KR100257574B1

KR100257574B1 - 매독 트레포네마 융합 항원 및 그 융합 항원을 사용한 항매독 트레포네마 항체의 측정 방법

Info

Publication number: KR100257574B1
Application number: KR1019960071472A
Authority: KR
Inventors: 노부유끼 이세; 다께야 호리; 가쯔야 후지무라; 테쯔지 다니모또; 마사히사 오까다
Original assignee: 후꾸야마 마사루; 후지레비오 가부시끼가이샤
Priority date: 1995-12-25
Filing date: 1996-12-24
Publication date: 2000-08-01
Also published as: US20010002311A1; ATE250128T1; US6794155B2; EP0781846A2; DE69630008D1; US6248331B1; CA2193870C; KR970048455A; ES2207671T3; EP0781846B1; DE69630008T2; EP0781846A3; CA2193870A1

Abstract

본 발명은 매독 트레포네마 융합 항원 및 그 융합 항원을 사용한 항매독 트레포네마 항체의 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 매독 트레포네마의 표면 항원이 2개 이상 융합된 매독 트레포네마 융합 항원이 제공된다. 본 발명에 따른 융합 항원은 각 표면 항원을 각각 단독으로 사용한 경우보다 훨씬 항 Tp 항체와의 반응성이 높고, 그 융합 항원을 항 Tp 항체의 측정계에 사용함으로서, 종래에는 없는 높은 측정 감도를 가진 항 Tp 항체 측정 방법이 제공될 수 있다.

Description

매독 트레포네마 융합 항원 및 그 융합 항원을 사용한 항매독 트레포네마 항체의 측정 방법

본 발명은 매독 트레포네마의 융합 항원 및 그 융합 항원을 사용한 항매독 트레포네마 항체의 측정 방법에 관한 것이다.

매독은 매독 트레포네마(트레포네마·팔리덤 Treponema pallidum, 이하 본 명세서 중에서 Tp로 기재할 수도 있다)에 의해 발생되는 감염증이다. Tp는 스피로헵터의 일종으로, Tp 항원으로서 그의 세포 표면상에 수 종의 표면 항원이 존재하는 것이 확인되어 있다(The Journal of Immunology, Vol. 129, p. 833-838, 1982; The Journal of Immunology, Vol. 129, p. 1287-1291, 1982; Journal of Clinical Microbiology, Vol. 21, p. 82-87, 1985; Journal of Clinical Microbiology, Vol. 30, p. 115-122, 1992). Tp에 감염되면, 이들의 표면 항원에 대한 항체가 혈액 중에 생산되므로, 혈액 중의 항 Tp 항체의 유무를 검사함으로서 매독의 진단이 실시되고 있다.

항 Tp 항체의 유무를 조사하기 위해서는, Tp 항원과 환자 혈액중의 항 Tp 항체와의 항원 항체 반응을 응용한 면역 측정법을 사용하는 것이 일반적이지만, 항 Tp 항체의 면역 측정을 위해서는, Tp 항원이 다량 필요하게 된다. 그러나, Tp는 생체외에서 대량 배양할 수 없으므로, 종래에는 Tp를 토끼의 고환에 접종시키고, Tp에 감염된 토끼 고환에서 Tp 항원을 정제하는 방법이 사용되어 왔다(Acta Pathol Microbiol Scand [B], Vol. 83, p. 157-160, 1975). 이 방법에서는 토끼 생체내에서 Tp를 배양하기 때문에 토끼의 개체차 및 정제 불순물의 혼입 등의 문제가 있어, 재현성이 양호하게 다량으로 Tp 항원을 입수하는 것은 매우 곤란하였다.

근년, 유전자 공학 기술의 진보에 의해 Tp의 표면 항원을 코드하는 유전자를 클로닝하고, 인공적으로 Tp 항원을 대량 생산하는 기술이 진보되어 왔다(Science, Vol. 216, p. 522-523, 1982; Infection and Immunlty, Vol. 36, p. 1238-1241, 1982; Infection and Immunity, Vol. 41, p. 709-721, 1983; Infection and Immunity, Vol. 42, p. 435-445, 1983; Infection and Immunity, Vol. 42, p. 187-196, 1983; Journal of Bacteriology, Vol. 162, p. 1227-1237, 1985; Infection and Immunity, Vol. 54, p. 500-506, 1986; Infection and Immunity, Vol. 56, p. 71-78, 1988; Infection and Immunity, Vol. 57, p. 2612-2623, 1989; Infection and Immunity, Vol. 57, p. 3708-3714, 1989; Molecular Microbiology, Vol. 4, p. 1371-1379, 1990; Infection and Immunity, Vol. 58, p. 1697-1704, 1990; Infection and Immunity, Vol. 61, p. 1202-1210, 1993; 일본국 특허공개 평 제2-500403호). 이와 같은 유전자 공학 기술을 사용하면 살아있는 동물을 사용하지 않아도 Tp 항원을 대량 생산할 수 있으나, Tp의 표면 항원의 종류에 따라서는, 그 항원을 코드하는 유전자만으로는 거의 항원을 발현하지 않는 것이 있다. 따라서, 이와 같은 목적 물질을 코드하는 유전자만으로는 발현시키기 어려운 물질을 사용하는 경우에는 대장균 유래의 티오레독신(이하, 본 명세서 중에서 TRX로 기재할 수도 있다)이나, 일본에 서식하는 흡혈충 유래의 글루타치온-S-트란스퍼라제 (이하, 본 명세서 중에서 GST라 기재할 수도 있다) 등의 유전자와 목적 물질의 유전자를 융합시킨 융합 유전자에서 목적 물질을 발현시키는 방법이 제안되고(일본국 특허공개 평 제5-507,209호, 특허공개 평 제1-503,441호), Tp의 표면 항원의 하나인 17 kDa 항원이나 15 kDa 항원에 GST를 융합한 GST 15 kDa 항원이나 GST 17 kDa 항원을 항 Tp 항체의 측정에 사용하면 높은 감도를 나타내는 것도 발견되었다(일본국 특허출원 평 제7-63,365호).

그러나, 대장균이나 일본에 서식하는 흡혈충은 인간의 생체내에서 살 수 있기 때문에 TRX나 GST에 대하여 반응하는 인자를 혈액 중에 갖는 인간이 적지 않게 존재한다. 이와 같은 경우, Tp에 감염되지 않아도 양성 반응이 나타나기 때문에 진단에 중대한 영향을 나타내는 것은 분명하다.

현재, 매독은 유효한 항생 물질의 개발에 의해 충분한 치료가 가능하며, 그감염을 가능한 빨리, 그리고 정확히 진단하여, 치료하는 것이 요망되고 있다. 그 때문에, 보다 높은 감도와 특이성을 나타낼 수 있는 Tp 항원과 Tp 항체의 측정 방법의 제공이 요구되어 왔다.

따라서, 본 발명의 목적은 종래의 방법보다도 높은 감도와 특이성을 나타내는 Tp 항원과 항 Tp 항체의 측정 방법을 제공하는 것이다.

제1도는 발현 벡터 pW6A의 상세 구조를 나타낸 도면.

제2도는 47K 항체를 코드하는 유전자의 조제 절차를 나타낸 도면.

제3도는 15K 및 17K 항원을 코드하는 유전자의 조제 절차를 나타낸 도면.

제4도는 2항원 융합 항원을 발현하는 벡터의 상세 구조를 나타낸 도면.

제5도는 3항원 융합 항원을 발현하는 벡터의 상세 구조를 나타낸 도면.

