JP3521841B2 - ファイトプラズマの検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物病原細菌であ
るファイトプラズマの検出方法、およびそれに使用する
ファイトプラズマのSecAタンパク質に対する特異的抗体
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ファイトプラズマ（phytoplasma)は種々
の植物に感染し萎縮病など農業上多大な被害を引き起こ
す植物病原細菌である。この細菌は培養が困難なことか
ら、詳しい性質の解析が進んでいないのが現状である。

【０００３】従って、ファイトプラズマの診断における
従来の方法としては、病徴の観察、電子顕微鏡による観
察、接ぎ木や昆虫による伝搬性の試験などが主流であ
り、多大な時間と手間がかかった。また、 PCR法による
検出診断は高価な資材と手間を要する。血清学的診断技
術は簡便で感度の高い技術であるが、ファイトプラズマ
については機能が既知のタンパク質に対する特異的抗体
はこれまで得られていないため、ファイトプラズマ属に
広く反応する検出・診断系は報告されていない。また、
感染植物から抽出したファイトプラズマのタンパク質を
抗原としてポリクローナル抗体を作出し、それを用いて
検出を行うという方法が提案されているが、タンパク質
の精製が困難なため、得られる抗体は健全植物とも反応
して特異性が低下するいう欠点がある。これを克服する
ためのモノクローナル抗体検出に供する方法も報告され
ている。この方法は特異性を上げるための有用な手段で
あるが、特異性が高すぎるため特定のファイトプラズマ
しか検出できず、しかも、モノクローナル抗体の性質と
して感度が低いのが欠点である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、従来の
ファイトプラズマ診断法は、手間と時間がかかったり、
高価な資材を必要としたりする。また、これまで提案さ
れた血清学的診断法は、特異性が低いか、あるいは特異
性が高すぎて広範なファイトプラズマの検出はできず、
しかも感度が低いという欠点があった。本発明は、ファ
イトプラズマに特異的でかつすべてのファイトプラズマ
種の検出が可能であり、しかも簡便で感度の高いファイ
トプラズマの検出方法を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ファイトプ
ラズマの血清学的検出法に用いるための抗体の製造にお
いて、ファイトプラズマ属の細菌に共通に存在する、菌
体表面の膜タンパク質であるSecAタンパク質を抗原とし
て用いれば上記目的を達成しうることを見出した。具体
的には、本発明者は初めてsecA遺伝子をクローニングし
て塩基配列を決定し、遺伝子組換え技術により製造した
SecAタンパク質を抗原として特異的抗体を作出し、これ
を用いた血清学的な診断技術を開発した。

【０００６】従って、本発明は、ファイトプラズマのSe
cAタンパク質に対する特異的抗体を用いた検出法により
ファイトプラズマを検出することを含む、ファイトプラ
ズマの検出方法を要旨とする。

【０００７】上記方法において特異的抗体は、ファイト
プラズマのSecAタンパク質の抗原性部位を含むポリペプ
チドを抗原として動物に免疫して得られるものであるの
が好ましく、特に、抗原性部位がファイトプラズマのse
cA遺伝子の 595bpから1056bpまでの領域によりコードさ
れる部位であるのが好ましい。

【０００８】また、上記検出法としては酵素免疫検定法
が使用できる。本発明によれば、配列番号１で表される
塩基配列を有するファイトプラズマのsecA遺伝子、およ
び配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するファイト
プラズマのSecAタンパク質をコードする遺伝子も提供さ
れる。

【０００９】また、配列番号３で表される塩基配列を有
するDNA 、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドをコードするDNA にも関する。さらに、
本発明は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを含有する免疫原、および配列番号４で表
されるアミノ酸配列を有する組換えポリペプチドを含有
する免疫原、ならびにこれらの免疫原を動物に免疫して
得られる特異的抗体にも関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のファイトプラズマ検出方
法は、ファイトプラズマに特異的でかつ広域スペクトラ
ムを示し (全てのファイトプラズマ種の検出が可能であ
る) 、しかも感度の極めて高い血清学的検出方法であ
る。本発明方法で用いる抗体は、ファイトプラズマ属を
通じて共通性高く存在する必須タンパク質であり、菌体
の表面に多量に発現している膜タンパク質であるSecAタ
ンパク質に対する特異的抗体である。特に、このSecAタ
ンパク質の抗原性の高い部位からなるポリペプチドを抗
原として得られる特異的抗体が望ましく、また、SecAタ
ンパク質またはポリペプチドは遺伝子組換え技術によ
り、例えば大腸菌で発現させて、均一なものを大量に製
造することができ、精製も容易である。抗体は、均質な
抗原が安定かつ大量に供給できれば容易に生産できる。 (1) secA遺伝子の抗原性部位の構造と塩基配列 secA遺伝子は総塩基数2505 bp であり、アミノ酸にして
835aaのタンパク質をコードしている。なお、このほか
に終止コドンとして３塩基（TAA)が2505bpの最後に付加
されている。secA遺伝子の終止コドンを含めた全塩基配
列および対応するアミノ酸配列は図１〜３および配列表
の配列番号１に示す通りである。また、SecAタンパク質
のアミノ酸配列を配列番号２に示す。

