CN117229376A - 一种用于制备巴氏杆菌病疫苗的重组蛋白PlpE及其制备和应用 - Google Patents
一种用于制备巴氏杆菌病疫苗的重组蛋白PlpE及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属兽用生物制品技术领域，提供了一种用于制备巴氏杆菌病疫苗的重组蛋白PlpE及其制备和应用。所述重组蛋白通过对巴氏杆菌保护性抗原蛋白PlpE基因上的非免疫显性基团氨基酸残基定点突变，既保留了PlpE的免疫原性又提高PlpE重组蛋白包涵体的表达量。该重组蛋白制备过程简单，表达量高，易于纯化，适用于巴氏杆菌亚单位疫苗生产。
Description
技术领域：
本发明涉及一种病原菌保护性抗原及其制备和应用，属于兽用生物制品与动物疫病防控领域。
背景技术：
巴氏杆菌病（Pasteurellosis）主要由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）引起，是多种畜禽、野生动物和人类的一种传染病的总称。巴氏杆菌病呈地方流行性，会造成动物死亡或影响其生长、降低饲料报酬，给畜禽养殖业带来较大经济损失。巴氏杆菌病因发病程度和感染动物不同而有不同的病名，如猪肺疫、猪进行性萎缩性鼻炎、禽霍乱、牛出血性败血症、兔巴氏杆菌病（兔出血性败血症）等，其中多数疫病被中国政府列为三类动物疫病。近年来巴氏杆菌的在多种动物中的临床分离或检出率都位居前列。多杀性巴氏杆菌同样可以造成人类感染发病，是一种人兽共患病病原体。
目前已经有巴氏杆菌病灭活疫苗或弱毒疫苗用于动物巴氏杆菌病的防控，但是这些传统疫苗存在效力低、交叉保护力弱、安全性差，不能鉴别诊断等缺点。亚单位疫苗具有成分单一、安全性好、稳定和可以借助基因工程手段大量生产的优点，能克服传统疫苗的不足，正成为兽用疫苗研究的重要方向。保护性抗原是研制基因工程亚单位疫苗的基础。目前已经发现PlpE是良好的巴氏杆菌保护性抗原，可以在原核表达系统中成功表达，对不同血清型巴氏杆菌均具有免疫保护作用，并且仅包涵体就具有良好的免疫保护作用。
以包涵体形式表达的保护性抗原相对于可溶性表达的保护性抗原具有易于纯化的优点，从而使亚单位疫苗生产工艺更简单，生产成本也更低。但是PlpE在大肠杆菌中表达时同时存在包涵体和可溶性蛋白两种形式，可溶性蛋白需要经过亲和纯化、切除标签、透析等操作才能利用，工艺相对复杂，成本较高，不利于PlpE的在生产上应用。本研究的目的是通过对PlpE的一级结构进行定点突变，从而获得一种包涵体表达量高且较好地保留了原PlpE蛋白免疫活性的重组蛋白。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：通过对巴氏杆菌PlpE一级结构进行定点突变，从而获得一种包涵体表达量高且较好地保留了原PlpE蛋白免疫活性的重组蛋白,从而应用于动物巴氏杆菌病疫苗的制备。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种用作巴氏杆菌病疫苗的重组蛋白,所述重组蛋白其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
其中，编码所述一种用作巴氏杆菌病疫苗的重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
所述用作巴氏杆菌病疫苗的重组蛋白的制备方法,其步骤如下所示:
(1)使用Bepipred-2.0软件预测PlpE线性表位集中区域;
(2)合成（1）中所确定的PlpE免疫表位集中区域对应的重叠多肽，通过ELISA检测重叠多肽与PlpE抗血清的作用，筛选到能与PlpE抗血清发生明显反应的PlpE多肽；
（3）对（2）中能发生明显反应的PlpE多肽片段进行丙氨酸扫描突变，ELISA检测不同丙氨酸突变多肽对PlpE抗血清的结合作用，确定突变后不影响PlpE多肽与PlpE抗体结合的氨基酸残基，即PlpE的非免疫显性基团；
(4) 将PlpE表达质粒定点突变，使（3）中确定的非免疫显性基团突变为丙氨酸基因，将突变后的质粒转化到宿主菌中诱导表达后,经洗涤包涵体即得到重组蛋白。
