベクターとし、常法により形質転換を実施した。形質転換体２０株をＬＢ（水１Ｌ中、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ，ｐＨ７.２）寒天培地にて３０℃で一晩培養した後、５mLのアンピシリン含有（５０μg／mL）ＬＢ液体培地に植菌し、さらに３７℃で１６時間培養した。次いで、最も高い発光活性を有する菌株、即ち最も高いＣｙｓ４−アポイクオリン産生菌株を選択し、高発光活性を有する菌株を大量培養用の種株とした。
【００３８】
実施例３ システイン挿入型アポイクオリン産生菌株の培養
Ｃｙｓ４−アポイクオリン産生菌株を３０℃で一晩培養後、５０mLのアンピシリン含有（５０μg／mL）ＬＢ液体培地に植菌した。さらに３０℃で８時間培養した後、新鮮ＬＢ液体培地２Ｌに移し、３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。菌体と培養液を低速遠心分離（５０００×ｇ）により分離した。菌体、培養液は両者とも発現したアポイクオリンを含むためそれぞれ保存し、Ｃｙｓ４−アポイクオリン精製の出発材料とした。
【００３９】
実施例４ 菌体からのシステイン挿入型イクオリンの再生および精製
集菌した菌体は、還元剤のジチオスレイトール（和光純薬社製）２００mgを含む４００mLの緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）に懸濁した。菌体を氷冷下で２分間超音波破砕処理して破砕した後、２０分間遠心分離（１２０００×ｇ）して上澄み液を集めた。少量のメタノールに溶解した化学合成セレンテラジンを、Ｃｙｓ４−アポイクオリンの１.２倍のモル濃度になるように、上記の上澄み液に添加し、４℃で５時間以上放置した。得られた上澄み液を直ちに、カラム緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア製、直径２cm×１０cm）に吸着させ、２８０nmでの溶出液の吸光度が０.０５以下になるまで０.１Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液でカラムを洗浄した。次いで、カラムに吸着した未再生Ｃｙｓ４−アポイクオリンと再生Ｃｙｓ４−イクオリンの両者を含む画分を０.１Ｍ〜０.４Ｍ−ＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出した。
【００４０】
再生Ｃｙｓ４−イクオリンと未再生Ｃｙｓ４−アポイクオリンとの分離は、ブチルセファロース４ファーストフローゲルクロマトグラフィーによって、次のように実施した。
Ｑ−セファロースカラムから溶出したオレンジ色の溶出液に、最終濃度が２Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加した。添加後、不溶性画分を遠心分離により除去した。次いで、２Ｍ 硫酸アンモニウムを含む上述のカラム緩衝液で平衡化したブチルセファロース４ファーストフロー（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２cm×８cm）にその上澄み液を加え、硫酸アンモニウムの２Ｍ〜１Ｍの直線濃度勾配により溶出し、発光活性を有する、即ち再生Ｃｙｓ４−イクオリンを含むオレンジ色画分を収集した。一方、未再生のＣｙｓ４−アポイクオリンはカラム緩衝液でのみ溶出された。
【００４１】
精製画分の純度検定は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実施した。その結果、精製画分について分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターで測定した結果、９８％以上であった（図２）。精製蛋白質濃度をウシ血清アルブミンを標品としてBradford法（バイオラッド社製）により決定したところ、２Ｌの培養菌体からの高純度Ｃｙｓ４−イクオリン収量は４４.６mgであった。
【００４２】
実施例５ 培養液からのシステイン挿入型イクオリンの再生および精製
培養液から純度９８％以上のアポイクオリンを取得し、実施例４に従ってイクオリンに再生し、精製した。精製されたイクオリンを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、実施例４で得られたものと同じであった。培養液２Ｌから高純度Ｃｙｓ４−イクオリン１０.４mgが得られた。
【００４３】
実施例６ マレイミド活性化ビオチンによるビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの調製
精製Ｃｙｓ４−イクオリンのモル数の１.２から３倍当量のマレイミド活性化ビオチンとをＰＢＳ溶液（１０mM リン酸緩衝液、２.７mM ＫＣｌ、１３７mMＮａＣｌ、ｐＨ７.４）中において、反応温度０〜２０℃にて２時間インキュベートすることにより、Ｎ−末端に挿入したシステイン残基を特異的にビオチン化した。具体的には次のように実施した。
１.５mlのポリプロピレン製チューブに、８００μlのＰＢＳ溶液に、ＰＢＳ溶液に溶解したマレイミド活性化ビオチン（EZ-Link PEO-Maleimide-activated Biotin，Pierce社：スペーサーの長さ：２９.１オングストローム）４μl（３０nmol）を加え、次いでＣｙｓ４−イクオリン２００μl（１０nmol）を添加して、修飾反応を開始させ、暗所で２０℃にて２時間反応を行った。修飾反応の経過は、３０分ごとに反応液を１μl取り出し、ニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にてドットブロットを行い、抗ビオチンウサギ抗体−アルカリフォスファターゼ（シグマ社製）を用いたドットブロット発色法で、ビオチン化を確認した。その結果、０分から１時間で急速にビオチン化が起こるが、２時間以上において顕著なビオチン化の増加は検出されなかった。コントロールとして、システインを挿入していないイクオリンについて、同一の条件でビオチン化を行ったが、ビオチン化はほとんど検出されず、新規に挿入されたシステイン残基のみでビオチン化反応が起こっていることが明らかとなった。
２０オングストローム以上のスペーサーを持つマレイミド型の修飾法により、ビオチン以外のリガンド、例えば抗体、抗原、低分子有機化合物等を直接結合させることが可能であることが示された。
【００４４】
また、上述のようにして得られたビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンと未反応のＣｙｓ４−イクオリンの発光活性を比較したところ、ビオチン化により発光活性の低下はほとんど観察されず、ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンは９６％の発光活性を保持していた。また、上記反応系で、反応温度を３０℃以上に上げた場合、発光活性は反応時間２時間で５０％以下に低下した。さらに、上記反応系をｐＨ８以上で実施すると、発光活性は２時間で、５０％以下に低下することも明らかとなった。
したがって、システイン挿入イクオリンのビオチン化反応は、温度３０℃以下、好ましくは２５℃以下、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６〜７.５で行うのが望ましい。
反応後、未反応試薬の除去、ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの単離および緩衝液交換は、４℃でのセントリコン１０（アミコン社製）を用いた遠心型濾過法の単一工程で行った。この工程は、使用目的の反応系に応じて、緩衝液を交換できる利点がある。発光活性の低下を防ぐため、蛋白質濃度を１００ng／mL以上で、−８０℃以下の温度で保存する。この場合と６ヶ月以上、著しい活性低下は観察されない。
【００４５】
実施例７ ヨードアセチル活性化型ビオチンによるビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの調製
他の代表的なシステイン(−ＳＨ)残基への特異的修飾法として、ヨードアセチル型ビオチンを用いたビオチン化を、次のように実施した。
