CN112375127B - 一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白及其应用 - Google Patents

一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属免疫生物学领域,提供了一种截短表达的支气管败血波氏菌BcfA重组蛋白及其制备方法和应用,通过截短表达提高BcfA重组蛋白的表达量和可溶性。对BcfAN端373位氨基酸残基之后的序列进行了克隆和表达，截短后的BcfA的表达量提高了10倍，且主要为可溶性表达。Western blot结果显示，截短表达后的BcfA依然与支气管败血波氏菌感染康复血清反应明显。免疫保护力实验表明BcfA的截短表达重组蛋白依然对支气管波氏败血波氏菌表现出良好的免疫保护作用。通过截短表达提高了BcfA重组蛋白的表达量和可溶性，为后期研制以BcfA重组蛋白抗原为基础的基因工程疫苗奠定了基础。

Description

一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白及其应用
技术领域
本发明属免疫生物学领域，具体涉及一种截短表达的支气管败血波氏菌BcfA重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
支气管败血波氏菌（Bordetella bronchiseptica）是一种能感染多种哺乳动物、引起动物发生鼻炎和肺炎的革兰氏阴性细小杆菌。此菌以犬、猪及兔的感染最为普遍，常导致犬传染性支气管炎、猪传染性萎缩性鼻炎和兔支气管败血波氏菌病。此外，支气管败血波氏菌和其他病原体之间存在协同作用，从而增加其他原发性和继发性病原体引起的呼吸道疾病的严重程度，对养殖业造成较大经济损失。此外，也有报道支气管败血波氏菌感染人的报道。
目前已经研制或有报道的支气管败血波氏菌病疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗三种。与灭活疫苗和减毒活疫苗相比，亚单位疫苗具有安全、稳定和可以借助基因工程手段大量生产的优点，正成为兽用疫苗研究的重要方向。支气管败血波氏菌的波氏菌克隆因子A（Bordetella colonization factor A， BcfA）蛋白是一种和细菌定殖有关的外膜蛋白，具有良好的免疫保护力，是支气管败血波氏菌亚单位疫苗研制的重要候选抗原。但是BcfA重组蛋白的表达量不高，而且主要以包涵体形式表达，这就不利于其临床应用。本研究的目的是通过对BcfA进行截短表达，从而获得一种表达量高、可溶性好、且较好地保留了原BcfA全长蛋白免疫活性的重组蛋白。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：通过对BcfA进行截短表达，从而获得一种表达量高、可溶性好、且较好地保留了原BcfA全长蛋白免疫活性的重组蛋白，从而应用于支气管败血波氏菌病疫苗的制备。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种用作一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白，所述重组蛋白其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
其中，编码所述一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
优选的，所述重组蛋白可以添加His、GST标签，便于纯化和鉴定。
所述用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白的制备方法，其步骤如下所示:
(1)通过PCR扩增BcfA的第373位到第968位氨基酸所对应的DNA序列；
(2)将步骤(1)得到PCR产物连接到骨架质粒上，得到表达载体；
(3)将步骤(2)得到的表达载体转化到宿主菌中诱导表达后，经提取纯化即得到重组蛋白。
优选的，所述步骤（1）中PCR扩增所采用的引物序列为：373T-F：cagcaaatgggtcgcggatccACGATCGCGCGCGTCGATAC和373T-R：gcaagcttgtcgacggagctcGTGAAGCAAGCCATCCACG，用于扩增截短的BcfA。
优选的，所述步骤（2）和（3）是通过包括下述步骤的方法实现的：将BcfA的PCR扩增片段整合到骨架质粒PET28a（+）上获得表达载体，然后将整合成功的表达载体转入BL21宿主菌获得重组菌，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组菌，表达后用超声波破碎仪器进行破碎后，使用Ni磁珠纯化BcfA重组蛋白。
所述重组蛋白在制备支气管败血波氏菌病疫苗方面的应用。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，尽管目前现有技术采用BcfA、PRN、FHA、DNT等保护性抗原，但这些保护性抗原主要表达形式都是包涵体，需要溶解复性后才能起到保护性抗原的作用，而且有的重组蛋白的本身表达量不高。这就增加了生产工艺和成本，限制了他们的应用。故本研究在分析BcfA各个氨基酸残基构成B细胞表位能力的基础上对BcfA进行了截短表达，意外地提升了BcfA的表达量和可溶性。实验结果表明截短后的BcfA的表达量提升了10倍以上并且以可溶性表达为主。截短后的BcfA重组蛋白依然与支气管败血波氏菌感染康复血清反应明显，较好地保留了原蛋白的免疫原性。免疫保护力实验表明截短后的BcfA具有和全长蛋白相似的免疫保护力。