所述重组蛋白在制备动物巴氏杆菌病疫苗方面的应用。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，尽管目前现有技术能通过大肠杆菌表达系统获得PlpE重组蛋白，但这些重组蛋白表达形式是包涵体与可溶性蛋白的混合物。需要经过亲和纯化、透析、切除标签等操作，这就增加了生产工艺和成本，限制了PlpE的应用。故本研究先分析了PlpE的线性表位组成并确定了各PlpE的非免疫显性基团，然后对非免疫显性基团的基因进行定点突变，使之突变为丙氨酸残基，成功获得了以包涵体形式表达为主PlpE重组蛋白。实验结果表明非免疫显性基团突变后的PlpE重组蛋白的包涵体表达量提升了1.5倍以上并且具有和PlpE相似的免疫活性。
总之，本发明通过对PlpE的非免疫显性基团进行突变提高了包涵体的表达量，为后期研制以PlpE重组蛋白抗原为基础的巴氏杆菌病重组亚单位疫苗提供了基础。
附图说明
图1为PlpE的氨基酸残基构成B细胞表位能力预测结果;(使用在线软件Bepipred-2.0（http://tools.immuneepitope.org/bcell/），预测分值高于0.5构成B细胞表位的几率较大)。
图2 为PlpE重叠多肽与PlpE抗血清的反应情况。Peptide 1-29，PlpE表位集中区域对应的合成多肽。Control，阴性对照，未包被任何多肽，其他与操作实验组相同。
图 3 为各多肽丙氨酸扫描突变体与PlpE抗血清反应的ELISA检测结果，2-1,中2表示表1中合成多肽名称，1表示发生丙氨酸突变的氨基酸残基位置（0表示没有氨基酸残基发生丙氨酸突变，即原始多肽），其他多肽表示方法相同。
图 4 非免疫显性基团氨基酸残基突变对PlpE（约35kDa）表达形式的影响。M，蛋白marker；1，突变前的PlpE重组菌经过夜诱导并裂解后的上清菌体蛋白；2，突变前的PlpE重组菌经过夜诱导并裂解后的包涵体蛋白；3，突变后的PlpE重组菌经过夜诱导并裂解后的上清菌体蛋白；4，突变后的PlpE重组菌经过夜诱导并裂解后的包涵体蛋白。
图 5 免疫与攻毒实验结果。A为免疫后小鼠体内特异性抗体产生情况；B为攻毒后小鼠的存活情况。Control，阴性对照；rPlpE-M，突变型PlpE重组蛋白；rPlpE，PlpE重组蛋白。
实施例1巴氏杆菌PlpE抗原表位预测
以Genbank公布的多杀性巴氏杆菌C51-17株的全基因组 (NZ_MAPQ01000003.1)序列中的PlpE基因序列为参考序列进行分析。使用Bepipred-2.0（http://tools.immuneepitope.org/bcell/）确定PlpE的B细胞表位分布情况。
上述PlpE的B细胞表位预测结果如图1所示:PlpE一级结构共包含336个氨基酸残基。选择Bepipred-2.0软件默认的0.5作为氨基酸残基构成表位的阈值，预测结果表明PlpE的表位主要分布于N端（图1）。
实施例2 巴氏杆菌PlpE表位多肽鉴定
（1）重叠多肽的化学合成 以人工化学合成方式制备PlpE表位集中区域对应的重叠多肽（表1），通过南京金斯瑞生物科技股份有限公司完成。合成过程简述如下，使用固相肽合成法（SPPS）合成多肽，即依次向树脂中添加氨基酸以构建肽链。当合成完成后，首先去保护N-端的Fmoc基团，然后去保护侧链保护基团，最后将多肽从树脂上切割下来。粗肽液样品溶解后，注入高效液相色谱（HPLC）仪，对色谱中出现的每个部分进行分子量和纯度测试，以确认目标多肽含量。
表1 PlpE表位集中区域所对应的重叠合成多肽
| 多肽名称 | 序列（N-C） | 在PlpE上的位置 |
| 1 | CSGGGGSAGNRADRVEEKAQ | 21-40 |
| 2 | GSAGNRADRVEEKAQPVQSN | 26-45 |
| 3 | RADRVEEKAQPVQSNSEPSS | 31-50 |
| 4 | EEKAQPVQSNSEPSSTPIKH | 36-55 |
| 5 | PVQSNSEPSSTPIKHPMTNS | 41-60 |
| 6 | SEPSSTPIKHPMTNSATNTS | 46-65 |
| 7 | TPIKHPMTNSATNTSLHDKL | 51-70 |
| 8 | PMTNSATNTSLHDKLSMSSH | 56-75 |
| 9 | ATNTSLHDKLSMSSHDTSKE | 61-80 |
| 10 | LHDKLSMSSHDTSKENSQQS | 66-85 |
| 11 | SMSSHDTSKENSQQSSFQAP | 71-90 |
| 12 | DTSKENSQQSSFQAPLEQEK | 76-95 |
| 13 | NSQQSSFQAPLEQEKNQPAQ | 81-100 |
| 14 | SFQAPLEQEKNQPAQENLTW | 86-105 |