４０nmolのヨードアセチル活性化型ビオチン（EZ-Link PEO-Iodoacetyl biotin，Pierce社製：スペーサーの長さ：２４.８オングストローム）を含む８００μlの５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）に、１５nmolのＣｙｓ４−イクオリンを添加し、暗所で２０℃にて２時間反応を行った。修飾反応の経過は、３０分ごとに反応液を１μl取り出し、ニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にてドットブロットを行い、抗ビオチンウサギ抗体−アルカリフォスファターゼ（シグマ社製）を用いたドットブロット発色法で、ビオチン化を確認した。その結果、０分から１時間で急速にビオチン化が起こったが、２時間以上において顕著なビオチン化の増加は検出されなかった。一方、コントロールとしてシステインを挿入していないイクオリンについて、同一の条件でビオチン化を行ったが、ビオチン化はほとんど検出されず、新規挿入イクオリンのみで効率よくビオチン化反応が起こっていることが明らかとなった。
また、上述のようにして得られたビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンと未反応のＣｙｓ４−イクオリンの発光活性を比較したところ、ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンは８８％の発光活性を保持していた。このことは、ビオチン化に関してマレイミド法等の付加反応のみならず、置換反応を利用して新規挿入システイン残基に特異的なビオチン化が可能であることを示している。さらに、２０オングストローム以上のスペーサーを持つヨードアセチル型の修飾法により、ビオチン以外のリガンド、例えば抗体、抗原、低分子有機化合物等を直接結合させることが可能であることが示された。
【００４６】
実施例８ ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの結合数の決定
実施例４で得られたビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンについて、蛋白質１分子当たりのビオチンの結合個数を確認した。確認手段として、Voyager DE Pro mass spectometer（PerSeptive Biosystem社）を用いたマトリックス支援レーザー脱離イオン飛行時間型質量分析装置(Matrix assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometory／MALDI-TOF-MS）法により分子量を測定することにより実施した。この方法はビオチン化されたシステイン挿入型イクオリンとビオチン化されていないものとの分離が可能であり、且つビオチンの結合個数が決定できる。
【００４７】
Ｃｙｓ４−イクオリンの計算平均分子量（m／z）は２１７３５.３４、１ケ所、２ケ所、３ケ所ビオチン化されたシステイン挿入型イクオリンの計算平均分子量はそれぞれ、２２２６０.９６、２２７８６.５８、２３３１２.２０である。分子量スタンダードとて、アンジオテンシンI (m／z 1296.69), インスリン（m／z 5734.59）、アポミオグロビン（m／z 16952.60）、アポイクオリン（m／z 2163.20）を用いた。使用するマトリックスは、アルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（アルドリッチ社製）とシナピン酸（アルドリッチ社製）より調製した。マトリックス液１.５μlと測定サンプル０.５μlを混合し、次いで風乾した後に混合液を分子量測定に供した。その結果、未反応のＣｙｓ４−イクオリン、１ケ所のみビオチン化されたＣｙｓ４−イクオリン、１ケ所のみビオチン化されたＣｙｓ４−イクオリンとシナピン酸のコンプレックスに相当する分子量、２１７２３.１２、２２２５２.２３、２２４７４.５６のピークが検出された。そのピーク比は４.９：６９.６：２５.５であった。また２ケ所以上ビオチン化されたＣｙｓ４−イクオリンは全く検出されなかった。これらの結果より、未反応のＣｙｓ４−イクオリンは５％以下であり、９５％以上の効率でＣｙｓ４−イクオリン１分子につき、１個のビオチン化が起きていることが明らかとなった。故に、結合比率を１：１で結合したビオチン化イクオリンを安定的に且つ高効率で製造しうる方法が達成された。
【００４８】
実施例９ ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの検定
１）発光パターンの比較
システインが挿入されていない組換えイクオリン、Ｃｙｓ４−イクオリン、ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの１ngに１００μlの５０mM 塩化カルシウム溶液を添加し、発光量および瞬間発光のパターンをルミノメーター（ＴＤ−４０００型、ラボサイエンス社製）で測定した（図３）。図中ａはシステインが挿入されていない組換えイクオリン、ｂはＣｙｓ４−イクオリン、ｃはビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンのものである。その結果、発光量および発光パターンは３者で変化はなく、システイン残基へのビオチン化修飾により発光活性の低下、カルシウムに対するレスポンスの違いは無いことが明らかとなった。
【００４９】
２）ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの定量性
ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの検出限界と蛋白質濃度に対する直線性についての検討を行った。ビオチン化蛋白濃度を１０フェムトグラムから１００ナノグラムに希釈し、５０mMの塩化カルシウム溶液（１００μl）添加し、その発光強度（初期発光最大値：Ｉｍａｘ）をルミノメーター（アトー社製、モデルＡＢ２２００型）で測定した。３回の測定値の平均値をプロットした結果、直線性が確認された（図４）。ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの検出限界は１ピコグラム以下であり、この検出限界は、システインを導入していない組換えイクオリンと同等であった。
【００５０】
実施例１０ ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンを用いたアビジンの検出
ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンのビオチン部分がアビジンを認識し、且つ検出に定量性があるかどうかを直接結合法により確認した。アビジン（和光純薬社製）をＴＢＳＴ溶液（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１５０mM ＮａＣｌ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解したストック溶液（１mg／ml）を希釈して、１ピコグラムから１マイクログラムの濃度で５mlイムノアッセイ用ポリソープチューブ（ヌンク社製）に分注し、アビジンをチューブ内に吸着させた。これとは別にＴＢＳＴ−ＥＤＴＡ溶液（１０mM ＥＤＴＡ含有ＴＢＳＴ溶液）にて、１％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、生化学工業社製）溶液を調製した。次いで、２００μlの１％ウシ血清アルブミン溶液でアビジンを吸着したチューブをコーティングし、非特異吸着を防止した。このチューブに５μlのビオチン化システイン挿入型イクオリン（１００μg／ml）および１００μlの１％ウシ血清アルブミン含有ＴＢＳＴ−ＥＤＴＡ溶液を加え、室温で２０分間放置し、５００μlのＴＢＳＴ−ＥＤＴＡ溶液で３回洗浄した。洗浄チューブをルミノメーター（アト−社製、モデルＡＢ２２００型）内に装着し、１００μlの５０mM塩化カルシウム溶液を注入し、発光の初期発光最大値（Ｉｍａｘ）を測定した。測定は３回実施し、その平均値をプロットにした（図５）。その結果、直接結合法ではビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリン１０ナノグラム以上において直線性があり、アビジンの定量が可能であることが示された。故に、本発明のビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンはビオチン−アビジン結合を基本とするイムノアッセイ系において有用であることが示された。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば、カルシウム結合型発光蛋白質のアミノ末端部分にシステイン残基を導入した新規発光蛋白質およびその製造方法が提供される。該発光蛋白質は、前記導入したシステイン残基を介して、検出すべき物質に対する特異的リガンドと１：１の結合比率で結合した複合体を形成する。該複合体はカルシウムイオンによって発光するので、イムノアッセイ等の標識として有用である。