总之，本发明通过截短表达提高了BcfA重组蛋白的表达量和可溶性程度，为后期研制以BcfA重组蛋白抗原为基础的基因工程疫苗提供了基础。
附图说明
图1为BcfA的氨基酸残基构成B细胞表位能力预测结果；(使用在线软件Bepipred-2.0（http://tools.immuneepitope.org/bcell/），预测分值高于0.5构成B细胞表位的几率较大)；
图2为BcfA重组蛋白的表达情况，其中Marker，分子大小标识；1，含空体的BL21菌体粗蛋白； 2，BcfA全长蛋白（BcfAqc）重组菌经过夜诱导后的上清菌体蛋白；3，BcfAqc的包涵体蛋白（约103 kDa）；4，BcfA截短表达蛋白（BcfA-373T）重组菌经过夜诱导后的上清菌体蛋白（约67 kDa）；5，BcfA-373T的包涵体蛋白；6，纯化前的BcfA-373T重组菌上清菌体蛋白；7，纯化了的的BcfA-373T重组蛋白；8，经过Ni磁珠吸附处理后的BcfA-373T重组菌上清菌体蛋白；9，孵育支气管败血波氏菌感染康复血清的Western blot实验中BcfA-373T泳道出现符合预期大小的条带（67 kDa）。
图3为免疫后小鼠体内BcfA特异性抗体产生情况（A）和攻毒后小鼠的肺脏载菌量（B）
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：通过截短表达的方法制备BcfA重组蛋白
(1)质粒、菌种及培养 pET28a（+）表达载体、BL21 (DE3)宿主菌、支气管败血波氏菌BJL0504（分离于患鼻炎的家兔）为本试验室保存。胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）（添加10%小牛血清），胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）（添加4%小牛血清，0.2%羊血）购自海博生物（青岛）用于波氏菌培养。大肠杆菌使用LB（青岛海博生物）液体或固体培养基培养。
蛋白质氨基酸序列分析 以Genbank公布的支气管败血波氏菌NCTC8344 株的全基因组序列中的BcfA基因序列为参考序列进行分析。使用Bepipred-2.0（http://tools.immuneepitope.org/bcell/）确定BcfA的B细胞表位分布情况。使用Clustal Omega（http://www.clustal.org/omega/）进行多序列比对，比较本实验所用的BcfA序列和NCTC8344 株参考序列之间的相似性。
上述BcfA的信号肽与B细胞表位预测结果如下所示: BcfA一级结构共包含969个氨基酸残基。选择Bepipred-2.0软件默认的0.5作为氨基酸残基构成表位的阈值，预测结果表明BcfA的表位主要分布于C端，特别是后600个氨基酸残基序列（如图1所示）。因此本发明选择了重组表达373T以后的BcfA（称为BcfA-373T）。连接产物测序和多序列比对结果表明本研究所克隆的BJL0504株BcfA基因序列与参考菌株NCTC8344的BcfA基因序列完全相同。即本发明所述用作支气管败血波氏菌病疫苗的BcfA截短重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ IDNO :1。
(3) BcfA基因的克隆以支气管败血波氏菌NCTC8344 株的BcfA基因序列为参考序列，设计引物373T-F（cagcaaatgggtcgcggatccACGATCGCGCGCGTCGATAC，小写字母为与载体相同的同源臂，下同）和373T-R（gcaagcttgtcgacggagctcGTGAAGCAAGCCATCCACG）扩增截短的BcfA（BcfA-373T）。设计引物qc-F（cagcaaatgggtcgcggatccCCCAGCAGGCCGCCCTC）和qc-R（gcaagcttgtcgacggagctcTCCCAGCAGGCCGCCCTC）扩增全长BcfA (BcfAqc)。按照文献“兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌复合PCR方法的建立及临床应”中所述方法提取支气管败血波氏菌BJL0504菌株基因组并进行PCR扩增。酶切质粒并通过同源重组克隆试剂盒（诺唯赞，南京）将BcfA的PCR扩增片段整合到PET28a（+）上，然后将阳性重组质粒转入BL21宿主菌。挑取阳性克隆PCR鉴定正确后送北京擎科新业有限公司南京分部测序，鉴定所克隆基因是否完整及是否正确连接到载体上，测序结果显示，本发明所述编码截短表达的支气管败血波氏菌BcfA重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
(4)诱导表达与鉴定对BcfA重组大肠杆菌进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并优化诱导条件，包括比较37℃、28℃、16℃的表达效果，比较0.2 mM、0.4 mM、0.6mM、0.8 mM、1 mM等终浓度下IPTG的诱导效果。重组菌诱导表达后用超声波破碎仪器进行破碎，并离心分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE跑胶，并进行考马斯亮蓝染色，检测表达效果。使用Ni磁珠（金斯瑞，南京）纯化BcfA重组蛋白。通过Bradford法测定纯化后的蛋白浓度进而估测重组蛋白表达量。