제6도는 15K를 반복 융합시킨 항원을 발현하는 벡터의 상세 구조를 나타낸 도면.

제7도는 정제된 융합 항원의 전기 영동도.

제8도는 15K 반복 융합 항원의 전기 영동도.

제9도는 15K 반복 융합 항원의 웨스턴 블롯의 도면.

제10도는 15K 반복 융합 항원의 정량을 실시하기 위한 전기 영동도.

제11도는 BSA를 사용하여 제작된 전기 영동의 겔 상의 밴드의 정량용 검량선을 나타낸 도면.

본 발명자들은 종래의 과제를 해결하고자 예의 연구한 결과, 융합된 Tp의 표면 항원을 코드하는 유전자로부터, 수 종의 표면 항원을 융합시킨 상태의 Tp 융합 항원을 발현시킨 결과, 종래보다도 Tp 항원의 발현량을 증가하고, 다시 그 융합 항원을 항 Tp 항체 측정 방법의 항원으로서 사용함으로서 표면 항원을 각각 단독으로 사용한 측정계보다도 항 Tp 항체를 높은 감도로 측정할 수 있다는 놀라운 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 Tp의 융합 항원 및 그 융합 항원을 사용한 항 Tp 항체의 측정 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

Tp의 세포 표면에는 여러 가지의 분자량의 표면 항원이 존재하며, 주된 것으로서 분자량 15 kDa, 17 kDa, 42 kDa, 47 kDa 등의 항원이 알려져 있다(The Journal of Immunology, Vol. 129, p. 833-838, 1982; The Journal of Immunology, Vol. 129, p. 1287-1291, 1982; Journal of Clinical Microbiology, Vol. 21, p. 82-87, 1985; Journal of Clinical Microbiology, Vol. 30, p. 115-122, 1992). 이들의 항원은 노리스 등에 의해 각각 TpN15, TpN17, TpN44.5 (a), TpN47이라 명명되어 있다(Microbiological, Reviews. vol. 57, p. 750-779)(이하, 본 명세서 중에서 TpN47을 47K, TpN 17을 17K, TpN15를 15K라 기재할 수도 있다). 이들의 표면 항원을 코드하는 유전자는 이미 클로닝되어 있으며, 유전공학적으로 항원이 생산되고 있다. 또한, 이들의 아미노산 배열도 결정되어 있다(Molecular Microbiology, Vol. 4, p. 1371-1379, 1990; Infection and Immunity, Vol. 61, p. 1202-1210, 1993; Journal of Bacteriology, Vol. 162, p. 1227-1237, 1992; Infection and Immunity, Vol.57, p. 3708-3714, 1989).

본 발명의 융합 항원에 사용되는 Tp의 표면 항원은, Tp의 세포 표면에 존재 하는 모든 표면 항원을 의미하며, 예를 들면, 47K, 17K, 15K 등의 항원을 들 수 있다. 또, 본 발명에서 사용되는 표면 항원은 그의 항원성을 손상하지 않는 범위내에서 적절히 수식하여 사용할 수 있다. 예를 들면, Tp의 표면 항원을 코드하는 DNA배열의 N 말단에는 20 아미노산 전후의 신호 펩티드가 있으나, 천연 항원에서 신호 펩티드는 삭제되어 있다. 이것은 표면 항원의 DNA 번역이 종료된 후, 신호 펩티다아제 Ⅱ에 의해 신호 펩티드가 절단되기 때문이라 생각된다(Microbial Pathogenesis, Vol.7, p. 175-188, 1989; Infection and Immunity, Vol.61, p. 1202-1210, 1993; Molecular Microbiology, Vol. 4, p. 1371-1379; 1990 Infection and Immunity, Vol.60, p. 1568-1576, 1993). 본 발명의 융합 항원에서는 이와 같은 N 말단의 신호 펩티드를 포함하는 항원이나, 신호 펩티드를 포함하지 않은 항원도 융합 항원으로서 사용할 수 있다. 또, 예를 들면 47K에서는 본체의 434 아미노산의 C 말단 후에, 다시 9 아미노산이 부가되어 있을 가능성이 보고되어 있다(Infection and Immunity, Vol. 60, p. 1568-1576, 1992). 이와 같은 경우, 신호 펩티드를 포함하지 않도록 디자인된 센스 프라이머와, C 말단 이후의 9 아미노산에 대응하는 DNA 배열을 가한 안티센스 프라이머를 사용함으로서 47K를 코드하는 DNA 단편을 제작하여 47K로서 사용할 수도 있다.

본 발명의 Tp 융합 항원은 이들의 표면 항원의 유전자를 서로 융합하여 발현시킨 항원이다. Tp 표면 항원의 유전자를 융합함에 있어서는, 그 조합은 Tp의 표면 항원이면 어느 항원도 좋으며, 다른 항원끼리, 서로 같은 항원끼리 등, 융합하는 조합에 제한이 있는 것은 아니다.

본 발명의 융합 항원을 발현시키는 데는, 통상의 유전자 공학 기술을 사용할 수 있다. 즉, 토끼의 고환에서 증식시킨 Tp에서 게놈 DNA를 추출하고, 이것을 주형으로 한다. 기지의 DNA 배열을 시초로 제작한 프라이머를 사용하여, PCR법에 의해 각각의 표면 항원을 코드하는 DNA 단편을 얻고, 이들의 DNA 단편을 재조합 PCR법, 또는 DNA 라이게이스를 사용하여 융합시켜, 융합 항원에 상당하는 DNA 단편을 수득한다. 이 DNA 단편을 삽입한 벡터를 대장균 등의 숙주에 삽입하여, 이 균을 배양 등에 의해 증식시킨 후, 융합 항원의 발현을 유도한다. 숙주 파쇄, 전기 영동 등의 정제 수단을 거쳐서, 목적하는 융합 항원을 입수한다(Molecular Cloning - A Laboratory Mannual 2nd. Ed., 1989).

DNA 단편을 벡터에 삽입하는데는, 예를 들면, 발현 벡터의 멀티클로닝 사이트에, Nde I, Sac I, Eco RI, Sal I, Xho I, Bam HI, Kpn Ⅰ, Hind Ⅲ 등의 제한효소 인식 부위를 사용하여 융합하는 Tp 항원의 DNA 단편을 삽입할 수 있다.

또, 벡터에 삽입하는 DNA 단편은 융합하는 DNA 단편을 개별적으로 삽입할 수도 있고, 미리 재조합 PCR법 등에 의해 DNA 단편끼리 직접 결합한 것을 삽입할 수도 있다. 이들의 제한효소 인식부위를 사용하여 DNA 단편을 삽입하면, 삽입한 DNA 단편의 사이에 링커로서 짧은 아미노산이 삽입될 때가 있다. 이 링커는 재조합 PCR법으로 DNA 단편을 융합시킨 후, 발현 벡터의 멀티클로닝 사이트에 삽입함으로서 제거할 수 있으나, 링커를 포함한 그대로 융합 항원을 발현시켜도 좋다.