【００５２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】システイン挿入イクオリン発現ベクターの構築を示す概略図である。
【図２】システイン挿入型イクオリンの精製純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した結果を示す図である。
【図３】ａはシステインを導入していないイクオリン、ｂはＣｙｓ４−イクオリン、ｃはビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの発光量および瞬間発光のパターンである。
【図４】ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの検出限界と蛋白質濃度に対する発光活性を示すグラフである。
【図５】ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンを用いてアビジンを定量した結果を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ末端領域にシステイン残基を導入した組換えカルシウム結合型発光蛋白質に関する。また、検出すべき物質に特異的に結合するリガンドを該システインを介して結合させた複合体、その複合体を発光性標識として用いる物質の検出方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カルシウム結合型発光蛋白質は、カルシウムと特異的に反応し、瞬間発光する蛋白質であり、現在イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボイン等が知られている。これらの発光蛋白質のカルシウムイオンに対する感受性は非常に高く、その発光感度もまた、市販の検出装置においての検出限界が１ピコグラム以下と非常に高いものである。このため、これらの発光蛋白質は、微量カルシウムイオンの検出・定量や細胞内カルシウムの動的変化のイメ−ジプローブとして用いられている。これらの発光蛋白質は、その発光がカルシウムイオンとの特異的結合による発光であるため、通常の化学発光で問題になるバックグランドがほとんどなく、且つ反応自体が瞬間発光で数秒以内に終了するため、短時間にＳ／Ｎ比のよいシグナルを得ることができるという利点を有する。
【０００３】
さらに、その発光反応系は、生物発光と呼ばれる酵素発光反応であり、全て生体内由来の成分で構成されているため、有害な化学物質等（例えばラジオアイソトープや発癌性化合物等）を含んでおらず安全性が高い。このため、当該発光蛋白質は診断薬等における標識としての応用が期待されている。
【０００４】
イクオリンをはじめとするカルシウム結合型発光蛋白質をイムノアッセイ等における標識として用いる場合、その標識を検出すべき物質と関連付けることが必要である。つまり、標識となる発光蛋白質を、検出すべき物質に直接結合させるか、または、何らかの物質を介して間接的に結合させる必要がある。本明細書においては、検出すべき物質と発光蛋白質（標識）を関連付ける物質であって、検出すべき物質に直接的に結合する物質、または、検出すべき物質に間接的に結合する物質を「リガンド」と称する。リガンドとしては、後で詳細に説明するように、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗原、抗体等があげられる。
【０００５】
カルシウム結合型発光蛋白質は比較的不安定であるため、リガンドとの結合の際にその発光活性が失活する可能性がある。また、より正確な分析・診断結果を得るためには、発光蛋白質とリガンドとの結合比率が１：１またはそれに近いことが所望される。もし、リガンドと発光蛋白質が結合比率１：１にて結合したリガンド−発光蛋白質からなる複合体が得られれば、迅速且つ正確な診断・検出系を確立することができる。
【０００６】
カルシウム結合型発光蛋白質の代表的なものは、オワンクラゲ(Aequorea aequorea)から得られたイクオリン(aequorin)である。イクオリンは、アポ蛋白質部分であるアポイクオリン（apoaequorin）と発光基質に相当するセレンテラジン（coelenterazine）と分子状酸素が複合体を形成した状態で存在している。イクオリン分子にカルシウムイオンが結合すると、青色（極大波長４６５nm）の瞬間発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミド（coelenteramide）、二酸化炭素を生成する。発光反応後、アポイクオリンは、ＥＤＴＡ等のキレート剤によりカルシウムイオンを除去し、還元剤、セレンテラジンおよび酸素の存在下にて低温にてインキュベーションすることによってイクオリンに再生することができる。イクオリンは、アポイクオリンをコードする遺伝子の解析により、１８９個のアミノ酸からなる蛋白質であることが知られている。そのアミノ酸配列は配列番号：１に示される。イクオリンは、カルシウム結合蛋白質のカルモジュリンと相同性があり、カルシウム結合のためヘリックス−ループ−へリックス構造であるＥＦハンドモチーフが３カ所あることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、Ｘ線結晶解析により、Ｃ末端付近の１８４番目のチロシン残基が発光基質であるセレンテラジン(coelenterazine)のペルオキシドの安定化に関与していることが示唆されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００７】
イムノアッセイ等の一般的な診断検出系において、汎用される方法の一つがビオチン−アビジン（またはストレプトアビジン）であり、イクオリンのビオチン化が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。Zattaらのビオチン化イクオリンは、イクオリンの遊離のアミノ基（−ＮＨ2）をビオチン化したものである。Zattaらの方法により修飾される可能性のあるアミノ基は、アミノ末端のアミノ基１箇所と１５箇所のリジンのアミノ基であるが、どのアミノ基がどの程度の比率でビオチン化されるかは一定でない。また特定の部位のアミノ基のみを特異的に修飾する方法は確立されていない。すなわち、イクオリンの遊離のアミノ基を介してビオチンを結合させる方法によっては、高品質なビオチン化イクオリンは未だ提供されていない。
【０００８】
カルシウム結合型発光蛋白質には、分子内に３〜６個のシステイン残基が存在することがその遺伝子解析より明らかとなっている。また、イクオリンとオベリンはＸ−線による構造解析が行われており、全てのシステイン残基はジスルフィド結合を形成しておらず、フリーの状態で存在していることが明らかになっている。さらにイクオリンはシステインの−ＳＨ基への低分子化学修飾剤Ｎ−エチルマレイミドやヨード酢酸により、容易にその発光活性を失活することも知られている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００９】
本発明者らは、すでにイクオリンの分子内に存在する３個のシステイン残基をセリン残基に変換したシステインフリーの変異イクオリンが発光活性を有することを報告している（例えば、非特許文献５参照）。このシステインフリーの変異型イクオリンを構成するアポイクオリンの５番目のセリン、５３番目のグルタミン酸、７１番目のメチオニン、８４番目のグルタミン酸をシステインに置換したアポイクオリンを作り、そのシステインを介してチロキシンを結合させたチロキシン−アポイクオリン複合体を作り、これをチロキシン−イクオリン複合体に再生したことが報告されている（例えば、非特許文献６参照）。しかし、これは、天然型イクオリンが持つ３つのシステイン残基を全てセリンに置換し、新たに導入した唯一のシステインを修飾したものである。すなわち、これまで天然型イクオリンがもつ固有の３個のシステイン残基を保持したまま、新たに導入したシステイン残基の−ＳＨ基にリガンドを結合させてなお発光活性を維持しているものは得られていない。
【００１０】
アポイクオリンを修飾してからイクオリンに再生するLweis等の方法では、再生されたイクオリンを修飾する場合に比較して収率が低い。また、イクオリンへの再生機構を考慮すると、修飾されたイクオリンを再生する方法では、修飾に用いられる化合物は再生過程に影響の少ない特定の化合物に限定される。一方、再生されたイクオリンを修飾する場合には、リガンド分子が特定されることはない。さらに、Lweis等の方法では、リガンド−イクオリン複合体、リガンド−アポイクオリン複合体、未修飾イクオリン、未修飾アポイクオリンの分離が行われていない。したがって、イクオリンに導入したシステイン−ＳＨ基を介してリガンドを結合させた均一なリガンド−イクオリン複合体で、実際の分析に応用できるものは未だに提供されていない。