【００１１】secA遺伝子の塩基配列は、本発明者により
後述の実施例１に記載のようにして決定された。SecAタ
ンパク質を抗原として用いて特異的抗体を製造する場
合、このタンパク質の全体を用いてもよいが、力価が高
く、かつSecAタンパク質に対して特異性の高い抗体を得
る目的から強い抗原性を示す部位のみを用いるの有益で
ある。ファイトプラズマ以外のバクテリアでは細胞膜の
外側にペプチドグリカンからなる細胞壁が存在するが、
ファイトプラズマでは細胞壁がないためSecA蛋白質が膜
表面に露出する部分があり、抗SecA抗体を用いる検出方
法が可能になる。例えば、膜表面に露出していると予想
される領域を遺伝子解析プログラム (例、DNA STAR (帝
人システムテクノロジー))を用いて解析して、secA遺伝
子の595 bpから1056bpまでの462 bp (図４および配列表
の配列番号３に示す) 、あるいは１bpから450bp までの
領域が特異的に抗原性が高い部位と判断される。そこで
まず前者の領域を用いて、以下のような方法でこの部位
を発現させて抗原となるペプチドを得る。 (2) 抗原の調製 抗原として用いるSecAタンパク質またはその断片を遺伝
子組換え技術により調製すると、精製されたタンパク質
またはペプチドを大量に得ることができる。遺伝子組換
え技術により目的のタンパク質またはペプチドを製造す
るには、この分野で通常用いられている技術により、遺
伝子の調製、クローニング、組換えプラスミドの作製、
形質転換体の作製、目的タンパク質の発現、回収などを
行えばよい。

【００１２】例えば、secA遺伝子またはその断片を調製
するには、ファージライブラリーの作製、ゲノムDNA を
制限酵素で切断してクローニングする方法、特異的プラ
イマーを用いた PCRにより目的の遺伝子を増幅する方法
などにより行うことができる。こうして得た遺伝子をpE
T30aなどの発現ベクターにクローニングする。次いで、
得られた組換えプラスミドを大腸菌BL21(DE3) 株、JM10
9(DE3)などの適宜宿主に導入して形質転換体を作製す
る。得られた形質転換体を適宜培地で培養してSecAタン
パク質またはその断片ペプチドを発現させ、培養物から
発現したタンパク質またはペプチドを回収する。回収し
たタンパク質等はカラムクロマトグラフィーや電気泳動
等により精製し、これを抗原とし抗体の作出に用いる。 (3) 抗SecA抗体（ポリクローナル抗体）の作出 精製SecAタンパク質またはその断片を家兎、ラビット、
マウスなどの動物に免疫して体内に抗体を産生させ、抗
体を含有する体液、細胞、組織等として回収する。例え
ば抗血清として抗体を回収した場合、必要によりカラム
クロマトグラフィーなどの手段で精製し、抗secA抗体を
得る。 (4) ファイトプラズマの検出 得られた抗SecA抗体を用いて抗原抗体反応により、ファ
イトプラズマを検出する。例えば、DAS-ELISA などの酵
素免疫検定法やDIBA、Immuno Tissue Blotting、ウェス
タンブロットなどを用いて植物の抽出液中のファイトプ
ラズマを検出できる。

【００１３】使用する抗SecA抗体は、ファイトプラズマ
の膜タンパク質であるSecAタンパク質を抗原として用い
るため、健全植物とは反応せず、感染植物にのみ特異的
に反応する。そして、SecAタンパク質は感染植物から抽
出して得るのではなく、遺伝子組換え技術により大腸菌
などの宿主で発現させて精製するので、従来の血清学的
診断方法と異なり特異性が高い。

【００１４】さらに、本発明で使用する特異的抗体はポ
リクローナル抗体であるので、ファイトプラズマ属の各
種に共通に、なおかつファイトプラズマ属細菌に特異的
に反応を示す。また、本発明方法は著しく感度が高い。
これは、SecAタンパク質はファイトプラズマ細胞の最も
外側の細胞膜に局在しており、SecAタンパク質に対する
抗体は細胞全体を抗原として認識できることから起因す
ると考えられる。

【００１５】

【実施例】以下の実施例において本発明をさらに詳しく
説明する。

【００１６】

【実施例１】secA遺伝子の塩基配列の決定 Onion Yellows Phytoplasma 感染シュンギクより全ゲノ
ムDNA を抽出し、パスフィールド電気泳動によりファイ
トプラズマDNA を分離した。ショットガンクローニング
によりDNA を細分化し、pUC18 ベクターを用いて大腸菌
JM109 (タカラ) に形質転換してランダムクローンを作
製した。オートシーケンサー377(ABI)を用いて塩基配列
を決定した。

【００１７】

【実施例２】secA遺伝子の抗原性部位の解析 実施例１において決定した塩基配列において、遺伝子解
析プログラム、DNA STAR (帝人システムテクノロジー)
を用いて、膜表面に露出していると予想される領域を解
析した。その結果、595 bpから1056bpまでの462 bp、お
よび１bpから450bp までの450bp を特異的に抗原性が高
い部位と判断した。

【００１８】

【実施例３】SecAタンパク質の発現 実施例２で解析した抗原性の高い部位の１つ、595 bpか
ら1056bpまで (配列番号３）を、以下のようにして大腸
菌で大量発現させて、154 アミノ酸からなるタンパク質
（配列番号４）を得た。発現系構築の手順は図５に示す
通りである。