본 발명의 융합 항원으로서는 예를 들면 N 말단에서 C 말단으로의 항원의 열에 대응하여, 47K, 17K 및 15K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 47-17-15로 기재한다), 47K, 15K 및 17K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 47-15-17로 기재한다), 15K, 17K 및 47K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 15-17-47로 기재한다), 15K, 47K 및 17K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 15-47-17로 기재한다), 17K, 15K 및 47K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 17-15-47로 기재한다), 17K, 47K 및 15K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 17-47-15로 기재한다), 47K 및 17K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 47-17로 기재한다), 47K 및 15K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 47-15로 기재한다), 17K 및 47K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 17-47로 기재한다), 17K 및 15K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 17-15로 기재한다), 15K 및 47K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 15-47로 기재한다), 15K 및 17K를 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 15-17로 기재한다), 15K 끼리 융합한 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 15-15로 기재한다), 15-15-15 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 15-15-15로 기재한다), 15-15-15-15 융합 항원(이하, 본 명세서 중에서는 15-15-15-15로 기재한다)등을 들 수 있다.

일반적으로 항 Tp 항체의 측정계에서는, 47K, 17K, 15K 등의 TP 주요 항원을 혼합하여 사용하기 때문에, 필요한 항원을 각각 개별적으로 정제하지 않으면 안된다. 본 발명의 융합 항원을 사용하면, 복수의 항원을 포함한 융합 항원을 단일의 항원으로서 정제하여 간단히 입수할 수 있다.

또, 17K 및 15K의 항원은 그 항원을 코드하는 유전자 그 자체에서는 거의 발현되지 않으므로, TRX, GST 등의 단백질과의 융합 단백질로서 발현시키고 있다. 그러나, Tp 항원 이외의 이종 항원의 유전자를 포함한 융합 유전자에 의해 발현시킨 융합 항원은, Tp 항원에서는 유래되지 않은 예상외의 비특이 반응을 일으킬 가능성이 있다. 본 발명의 융합 항원은 Tp 항원만을 융합시킨 항원이고, 발현시킨 융합 항원 중에서는 Tp 항원 이외의 이종 항원이 없으므로 항 Tp 항체를 특이적으로 측정하기 위한 항원으로서 매우 우수하다.

바이러스 감염을 진단하는 항체 측정법의 경우, 미리 복수의 동종 항원을 융합시킨 하나의 융합 항원을 항체 측정의 항원으로서 사용하는 예가 알려져 있다(Hepatology, Vol. 14, p. 381-387, 1991). 그러나, 본 발명의 융합 항원은 각 표면 항원을 각각 단독으로 사용한 경우보다 훨씬 항 Tp 항체와의 반응성이 높고, 그 융합 항원을 항 Tp 항체의 측정계에 사용함으로서, 종래에는 없는 높은 측정 감도를 가진 항 Tp 항체 측정 방법이 제공될 수 있다. 또, 본 발명에서는 주요 표면 항원 중, 17K와 15K의 표면 항원은 그 유전자만으로는 거의 발현하지 않으며, 다른 Tp 항원과 조합한 융합 항원으로한 경우에는 경이적으로 발현량이 증가하는 놀라운 사실이 있다.

본 발명의 융합 항원은 항 Tp 항체의 측정 방법에 사용할 수 있다. 항 Tp 항체의 측정 방법으로서는 그 융합 항원을 항 Tp 항체 측정 방법의 항원으로서 사용하는 측정 방법이며, 검체 중의 항 Tp 항체와 그 융합 항원과의 면역 반응에 따른 측정 방법이면, 그 반응 방법은 어떤 방법이라도 좋다. 여러가지의 면역 측정 방법이 당업자에 의해 주지되고 있으며, 예를 들면, 반응 형식으로 분류하면 응집법, 비탁법, 샌드위치법, 경합법 등, 또 표식체로 분류하면 효소면역 분석법, 형광면역 분석법, 발광면역 분석법, 방사면역 분석법 등을 들 수 있다. 이들 중, 전용의 설비를 필요로하지 않은 응집법, 다수검체의 조작에 적합한 효소 면역법에 의한 ELISA법, 고감도화 및 자동화가 진보된 발광면역 분석법 등이 특히 바람직하다.

본 발명의 융합 항원을 항 Tp 항체의 측정에 사용하는 데는, 예를 들면, 응집법의 경우, 본 발명의 융합 항원을 라텍스, 젤라틴 입자, 자성 입자 등의 담체에 감작시키고, 비특이 흡착 부위를 블록킹한다. 검체와 융합 항원 감작 담체를 일정 시간 반응시킨 후, 면역 반응에 의해 생긴 응집을 탁도, 응집상 등을 지표로하여 검출함으로서 검체 중의 항 Tp 항체량을 측정할 수 있다.

또, ELISA법의 경우에 본 발명의 융합 항원을 마이크로타이터 플레이트의 웰에 감작시키고, 비특이 흡착 부위를 블록킹한다. 융합 항원 감작 플레이트의 웰에 검체를 가하여 일정시간 반응시켜, 웰내부를 세정한 후, 퍼록시다제 등의 효소로 표지한 항인간 면역 글로불린 항체를 반응시킨다. 웰내를 세정한 후, 표식 효소에 대한 기질을 가하고 효소 반응을 실시하여 산소 활성을 측정함으로서 검체 중의 항 Tp 항체량을 측정할 수 있다.

또한, 본 기술 분야에서는 이와 같은 응집법이나 ELISA법은 주지의 기술이며, 본 발명의 측정 방법은 이것에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 측정 방법에 제공되는 검체로서는 매독 트레포네마의 진단을 실시해야할 인간이나 동물의 혈청 등의 체액 및 그의 희석물을 들 수 있다.

[실시예]

본 발명을 아래의 참고예 및 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다.

[참고예 1]

[항 47K 모노클로날 항체, 항 17K 모노클로날 항체 및 항 15K 모노클로날 항체의 제작]

Tp의 표면 항원으로서 47K와, 17K 또는 15K의 N 말단에 GST를 융합한 GST 17K 또는 GST 15K를 대장균에 의해 발현시켜 정제하였다. 각각의 재조합 항원을 면역시킨 마우스로부터 채취한 비장 세포와 마우스 미엘로마 세포를 세포융합시켜, 하이브리도마를 제작하였다. 각 하이브리도마를 배양하고, 상기의 재조합 항원을 사용한 ELISA 및 천연 항원을 사용한 웨스턴 블롯에 의해, 재조합 항원과 반응하고, 동시에 천연 항원에도 반응하는 하이브리도마를 스크리닝하였다. 스크리닝한 하이브리도마를 클로닝하고, 세포주를 확립하였다. 확립된 클론을 마우스 복강내에 주입하고, 복수를 채취한 후, 그 복수를 정제함으로서 항 47K 모노클로날 항체(이하, 본 명세서 중에서 47 KMab라 기재한다), 항 17K 모노클로날 항체(이하, 본 명세서 중에서 17 KMab라 기재한다) 및 항 15k 모노클로날 항체(이하, 본 명세서 중에서 15 KMab라 기재한다)를 수득하였다.

[참고예 2]

[발현 벡터 pW6A의 제작]

파마시아사제 벡터 pGEX2T로부터 tac 프로머터와 GST를 코드하는 염기 배열을 제거하여, 프로메가사제 pGEMEX-1의 T7 프로모터로부터 gene 10, 멀티클로닝 사이트, T7 전사 종결 인자까지의 염기 배열을 삽입하였다. 수득된 벡터로부터 gene 10의 염기 배열을 제거하고, T7 프로모터의 직후에 DNA 합성 장치(어플라이드 바이오시스템사제 모델 381A)에서 합성한 lac 오퍼레이터를 삽입하여 멀티클로닝 사이트를 일부 변경하였다. 이렇게 하여 수득된 발현 벡터를 pW6A로 명명하였다. pW6A의 상세도를 도1에 나타낸다.