【００１１】
【非特許文献１】
Inouye et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(1985): 3154〜3158
【非特許文献２】
Head et al., Nature 405 (2000): 372〜376
【非特許文献３】
Zatta et al., Anal. Biochem. 194(1991): 185〜191
【非特許文献４】
Shimomura et al., Biochemistry 13(1974): 3278-3286
【非特許文献５】
K. Kurose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989): 80-84
【非特許文献６】
Lewis et al., Bioconjugate Chem. 11(2000): 65-70 & 140-145
【非特許文献７】
Nomura et al., FEBS Lett. 295(1991): 63-66
【非特許文献８】
Inouye et al., J. Biochem., 105(1989): 473-477
【非特許文献９】
Inouye et al., Protein Expression and Purification 2(1991):
122-126
【非特許文献１０】
Shimomura et al., Biochem. J. 296(1993): 549〜551
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質にシステインを導入し、その−ＳＨ基を介してリガンドと１：１またはそれに近い結合比率で結合させることによって、発光活性のあるリガンド−発光蛋白質の複合体を提供することを目的とする。また、その複合体をイムノアッセイ等において標識として使用することも本発明の目的である。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、カルシウム結合型発光蛋白質としてイクオリン、リガンドとしてビオチンを用いて、発光蛋白質−リガンドの複合体について検討した。その結果、カルシウム結合型発光蛋白質を構成するアポ蛋白質に、一つのシステインをＮ−末端領域、特に天然型発光蛋白質のＮ−末端から４番目のアミノ酸残基までの領域に導入することにより元の発光蛋白質と同じ発光活性のある蛋白質が製造できること、それをリガンドと結合させると結合比率が１：１もしくはそれに近い複合体を製造しうること、その複合体が標識として使用できることを見出した。
【００１４】
前述のように、天然型イクオリンに存在するシステインに修飾を施すとその発光活性が低下するので、システインを介してリガンドを結合させるためには、新たにシステインを導入することが必要である。既にＣ末端領域あるいはＣ末端のアミノ酸を変更すると発光活性が低下することが知られている（例えば、非特許文献７参照）ので、Ｃ末端領域にシステインを導入することは適当でない。このため、イクオリン自身の安定性、アポイクオリンからイクオリンへの再生効率、システイン残基の導入によるイクオリンの高次構造への影響等を考慮した。その結果、天然型のアポイクオリンのＮ−末端から４番目のアミノ酸残基以内にシステイン残基の導入を試みた。その結果、驚くべきことに、得られたイクオリンは発光活性の低下がないこと、本来存在する３個のシステインに何らの影響がなく導入されたシステインのみにリガンドを結合させ得ること、そのようにして得られたリガンド−イクオリンが元の発光活性を維持していることが判明した。導入されたシステインのみにリガンドが導入され、固有の３個のシステインにリガンドが導入されないのは、（１）導入されたシステインはＮ−末端付近にあって、蛋白分子の表面に露出している（２）固有の３個のシステインが蛋白分子の内部に存在する（３）リガンドを結合させるための−ＳＨ基修飾試薬が蛋白分子内部に入り難い大きさであったことに起因すると考えられる。
【００１５】
カルシウム結合型発光蛋白質は、（１）セレンテラジンを基質とする（２）アポ蛋白質とセレンテラジンと酸素が結合して発光蛋白質を構成する（３）その発光蛋白質がカルシウムイオンの作用によって発光しアポ蛋白質とセレンテラミド（セレンテラミンの酸化物）および二酸化炭酸を発生する点で共通し、そのアミノ酸配列において類似性が高い。したがって、このイクオリンについて得られた結果は、他のカルシウム結合型発光蛋白質にも応用できる。
【００１６】
本発明は、天然型アポ蛋白質のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入された天然型または変異型のアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質である。ここで変異型の蛋白質とは、導入したシステインを維持し発光活性を損なわない範囲で、１〜５個のアミノ酸を失欠、置換、付加することによって改変した蛋白質である。蛋白質の改変においては、導入したシステインのみならず天然型発光蛋白質が有する全てのシステインを維持することが望ましい。何故ならば、天然型イクオリンが有する３個のシステインをセリンに変換した場合には、アポイクオリンからイクオリンへの再生に要する時間が３時間から２４時間に増加するからである（例えば、非特許文献５参照）。また、カルシウムとの結合のための構造、発光基質の安定化に必要な部位に変更を加えてはならない。カルシウム結合型発光蛋白質としては、イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインが挙げられる。システイン導入カルシウム結合型蛋白質は、システイン導入アポ蛋白質を発光基質であるセレンテラジンと酸素の存在下で処理することによって製造される。発光基質としては、セレンテラジンの外に発光活性を有するセレンテラジンのアナログ化合物を用いることもできる。
【００１７】
天然型アポイクオリンのアミノ酸配列は、配列番号：１に示される。システインは、アミノ末端のValから４番目のThrまで領域に導入される。したがって、本発明のカルシウム結合型発光蛋白質の１態様は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入された天然型または変異型のアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質である。配列番号：１のアミノ酸配列のＮ−末端のValとＮ−末端から２番目のLysの間、２番目のLysと３番目のLeuの間、３番目のLeuと４番目のThrの間にシステインを挿入することができる。また、Ｎ−末端のVal、Ｎ−末端から２番目のLys、３番目のLeu、４番目のThrのいずれかをシステインで置換することができる。特に好ましくは、３番目のLeuと４番目のThrの間にシステインを挿入する。
【００１８】
アポイクオリンは、遺伝子組換え法によって生産される。アポイクオリンを遺伝子組換え法で製造するに当たって、大腸菌（E. coli）の外膜タンパクＡ(ompA)遺伝子をアポイクオリン遺伝子と融合させてそれを大腸菌で発現させると高効率でアポイクオリンが生産される。その生産物は、天然型アポイクオリンのＮ−末端のValがAla-Asn-Ser-で置換されているが、カルシウム結合活性、発光活性において天然型アポイクオリンと同等である（例えば、非特許文献８および非特許文献９参照）。このＮ−末端にAla-Asn-Ser-を有する変異型アポイクオリンをセランテラジンおよび酸素と結合させたイクオリンが市販されている。この変異型イクオリンにおいては、Ｎ−末端から６番目（天然型Ｎ−末端から４番目）のThrまでの領域のどこにでもシステインを導入することができる。すなわち、この変異型イクオリンのＮ−末端のAlaから６番目のThrまでの領域にどこかにシステインを導入することができる。好ましい例は、５番目のLeuと６番目のThrの間にシステインを導入した変異型イクオリンであり、そのアミノ酸配列は配列番号：２に示されている。また、このシステイン導入変異型イクオリンは、６番目のシステインを維持し発光活性を維持する範囲で１〜５個のアミノ酸を失欠、置換、付加することによって改変することができる。したがって、本発明の好ましい他の態様は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するアポ蛋白質、または配列番号：２に示されるアミノ酸配列の６番目のシステインを維持し発光活性を維持する範囲で１〜５個のアミノ酸を失欠、置換、付加することによって改変したアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質である。