【００１９】配列番号１で表されるsecA遺伝子中の595
bpから1056bpまでの462 bpの領域（配列番号３）をNde
I、XhoIの制限酵素で切断し、同酵素で切断した発現ベ
クターpET30a(Novagen) とligationすることによってク
ローニングした。得られた組換えプラスミドを用いて大
腸菌BL21(DE3) 株 (Novagen)を形質転換し、LB培地で37
℃で培養した。大量発現は、前培養として２mlで一晩培
養し、それを 200mlのLB培地に植え継ぎ、OD₆₀₀ ＝0.6-
0.8 になるまで培養し、発現誘導のためIPTGを最終濃度
１mlになるように加えてから３時間培養を続けた。培養
後、大腸菌を遠心分離によって回収し、バッファー（50
mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8.0) に懸濁し
て超音波破砕機により菌体を破砕した。不溶性画分を抽
出するため、この破砕液を遠心分離し、沈殿をバッファ
ー（50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 6M Urea, p
H 8.0)で懸濁した。

【００２０】

【実施例４】発現タンパク質の精製 大腸菌より抽出したタンパク質粗抽出液の不溶性画分
を、バッファー（20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 5mM imid
azole, pH 7.9)で平衡化したニッケルカラム (Novagen
社) にかけ、同バッファーで洗浄した後、バッファー
（20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 5mM imidazole, pH 7.9)
で溶出し、発現タンパク質を精製した。SDSポリアクリ
ルアミド電気泳動を行った。図６には、大腸菌より抽出
したタンパク質粗抽出液の不溶性画分 (精製前) 、ニッ
ケルカラムにより精製した後の溶出画分 (精製後) およ
びＭとして分子量マーカー (SDS-PAGE Standards Low R
ange、Biorad) を泳動した結果を示し、分子量(kDa) を
右に記した。単一のバンドとして純度の高いタンパク質
が精製されたことを確認し、これを精製タンパク質試料
とした。

【００２１】

【実施例５】ポリクローナル抗体の作出 精製SecAタンパク質試料を用い、家兎を免疫して抗血清
を作出した。抗血清よりProtein A (BIO-RAD社) を用い
てIgG を精製した。以後このIgG 溶液をSecA抗体として
用いた。

【００２２】

【実施例６】植物抽出液の調製 健全植物または感染植物を試料として、植物１ｇ当たり
10mlの PBS（8.1mM Na ₂HPO₄, 1.47mM KH₂PO₄,137mM NaC
l, 2.68mM KCl, pH 7.4)を加え、組織を破砕した。これ
を植物粗抽出液として以下に用いた。

【００２３】

【実施例７】抗SecA抗体の特異性の解析 健全植物または感染植物の粗抽出液を用いてwestern bl
ottingを行った。まず、SDS ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって健全または感染植物から抽出したタンパ
ク質を分離した後、PVDF膜に転写し、５％スキムミルク
溶液でブロッキングした。その後、抗SecA抗体と反応さ
せ、TBST（20mM Tris-HCl, 150mM NaCl,0.1％ Tween20,
pH 7.5) で洗浄後、アルカリフォスファターゼと結合
させた抗ウサギIgG 抗体 (alkaline phosphatase conju
gated goat anti-rabbit IgG: Amersham LIfe Science
社) と反応させた。TBSTで洗浄後、基質であるPNP(p-Ni
trophenyl phosphate:シグマ社) 溶液を加え、発色させ
た。図７から分かるように、感染植物のレーンでのみ約
96kDa 付近に特異的なタンパク質のバンドが認められ、
アミノ酸配列から推定される分子量95.7kDa とほぼ一致
した。

【００２４】

【実施例８】DAS-ELISA 健全植物または感染植物の粗抽出液を用いてDAS-ELISA
を行った。まず、１次抗体として抗SecA抗体をマイクロ
タイタープレートのウェルに入れ、プレートと抗体を結
合させた。ウェルをPBST（8.1mM Na₂HPO₄, 1.47mM KH₂P
O₄,137mM NaCl,2.68mM KCl, 0.1％ Tween20, pH 7.4)
で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合抗SecA抗体を
入れた。ウェルをPBSTで洗浄後、基質となる PNP溶液を
ウェルに入れ、405nm の波長で吸光度を測定した。結果
を図８に示す。

【００２５】この実施例のDAS-ELISA において、SecAタ
ンパク質に対する本発明のポリクローナル抗体は感染植
物にのみ高感度で特異的反応した。また、ファイトプラ
ズマ属の各種の細菌を用いて測定した結果、本発明のポ
リクローナル抗体はファイトプラズマの各種に共通に反
応を示し、健全植物とは無反応であった。従って、この
抗体は、植物とは全く反応しないにもかかわらずファイ
トプラズマとは広く反応するという特徴をもった、これ
までに例のないファイトプラズマに特異的でかつ汎用性
の高い抗体である。

【００２６】

【発明の効果】本発明によれば、ファイトプラズマのSe
cAタンパク質に対する特異的抗体を用いるファイトプラ
ズマの検出診断法が提供される。この方法は、ファイト
プラズマに特異的でかつ広範囲のファイトプラズマ属の
細菌に対して反応し、また簡便で感度の高い方法であ
る。従って、手間と時間がかかったり、高価な資材を必
要とした従来の検出診断法とは異なり、広くファイトプ
ラズマ属に対しての検出法として有用な手段である。