(5)BcfA重组蛋白与支气管败血波氏菌感染康复血清的反应将BcfA重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转到NC膜上。经过5%的脱脂乳封闭后，加入本实验室保存的1/500稀释的BJL0504株的兔感染康复血清，37℃孵育1 h；PBST漂洗5遍，加入1/10000稀释的HRP偶联的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h； PBST漂洗5遍，进行ECL显色。
上述BcfA的截短表达效果如下所示:将重组质粒转入BL21工程菌后，通过优化诱导条件，选用37℃、0.5mM IPTG诱导表达，获得较多的重组蛋白。截短表达后BcfA的表达量显著增加，而且主要为可溶性表达，易于进行纯化（图2A、2B）。BcfA全长重组蛋白（BcfAqc）的表达量约为0.03mg/ml，而BcfA截短表达的重组蛋白（BcfA-373T）的表达量约为0.3mg/ml，即截短表达后BcfA的表达量提高了10倍左右。Western blot结果显示，BcfA-373T泳道存在一条67KDa左右的条带（图2C），这就表明BcfA截短表达的蛋白能够与支气管败血波氏菌感染康复血清反应，即截短表达后依然保留着BcfA的反应原性。
实施例2：免疫后血清抗体水平检测与免疫保护力实验
(1)小鼠免疫与血清抗体检测取30 只 4-6 周龄 C57BL/6雌鼠，随机分成3组，1组对照，2组实验，每组 10 只。实验组分别免疫BcfA截短重组蛋白（BcfA-373T）和BcfA全长重组蛋白（BcfAqc）。实验组：100μg/μl纯化的重组蛋白用等体积的弗氏完全佐剂（Sigma）乳化后，腹腔注射免疫小鼠。21天后加强免疫，佐剂换成弗氏不完全佐剂，其他与初免相同。阴性对照组：PBS代替重组蛋白，使用的佐剂与实验组的佐剂相同。所有小鼠第二次免疫 10 天后尾静脉取血获得血清，测定抗体产生情况。
以纯化的BcfA重组蛋白包被ELISA板（1μg/孔），37℃孵育2 h。以PBST洗涤3次以后，使用5%的脱脂乳于37℃下封闭1 h。接下来孵育1/200稀释的多克隆血清，37℃下1h。以PBST洗涤3遍以后，孵育偶联HRP的羊抗鼠二抗，37℃下孵育30 min。经过5遍洗涤以后加入100μl的TMB单组分显色液（湖州英创），反应10 min后加入50μl终止液（2M硫酸）。最后在酶标仪上读取450nm的吸光度。ELISA检测结果显示加强免疫10天后BcfAqc免疫组和BcfA-373T免疫组均产生了显著高水平的特异性抗体（如图3A所示）。
(2)攻毒试验ELISA检测确认特异性抗体产生后进行攻毒试验。参照文献”Bordetella Colonization Factor A (BcfA) Elicits Protective Immunity againstBordetella bronchiseptica in the Absence of an Additional Adjuvant”中的做法开展实验。取处于对数生长末期的支气管败血波氏菌菌液按照1.5×107 CFU（35 μL）/只的剂量对小鼠滴鼻攻毒。攻毒7天后的小鼠脱颈椎处死，无菌解剖取出肺脏。使用组织研磨仪充分研磨肺脏组织后，对样品进行连续稀释计数，计算每只小鼠的肺脏组织载菌量。通过菌落形态学观察和PCR鉴定进一步确定肺脏内的细菌是支气管败血波氏菌。攻毒后的检测结果表明BcfA-373T免疫组和BcfAqc免疫组小鼠肺脏内的支气管败血波氏菌数量都仅平均为约10CFU/只，二者差异不显著，均显著远低于对照组小鼠肺脏内的支气管败血波氏菌数量（平均约105CFU/只）（图3B）。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 596
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Ile Ala Arg Val Asp Thr Asp Pro Ala Thr Gly Arg Ile Thr Val
1 5 10 15
Thr Gly Val Thr Glu Pro Gly Ala Gln Val Ser Leu Gly Leu Pro Asn
20 25 30
Gly Glu Val Val Val Ala Gln Ala Asp Gly Ser Gly Thr Tyr Arg Ala
35 40 45
Thr Ser Ala Arg Asp Met Val Gly Gly Pro Val Arg Ala Arg Ala Thr
50 55 60
Asn Arg His Gly Asp Arg Ser Arg Glu Val Thr His His Tyr Val Asp
65 70 75 80
Val Ala Val Lys Gly Glu Val Pro Leu Thr Leu Gly Ala Val Arg Thr
85 90 95
His Pro Gly Thr Gly Val Val Thr Val Thr Gly Lys Thr Gly Pro Gly
100 105 110
Ala Lys Val Arg Ile Asp Phe Pro Asp Gly Thr Phe Gly Asp Val Val
115 120 125
Ala Gly Asn Gly Gly Asp Phe Thr Val Ala Ser Lys Gly Asp Val Thr
130 135 140
Ala Ser Gly Pro Ile Val Ala Ile Ala Arg Asp Asp Asp Gly Arg Glu
145 150 155 160
Ser Pro Arg Arg Thr Val Gln Tyr Asp Asp Arg Val Asn Gly Gly Gly
165 170 175
Ser Gly Ala Pro Thr Val Val Leu His Thr Asp Gly Thr Asn Gly Arg