【００１９】
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、検出すべき物質に特異的なリガンドと結合し複合体を形成する。本発明は上記の組換えカルシウム結合型発光蛋白質に、該システインを介して、検出すべき物質に特異的なリガンドが１：１の比率で結合する複合体に関する。この発光蛋白質とリガンドの結合比率１：１は、１：１またはその近い比率を意味しており、厳格に解釈されるものではない。
【００２０】
本発明に言う、リガンドとは 、検出すべき物質に直接的に結合する物質、または、検出すべき物質に間接的に結合する物質である。例えば、イムノアッセイで抗原部位や抗原量を検出する場合の１次抗体である。イクオリンが結合した１次抗体は、検出すべき抗原に結合するので、イクオリンの発光を測定することにより抗原の部位や量が検出できる。この場合は１次抗体がリガンドとなる。
【００２１】
感度を高めるために２次抗体を使う方法も周知である。ビオチンを結合させた２次抗体を用い、イクオリンを結合させたアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる方法である。この際、アビジンおよびストレプトアビジンがリガンドとなる。この場合に、１分子のアビジンおよびストレプトアビジンが、４分子のビオチンと結合する性質を利用することが出来る。すなわち、イクオリンをビオチンと結合させ次いでそのビオチンを介してアビジンまたはストレプトアビジンに結合させるものである。この場合はビオチンがリガンドとなる。
【００２２】
リセプターを検出する場合においては、リセプターに結合するシグナルペプチド（インシュリンのようなホルモン、サイトカイン、ＴＮＦ、Ｆａｓリガンド等）がリガンドとなる。シグナルペプチドを検出する場合にはレセプターを構成するタンパクがリガンドとなる。薬物のレセプターを検出する場合には薬物がリガンドとなり、薬物を検出する場合は薬物レセプターがリガンドとなる。
【００２３】
酵素を検出する場合にはその基質がリガンドとなり、酵素の基質を検出する場合には酵素がリガンドとなる。核酸に対して特異的に結合する他の核酸を検出する場合には、相補的な核酸がリガンドとなる。多糖類に対して特異的に結合する他の物質を検出する場合には、多糖類がリガンドとなる。血液凝固因子と特異的に結合しうるレクチンや転写因子等のＤＮＡ結合性蛋白質等もリガンドとなり得る。
【００２４】
上記の複合体は、システインを導入したアポ蛋白質を遺伝子工学的に生産し、これを酸素の存在下において、セレンテラジンで処理してカルシウム結合型発光蛋白質に再生し、ついで導入されたシステインを介して検出すべき物質に特異的なリガンドを１：１、またはその近くの比率で結合させて製造することができる。このようにアポ蛋白質カルシウム結合型蛋白質として再生した後にリガンドと結合することによって、如何なるリガンドとも結合させることができる。
【００２５】
上記の複合体は、検出すべき物質と特異的に結合し、カルシウムイオンによって発光するので、イムノアッセイ等における標識としての使用できる。したがって、本発明は上記複合体を用いるリガンドに特異的な物質の測定方法、および測定のためのキットに関する。
【００２６】
他の態様において、本発明はまた、そのアミノ末端の４アミノ酸残基内にシステインを導入したアポ蛋白質をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換え発現ベクター、および組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞に関する。
【００２７】
他の態様において、本発明は前記組換え発現ベクターまたは組換え宿主細胞を用いることを特徴とする、本発明のアポ蛋白質の製造方法に関する。具体的には、前記組換え発現ベクターを用いてインビトロ発現を実施または宿主細胞を培養し、産生したアポ蛋白質を単離・精製することからなる。さらに、そのアポ蛋白質を酸素の存在下でセレンテラジンと処理して発光蛋白質に再生し、その発光蛋白質をリガンドと結合させて複合体とする製造法に関する。
【００２８】
【発明の実施の態様】
発光蛋白質のＮ−末端へのシステインの導入は、天然型のＮ−末端から１〜４番目のアミノ酸のいずれかをシステインで置換する方法、１〜４番目のアミノ酸の間にシステインを挿入する方法のいずれかによって導入することができる。アミノ酸を挿入する方法が好ましい。システインの導入は、当該技術分野において周知の技術、例えばＰＣＲ法を用いて発光蛋白質をコードする遺伝子にシステインのコドンを導入することにより実施することができる。次いで、得られたシステイン導入型アポ蛋白質遺伝子を含む組換え発現ベクターを調製し、これを用いて適する宿主細胞内でシステイン導入型アポ蛋白質を発現させる。
【００２９】
好ましいアポ蛋白質は、アポイクオリンである。アポイクオリンは配列番号：１で表される天然型アポイクオリンであっても、その変異体であっても良い。その変異体としては、天然型アポイクオリンのＮ−末端のValがAla-Asn-Ser-で置換されているものが好ましい。システインは、天然型アポイクオリンの４番目のアミノ酸であるThrまでの領域に導入することができる。Ｎ−末端がAla-Asn-Ser-で置換されている変異体の場合は、Ｎ−末端のAlaから６番目のThrまでの間のどこかにシステインを導入することができる。本発明の最も好ましいシステイン導入型アポイクオリンは、該変異体の５番目のLeuと６番目のThrの間にシステインが導入されたものであり、そのアミノ酸配列は配列番号：２に示される。
【００３０】
本発明において、前記発光蛋白質を発現させるために用いるベクターには、無細胞発現系（インビトロ トランスクリプション−トランスレーション）に、および宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物培養細胞を用いる蛋白質発現系に適するベクターとすることができ、そのようなベクターは市販されているかまたは公知のベクターから容易に作製することができる。例えば、インビトロトランスレーションおよび動物培養細胞における発現に用いるベクターは、ヒトサイトメガロウイルスのimmeadiate−early エンハンサー／プロモター領域を組込み、その下流域にＴ７のプロモター配列／マルチクローニング部位を有するｐＴａｒｇｅｔＴベクターやＳＶ４０エンハンサーとＳＶ４０のｅａｒｌｙプロモターを有するｐＳＩベクター（プロメガ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ−ＴａｇおよびｐＢＫ−ＲＳＶ（ストラタジーン社）などである。また、大腸菌、酵母などの微生物宿主における発現に適するベクターは、例えば大腸菌系のＴ７のプロモターを有するｐＥＴシリーズベクター発現システム（例えばｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ２７ｂ（＋）、ｐＥＴ２８ａ（＋）；ノバジェン社）、および酵母系においてはアルコールオキシダーゼのプロモターを有するピチア発現系ベクターｐＩＣシリーズベクター（例えばｐＰＩＣ９Ｋ、ＰＩＣ３.５Ｋ；インビトロゲン社）などである。
【００３１】
システイン導入型アポイクオリン遺伝子を含む組換え発現ベクターを用いて適する宿主細胞を形質転換し、当該宿主細胞を培養し、次いで発現した所望のアポ蛋白質を単離する。得られたシステイン導入型アポイクオリンを、酸素の存在下においてセレンテラジンと処理して、システイン導入型イクオリンへ再生する。さらに、発光基質であるセレンテラジンの代わりに、セレンテラジン誘導体（アナログ化合物）を用いることにより、発光活性を有する半合成イクオリンを製造することも可能である。半合成イクオリンは、天然イクオリンに比べて、カルシウムに対するレスポンスの異なるもの、Ｓ／Ｎ比が改善された性質をもつものが報告されている（例えば、非特許文献１０参照）。再生されたイクオリンを例えば疎水性クロマトグラフによって精製することにより、未精製アポイクオリンを含まない、高純度システイン導入型イクオリンとすることができる。
【００３２】
システイン導入型イクオリンは、導入したシステイン残基の−ＳＨ基を介して、特異的リガンドと結合させることができる。特異的リガンドとの結合手段は、リガンドの物理化学的特性等により異なるが、イクオリン分子サイズおよびリガンドとの立体障害を考慮して、直接的にまたはリンカーもしくはスペーサーを介して結合させる。