【００２７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING 〈110 〉 NIPPON MEDICAL RESEARCH, INC. 〈120 〉 METHOD FOR DETECTION OF PHYTOPLASMA 〈130 〉 N18X11P 〈160 〉 4 〈210 〉 1 〈211 〉 2508 〈212 〉 DNA 〈213 〉Phytoplasma sp. 〈400 〉 1 atg tta aat ttt tta aaa aaa ata ttt aat tct tcc aaa aaa gct tta 48 Met Leu Asn Phe Leu Lys Lys Ile Phe Asn Ser Ser Lys Lys Ala Leu 1 5 10 15 aga aaa gct aga acc ata gct aat aaa gta caa aat tta gaa gcc caa 96 Arg Lys Ala Arg Thr Ile Ala Asn Lys Val Gln Asn Leu Glu Ala Gln 20 25 30 atg gct tta tta gat gac aaa gat ttt gcc aca aaa acc gca gaa tta 144 Met Ala Leu Leu Asp Asp Lys Asp Phe Ala Thr Lys Thr Ala Glu Leu 35 40 45 aaa aaa ctc ttt caa gaa gga aaa acc ctt aac caa ctg ctg ccc gaa 192 Lys Lys Leu Phe Gln Glu Gly Lys Thr Leu Asn Gln Leu Leu Pro Glu 50 55 60 gcc tat gct ctt gcc aaa gaa gct acc aaa aga gta aca gga ctt act 240 Ala Tyr Ala Leu Ala Lys Glu Ala Thr Lys Arg Val Thr Gly Leu Thr 65 70 75 80 cct tat tac gtt caa att ttg ggc gct gta att ttg cat caa gga aat 288 Pro Tyr Tyr Val Gln Ile Leu Gly Ala Val Ile Leu His Gln Gly Asn 85 90 95 att tct gag atg aaa act ggg gaa gga aaa acc ctt act gcc atc atg 336 Ile Ser Glu Met Lys Thr Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Ala Ile Met 100 105 110 cct gct tat ctt aac gct tta agt ggt aac ccc gtt cac att gtt aca 384 Pro Ala Tyr Leu Asn Ala Leu Ser Gly Asn Pro Val His Ile Val Thr 115 120 125 gtc aat gaa tac cta gct aaa aga gaa ttt gaa ggt agc atc ggt gat 432 Val Asn Glu Tyr Leu Ala Lys Arg Glu Phe Glu Gly Ser Ile Gly Asp 130 135 140 gtt ttt cgc ttt ttg gga atg aca gta gga ctt aat acc aaa gac aaa 480 Val Phe Arg Phe Leu Gly Met Thr Val Gly Leu Asn Thr Lys Asp Lys 145 150 155 160 gac cgc gca caa aaa caa caa gcc tat tta tgt gat att ctc tac act 528 Asp Arg Ala Gln Lys Gln Gln Ala Tyr Leu Cys Asp Ile Leu Tyr Thr 165 170 175 act aac agt gaa tta ggg ttt gat tat tta aga gac aac atg gaa att 576 Thr Asn Ser Glu Leu Gly Phe Asp Tyr Leu Arg Asp Asn Met Glu Ile 180 185 190 gaa gct tcc aat ttg gta atg aaa cgc cct tac agt tat gct att gtt 624 Glu Ala Ser Asn Leu Val Met Lys Arg Pro Tyr Ser Tyr Ala Ile Val 195 200 205 gat gaa gta gac tct att tta att gat gag gca aga acg cct tta att 672 Asp Glu Val Asp Ser Ile Leu Ile Asp Glu Ala Arg Thr Pro Leu Ile 210 215 220 att tcc caa agt gtc aaa gaa act aag aat tta tac aaa gaa gca caa 720 Ile Ser Gln Ser Val Lys Glu Thr Lys Asn Leu Tyr Lys Glu Ala Gln 225 230 235 240 cgt ttt gtt cgc acc ctt aaa aat agc cat tat ctt att gaa tta gaa 768 Arg Phe Val Arg Thr Leu Lys Asn Ser His Tyr Leu Ile Glu Leu Glu 245 250 255 act aaa aca att gaa ctt acc gaa gaa gga att acc aaa gct gaa aac 816 Thr Lys Thr Ile Glu Leu Thr Glu Glu Gly Ile Thr Lys Ala Glu Asn 260 265 270 ttt ttc caa att gat aat tta tac aac gta gaa cac gcc tct ttg ctc 864 Phe Phe Gln Ile Asp Asn Leu Tyr Asn Val Glu His Ala Ser Leu Leu 275 280 285 cac cat gtc aaa aac gcc ctt aaa gca gct ttt acg atc cac aaa gac 912 His His Val Lys Asn Ala Leu Lys Ala Ala Phe Thr Ile His Lys Asp 290 295 300 aaa gat tac tta gtt gat tac aaa gat gga caa gtt cta att att gat 960 Lys Asp Tyr Leu Val Asp Tyr Lys Asp Gly Gln Val Leu Ile Ile Asp 305 310 315 320 caa ttt act gga cgt gct ttg cca gga cgc caa ttt agc gac ggt ctt 1008 Gln Phe Thr Gly Arg Ala Leu Pro Gly Arg Gln Phe Ser Asp Gly Leu 325 330 335 cac caa gca tta gaa gcc aaa gaa gga gta tta att aaa gaa gaa gct 1056 His Gln Ala Leu Glu Ala Lys Glu Gly Val Leu Ile Lys Glu Glu Ala 340 345 350 tcc att gga gct act att act tat caa aat ttt ttc cgt ctt tat cac 1104 Ser Ile Gly Ala Thr Ile Thr Tyr Gln Asn Phe Phe Arg Leu