[참고예 3]

[각종 융합 항원 발현용 벡터 제작을 위한 프라이머의 제작]

아래의 실시예 1 내지 16 및 참고예 4에서 제작한 각 융합 항원을 발현시키는 벡터를 제작하기 위하여, 아래와 같은 프라이머를 DNA 합성 장치 (어플라이드 바이오시스템사제 모텔 381 A)를 사용하여 합성하였다.

5'-----------------------------------3'

Nde I 47 K-5'말단 18염기

프라이머-1 TAGCC CATATG GGCTCGTCTCATCATGAG (29염기)

(센스)

15K-5'말단 17염기 47K-3'말단측 20염기

프라이머-2 ATAGAACTAAATGAACA AGACACACGGGATAGGACAC (37염기)

(안티센스)

15K-5'말단측 17염기

프라이머-3 TGTTCATTTAGTTCTATCCC (20염기)

(센스)

17K-5'말단 15염기 15K-3'말단 20염기

프라이머-4 TGTGCACGAGACACA CCTGCTAATAATGGCTTCCT (35염기)

(안티센스)

17K-5'말단 20염기

프라이머-5 TGTGTCTCGTGCACAACCGT (20염기

(센스)

BamHI 17K-3'말단 21염기

프라이머-6 GATCC GGATCC CTA TTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC (35염기)

(안티센스) 종지 코돈

Ned I 15K-5'말단 18염기

프라이머-7 TAGCC CATATG TGTTCATTTAGTTCTATC (29염기)

(센스)

Ned I 말단 18염기

프라이머-8 TAGCC CATATG TGTGTCTCGTGCACAACC (29염기)

(센스)

BamHI 15K-3'말단 17염기

프라이머-9 GATCC GGATCC CTA CCTGCTAATAATGGCTT (31염기)

(안티센스) 종지코돈

BamHI 47K-3'말단 17염기

프라이머-10 GATCC GGATCC CTA AGACACACGGGATAGGA (31염기)

(안티센스) 종지코돈

Sal I 15K-5'말단 18염기

프라이머-11 CGAGGC GTCGAC TGTTCATTTAGTTCTATC (30염기)

(센스)

Sal I 47K-5'말단 18염기

프라이머-12 GAAC GTCGAC TGTGGCTCGTCTCATCAT (28염기)

(센스)

Xho I 47K-3'말단 18염기

프라이머-13 CTTG CTCGAC AGACACACGGGATAGGAC (28염기)

(안티센스)

Sal I 17K-5'말단 18염기

프라이머-14 AGTA GTCGAC TGTGTCTCGTGCACAACC (28염기)

(센스)

Xho I 17K-3'말단 21염기

프라이머-15 CAGA CTCGAG TTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC (31염기)

(안티센스)

Sal I 17K-3'말단 21염기

프라이머-16 CAGA GTCGAC TTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC (31염기)

(안티센스)

Sal I 15K-3'말단 18염기

프라이머-17 GCTA GTCGAC CCTGCTAATAATGGCTTC (28염기)

(안티센스)

Sal I 47K-3'말단 20염기

프라이머-18 CGTA GAGCTC AGACACACGGGATAGGACAC (30염기)

(안티센스)

Sac I 17K-5'말단 20염기

프라이머-19 TAGC GAGCTC TGTGTCTCGTGCACAACCGT (30염기)

(센스)

프라이머-20

BamHI 9 아미노산을 코드하는 염기 47K-3'말단 18염기

GATCC GGATCC CTA AGACACACGGGATAGGACACCCCTCTT CTGGGCCA CTACCTTCGC (59염기)

종지코돈

(안티센스)

Sac I 47K-3'말단 18염기

프라이머-21 CTCTT GTCGAC AGACACACGGGATAGGAC (29염기)

(안티센스)

BamHI 15K-3'말단 18염기

프라이머-22 CCGG GGATCC CCTGCTAATAATGGCTTC (28염기)

(안티센스)

BamHI 15K-5'말단 18염기

프라이머-23 CCGG GGATCC TGTTCATTTAGTTCTATC (28염기)

(안티센스)

Kpn I 15K-3'말단 18염기

프라이머-24 CCGG GGTACC CTA CCTGCTAATAATGGCTTC (31염기)

(안티센스) 종지코돈

Kpn I 15K-3'말단 18염기

프라이머-25 CCGG GGTACC CCTGCTAATAATGGCTTC (28염기)

(안티센스)

Kpn I 15K-5'말단 18염기

프라이머-26 CCGG GGTACC TGTTCATTTAGTTCTATC (28염기)

(센스)

Hind Ⅲ 15K-3'말단 15염기

프라이머-27 CCGG AAGCTT CTA CCTGCTAATAATGGC (28염기)

(안티센스) 종지코돈

Eco RI 17K-3'말단 21염기

프라이머-28 GACT GAATTC TTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC (31염기)

(안티센스)

Eco RI 15K-5'말단 21염기

프라이머-29 GGTG GAATTC TGTTCATTTAGTTCTATCCCG (31염기)

(센스)

[참고예 4]

[Tp 47K, 17K, 15K 유전자의 조제]

매독균(Treponema pallidum, Nicols strain)을 계대배양한 토끼 고환으로부터 균을 파콜 밀도 원심에 의해 정제 (Sex. Transm. Dis., Vol. 11, p. 275-286, 1984)하고, SDS-프로테나아제 K/페놀·클로로포름법에 의해 게놈의 DNA를 추출하였다. 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 법에 의해, 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작한 프라이머 7을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작한 프라이머 9를 선택하고, 추출된 게놈의 DNA를 주형으로 하여 15K (Molecular Microbiology, Vol. 4. p. 1371-1379. 1990)를 코드하는 DNA 단편을 제작하였다. 다음에, 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작한 프라이머 8을, 또 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작한 프라이머 6을 선택하여, 17K(Infection and Immunity, Vol. 60. p. 1202-1210. 1993)를 코드하는 DNA 단편을 제작하였다. 또한, 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작한 프라이머 1을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작한 프라이머 20을 선택하여, 47K(Infection and Immunity, Vol. 60. p. 1568-1576. 1992)를 코드하는 DNA 단편을 제작하였다. 47K에서는 본체의 434 아미노산의 C말단 후에, 다시 9 아미노산이 부가될 가능성이 보고되어 있으므로 (Infection and Immunity, Vol. 60. p. 1568-1576, 1992), 도2에 표시한 바와같이 47 K의 DNA 단편의 증폭시에 사용되는 안티센스 프라이머에 이 9 아미노산에 대응하는 염기 배열을 가함으로서 47K를 코드하는 DNA단편을 제작하여 사용하였다. 또, 15 K 및 17 K를 코드하는 DNA 단편을 도3에 표시하였다.