【００３３】
本発明において用いるリンカーもしくはスペーサーは、−ＳＨ基と特異的に反応しうるものであれば特に限定されないが、２０オングストローム以上の長さを有するものが好ましい。リンカーもしくはスペーサーとして使用しうる種々の−ＳＨ基修飾試薬は市販されており、これらを適宜利用することができる。システイン導入型イクオリンにリガンドを結合させる反応は、３０℃以下、好ましくは２５℃以下、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６〜７.５で行うのが望ましい。
【００３４】
イクオリンを発光蛋白質の代表例とし、実施例にて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
【実施例】
実施例１ システイン挿入アポイクオリン発現ベクターの構築
天然型アポイクオリンのＮ−末端のValがAla-Asn-Serで置換された変異型アポイクオリンの発現ベクターpiP-HE（例えば、非特許文献８参照）から、アポイクオリン遺伝子のＮ−末端近傍にある制限酵素部位EcoRIをＰＣＲ法で欠失したpiP-HEΔEを構築した。変異型アポイクオリンのＮ−末端より６番目）（天然型アポイクオリンのＮ−末端より４番目）にシステイン残基をＰＣＲ法で導入することにより、システイン挿入イクオリン遺伝子発現ベクターpiP-HE-Cys4を構築した。具体的に、その構築手順を示す（図１）。
０.１μgのpiP-HEプラスミドをテンプレートとして、各１μgのＰＣＲプライマーOmpA1-XbaI（5'TGG-AAC-TCT-AGA-TAA-CGA-GGG-CAA-AAA 3', SEQ ID NO：3）およびOmpA1-HindIII（5'TCC-AAG-CTT-GGA-GTT-CGC-GGC-CTG 3', SEQ ID NO：4）を用いた。DNA Thermal Cycler（Perkin-Elmer社製）およびAmpli Taq DNAポリメラーゼを含むGeneAmp ＰＣＲ試薬キット（宝酒造社製）を用いて所望のフラグメントをＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）でフラグメントを分離、制限酵素XbaIとHindIIIで消化を行い、制限酵素部位EcoRIを欠失したXbaI-HindIIIフラグメントを取得した。一方、piP-HEプラスミドを制限酵素XbaIとHindIIIで消化し、アポイクオリン遺伝子を含むベクター部分をＤＮＡ精製キット（キアゲン社製）で単離した。これを増幅したXbaI-HindIIIフラグメントと連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ８３株を形質転換した。形質転換体の中から、EcoRI部位を欠失したpiP-HEΔEプラスミドを単離した。遺伝子配列の確認は、Taq DyeDeoxy Termintor Cycle sequencing Kit（Applied Biosytems 社製）およびＤＮＡ ３７７ シークエンサー（Applied Biosytems 社製）を用いて決定した。EcoRI部位のみが欠失し、アミノ酸配列はもとの変異型と同一であった。
【００３６】
次に０.１μgのpiP-HEΔEプラスミドをテンプレートとして、各１μgのＰＣＲプライマーCys4-AQ (5'GGC-AAG-CTT-TGT-ACT-AGT-GAC-TTC-GAC-AAC-CCA-AGA-TGG 3', SEQ ID NO：5)および630EcoRI-AQ (5'GCC-GAA-TTC-ATC-AGT-GTT-TTA-TTC-AAA 3', SEQ ID NO：6) を用いて、GeneAmp PCR 試薬キット（宝酒造社製）により所望のフラグメントをＰＣＲ増幅した後、精製キット（キアゲン社製）でフラグメントを分離し、次いで制限酵素HindIIIとEcoRIで消化して、変異型アポイクオリン遺伝子のＮ−末端から６番目（天然型アポイクオリン遺伝子のＮ−末端から４番目に）にシステインを有するHindIII-EcoRIフラグメントを取得した。一方、piP-HEΔEプラスミドを制限酵素HindIIIとEcoRIで消化した後、プロモーターおよびOmpAシグナルペプチドを含むベクター側を単離した。次いで、これをHindIII-EcoRIフラグメントと連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ８３株を形質転換した。形質転換体の中から、Ｎ−末端から６番目にシステインが挿入された変異型アポイクオリン発現するpiP-HE-Cys4プラスミドを単離した。塩基配列を、Taq DyeDeoxy Termintor Cycle sequencing Kit (Applied Biosytems 社製)およびＤＮＡ ３７７ シークエンサー（Applied Biosytems 社製）を用いて決定し、システイン挿入アポイクオリン（Ｃｙｓ４−アポイクオリン）遺伝子を確認した。Ｃｙｓ４−アポイクオリンのアミノ酸配列は配列番号：２で示される。
【００３７】
実施例２ システイン挿入型アポイクオリン生産株の分離
宿主として大腸菌ＷＡ８０２株を使用し、実施例１で作製した組換えプラスミドpiP-HE-Cys4を発現ベクターとし、常法により形質転換を実施した。形質転換体２０株をＬＢ（水１Ｌ中、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ，ｐＨ７.２）寒天培地にて３０℃で一晩培養した後、５mLのアンピシリン含有（５０μg／mL）ＬＢ液体培地に植菌し、さらに３７℃で１６時間培養した。次いで、最も高い発光活性を有する菌株、即ち最も高いＣｙｓ４−アポイクオリン産生菌株を選択し、高発光活性を有する菌株を大量培養用の種株とした。
【００３８】
実施例３ システイン挿入型アポイクオリン産生菌株の培養
Ｃｙｓ４−アポイクオリン産生菌株を３０℃で一晩培養後、５０mLのアンピシリン含有（５０μg／mL）ＬＢ液体培地に植菌した。さらに３０℃で８時間培養した後、新鮮ＬＢ液体培地２Ｌに移し、３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。菌体と培養液を低速遠心分離（５０００×ｇ）により分離した。菌体、培養液は両者とも発現したアポイクオリンを含むためそれぞれ保存し、Ｃｙｓ４−アポイクオリン精製の出発材料とした。
【００３９】
実施例４ 菌体からのシステイン挿入型イクオリンの再生および精製
集菌した菌体は、還元剤のジチオスレイトール（和光純薬社製）２００mgを含む４００mLの緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）に懸濁した。菌体を氷冷下で２分間超音波破砕処理して破砕した後、２０分間遠心分離（１２０００×ｇ）して上澄み液を集めた。少量のメタノールに溶解した化学合成セレンテラジンを、Ｃｙｓ４−アポイクオリンの１.２倍のモル濃度になるように、上記の上澄み液に添加し、４℃で５時間以上放置した。得られた上澄み液を直ちに、カラム緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア製、直径２cm×１０cm）に吸着させ、２８０nmでの溶出液の吸光度が０.０５以下になるまで０.１Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液でカラムを洗浄した。次いで、カラムに吸着した未再生Ｃｙｓ４−アポイクオリンと再生Ｃｙｓ４−イクオリンの両者を含む画分を０.１Ｍ〜０.４Ｍ−ＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出した。
【００４０】
再生Ｃｙｓ４−イクオリンと未再生Ｃｙｓ４−アポイクオリンとの分離は、ブチルセファロース４ファーストフローゲルクロマトグラフィーによって、次のように実施した。
Ｑ−セファロースカラムから溶出したオレンジ色の溶出液に、最終濃度が２Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加した。添加後、不溶性画分を遠心分離により除去した。次いで、２Ｍ 硫酸アンモニウムを含む上述のカラム緩衝液で平衡化したブチルセファロース４ファーストフロー（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２cm×８cm）にその上澄み液を加え、硫酸アンモニウムの２Ｍ〜１Ｍの直線濃度勾配により溶出し、発光活性を有する、即ち再生Ｃｙｓ４−イクオリンを含むオレンジ色画分を収集した。一方、未再生のＣｙｓ４−アポイクオリンはカラム緩衝液でのみ溶出された。
【００４１】