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| 16 | NQPAQENLTWTGYHVSEWGN | 96-115 |
| 17 | ENLTWTGYHVSEWGNASNNV | 101-120 |
| 18 | TGYHVSEWGNASNNVDKDNV | 106-125 |
| 19 | SEWGNASNNVDKDNVTVFTF | 111-130 |
| 20 | ASNNVDKDNVTVFTFVKYNS | 116-135 |
| 21 | DKDNVTVFTFVKYNSQYNDD | 121-140 |
| 22 | TVFTFVKYNSQYNDDPVFDK | 126-145 |
| 23 | VKYNSQYNDDPVFDKTKTQS | 131-150 |
| 24 | QYNDDPVFDKTKTQSKTISL | 136-155 |
| 25 | PVFDKTKTQSKTISLVDGKN | 141-160 |
| 26 | TKTQSKTISLVDGKNENKEH | 146-165 |
| 27 | KTISLVDGKNENKEHYYHFT | 151-170 |
| 28 | VDGKNENKEHYYHFTLKDDL | 156-175 |
| 29 | ENKEHYYHFTLKDDLFYYGS | 161-180 |
| E | TVFTFVKYNSQYNDDPVFDKTKTQS | 126-150 |
（2）重叠多肽与PlpE抗血清的反应使用间接ELISA法检测多肽与血清的反应，简要叙述如下。以多肽包被ELISA板（10μg/孔，对照组不包被任何抗原），37℃孵育2 h。以PBST洗涤5次以后，使用5%的脱脂乳于37℃下封闭1 h。接下来孵育1/200稀释的鼠源PlpE抗血清（PlpE基因源自巴氏杆菌C51-17株，免疫血清已经提前制备），37℃下1 h。以PBST洗涤5遍以后，孵育偶联HRP的羊抗鼠二抗，37℃下孵育30 min。经过5遍洗涤以后加入100μl的TMB单组分显色液，反应10 min后加入50 μl终止液（2M硫酸）。最后在酶标仪上读取450nm的吸光度。
结果如图2所示，巴氏杆菌PlpE合成多肽2、7、12、16、21-24均能与PlpE抗血清发生明显反应（即对应PlpE区域为PlpE表位）。选择合成多肽2、7、12、16、E（包含多肽22和23的序列）进行后续实验。
实施例3巴氏杆菌PlpE非免疫显性基团鉴定
对实施例2中筛选到的PlpE合成多肽2、7、12、16、E进行丙氨酸扫描突变，即合成成这些表位多肽的一系列突变体多肽，每条突变体多肽与表位多肽相比仅有1个氨基酸残基发生了变化（变成了丙氨酸残基）。然后使用实施例2中的ELISA方法检测这些表位多肽及其突变体多肽对PlpE抗血清反应性的差异。
检测结果如图3所示，多肽2（GSAGNRADRVEEKAQPVQSN）的第8位氨基酸残基（D）、多肽7（TPIKHPMTNSATNTSLHDKL）的第5位氨基酸残基（H）、多肽12（DTSKENSQQSSFQAPLEQEK）的第6位氨基酸残基（N）、多肽16（NQPAQENLTWTGYHVSEWGN）的第8位氨基酸残基（L）、多肽E（TVFTFVKYNSQYNDDPVFDKTKTQS）的第1位氨基酸残基（T）突变为丙氨酸残基（A）后不影响多肽与PlpE抗体的结合，即这些氨基酸残基是PlpE的非免疫显性基团。
实施例4 定点突变对PlpE表达形式的影响
(1) 质粒、菌种及培养 巴氏杆菌PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE、BL21 (DE3)宿主菌为本试验室保存。大肠杆菌使用LB（青岛海博生物）液体或固体培养基培养。
(2) PlpE基因的定点突变
设计不同引物分步完成PlpE非免疫显性基团基因的定点突变，具体操作如下：
① 设计引物33D-F（5’-TgcgCGTGTAGAGGAAAAAGCACAACCGGTTC-3’）和33D-R（5’-TTTCCTCTACACGcgcAGCACGATTTCCAGCGCTAC-3’），其中小写字母表示待突变基因位点，以巴氏杆菌PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE为模板进行PCR扩增，获得携带突变位点基因的线性质粒。使用同源重组克隆试剂盒（诺唯赞，南京）将线性pET28a（+）-PlpE质粒两端连接，然后转入BL21宿主菌。挑取阳性克隆PCR鉴定正确后对突变PlpE表达质粒测序，确认定点突变成功，获得突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A）。