Tyr His 355 360 365 aaa tta tca ggg atg aca gga act gcc aaa acc gaa gaa gat gaa ttt 1152 Lys Leu Ser Gly Met Thr Gly Thr Ala Lys Thr Glu Glu Asp Glu Phe 370 375 380 aga gac att tat aac atg gaa gtt atc gaa att cct acc aat gtt cct 1200 Arg Asp Ile Tyr Asn Met Glu Val Ile Glu Ile Pro Thr Asn Val Pro 385 390 395 400 atg ata aga att gac gag ccc gat ttt att ttt gtt tct tta aaa gaa 1248 Met Ile Arg Ile Asp Glu Pro Asp Phe Ile Phe Val Ser Leu Lys Glu 405 410 415 aaa tac gac gct tta att gaa gaa ata act tct cgc cac aaa aaa aga 1296 Lys Tyr Asp Ala Leu Ile Glu Glu Ile Thr Ser Arg His Lys Lys Arg 420 425 430 caa ccc att tta att ggg aca act aca gta gaa gtt tct gaa att att 1344 Gln Pro Ile Leu Ile Gly Thr Thr Thr Val Glu Val Ser Glu Ile Ile 435 440 445 tct aaa aaa tta aaa aaa cat tcc att aaa cac gaa att cta aat gcc 1392 Ser Lys Lys Leu Lys Lys His Ser Ile Lys His Glu Ile Leu Asn Ala 450 455 460 aaa aac cac tct aaa gaa gca gac atc att gct aag gca gga ctt aaa 1440 Lys Asn His Ser Lys Glu Ala Asp Ile Ile Ala Lys Ala Gly Leu Lys 465 470 475 480 aat gca gtt act att gct act aat atg gca gga cgt gga act gat att 1488 Asn Ala Val Thr Ile Ala Thr Asn Met Ala Gly Arg Gly Thr Asp Ile 485 490 495 cgt tta ggc gaa ggg gtt aaa gaa tta ggc gga ctt gct gtt tta ggt 1536 Arg Leu Gly Glu Gly Val Lys Glu Leu Gly Gly Leu Ala Val Leu Gly 500 505 510 act gaa aga cac gaa tca cga aga att gat aac caa tta aga gga cgt 1584 Thr Glu Arg His Glu Ser Arg Arg Ile Asp Asn Gln Leu Arg Gly Arg 515 520 525 gct gga cgt caa ggc gac cct ggt tat tca cgt ttt ttt att tct agc 1632 Ala Gly Arg Gln Gly Asp Pro Gly Tyr Ser Arg Phe Phe Ile Ser Ser 530 535 540 gaa gat gaa ctt gcc caa aga ttt ggt ggc act aga ata gaa aaa att 1680 Glu Asp Glu Leu Ala Gln Arg Phe Gly Gly Thr Arg Ile Glu Lys Ile 545 550 555 560 att tct ttg ctc caa aaa ata agc gat tgt gaa act aaa act tca tct 1728 Ile Ser Leu Leu Gln Lys Ile Ser Asp Cys Glu Thr Lys Thr Ser Ser 565 570 575 aaa atg gtg act aaa ttt ttt acc aaa ata caa aaa aaa gta gaa tct 1776 Lys Met Val Thr Lys Phe Phe Thr Lys Ile Gln Lys Lys Val Glu Ser 580 585 590 tcc aat ttt gac tat cgt aaa tac ctc tta aaa tat gat gat att tta 1824 Ser Asn Phe Asp Tyr Arg Lys Tyr Leu Leu Lys Tyr Asp Asp Ile Leu 595 600 605 cgt att caa aga gaa att atc tat aac caa aga aaa gaa att cta gtt 1872 Arg Ile Gln Arg Glu Ile Ile Tyr Asn Gln Arg Lys Glu Ile Leu Val 610 615 620 agc aat aga gta gaa caa atc gtt caa gat tta atg caa aag acc ctt 1920 Ser Asn Arg Val Glu Gln Ile Val Gln Asp Leu Met Gln Lys Thr Leu 625 630 635 640 aat aaa gct att ttg cca tat ttt act aac aac cct acc caa tgt caa 1968 Asn Lys Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Thr Asn Asn Pro Thr Gln Cys Gln 645 650 655 acc caa act tta att act ttt tta gaa aat aaa ttt ttc cct aaa caa 2016 Thr Gln Thr Leu Ile Thr Phe Leu Glu Asn Lys Phe Phe Pro Lys Gln 660 665 670 acc ttt gat tta gaa gaa gta caa gaa tta tgc aac aac cct aaa aca 2064 Thr Phe Asp Leu Glu Glu Val Gln Glu Leu Cys Asn Asn Pro Lys Thr 675 680 685 aac tcc ctt gat tct ttt caa caa cat tta ttg caa aaa gta aaa gac 2112 Asn Ser Leu Asp Ser Phe Gln Gln His Leu Leu Gln Lys Val Lys Asp 690 695 700 act tta caa tct caa aaa gat ttt ttt gaa aaa gac cct gat aaa gct 2160 Thr Leu Gln Ser Gln Lys Asp Phe Phe Glu Lys Asp Pro Asp Lys Ala 705 710 715 720 caa tat ttt gca aaa ggt ctt aaa tgg att aca tta aaa ata att gat 2208 Gln Tyr Phe Ala Lys Gly Leu Lys Trp Ile Thr Leu Lys Ile Ile Asp 725 730 735 aat tac tac caa cgc cac atc aat gac atg agt tct tta aga caa gga 2256 Asn Tyr Tyr Gln Arg His Ile Asn Asp Met Ser Ser Leu Arg Gln Gly 740 745 