精製画分の純度検定は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実施した。その結果、精製画分について分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターで測定した結果、９８％以上であった（図２）。精製蛋白質濃度をウシ血清アルブミンを標品としてBradford法（バイオラッド社製）により決定したところ、２Ｌの培養菌体からの高純度Ｃｙｓ４−イクオリン収量は４４.６mgであった。
【００４２】
実施例５ 培養液からのシステイン挿入型イクオリンの再生および精製
培養液から純度９８％以上のアポイクオリンを取得し、実施例４に従ってイクオリンに再生し、精製した。精製されたイクオリンを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、実施例４で得られたものと同じであった。培養液２Ｌから高純度Ｃｙｓ４−イクオリン１０.４mgが得られた。
【００４３】
実施例６ マレイミド活性化ビオチンによるビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの調製
精製Ｃｙｓ４−イクオリンのモル数の１.２から３倍当量のマレイミド活性化ビオチンとをＰＢＳ溶液（１０mM リン酸緩衝液、２.７mM ＫＣｌ、１３７mMＮａＣｌ、ｐＨ７.４）中において、反応温度０〜２０℃にて２時間インキュベートすることにより、Ｎ−末端に挿入したシステイン残基を特異的にビオチン化した。具体的には次のように実施した。
１.５mlのポリプロピレン製チューブに、８００μlのＰＢＳ溶液に、ＰＢＳ溶液に溶解したマレイミド活性化ビオチン（EZ-Link PEO-Maleimide-activated Biotin，Pierce社：スペーサーの長さ：２９.１オングストローム）４μl（３０nmol）を加え、次いでＣｙｓ４−イクオリン２００μl（１０nmol）を添加して、修飾反応を開始させ、暗所で２０℃にて２時間反応を行った。修飾反応の経過は、３０分ごとに反応液を１μl取り出し、ニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にてドットブロットを行い、抗ビオチンウサギ抗体−アルカリフォスファターゼ（シグマ社製）を用いたドットブロット発色法で、ビオチン化を確認した。その結果、０分から１時間で急速にビオチン化が起こるが、２時間以上において顕著なビオチン化の増加は検出されなかった。コントロールとして、システインを挿入していないイクオリンについて、同一の条件でビオチン化を行ったが、ビオチン化はほとんど検出されず、新規に挿入されたシステイン残基のみでビオチン化反応が起こっていることが明らかとなった。
２０オングストローム以上のスペーサーを持つマレイミド型の修飾法により、ビオチン以外のリガンド、例えば抗体、抗原、低分子有機化合物等を直接結合させることが可能であることが示された。
【００４４】
また、上述のようにして得られたビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンと未反応のＣｙｓ４−イクオリンの発光活性を比較したところ、ビオチン化により発光活性の低下はほとんど観察されず、ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンは９６％の発光活性を保持していた。また、上記反応系で、反応温度を３０℃以上に上げた場合、発光活性は反応時間２時間で５０％以下に低下した。さらに、上記反応系をｐＨ８以上で実施すると、発光活性は２時間で、５０％以下に低下することも明らかとなった。
したがって、システイン挿入イクオリンのビオチン化反応は、温度３０℃以下、好ましくは２５℃以下、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６〜７.５で行うのが望ましい。
反応後、未反応試薬の除去、ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの単離および緩衝液交換は、４℃でのセントリコン１０（アミコン社製）を用いた遠心型濾過法の単一工程で行った。この工程は、使用目的の反応系に応じて、緩衝液を交換できる利点がある。発光活性の低下を防ぐため、蛋白質濃度を１００ng／mL以上で、−８０℃以下の温度で保存する。この場合と６ヶ月以上、著しい活性低下は観察されない。
【００４５】
実施例７ ヨードアセチル活性化型ビオチンによるビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの調製
他の代表的なシステイン(−ＳＨ)残基への特異的修飾法として、ヨードアセチル型ビオチンを用いたビオチン化を、次のように実施した。
４０nmolのヨードアセチル活性化型ビオチン（EZ-Link PEO-Iodoacetyl biotin，Pierce社製：スペーサーの長さ：２４.８オングストローム）を含む８００μlの５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）に、１５nmolのＣｙｓ４−イクオリンを添加し、暗所で２０℃にて２時間反応を行った。修飾反応の経過は、３０分ごとに反応液を１μl取り出し、ニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にてドットブロットを行い、抗ビオチンウサギ抗体−アルカリフォスファターゼ（シグマ社製）を用いたドットブロット発色法で、ビオチン化を確認した。その結果、０分から１時間で急速にビオチン化が起こったが、２時間以上において顕著なビオチン化の増加は検出されなかった。一方、コントロールとしてシステインを挿入していないイクオリンについて、同一の条件でビオチン化を行ったが、ビオチン化はほとんど検出されず、新規挿入イクオリンのみで効率よくビオチン化反応が起こっていることが明らかとなった。
また、上述のようにして得られたビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンと未反応のＣｙｓ４−イクオリンの発光活性を比較したところ、ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンは８８％の発光活性を保持していた。このことは、ビオチン化に関してマレイミド法等の付加反応のみならず、置換反応を利用して新規挿入システイン残基に特異的なビオチン化が可能であることを示している。さらに、２０オングストローム以上のスペーサーを持つヨードアセチル型の修飾法により、ビオチン以外のリガンド、例えば抗体、抗原、低分子有機化合物等を直接結合させることが可能であることが示された。
【００４６】
実施例８ ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの結合数の決定
実施例４で得られたビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンについて、蛋白質１分子当たりのビオチンの結合個数を確認した。確認手段として、Voyager DE Pro mass spectometer（PerSeptive Biosystem社）を用いたマトリックス支援レーザー脱離イオン飛行時間型質量分析装置(Matrix assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometory／MALDI-TOF-MS）法により分子量を測定することにより実施した。この方法はビオチン化されたシステイン挿入型イクオリンとビオチン化されていないものとの分離が可能であり、且つビオチンの結合個数が決定できる。
【００４７】
Ｃｙｓ４−イクオリンの計算平均分子量（m／z）は２１７３５.３４、１ケ所、２ケ所、３ケ所ビオチン化されたシステイン挿入型イクオリンの計算平均分子量はそれぞれ、２２２６０.９６、２２７８６.５８、２３３１２.２０である。分子量スタンダードとて、アンジオテンシンI (m／z 1296.69), インスリン（m／z 5734.59）、アポミオグロビン（m／z 16952.60）、アポイクオリン（m／z 2163.20）を用いた。使用するマトリックスは、アルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（アルドリッチ社製）とシナピン酸（アルドリッチ社製）より調製した。マトリックス液１.５μlと測定サンプル０.５μlを混合し、次いで風乾した後に混合液を分子量測定に供した。その結果、未反応のＣｙｓ４−イクオリン、１ケ所のみビオチン化されたＣｙｓ４−イクオリン、１ケ所のみビオチン化されたＣｙｓ４−イクオリンとシナピン酸のコンプレックスに相当する分子量、２１７２３.１２、２２２５２.２３、２２４７４.５６のピークが検出された。そのピーク比は４.９：６９.６：２５.５であった。また２ケ所以上ビオチン化されたＣｙｓ４−イクオリンは全く検出されなかった。これらの結果より、未反応のＣｙｓ４−イクオリンは５％以下であり、９５％以上の効率でＣｙｓ４−イクオリン１分子につき、１個のビオチン化が起きていることが明らかとなった。故に、結合比率を１：１で結合したビオチン化イクオリンを安定的に且つ高効率で製造しうる方法が達成された。