[실시예 1]

[15-17 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 7을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 4를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 15 K 유전자 0.1 ng 및 Taq 폴리머라제 (TaKaRa사제) 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 1을 제작하였다.

b) 참고예 3에서 제작된 프라이머 5 및 6과, 참고예 4에서 제작된 17 K를 코드하는 DNA 단편을 사용하고, 실시예 1-a)와 동일하게 PCR법을 실시하여 DNA 단편 2를 제작하였다.

c) 실시예 1-a) 및 b)에서 제작된 DNA 단편 1 및 2를 각각 1 ng, 참고예 3에서 제작된 프라이머 7 및 6을 각각 1 μM 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하고, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 40 사이클 후, 다시 72 ℃ 15분, 1사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여, 15 내지 17 융합 항원을 코드하는 DNA 단편을 제작하였다.

d) 참고예 2에서 제작된 pW6A와 실시예 1-c)에서 제작된 15-17 융합 항원 유전자를, Nde I (New England Biolab 사제) 5 유니트 및 Bam HI (New England Biolab 사제) 5 유니트로 37 ℃에서 1 시간 동안 절단하였다.

e) 실시예 1-d)에서 조제된 pW6A 및 15-17 융합 항원 유전자를 TaKaRa 사제 Ligation Kit ver. 1을 사용하여, 16 ℃ 2시간의 조건에서 반응시켰다. 반응종료후, 이 반응액을 사용하여 한나한법으로 제작된 콤피턴트 세포인 대장균 DH5α를 형질전환시켜 50㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 LB 한천 배지 상에 그 균을 뿌리고, 37 ℃에서 하루밤 배양하였다. 나타난 암피실린 내성균의 콜로니 중에서 15-17 융합 항원 유전자가 조합되어 들어간 15-17 융합 항원 발현용 벡터를 갖는 콜로니를 선택하고, 이 콜로니를 50㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 LB 액체 배지에서 37 ℃에서 하루밤 진탕 배향하여, 집균후, 알칼리 SDS법으로 목적하는 벡터를 정제하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

[실시예 2]

[15-17 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 7을, 안티센스 프라이머로서 프라이머 17를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 15 K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 3을 제작하였다.

b) 실시예 2-a)에서 제작된 DNA 단편 3과 참고예 2에서 제작된 pW6A를, NdeI 5 유니트 및 Sal I(토요보 사제) 5 유니트로 37 ℃에서 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일 조건에서 참고예 2에서 제작된 pW6A에 DNA 단편 3을 삽입하였다.

c) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 12를, 안티센스 프라이머로서 프라이머 10을 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 수득한 47K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여, DNA 단편 4를 수득하였다.

d) 실시예 2-b)에서 제작된 DNA 단편 3 삽입 pW6A와 실시예 2-c)에서 제작된 DNA 단편 4를, 각각 상기 Sal I 5 유니트 및 상기 Bam HI 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 DNA 단편 3 삽입 pW6A에 DNA 단편 4를 삽입하여, 15-47 융합 항원 발현용 벡터를 수득하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

[실시예 3]

[17-47 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 8을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 15를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 17 K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 3을 제작하였다.

b) 실시예 3-a)에서 얻은 DNA 단편 5와 참고예 2에서 제작된 pW6A를, 상기 NdeI 5 유니트 및 Xho I(토요보 사제) 5 유니트로 37 ℃에서 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 pW6A에 DNA 단편 5를 삽입하였다.

c) 실시예 2-c)에서 수득된 DNA 단편 4는 상기 Sal I 5 유니트와 BamHI 5 유니트로, 실시예 3-b)에서 수득된 DNA 단편 5 삽입 pW6A는 상기 Xho I 5 유니트 및 상기 BamHI 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 그 후, 실시예 1-e) 와 동일한 조건에서 DNA 단편 5 삽입 pW6A에 DNA단편 4를 삽입하여, 17-47 융합 항원 발현용 벡터를 제작하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

[실시예 4]

[17-15 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 11을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 9를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 15 K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 6을 제작하였다.

b) 실시예 4-a)에서 제작된 DNA 단편 6을 상기 Sal I 5 유니트와 BamHI 5 유니트로, 실시예 3-b)에서 제작된 DNA 단편 5 삽입 pW6A는 상기 XhoI 5 유니트 및 상기 BamHI 5 유니트로, 실시예 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e) 와 동일한 조건에서 DNA 단편 5 삽입 pW6A에 DNA단편 6을 삽입하여, 17-15 융합 항원 발현용 벡터를 제작하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

[실시예 5]

[47-15 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 1을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 21을 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 47 K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 3을 제작하였다.

b) 실시예 5-a)에서 제작된 DNA 단편 7과 pW6A를, 각각 상기 NdeI 제작된 5 유니트 및 Xho I 5 유니트로 37 ℃에서 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1- e)와 동일한 조건에서 pW6A에 DNA 단편 7을 삽입하였다.

c) 실시예 4-a)에서 제작된 DNA 단편 6과, 실시예 5-b)에서 제작된 DNA 단편 7 삽입 pW6A을 각각 상기 Sal I 5 유니트 및 상기 BamHI 5 유니트로 실시예 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e) 와 동일한 조건에서 DNA 단편 7 삽입 pW6A에 DNA단편 6을 삽입하여, 47-15 융합 항원 발현용 벡터를 제작하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

[실시예 6]

[47-15 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 14를, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 6을 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 얻은 17 K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 8을 제작하였다.

b) 실시예 6-a)에서 제작된 DNA 단편 8과 실시예 5-b)에서 제작된 DNA 단편 7 삽입 pW6A를, 각각 상기 Sal I 5 유니트 및 상기 BamHI 5 유니트로, 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e) 와 동일한 조건에서 DNA 단편 7 삽입 pW6A에 DNA 단편 8을 삽입하여, 47-15 융합 항원 발현용 벡터를 제작하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

[실시예 7]

[47-15-17 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 11을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 6을 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 실시예 1에서 제작된 15-17 융합 항원 발현용 벡터 0.1 ng 및 상기 Taq폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 9를 얻었다.

b) 실시예 7-a)에서 제작된 DNA 단편 9와 실시예 5-b)에서 제작된 DNA 단편 7 삽입 pW6A를, 각각 상기 Sal I 5 유니트 및 상기 BamHI 5 유니트로, 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e) 와 동일한 조건에서 DNA 단편 7 삽입 pW6A에 DNA단편 9를 삽입하여, 47-15-17 융합 항원 발현용 벡터를 제작하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

[실시예 8]

[17-47-15 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 12를, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 2를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 47K 유전자 0.1 ng 및 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 10을 제작하였다.

b) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 3을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 9를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 15K 유전자 0.1 ng 및 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 11을 제작하였다.

c) 실시예 8-a) 및 b)에서 제작된 DNA단편 10 및 11을 각각 1 ng와, 참고예 3에서 제작된 프라이머 12 및 9를 각각 1 μM 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃에서 1분 - 55 ℃에서 2분 - 72 ℃에서 3분, 40 사이클 후, 다시 72 ℃에서 15분, 1 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여, 47-15 융합 항원을 코드하는 유전자를 제작하였다.

d) 실시예 8-c)에서 수득된 47 - 15 융합 항원을 코드하는 유전자는 상기 Sal I 5 유니트와 BamHI 5 유니트로, 실시예 3-b)에서 제작된 DNA 단편 5 삽입 pW6A는 상기 Xho I 5 유니트 및 상기 BamHI 5 유니트로, 37 ℃에서 1 시간 동안 절단하였다. 반응 종료후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 DNA 단편 5 삽입 pW6A에 47-15 융합 항원을 코드하는 유전자를 삽입하여, 17-47-15 융합 항원 발현용 벡터를 제작하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

[실시예 9]

[17-15-47 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 8을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 17을 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 실시예 4에서 제작된 17-15 융합 항원 발현용 벡터 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 12를 제작하였다.

b) 실시예 9-a)에서 제작된 DNA 단편 12와 참고예 2에서 제작된 pW6A를 각각 상기 Nde I 5 유니트 및 Sal I 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 pW6A에서 DNA단편 12를 삽입하였다.

c) 실시예 2-a) 에서 제작된 DNA 단편 4와, 실시예 9-b)에서 제작된 DNA 단편 12 삽입 pW6A는 각각 상기 Sal I 5유니트 및 상기 Bam HI 5유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 DNA 단편 12 삽입 pW6A에 DNA 단편 4를 삽입하여, 17-15-47 융합 항원 발현용 벡터를 제작하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.