750 att gga ttt gta agt tac gga caa caa gat tct ttt att gag tat caa 2304 Ile Gly Phe Val Ser Tyr Gly Gln Gln Asp Ser Phe Ile Glu Tyr Gln 755 760 765 aaa gaa gga caa gtt tta ttc aat aac atg att gca aaa att gca aac 2352 Lys Glu Gly Gln Val Leu Phe Asn Asn Met Ile Ala Lys Ile Ala Asn 770 775 780 gac att act gct act att tta aag ttt tct ttc gca gat agt ttt caa 2400 Asp Ile Thr Ala Thr Ile Leu Lys Phe Ser Phe Ala Asp Ser Phe Gln 785 790 795 800 acg cct ccc aaa caa aaa gtt ttt tta aac aat gat tca agc gat gat 2448 Thr Pro Pro Lys Gln Lys Val Phe Leu Asn Asn Asp Ser Ser Asp Asp 805 810 815 gaa tct tct aaa aaa aga aga act aga aaa gta aga att tct aaa aaa 2496 Glu Ser Ser Lys Lys Arg Arg Thr Arg Lys Val Arg Ile Ser Lys Lys 820 825 830 cct tgg aat taa 2508 Pro Trp Asn 835 〈210 〉 2 〈211 〉 835 〈212 〉 PRT 〈213 〉Phytoplasma sp. 〈400 〉 2 Met Leu Asn Phe Leu Lys Lys Ile Phe Asn Ser Ser Lys Lys Ala Leu 1 5 10 15 Arg Lys Ala Arg Thr Ile Ala Asn Lys Val Gln Asn Leu Glu Ala Gln 20 25 30 Met Ala Leu Leu Asp Asp Lys Asp Phe Ala Thr Lys Thr Ala Glu Leu 35 40 45 Lys Lys Leu Phe Gln Glu Gly Lys Thr Leu Asn Gln Leu Leu Pro Glu 50 55 60 Ala Tyr Ala Leu Ala Lys Glu Ala Thr Lys Arg Val Thr Gly Leu Thr 65 70 75 80 Pro Tyr Tyr Val Gln Ile Leu Gly Ala Val Ile Leu His Gln Gly Asn 85 90 95 Ile Ser Glu Met Lys Thr Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Ala Ile Met 100 105 110 Pro Ala Tyr Leu Asn Ala Leu Ser Gly Asn Pro Val His Ile Val Thr 115 120 125 Val Asn Glu Tyr Leu Ala Lys Arg Glu Phe Glu Gly Ser Ile Gly Asp 130 135 140 Val Phe Arg Phe Leu Gly Met Thr Val Gly Leu Asn Thr Lys Asp Lys 145 150 155 160 Asp Arg Ala Gln Lys Gln Gln Ala Tyr Leu Cys Asp Ile Leu Tyr Thr 165 170 175 Thr Asn Ser Glu Leu Gly Phe Asp Tyr Leu Arg Asp Asn Met Glu Ile 180 185 190 Glu Ala Ser Asn Leu Val Met Lys Arg Pro Tyr Ser Tyr Ala Ile Val 195 200 205 Asp Glu Val Asp Ser Ile Leu Ile Asp Glu Ala Arg Thr Pro Leu Ile 210 215 220 Ile Ser Gln Ser Val Lys Glu Thr Lys Asn Leu Tyr Lys Glu Ala Gln 225 230 235 240 Arg Phe Val Arg Thr Leu Lys Asn Ser His Tyr Leu Ile Glu Leu Glu 245 250 255 Thr Lys Thr Ile Glu Leu Thr Glu Glu Gly Ile Thr Lys Ala Glu Asn 260 265 270 Phe Phe Gln Ile Asp Asn Leu Tyr Asn Val Glu His Ala Ser Leu Leu 275 280 285 His His Val Lys Asn Ala Leu Lys Ala Ala Phe Thr Ile His Lys Asp 290 295 300 Lys Asp Tyr Leu Val Asp Tyr Lys Asp Gly Gln Val Leu Ile Ile Asp 305 310 315 320 Gln Phe Thr Gly Arg Ala Leu Pro Gly Arg Gln Phe Ser Asp Gly Leu 325 330 335 His Gln Ala Leu Glu Ala Lys Glu Gly Val Leu Ile Lys Glu Glu Ala 340 345 350 Ser Ile Gly Ala Thr Ile Thr Tyr Gln Asn Phe Phe Arg Leu Tyr His 355 360 365 Lys Leu Ser Gly Met Thr Gly Thr Ala Lys Thr Glu Glu Asp Glu Phe 370 375 380 Arg Asp Ile Tyr Asn Met Glu Val Ile Glu Ile Pro Thr Asn Val Pro 385 390 395 400 Met Ile Arg Ile Asp Glu Pro Asp Phe Ile Phe Val Ser Leu Lys Glu 405 410 415 Lys Tyr Asp Ala Leu Ile Glu Glu Ile Thr Ser Arg His Lys Lys Arg 420 425 430 Gln Pro Ile Leu Ile Gly Thr Thr Thr Val Glu Val Ser Glu Ile Ile 435 440 445 Ser Lys Lys Leu Lys Lys His Ser Ile Lys His Glu Ile Leu Asn Ala 450 455 460 Lys Asn His Ser Lys Glu Ala Asp Ile Ile Ala Lys Ala Gly Leu Lys 465 470 475 480 Asn Ala Val Thr Ile Ala Thr Asn Met Ala Gly Arg Gly Thr Asp Ile 485 490 495 Arg Leu Gly Glu Gly Val Lys Glu Leu Gly Gly Leu Ala Val Leu Gly 500 505 510 Thr Glu Arg His Glu Ser Arg Arg Ile Asp Asn Gln Leu Arg Gly Arg 515 520 525 Ala Gly Arg Gln Gly Asp Pro Gly Tyr Ser Arg Phe Phe Ile Ser Ser 530 535 540 Glu Asp Glu Leu Ala Gln Arg Phe Gly Gly Thr Arg Ile Glu Lys Ile 545 550 555 560 Ile Ser Leu Leu Gln