② 设计引物55H-F（5’-CAATCAAAgccCCTATGACTAATAGTGCTACGAATACTTCT-3’）和55H-R（5'- CATAGGggcTTTGATTGGAGTGGAAGAAGGCT -3'），其中小写字母表示待突变基因位点，以上面①中获得的突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A）为模板进行PCR扩增，获得携带新突变位点基因的线性质粒。使用同源重组克隆试剂盒将线性质粒两端连接，然后转入BL21宿主菌。挑取阳性克隆PCR鉴定正确后对突变型PlpE表达质粒测序，鉴定定点突变成功，获得新突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A）。
③ 设计引物81N-F（5'- gcaAGTCAACAATCCTCCTTTCAAGCCCCTCT -3'）和81N-R（5'-GAGGATTGTTGACTtgcTTCTTTGGATGTGTCATGAGAAGAC -3'），其中小写字母表示待突变基因位点，以上面②中获得的突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A）为模板进行PCR扩增，获得携带新突变位点基因的线性质粒。使用同源重组克隆试剂盒将线性质粒两端连接，然后转入BL21宿主菌。挑取阳性克隆PCR鉴定正确后对突变型PlpE表达质粒测序，确定定点突变成功后获得新突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A，N81A）。
④ 设计引物103L-F（5'- AATCgatCTTGGACAGGTTATCATGTTTCAGA -3'）和103L-R（5'- CCTGTCCAAGatcGATTTTCTTGTGCAGGTTGGTTT -3'），其中小写字母表示待突变基因位点，以上面③中获得的突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A，N81A）为模板进行PCR扩增，获得携带新突变位点基因的线性质粒。使用同源重组克隆试剂盒（诺唯赞，南京）将线性质粒两端连接，然后转入BL21宿主菌。挑取阳性克隆PCR鉴定正确后对新突变型PlpE表达质粒测序，进一步确认定点突变已经成功后获得新的突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A，N81A，L103A）。
⑤ 设计引物126T-F（5'- TgcgGTATTCACTTTCGTAAAATATAATTCTCAATAT -3'）和126T-R（5'- CGAAAGTGAATACcgcAACATTATCTTTATCTACATTATTACTCGCA -3'），其中小写字母表示待突变基因位点，以上面④中获得的突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A，N81A，L103A）为模板进行PCR扩增，获得携带新突变位点基因的线性pET28a（+）-PlpE质粒。使用同源重组克隆试剂盒将线性质粒两端连接，然后转入BL21宿主菌。挑取阳性克隆PCR鉴定正确后对突变PlpE表达质粒测序，进一步确认定点突变已经成功后获得新突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A，N81A，L103A，T126A），即获得表达基因序列为SEQ ID NO:2的表达质粒和工程菌。所表达的重组蛋白PlpE的免疫显性基团氨基酸残基被突变成丙氨酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
诱导表达与鉴定对pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A，N81A，L103A，T126A）重组大肠杆菌进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并优化诱导条件，包括比较37℃、28℃、16℃的表达效果，比较0.2 mM、0.4 mM、0.6 mM、0.8 mM、1 mM等终浓度下IPTG的诱导效果。重组菌诱导表达后用超声波破碎仪器进行破碎，并离心分别收集沉淀，进行SDS-PAGE跑胶，并进行考马斯亮蓝染色，检测表达效果。通过Bradford法测定纯化后的蛋白浓度进而估测重组蛋白表达量。