[실시예 10]

[15-47-17 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 12를, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 13을 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 47K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 13을 제작하였다.

b) 실시예 10-a)에서 제작된 DNA 단편 13과 참고예 2에서 제작된 pW6A를, 각각 상기 Sal I 5 유니트 및 상기 Xho I 5 유니트로 37 ℃에서 1 시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 pW6A에 DNA 단편 13을 삽입하였다.

c) 실시예 6에서 제작된 DNA 단편 8은 상기 Sal I 5 유니트와 Bam HI 5 유니트로, 실시예 10-b)에서 제작된 DNA 단편 13 삽입 pW6A는 상기 XhoI 5 유니트 및 상기 Bam HI 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 DNA 단편 13 삽입 pW6A에 DNA 단편 8을 삽입하였다.(이하, DNA 단편 13-8 삽입 pW6A로 표시한다).

d) 실시예 2-a)에서 제작된 DNA 단편 3과 실시예 10-c)에서 제작된 DNA 단편 13-8 삽입 pW6A를, 각각 상기 NdeI 5 유니트 및 상기 Sal I 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 DNA 단편 13-8삽입 pW6A에 DNA 단편 3을 삽입하여, 15-47-17 융합 항원 발현용 벡터를 수득하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

[실시예 11]

[15-17-47 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 7을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 16을 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과 실시예 1에서 제작된 15-17 융합 항원 발현용 벡터 0.1 ng 및 Taq 폴리머라제 2.5 유니트 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 14를 제작하였다.

b) 실시예 11-a)에서 제작된 DNA 단편 14와 참고예 2에서 제작된 pW6A를, 각각 상기 Nde I 5 유니트 및 상기 Sal I 5 유니트로 37 ℃에서 1 시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 pW6A에 DNA 단편 14를 삽입하였다.

c) 실시예 2-c)에서 제작된 DNA 단편 4와, 실시예 11-b)에서 제작된 DNA 단편 14 삽입 pW6A를, 각각 상기 Sal I 5 유니트 및 상기 Bam HI 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 DNA 단편 14 삽입 pW6A에 DNA 단편 4를 삽입하여, 15-17-47 융합 항원 발현용 벡터를 제작하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.

[실시예 12]

[47-17-15 융합 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 1을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 18을 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 47K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 15를 제작하였다.

b) 실시예 12-a)에서 제작된 DNA 단편 15와 참고예 2에서 제작된 pW6A를, Sal I(토요보 사제) 5 유니트로 하여 37 ℃에서 1 시간 동안 절단하였다. 다시 상기 NdeI 5 유니트로 37 ℃에서 1 시간 동안 절단하였다. 반응 종료후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 pW6A에 DNA 단편 15를 삽입하였다.

c) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 19를, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 28을 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 17K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 16을 제작하였다.

d) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 29를, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 9를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 15K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 17을 제작하였다.

e) 실시예 12-c)에서 수득된 DNA 단편 16은, 상기 Sac I 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단후, 다시 Eco RI (토요보 사제) 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 실시예 12-d)에서 수득된 DNA 단편 17은 상기 Eco RI 5 유니트 및 상기 BamHI 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 또, 실시예 12-b)에서 제작된 DNA 단편 15 삽입 pW6A를, 상기 SacI 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단후, 다시 상기 BamHI 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료후, 실시예 1-e)와 동일조건에서 DNA 단편 15삽입 pW6A에 DNA 단편 16과 DNA 단편 17을 동시에 삽입하여, 47-17-15 융합 항원 발현용 벡터를 수득하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.

[실시예 13]

[15 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 7을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 9를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과, 참고예 4에서 제작된 15K 유전자 0.1 ng 및 Taq 폴리머라제 (TaKaRa 사제) 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 18을 제작하였다.

b) DNA 단편 18과 참고예 2에서 제작된 pW6A를 각각 상기 Nde I 5 유니트 및 상기 BamHI 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 pW6A에 DNA 단편 18을 삽입하여, 15 항원 발현용 벡터를 수득하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.

[실시예 14]

[15-15 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 11을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 9를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과 참고예 4에서 제작된 15K 유전자 0.1 ng 및 Taq 폴리머라제(TaKaRa 사제) 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 19를 제작하였다.

b) DNA 단편 19와 실시예 10에서 수득된 15-47-17 융합 항원 발현용 벡터를, 각각 상기 Sal I 5 유니트 및 상기 Bam HI 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 DNA 단편 47-17을 제거한 15-47-17 융합 항원 발현용 벡터에 DNA 단편 19를 삽입하여, 15-15 융합 항원 발현용 벡터를 수득하였다. 결과를 도 6에 나타낸다.

[실시예 15]

[15-15-15 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 11을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 22를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과 참고예 4에서 제작된 15K 유전자 0.1 ng 및 Taq 폴리머라제 (TaKaRa 사제) 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 20을 제작하였다.

b) DNA 단편 20과 실시예 10에서 수득된 15-47-17 융합 항원 발현용 벡터를, 각각 상기 Sal I 5 유니트 및 상기 Bam HI 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 DNA 단편 47-17을 제거한 15-47-17 융합 항원 발현용 벡터에 DNA 단편 20을 삽입하였다(이하, DNA 단편 15-15 삽입 pW6A라 표시한다).

c) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 23을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 24를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과 참고예 4에서 제작된 15K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 (TaKaRa 사제) 2.5 유니트 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 21을 제작하였다.

d) 실시예 15-c)에서 수득된 DNA 단편 21과 실시예 15-b)에서 제작된 DNA 단편 15-15 삽입 pW6A를, Kpn I (토요보 사제) 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단후, 다시 상기 Bam HI 5유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 DNA 단편 15-15삽입 pW6A에 DNA 단편 21을 삽입하여, 15-15-15 융합 항원 발현용 벡터를 수득하였다. 결과를 도 6에 나타낸다.

[실시예 16]

[15-15-15-15 항원 발현용 벡터의 제작]

a) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 23를, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 25를 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM과 참고예 4에서 제작된 15K 유전자 0.1 ng 및 Taq 폴리머라제(TaKaRa 사제) 2.5 유니트를 사용하여, 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 22를 제작하였다.

b) 실시예 16-a)에서 수득된 DNA단편 22와 실시예 15-b)에서 제작된 DNA 단편 15-15 삽입 pW6A를, 상기 Kpn I 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단후, 다시 상기 BamHI 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 DNA 단편 15-15삽입 pW6A에 DNA단편 22를 삽입하였다(이하, DNA 단편 15-15-15 삽입 pW6A로 표시한다).

c) 센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 26을, 안티센스 프라이머로서 참고예 3에서 제작된 프라이머 27을 선택하였다. 각각의 프라이머 1 μM와, 참고예 4에서 수득한 15K 유전자 0.1 ng 및 상기 Taq 폴리머라제 (TaKaRa 사제) 2.5 유니트를 사용하여 94 ℃ 1분 - 55 ℃ 2분 - 72 ℃ 3분, 30 사이클의 조건에서 PCR법을 실시하여 DNA 단편 23을 수득하였다.

d) 실시예 16-c)에서 제작된 DNA 단편 23과, 실시예 16-b)에서 제작된 DNA 단편 15-15-15 삽입 pW6A를, 상기 Kpn I 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단후, 다시 Hind Ⅲ (토요보사제) 5 유니트로 37 ℃에서 1시간 동안 절단하였다. 반응 종료 후, 실시예 1-e)와 동일한 조건에서 DNA 단편 15-15-15 삽입 pW6A에 DNA 단편 23을 삽입하여, 15-15-15-15 융합 항원 발현용 벡터를 수득하였다. 결과를 도 6에 나타낸다.