180 185 190
Val Thr Val Ser Gly Lys Gly Arg Pro Gly Asp Thr Ile Arg Val Asp
195 200 205
Phe Pro Asp Gly Thr Thr Lys Glu Val Val Ala Gly Pro Asp Gly Thr
210 215 220
Tyr Arg Val Thr Ser Asp Arg Asp Met Thr Ala Gly Asp Ile Thr Val
225 230 235 240
Ser Gly Thr Asp Ala Lys Gly Asn Val Gly Gly Pro Val Lys Arg Pro
245 250 255
Tyr His Asp Ile Phe Val Pro Val Pro Pro Thr Val Glu Val Ala Thr
260 265 270
Asp Ser Ser Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Gly Lys Ala Thr Pro Arg
275 280 285
Ala Lys Val Lys Val Asp Phe Pro Gly Gly Thr Ser Lys Thr Val Thr
290 295 300
Ala Asp Ala Asp Gly Arg Tyr Arg Ala Thr Ser Asp Gly Asp Val Pro
305 310 315 320
Gly Gly Asp Ile Val Val Thr Gln Thr Gly Met Pro Gly Ala Ala Gly
325 330 335
Lys Pro Val Arg Arg Pro Tyr Val Asp Thr Val Ala Pro Thr Pro Met
340 345 350
Lys Val Thr Ile Asp Ser Met Arg Thr Asp Gly Asn Ser Gly Val Val
355 360 365
Thr Val Thr Gly Tyr Thr Val Gly Gly Ser Thr Val Thr Val Thr Phe
370 375 380
Pro Asp Gly Thr Thr Ala Gly Thr Thr Ala Asn Asp Arg Gly Lys Tyr
385 390 395 400
Thr Val Thr Ser Thr Ala Asp Ile Pro Ala Gly Pro Ile Arg Val Ser
405 410 415
Ala Arg Gly Pro Arg Asn Gln Gln Gly Ser Ala Thr Asp His Tyr Leu
420 425 430
Asp Ala Trp Thr Lys Gln Thr Leu Leu Gly Gly Lys Ile Arg Leu Leu
435 440 445
Arg Pro Val Ala Arg Leu Leu Leu Ser Pro Gly Ser Met Thr Tyr Thr
450 455 460
Glu Ile Ala Lys Ser Phe Asp Gly Ser Ser Leu Gly Gly Ile Val Ala
465 470 475 480
Arg Phe Glu Pro Ala Asn Gly Ala Pro Pro Gln Thr Ala Ala Leu Leu
485 490 495
Ala Ala Ile Lys Leu His Asp Pro Asn Tyr Arg Leu Glu Ser Asp Lys
500 505 510
Met Phe Ile Tyr Leu Asp Thr Met Asn Ser Asp Pro Tyr Asn Arg Val
515 520 525
Pro Asn Gly Asp Tyr Pro Val Thr Leu Val Leu Glu Asp Lys Ala Thr
530 535 540
Gly Ala Arg Glu Ala Thr Thr Met Val Leu Lys Val Thr Gly Ser Thr
545 550 555 560
Tyr Gly Lys Ala Pro Val Val Pro Gly Ala Asn Gly Val Leu Gly Thr
565 570 575
Gly Pro Gly Pro Ser Leu Gly Gly Ser Leu Leu Ile Gly Gly Glu Gly
580 585 590
Gly Leu Leu Gly
595
<210> 2
<211> 1788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgatcgcgc gcgtcgatac cgatccggca accgggcgga tcacggtaac cggcgtcacc 60
gagccggggg cgcaggtcag cctggggctg cccaatggcg aagtcgtggt cgcgcaggcc 120
gatggcagcg gaacctaccg agcgacgtcg gcgcgcgaca tggtgggcgg tccggtgcgg 180
gctcgcgcaa cgaaccgtca tggcgaccgt agccgggaag tcacgcacca ttacgtggat 240
gtcgcggtca agggcgaggt accgctgacg ctcggtgctg tgcgcacgca tcctggcacc 300
ggcgtcgtga ccgtgaccgg caagaccggg cctggcgcca aggtgcgcat cgattttccc 360