非免疫显性基团突变型PlpE的表达效果如图4所示:选用37℃、0.5mM IPTG诱导表达，获得的重组蛋白包涵体最多。非免疫显性基团突变型PlpE的包涵体表达量显著增加，表达产物以包涵体为主。工程菌表达产物经过简单清洗就可以完成纯化。非免疫显性基团突变突变前PlpE包涵体的表达量约为0.2mg/ml，突变后PlpE的表达量约为0.5mg/ml，即非免疫显性基团突变后PlpE包涵体的表达量提高了1.5倍左右。
实施例5突变型PlpE的免疫保护效力
(1)小鼠免疫与血清抗体检测取30 只 4-6 周龄 ICR雌鼠，随机分成3组，1组对照（Control），2组实验，每组 10 只。实验组分别免疫非免疫显性基团突变型PlpE重组蛋白包涵体（rPlpE-M）和PlpE重组蛋白包涵体（rPlpE）。实验组：100μg/μl纯化的重组蛋白用等体积的弗氏完全佐剂（Sigma）乳化后，腹腔注射免疫小鼠。21天后加强免疫，佐剂换成弗氏不完全佐剂，其他与初免相同。阴性对照组：PBS代替重组蛋白，使用的佐剂与实验组的佐剂相同。所有小鼠第二次免疫 10 天后尾静脉取血获得血清，测定抗体产生情况。
以纯化的重组蛋白（所免疫的重组蛋白）包被ELISA板（1μg/孔），37℃孵育2 h。以PBST洗涤3次以后，使用5%的脱脂乳于37℃下封闭1 h。接下来孵育1/200稀释的多克隆血清，37℃下1h。以PBST洗涤3遍以后，孵育偶联HRP的羊抗鼠二抗，37℃下孵育30 min。经过5遍洗涤以后加入100μl的TMB单组分显色液（湖州英创），反应10 min后加入50μl终止液（2M硫酸）。最后在酶标仪上读取450nm的吸光度。ELISA检测结果显示加强免疫10天后rPlpE-M免疫组和rPlpE免疫组均产生了显著高水平的特异性抗体（图5A所示）。
攻毒试验ELISA检测确认特异性抗体产生后进行攻毒试验。使用巴氏杆菌C51-17株对小鼠皮下注射攻毒，每只100CFU左右（约10×LD50）。连续7天每天记录小鼠的发病和死亡情况。攻毒后对照组小鼠全部死亡，而rPlpE-M免疫组和rPlpE免疫组小鼠全部存活（图5B）。这就表明免疫显性基团突变后的PlpE依然保留了PlpE的免疫保护效力。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.一种用于制备巴氏杆菌病疫苗的重组蛋白PlpE,其特征在于,所述重组蛋白PlpE中包含以下所述突变中的一个或多个突变，即：多肽2（GSAGNRADRVEEKAQPVQSN）的第8位氨基酸残基（D）突变为丙氨酸残基（A）、多肽7（TPIKHPMTNSATNTSLHDKL）的第5位氨基酸残基（H）突变为突变为丙氨酸残基（A）、多肽12（DTSKENSQQSSFQAPLEQEK）的第6位氨基酸残基（N）突变为突变为丙氨酸残基（A）、多肽16（NQPAQENLTWTGYHVSEWGN）的第8位氨基酸残基（L）突变为丙氨酸残基（A）、多肽E（TVFTFVKYNSQYNDDPVFDKTKTQS）的第1位氨基酸残基（T）突变为丙氨酸残基（A）。
2.根据权利要求1所述用于制备巴氏杆菌病疫苗的重组蛋白PlpE, 其特征在于,所述重组蛋白PlpE的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述一种用于制备巴氏杆菌病疫苗的重组蛋白PlpE, 其特征在于,编码所述重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种如权利要求1所述用作巴氏杆菌病疫苗的重组蛋白的制备方法,其步骤如下所示:
通过多肽扫描技术确定PlpE的表位多肽序列，
通过丙氨酸扫描突变技术确定PlpE的非免疫显性基团氨基酸残基
对已经连到表达载体上的巴氏杆菌C51-17菌株的PlpE基因定点突变，使非免疫显性氨基酸残基突变为丙氨酸;
将步骤(2)得到的突变型PlpE表达载体转化到宿主菌中诱导表达后,经洗涤包涵体得到重组蛋白。
5.根据权利要求4所述重组蛋白的制作方法，其特征在于，所述步骤（3）中PlpE基因的定点突变是通过设计不同引物分步完成PlpE非免疫显性基团基因的定点突变，具体操作如下：