[실시예 17]

[각종 융합 항원의 발현]

실시예 1에서 12까지 수득된 각 발현 벡터를 사용하여 하나한법으로 제작된 콤피턴트 세포인 대장균 BL 21(DE 3)을 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 LB 한천 배지 상에 그 균을 뿌리고, 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 나타난 암피실린 내성균의 콜로니 중에서, 각 융합 항원 유전자가 재조합된 융합 항원 발현용 벡터를 갖는 콜로니를 선택하여, 50 ㎍/㎖ 암피실린을 포함한 4 ㎖의 LB 액체 배지에서, 37 ℃에서 하룻밤 진탕 배양하였다. 이 배양된 균을 다시 50 ㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 1 ℓ의 LB 액체 배지에서, 37 ℃에서 3시간 진탕 배양후, 최종 농도로 1 mM IPTG (이소프로필-β-D(-)-티오갈락토피라노시드)를 첨가하고, 다시 37 ℃에서 하룻밤 진탕 배양하여, 각 융합 항원의 발현을 유도하였다.

[실시예 18]

[융합 항원의 정제]

실시예 17에서 발현된 각 융합 항원 중, 47-17-15 융합 항원, 47-15-17 융합 항원, 15-17-47 융합 항원 및 15-17 융합 항원의 정제를 하였다.

3 항원 융합형의 47-17-15 융합 항원, 47-15-17 융합 항원 및 15-17-47 융합 항원은 항원 발현 후의 대장균을 초음파 파쇄하고, 원심 조작후, 그 잔사를 요소에 의해 가용화하여, Superdex-200(파마시아사제)를 사용한 겔여과 크로마토그래피, Q-세파로스(파마시아 사제)를 사용한 이온 교환 크로마토그래피, 세라믹 하이드록시아파타이트(아사히고가쿠 사제)를 사용한 흡착 크로마토그래피로 정제하였다.

2 항원 융합 형의 15-1 융합 항원에 대해서는 항원 발현 후의 대잔균을 초음파 파쇄하고, 원심 조작 후, 그 상징액을 요소로 변성하고, Q-세파로스(파마시아 사제)를 사용한 이온 교환 크로마토그래피, 세라믹 하이드록시아파타이트(아사히고카쿠사제)를 사용한 흡착 크로마토그래피, SP-세파로스(파마시아 사제)를 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

각 항원 모두에 1 ℓ의 배양액으로부터 순도 95 % 이상으로, 47-17-15 융합 항원은 7 mg, 47-15-17 융합 항원은 10 mg, 15-17-47 융합 항원은 20 mg, 15-17 융합 항원은 10 mg을 수득하였다. 정제 후의 각 융합 항원을 환원 SDS 폴리아크릴 아미드겔 전기 영동 후, 쿠마시 염색하였다. 결과를 도 7에 표시한다. 3 항원 융합 형의 항원은 아미노산 배열에서 75K의 분자량을 가지고, 15-17 융합 항원은 29 K의 분자량을 갖는 것으로 예상되었으며, 전기영동의 결과로부터 정제된 항원이 각각 예상된 분자량을 가지고 있음을 확인되었다. 또, 참고예 1에서 제작된 47 K Mab, 17 KMab 및 15 K Mab를 사용하여 웨스턴 블롯을 실시한 결과, 융합 항원 중의 각 항원에 대응하여 각 모노클로날 항체가 반응하는 것이 확인되었다.

[실시예 19]

[융합 항원 감작 플레이트의 제작]

96 웰 ELISA 플레이트(BECTON DICKINSON사 제)의 각 웰에, 실시예 18에서 정제한 각 융합 항원을 10 mM PBS로 희석하고, 0.66 pmol/웰에 분주하여 하루밤 동안 4 ℃에서 방치함으로서 감작시켰다. 감작후, 1 % 탈지유를 포함하는 10 mM PBS로 37 ℃에서 12시간 블록킹하였다.

[참고예 5]

[단독 항원 감작 플레이트의 제작]

대장균에서 발현시켜 정제된 재조합체의 단독 항원 47 K 항원, N 말단에 신호 펩티드를 포함한 17 K 항원(이하, 본 명세서 중에서 S17 K 항원으로 기재한다) 및 GST 15K 항원을 각각 또는 모두를 혼합하여, 별도의 웰에 0.66 pmol/웰로 감작하였다. 감작후 1 % 탈지유를 포함하는 10 mM PBS로 37 ℃에서 12시간 블록킹하였다.

[실시예 20]

[융합 항원과 모노클로날 항원과의 반응성 시험]

참고예 1에서 제작된 47 KMab, 17 KMab, 15 KMab의 각각, 또는 혼합물의 각 모노클로날 항체 최종 농도가 10 μM이 되도록 1 % 탈지유 및 0.05 % Tween 20(상품명)을 포함하는 10 mM PBS(이하, 탈지유 함유 PBST로 기재한다)로 희석하고, 실시예 19 및 참고예 5에서 제작된 항원 감작 플레이트의 세정후의 각 웰에 50 ㎕ 가하여, 실온에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 세정후, 탈지유 함유 PBST로서 1/1000으로 희석한 퍼록시다아제 표지 항 마우스 Ig(DAKO 사제)를 50 ㎕ 가하고, 실온에서 1.5 시간 인큐베이션하였다. 세정후, 과산화수소와 ABTS의 혼합 용액을 50 ㎕가하여 3분간 발색시켰다. 반응을 정지시킨 후, 분광 광도계로 405 nm의 흡광도를 측정하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1에 표시한 바와 같이, 융합 항원은 단독 항원인 47 K, S17K, GST 15K와 비교하여 동등 이상의 활성을 나타냈다.

[실시예 21]

[융합 항원과 단독 항원과의 반응성 시험]

탈지유 함유 PBST로 1/1000으로 희석한 Tp 양성 혈청(Boston Biomedica Inc. 사로부터 구입) 및 음성 혈청을 실시예 19 및 참고예 5에서 제작된 항원 감작 플레이트의 세정후의 각 웰에 50 ㎕ 가하여, 실온에서 1.5 시간 인큐베이션하였다. 세정후, 탈지유 함유 PBST로 1/1000으로 희석한 퍼록시다아제 표지 항인간 IgG(Bio Source 사제)를 50 ㎕ 가하여 3시간 동안 발색시켰다. 반응을 정지시킨 후, 분광 광도계로 405 nm의 흡광도를 측정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 융합 항원은 단독 항온 및 단독 항원을 혼합하여 감작한 것 보다도 양성 혈청과의 반응이 높고, 응성 혈청과는 전혀 반응하지 않았다.

47K+S17K+GST15K은 단독항원을 합하여 감작한 것을 표시함

[실시예 22]

[융합 항원과 양성 혈청과의 반응성 시험]

Tp 양성 혈청 24 시료(Boston Biomedica Inc. 사로부터 구입) 및 음성 혈청 1 시료를 실시예 21과 동일한 방법으로 발색 시간을 30분으로하여 측정하였다. 결과를 표 3에 나타낸다. 융합 항원의 24예의 양성 혈청과의 반응은 음성 혈청과의 반응과 비교하여 유의성 있게 높았다.