gacggtacgt tcggtgatgt ggtcgccggc aatgggggcg atttcacggt cgcctcgaaa 420
ggcgatgtga cggccagcgg cccgatcgtg gcgattgccc gcgatgacga cgggcgggaa 480
agcccccgcc gtactgtcca gtacgacgac agggtcaatg gcggtggctc gggcgcgccg 540
acggtggtgc tgcataccga cggcaccaac ggtcgcgtga cggtcagcgg caaaggacgg 600
cccggcgata cgatcagggt ggacttcccc gacggcacca ccaaggaggt ggtggcgggc 660
ccggacggta cctaccgcgt cacgtccgac cgcgacatga cggcgggcga cataacggtg 720
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gggggcgaca tcgtcgtcac gcagaccggg atgccgggcg ctgcgggcaa gccggtgcgt 1020
cgaccgtatg tcgatacggt ggcgccgacg ccgatgaaag tgaccatcga cagcatgcgc 1080
acggacggca acagcggcgt cgtgacggtg acgggctaca cggtcggcgg ctccacggtg 1140
acggtgacct tccccgacgg cacgaccgcc ggtaccaccg ccaatgaccg aggcaaatac 1200
acggtaacgt cgaccgccga cattcctgcc ggtccgatcc gcgtcagcgc gcgcggaccg 1260
cgcaaccagc agggcagcgc gacggaccat tacctcgatg cgtggaccaa gcagacgctg 1320
ctgggcggca agattcgcct tctccggccg gtcgcgaggc tgttgctgag cccgggcagc 1380
atgacatata ccgaaatcgc caagtcgttc gatggcagtt cgctcggcgg catcgtggca 1440
cggttcgagc cggcaaacgg agcaccgccg cagacggcgg cgctgctggc ggcgatcaag 1500
ctgcacgatc caaattatcg gctggagtcc gacaagatgt tcatctatct cgacaccatg 1560
aacagcgacc cgtacaaccg tgttcccaac ggcgattatc ccgtcacgct ggttctcgag 1620
gacaaggcca ccggggcgcg ggaggcgacc accatggtcc tgaaggtgac cggcagtacc 1680
tatggcaaag ccccggtcgt ccccggcgcg aatggtgtgc ttggcacggg gcccggcccg 1740
tcgttgggcg gcagtctgct gatcggtggc gagggcggcc tgctggga 1788

Claims (7)

1.一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白，其特征在于，编码所述一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.根据权利要求1所述一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白添加了His、GST标签，便于纯化和鉴定。
4.一种如权利要求1所述用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白的制备方法，其步骤如下所示:
(1)通过PCR扩增BJL0504株BcfA的第373位到第968位氨基酸所对应的DNA序列；其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
(2)将步骤(1)得到PCR产物连接到骨架质粒上，得到表达载体；
(3)将步骤(2)得到的表达载体转化到宿主菌中诱导表达后，经提取纯化即得到重组蛋白。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中PCR扩增所采用的引物序列为：上游引物373T-F：cagcaaatgggtcgcggatccACGATCGCGCGCGTCGATAC和下游引物373T-R：gcaagcttgtcgacggagctcGTGAAGCAAGCCATCCACG，用于扩增截短的BcfA。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤（2）和（3）是通过包括下述步骤的方法实现的：将BcfA的PCR扩增片段整合到骨架质粒PET28a（+）上获得表达载体，然后将整合成功的表达载体转入BL21宿主菌获得重组菌，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组菌，表达后用超声波破碎仪器进行破碎后，使用Ni磁珠纯化BcfA重组蛋白。
7.根据权利要求1所述重组蛋白在制备支气管败血波氏菌病疫苗方面的应用。
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