Lys Ile Ser Asp Cys Glu Thr Lys Thr Ser Ser 565 570 575 Lys Met Val Thr Lys Phe Phe Thr Lys Ile Gln Lys Lys Val Glu Ser 580 585 590 Ser Asn Phe Asp Tyr Arg Lys Tyr Leu Leu Lys Tyr Asp Asp Ile Leu 595 600 605 Arg Ile Gln Arg Glu Ile Ile Tyr Asn Gln Arg Lys Glu Ile Leu Val 610 615 620 Ser Asn Arg Val Glu Gln Ile Val Gln Asp Leu Met Gln Lys Thr Leu 625 630 635 640 Asn Lys Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Thr Asn Asn Pro Thr Gln Cys Gln 645 650 655 Thr Gln Thr Leu Ile Thr Phe Leu Glu Asn Lys Phe Phe Pro Lys Gln 660 665 670 Thr Phe Asp Leu Glu Glu Val Gln Glu Leu Cys Asn Asn Pro Lys Thr 675 680 685 Asn Ser Leu Asp Ser Phe Gln Gln His Leu Leu Gln Lys Val Lys Asp 690 695 700 Thr Leu Gln Ser Gln Lys Asp Phe Phe Glu Lys Asp Pro Asp Lys Ala 705 710 715 720 Gln Tyr Phe Ala Lys Gly Leu Lys Trp Ile Thr Leu Lys Ile Ile Asp 725 730 735 Asn Tyr Tyr Gln Arg His Ile Asn Asp Met Ser Ser Leu Arg Gln Gly 740 745 750 Ile Gly Phe Val Ser Tyr Gly Gln Gln Asp Ser Phe Ile Glu Tyr Gln 755 760 765 Lys Glu Gly Gln Val Leu Phe Asn Asn Met Ile Ala Lys Ile Ala Asn 770 775 780 Asp Ile Thr Ala Thr Ile Leu Lys Phe Ser Phe Ala Asp Ser Phe Gln 785 790 795 800 Thr Pro Pro Lys Gln Lys Val Phe Leu Asn Asn Asp Ser Ser Asp Asp 805 810 815 Glu Ser Ser Lys Lys Arg Arg Thr Arg Lys Val Arg Ile Ser Lys Lys 820 825 830 Pro Trp Asn 835 〈210 〉 3 〈211 〉 462 〈212 〉 DNA 〈213 〉 Phytoplasma sp. 〈400 〉 3 atg aaa cgc cct tac agt tat gct att gtt gat gaa gta gac tct att 48 Met Lys Arg Pro Tyr Ser Tyr Ala Ile Val Asp Glu Val Asp Ser Ile 1 5 10 15 tta att gat gag gca aga acg cct tta att att tcc caa agt gtc aaa 96 Leu Ile Asp Glu Ala Arg Thr Pro Leu Ile Ile Ser Gln Ser Val Lys 20 25 30 gaa act aag aat tta tac aaa gaa gca caa cgt ttt gtt cgc acc ctt 144 Glu Thr Lys Asn Leu Tyr Lys Glu Ala Gln Arg Phe Val Arg Thr Leu 35 40 45 aaa aat agc cat tat ctt att gaa tta gaa act aaa aca att gaa ctt 192 Lys Asn Ser His Tyr Leu Ile Glu Leu Glu Thr Lys Thr Ile Glu Leu 50 55 60 acc gaa gaa gga att acc aaa gct gaa aac ttt ttc caa att gat aat 240 Thr Glu Glu Gly Ile Thr Lys Ala Glu Asn Phe Phe Gln Ile Asp Asn 65 70 75 80 tta tac aac gta gaa cac gcc tct ttg ctc cac cat gtc aaa aac gcc 288 Leu Tyr Asn Val Glu His Ala Ser Leu Leu His His Val Lys Asn Ala 85 90 95 ctt aaa gca gct ttt acg atc cac aaa gac aaa gat tac tta gtt gat 336 Leu Lys Ala Ala Phe Thr Ile His Lys Asp Lys Asp Tyr Leu Val Asp 100 105 110 tac aaa gat gga caa gtt cta att att gat caa ttt act gga cgt gct 384 Tyr Lys Asp Gly Gln Val Leu Ile Ile Asp Gln Phe Thr Gly Arg Ala 115 120 125 ttg cca gga cgc caa ttt agc gac ggt ctt cac caa gca tta gaa gcc 432 Leu Pro Gly Arg Gln Phe Ser Asp Gly Leu His Gln Ala Leu Glu Ala 130 135 140 aaa gaa gga gta tta att aaa gaa gaa gct 462 Lys Glu Gly Val Leu Ile Lys Glu Glu Ala 145 150 〈210 〉 4 〈211 〉 154 〈212 〉 PRT 〈213 〉Phytoplasma sp. 〈400 〉 4 Met Lys Arg Pro Tyr Ser Tyr Ala Ile Val Asp Glu Val Asp Ser Ile 1 5 10 15 Leu Ile Asp Glu Ala Arg Thr Pro Leu Ile Ile Ser Gln Ser Val Lys 20 25 30 Glu Thr Lys Asn Leu Tyr Lys Glu Ala Gln Arg Phe Val Arg Thr Leu 35 40 45 Lys Asn Ser His Tyr Leu Ile Glu Leu Glu Thr Lys Thr Ile Glu Leu 50 55 60 Thr Glu Glu Gly Ile Thr Lys Ala Glu Asn Phe Phe Gln Ile Asp Asn 65 70 75 80 Leu Tyr Asn Val Glu His Ala Ser Leu Leu His His Val Lys Asn Ala 85 90 95 Leu Lys Ala Ala Phe Thr Ile His Lys Asp Lys Asp Tyr Leu Val Asp 100 105 110 Tyr Lys Asp Gly Gln Val Leu Ile Ile Asp Gln Phe Thr Gly Arg Ala 115 120 125 Leu Pro Gly Arg Gln Phe Ser Asp Gly Leu His Gln Ala Leu Glu Ala 130 135 140 Lys Glu Gly Val Leu Ile Lys Glu Glu Ala 145 150