① 设计引物33D-F（5’-TgcgCGTGTAGAGGAAAAAGCACAACCGGTTC-3’）和33D-R（5’-TTTCCTCTACACGcgcAGCACGATTTCCAGCGCTAC-3’），其中小写字母表示待突变基因位点，以巴氏杆菌PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE为模板进行PCR扩增，获得携带突变位点基因的线性质粒；
使用同源重组克隆试剂盒将线性pET28a（+）-PlpE质粒两端连接，然后转入BL21宿主菌；
挑取阳性克隆PCR鉴定正确后对突变PlpE表达质粒测序，确认定点突变成功，获得突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A）；
② 设计引物55H-F（5’-CAATCAAAgccCCTATGACTAATAGTGCTACGAATACTTCT-3’）和55H-R（5'- CATAGGggcTTTGATTGGAGTGGAAGAAGGCT -3'），其中小写字母表示待突变基因位点，以上面①中获得的突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A）为模板进行PCR扩增，获得携带新突变位点基因的线性质粒，使用同源重组克隆试剂盒将线性质粒两端连接，然后转入BL21宿主菌；
挑取阳性克隆PCR鉴定正确后对突变型PlpE表达质粒测序，鉴定定点突变成功，获得新突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A）；
③ 设计引物81N-F（5'- gcaAGTCAACAATCCTCCTTTCAAGCCCCTCT -3'）和81N-R（5'- GAGGATTGTTGACTtgcTTCTTTGGATGTGTCATGAGAAGAC -3'），其中小写字母表示待突变基因位点，以上面②中获得的突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A）为模板进行PCR扩增，获得携带新突变位点基因的线性质粒；
使用同源重组克隆试剂盒将线性质粒两端连接，然后转入BL21宿主菌，挑取阳性克隆PCR鉴定正确后对突变型PlpE表达质粒测序，确定定点突变成功后获得新突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A，N81A）；
④ 设计引物103L-F（5'- AATCgatCTTGGACAGGTTATCATGTTTCAGA -3'）和103L-R（5'-CCTGTCCAAGatcGATTTTCTTGTGCAGGTTGGTTT -3'），其中小写字母表示待突变基因位点，以上面③中获得的突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A，N81A）为模板进行PCR扩增，获得携带新突变位点基因的线性质粒；
使用同源重组克隆试剂盒将线性质粒两端连接，然后转入BL21宿主菌；
挑取阳性克隆PCR鉴定正确后对新突变型PlpE表达质粒测序，进一步确认定点突变已经成功后获得新的突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A，N81A，L103A）；
⑤ 设计引物126T-F（5'- TgcgGTATTCACTTTCGTAAAATATAATTCTCAATAT -3'）和126T-R（5'- CGAAAGTGAATACcgcAACATTATCTTTATCTACATTATTACTCGCA -3'），其中小写字母表示待突变基因位点，以上面④中获得的突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A，N81A，L103A）为模板进行PCR扩增，获得携带新突变位点基因的线性pET28a（+）-PlpE质粒；
使用同源重组克隆试剂盒将线性质粒两端连接，然后转入BL21宿主菌；
挑取阳性克隆PCR鉴定正确后对突变PlpE表达质粒测序，进一步确认定点突变已经成功后获得新突变型PlpE表达质粒pET28a（+）-PlpE（D33A，H55A，N81A，L103A，T126A），即获得表达基因序列为SEQ ID NO:2的表达质粒和工程菌，所表达的重组PlpE的免疫显性基团氨基酸残基被突变成丙氨酸残基。
6.权利要求1所述重组蛋白在制备动物巴氏杆菌病疫苗方面的应用。
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