【００４８】
実施例９ ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの検定
１）発光パターンの比較
システインが挿入されていない組換えイクオリン、Ｃｙｓ４−イクオリン、ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの１ngに１００μlの５０mM 塩化カルシウム溶液を添加し、発光量および瞬間発光のパターンをルミノメーター（ＴＤ−４０００型、ラボサイエンス社製）で測定した（図３）。図中ａはシステインが挿入されていない組換えイクオリン、ｂはＣｙｓ４−イクオリン、ｃはビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンのものである。その結果、発光量および発光パターンは３者で変化はなく、システイン残基へのビオチン化修飾により発光活性の低下、カルシウムに対するレスポンスの違いは無いことが明らかとなった。
【００４９】
２）ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの定量性
ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの検出限界と蛋白質濃度に対する直線性についての検討を行った。ビオチン化蛋白濃度を１０フェムトグラムから１００ナノグラムに希釈し、５０mMの塩化カルシウム溶液（１００μl）添加し、その発光強度（初期発光最大値：Ｉｍａｘ）をルミノメーター（アトー社製、モデルＡＢ２２００型）で測定した。３回の測定値の平均値をプロットした結果、直線性が確認された（図４）。ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの検出限界は１ピコグラム以下であり、この検出限界は、システインを導入していない組換えイクオリンと同等であった。
【００５０】
実施例１０ ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンを用いたアビジンの検出
ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンのビオチン部分がアビジンを認識し、且つ検出に定量性があるかどうかを直接結合法により確認した。アビジン（和光純薬社製）をＴＢＳＴ溶液（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１５０mM ＮａＣｌ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解したストック溶液（１mg／ml）を希釈して、１ピコグラムから１マイクログラムの濃度で５mlイムノアッセイ用ポリソープチューブ（ヌンク社製）に分注し、アビジンをチューブ内に吸着させた。これとは別にＴＢＳＴ−ＥＤＴＡ溶液（１０mM ＥＤＴＡ含有ＴＢＳＴ溶液）にて、１％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、生化学工業社製）溶液を調製した。次いで、２００μlの１％ウシ血清アルブミン溶液でアビジンを吸着したチューブをコーティングし、非特異吸着を防止した。このチューブに５μlのビオチン化システイン挿入型イクオリン（１００μg／ml）および１００μlの１％ウシ血清アルブミン含有ＴＢＳＴ−ＥＤＴＡ溶液を加え、室温で２０分間放置し、５００μlのＴＢＳＴ−ＥＤＴＡ溶液で３回洗浄した。洗浄チューブをルミノメーター（アト−社製、モデルＡＢ２２００型）内に装着し、１００μlの５０mM塩化カルシウム溶液を注入し、発光の初期発光最大値（Ｉｍａｘ）を測定した。測定は３回実施し、その平均値をプロットにした（図５）。その結果、直接結合法ではビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリン１０ナノグラム以上において直線性があり、アビジンの定量が可能であることが示された。故に、本発明のビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンはビオチン−アビジン結合を基本とするイムノアッセイ系において有用であることが示された。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば、カルシウム結合型発光蛋白質のアミノ末端部分にシステイン残基を導入した新規発光蛋白質およびその製造方法が提供される。該発光蛋白質は、前記導入したシステイン残基を介して、検出すべき物質に対する特異的リガンドと１：１の結合比率で結合した複合体を形成する。該複合体はカルシウムイオンによって発光するので、イムノアッセイ等の標識として有用である。
【００５２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】システイン挿入イクオリン発現ベクターの構築を示す概略図である。
【図２】システイン挿入型イクオリンの精製純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した結果を示す図である。
【図３】ａはシステインを導入していないイクオリン、ｂはＣｙｓ４−イクオリン、ｃはビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの発光量および瞬間発光のパターンである。
【図４】ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンの検出限界と蛋白質濃度に対する発光活性を示すグラフである。
【図５】ビオチン化Ｃｙｓ４−イクオリンを用いてアビジンを定量した結果を示すグラフである。
Claims (13)
- 配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質。
- 発光基質としてセレンテラジンまたは発光活性を有するそのアナログ化合物を含む、請求項１に記載の組換えカルシウム結合型発光蛋白質。
- 配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するアポ蛋白質をコードするＤＮＡ。
- 請求項３に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
- 請求項４に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
- 配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質に、配列番号：２における６番目のシステインを介して、検出すべき物質に特異的なリガンドが１：１の比率で結合する複合体。
- 検出すべき物質に特異的なリガンドがビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、酵素、基質、抗体、抗原、核酸、多糖類、レセプター、またはこれらに結合能を有する化合物である請求項６記載の複合体。
- 検出すべき物質に特異的なリガンドがビオチンである請求項７記載の複合体。
- 発光基質としてセレンテラジンまたは発光活性を有するそのアナログ化合物を含む、請求項６〜８のいずれかに記載の複合体。
- 配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するアポ蛋白質を遺伝子工学的に生産し、これを酸素の存在下でセレンテラジンで処理して組換えカルシウム結合型発光蛋白質とし、配列番号：２における６番目のシステインを介して、検出すべき物質に特異的なリガンドを１：１の比率で結合させることよりなる複合体の製造方法。
- 検出すべき物質に特異的なリガンドがビオチンである請求項１０記載の複合体の製法。
- 請求項６〜９のいずれか１つに記載の複合体を用いることを特徴とするリガンドに特異的な物質を測定する方法。
- 請求項６〜９のいずれか１つに記載の複合体を構成成分とすることを特徴とするリガンドに特異的な物質を測定するためのキット。
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