[실시예 23]

[15K, 15K-15K, 15-15K-15K, 15K-15K-15K-15K의 발현]

실시예 13 내지 16에서 수득된 15K, 15K-15K, 15-15K-15K, 15K-15K-15K-15K의 발현 벡터를 사용하여 대장균 BL21(DE 3)을 한나한법으로 형질전환시켰다. 다음에, 50 ㎍/㎖ 암피실린을 포함한 LB 한천 배지상에 형질전환된 균을 뿌리고, 37 ℃에서 하루밤 배양하였다.

나타난 암피실린 내성균의 콜로니 중에서 각 융합 항원 유전자의 재조합된 융합 항원 발현용 벡터를 갖는 콜로니를 선택하고, 50 ㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 2 ㎖의 LB 액체 배지에서, 37 ℃에서 하루밤 진탕 배양하였다. 이 배양된 균 가운데 40 ㎕를 50 ㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 2 ㎖의 LB 액체 배지에서, 37 ℃에서 2시간 진탕 배양한 후, 최종 농도로서 1 mM IPTG(이소프로필-β-D(-)-티오가락토피라노시드)를 첨가하고, 다시 37 ℃에서 하루밤 진탕 배양하여, 각 융합 항원의 발현을 유도하였다.

이와 같이 얻어진 대장균 배양액 2 ㎖ 중, 5 ㎖를 마이크로 원심튜브에 옮기고, 마이크로 원심분리기(히타찌 사제 himac CT 15D)를 사용하여, 15,000 회전에서 30초간 원심분리 조작을 실시하여 집균하였다. 각 튜브에 150 ㎕ TE 완충액(10 mM 트리스-염산 완충액, pH 8.0, 1 mM EDTA)와, 150 ㎕ x 2 시료 완충액(1 M 트리스-염산 완충액, pH 6.8, 20 % w/v SDS, 10 % v/v β-ME)를 가하고, 잘 혼합한 후, 5분간 끓인 다음, 다시 10분간 초음파 처리하였다. 이와 같이 수득된 시료 13 ㎕에 2㎕의 50% 글리세린을 가하여 혼합하고, 그 중 10㎕를 15% 폴리아크릴아미드겔을 사용하여, 환원 SDS 전기영동하였다. (Laemmli, U.K. 1970 : Nature 227, 680). 전기영동 후 겔을 쿠마시 염색하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다. 하루밤 발현 유도하여 15K-15K, 15K-15K-15K, 15K-15K-15K-15K의 밴드가 확인되었다. 또, 하루밤 발현 유도한 각 항원을 동일하게 10 내지 15%의 폴리아크릴아미드 구배겔을 사용하여 환원 SDS 전기영동을 실시하고, 니트로셀룰로오스 막에 전기 블롯팅하여, 블록킹한 후 일차 항체로 하여, 참고예 1에서 제작된 15 KMab를 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 도 9에 표시한 바와 같이, 15K, 15K-15K, 15K-15K-15K, 15K-15K-15K-15K의 모든 밴드가 확인되었다.

[실시예 24]

[15K, 15K-15K, 15K-15K-15K, 15K-15K-15K-15K의 발현량의 비교]

하루밤 발현 유도한 대장균을 실시예 23에 표시한 바와 같이 조제된 전기영동 시료와, 농도가 알려진 BSA를 포함하는 전기영동용 마커(Pharmacia LKB 제 Low Molecular Weight Calibration Kit)를 15% 폴리아크릴미드 겔을 사용하여, 환원 SOS 전기영동을 실시하고, 전기영동 후 겔을 쿠마시 염색하였다. 그 결과를 도 10에 나타낸다. 다음에, 밀도계 (ATTO 사제 AE-6900 덴시토그래프)를 사용하여, 염색된 밴드로부터 발현된 항원의 양을 산출하였다. 도 10의 레인 1로부터 레인 6의 농도가 알려진 BSA의 밴드의 농도를 밀도계를 사용하여 측정하여, 검량선을 제작하였다. 그 결과를 도 11에 나타낸다. 다시, 15K, 15K-15K, 15K-15K-15K, 15K-15K-15K-15K의 상당하는 밴드의 농도를 동일하게 밀도계를 사용하여 측정하고, 도 11의 검량선을 사용하여 발현량을 산출하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다. 15K는 밴드가 확인되지 못하고, 역으로 15K-15K-15K에서는 레인 당 1㎍(균체 배양액 1 ℓ당 23 mg에 상당함)으로 가장 발현량이 컸다. 이와같이 15K를 직렬로 반복하여 융합함으로서, 그 발현량이 증가하였다.

본 발명에 따른 융합 항원은 각 표면 항원을 각각 단독으로 사용한 경우보다 훨씬 항 Tp 항체와의 반응성이 높고, 그 융합 항원을 항 Tp 항체의 측정계에 사용함으로서, 종래에는 없는 높은 측정 감도를 가진 항 Tp 항체 측정 방법이 제공될 수 있다.

Claims

매독 트레포네마의 15 kDa 표면 항원, 17 kDa 표면 항원 및 47 kDa 표면 항원으로 구성된 군에서 선택된 동일하거나 상이한 표면 항원 하나 이상을 포함하는 다수의 매독 트레포네마 표면 항원으로 본질적으로 구성된 매독 트레포네마 융합 항원.
제1항에 있어서, 매독 트레포네마의 15 kDa 표면 항원, 17 kDa 표면 항원 및 47 kDa 표면 항원으로 구성된 군에서 선택된 동일하거나 상이한 매독 트레포네마 표면 항원 2개 이상을 포함하는 매독 트레포네마 융합 항원.
제1항에 있어서, 매독 트레포네마의 15 kDa 표면 항원 및 17 kDa 표면 항원으로 구성된 군에서 선택된 매독 트레포네마의 표면 항원을 각기 구성하는 2개의 아미노산 서열로 이루어진 매독 트레포네마 융합 항원.
제1항에 있어서, 매독 트레포네마의 15 kDa 표면 항원 및 47 kDa 표면 항원으로 구성된 군에서 선택된 매독 트레포네마의 표면 항원을 각기 구성하는 2개의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 15 kDa 항원이 47 kDa 항원의 아미노 말단에 위치하거나 또는 47 kDa 항원이 15 kDa 항원의 아미노 말단에 위치하는 매독 트레포네마 융합 항원.
제1항에 있어서, 매독 트레포네마의 17 kDa 표면 항원 및 47 kDa 표면 항원으로 구성된 군에서 선택된 매독 트레포네마의 표면 항원을 각기 구성하는 2개의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 17 kDa 항원이 47 kDa 항원의 아미노 말단에 위치하거나 또는 47 kDa 항원이 17 kDa 항원의 아미노 말단에 위치하는 매독 트레포네마 융합 항원.
제1항에 있어서, 매독 트레포네마의 15 kDa 표면 항원을 구성하는 2개의 아미노산 서열로 이루어진 매독 트레포네마 융합 항원.
제1항에 있어서, 매독 트레포네마의 15 kDa 표면 항원, 17 kDa 표면 항원 및 47 kDa 표면 항원을 각기 구성하는 3개의 아미노산 서열로 이루어진 매독 트레포네마 융합 항원.
제1항에 있어서, 매독 트레포네마의 15 kDa 표면 항원, 17 kDa 표면 항원 및 47 kDa 표면 항원으로 구성된 군에서 선택된 매독 트레포네마 표면 항원을 각기 구성하는 동일하거나 상이한 4개의 아미노산 서열로 이루어진 매독 트레포네마 융합 항원.