【図面の簡単な説明】

【図１】ファイトプラズマのsecA遺伝子の塩基配列を示
す図である。

【図２】ファイトプラズマのsecA遺伝子の塩基配列を示
す図である。

【図３】ファイトプラズマのsecA遺伝子の塩基配列を示
す図である。

【図４】ファイトプラズマのsecA遺伝子の595bp から10
56bpまでの塩基配列を示す図である。

【図５】SecAタンパク質の発現系構築の手順を示す図で
ある。

【図６】精製した発現タンパク質の電気泳動図である。

【図７】ウェスタンブロッティングの結果を示す図であ
る。

【図８】抗SecA抗体を用いたDAS-ELISA の結果を示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:01 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 大島 研郎 東京都田無市西原町５−３−13ヘリオス ’87−207 (72)発明者 西川 尚志 東京都田無市北原町２−14−７−101 (72)発明者 柿澤 茂行 東京都田無市緑町２−18−６コーポアカ シア203 (56)参考文献 特開 平６−169757（ＪＰ，Ａ) 国際公開99／46405（ＷＯ，Ａ１) 柿崎茂行，ファイトプラズマの膜蛋白 質ＳｅｃＡの遺伝子クローニングと大腸 菌における大量発現及び特異抗体の作 出，2000年度日本植物病理学会大会 プ ログラム・講演要旨集，2000年 ３月10 日，ｐ125 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，1999年, ｖｏｌ．145，ｐ．1937−1943 Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，1998 年，ｖｏｌ．88，ｐ．1367−1371 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/569 C07K 14/195 C07K 16/12 C12N 15/09 ZNA C12P 21/08 C12Q 1/04 C12R 1:01

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ファイトプラズマのSecAタンパク質に対
   する特異的抗体を用いた検出法によりファイトプラズマ
   を検出することを含む、ファイトプラズマの検出方法。
2. 【請求項２】 前記特異的抗体が、ファイトプラズマの
   SecAタンパク質の抗原性部位を含むポリペプチドを抗原
   として動物に免疫して得られるものである請求項１記載
   の方法。
3. 【請求項３】 前記抗原性部位がファイトプラズマのse
   cA遺伝子の 595bpから1056bpまでの領域によりコードさ
   れる部位である請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 前記検出法が酵素免疫検定法である請求
   項１ないし３のいずれかの項記載の方法。
5. 【請求項５】 配列番号１で表される塩基配列を有する
   ファイトプラズマのsecA遺伝子。
6. 【請求項６】 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有
   するファイトプラズマのSecAタンパク質をコードする遺
   伝子。
7. 【請求項７】 配列番号３で表される塩基配列を有する
   DNA 。
8. 【請求項８】 配列番号４で表されるアミノ酸配列を有
   するペプチドをコードするDNA 。
9. 【請求項９】 配列番号４で表されるアミノ酸配列を有
   するポリペプチドを含有する免疫原。
10. 【請求項10】 配列番号４で表されるアミノ酸配列を有
    する組換えポリペプチドを含有する免疫原。
11. 【請求項11】 請求項９または10記載の免疫原を動物に
    免疫して得られる特異的抗体。