JPS59502131A - 組換えｄｎａ誘導型梅毒トレポネ−マ抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＤＮＡ誘導型梅毒トレポネーマ抗関連出願 本出願は、１９８２年１１月１２日出願の米国特許出願番号第０６／４４１，３ ９１号の一部改良に係るものであり１本明細書によって請求される共通の主題に ついて、優先権主張するものである。

発明の背景 本発明は、概して云えば、梅毒トレポネーマに対応してつくられた抗体と反応し うる抗原を産生ずることに関する。

特に、本発明は、遺伝子工学的に処理された微生物によって、前記抗原をつくる ことに係るものである。

梅毒トレポネーマは、よく知られた梅毒作因である。梅毒は、ペニシリンによっ て、早期に有効治療がなしうるにも拘わらず、世界的に深刻な罹病率を示し続け ている。

梅毒トレポネーマに関する研究は、微生物、人工培養基の中、もしくはそれによ って培養することが難しいため、非常に限られてきた。

この微生物は、兎の來丸で増殖はされるが、運動性の激しい形での大量の梅毒ト レポネーマの精製は、今もって確立されていない。従って、精製されたトレポネ ーマ抗原は、梅毒の生物学、発病学、血清診断法、および免疫の分野での実験研 究用として、簡単に入手できないのが実情である。

梅毒の罹病率が高い大きな理由は、梅毒を検出するための適切な血清診断試験法 でないことである。現行の血清診断試験法は、梅毒トレポネーマの感染に呼応し 、宿主によって発現される抗体を検出するようになっている。

この試験法には、２つの種類がある。その一つは、非トレポネーマ、即ちスクリ ーニング試験法であり、もう−っは、確証的トレポネーマ試験法である。

梅毒に対する現行のスクリーニング試験法、及び確証試験法は、いくつかの理由 で欠点がある。

例えば、ベネリール・ディシーズ・リサーチ・ラボラトリ−（Ｖｅｎｅｒｅａｌ 　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、以下ＶＤＲＬと略 す）式試験法は、梅毒に対するスクリーニング試験法として、よく使われている 。

ＶＤＲＬ式試験法は、２乃至１０％の割合で、プラスの方に誤った値が出る。こ のプラス誤差のほかに、ＶＤＲＬ式試験法は、早発性梅毒に対しては、約３０％ の誤判断をくだす。この試験法は、晩発性梅毒になると、１／３近いマイナス誤 差が出る。梅毒の発見が遅れると、生命体に危険を及ぼしかねないので、このこ とは、特に重要である。

ＶＤＲＬ式試験法のようなスクリーニング試験法によると、高い率のプラス誤差 が生ずるため、ＶＤＲＬ式によって、プラスに出た結果を確認する目的で、費用 の掛かる確証試験を行なう必要がある。

梅毒蛍光抗体吸着（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｌ　Ａｎｔｉ −ｂｏｄｙＡｄｓｏｒｐｔｉｏｎ、以下ＦＴＡ−ＡＤＳと略す）式試験法が、確 証試験として、広く用いられている。ＰＴＡ−ＡＤＳ式試験法は、費用の面から 、Ｖ　Ｄ　ＲＬ式試験法で、一部プラスに出たものに限り、確認のため使用され る。

仮りに、ＰＴＡ−ＡＤＳ式試験法が安く上がったとしても、まだ４％近いプラス 誤差を与えるので、スクリーニング試験として、的確なものであるとは云えない 。また、ＦＴＡ、−ＡＤＳ式試験法の解釈には、主観が入り、しかも、「ボーダ ーライン」とか「１＋」と云った用語で表現するため、結果が複雑になる。

ハンフ（Ｈａｎｆｆ）等〔ハンフ、ピー−エイ（Ｈａｎｆｆ、　Ｐ、Ａ、）−テ ィー・イー・フエーニガー（Ｔ、　Ｅ、　Ｆｅｎｎｉｇｅｒ）、ジェイ・エヌ・ ミラー（Ｊ、Ｎ０Ｍ１ｌｌｅｒ）、およびエム・エイ・ロベット（Ｍ、　Ａ、　 Ｌｏｖｅｔｔ）が、［人の梅毒における梅毒トレポネーマ・ポリペプチドに対す る液素性免疫反応（Ｈｕｍｏｒａｌ　ＩｍｍｕｎｅＲｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　Ｈ ｕｍａｎ　５ｙｐｈｉｌｉｓ　ｔｏ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｆＴｒｅｐ ｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ）、　１９８２年、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｖｏ ｌ、　１２９．　Ｎｏ。

３〕が発表しているように、感染した宿主における梅毒トレポネーマ抗体の存在 を決定するのに特に用いられる方法は、抗体と反応し、しかも、宿主における抗 体の存在を同定するべく使用される、梅毒トレポネーマから得られたトレポネー マ抗原を調製することを目的としている。この文献の内容は、不明ａ書の参考資 料となるものである。

現在、このようなトレポネーマ抗原を産生しうる方法は、既に述べた如く、兎の 來丸で、梅毒トレポネーマを増殖し、それに引き続いて、抗原の精製を行なうも のに限られている。

前述したことから明らかなように、兎の來丸での抗原育生に依存せず、大量の精 製されたトレポネーマ抗原を産生しうる新規な方法の提供が強く望まれるところ である。

このような抗原は、梅毒トレポネーマの生物学的発病学、及び免疫性の実験的研 究において使用できる。更に、トレポネーマ抗原は、特に梅毒の血清診断法に使 用でき、しかも、梅毒に対するワクチンの構築に可能性をはらんでいる。

発明の要約 本発明によれば、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原を、組換えＤ ＮＡ法によってつくることが可能となる。組換えＤＮＡ法を用いることによって 、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる大量の精製された抗原がつくられ ると、梅毒の血清診断法や、梅毒トレポネーマの生物学への実験的研究に使用で き、また、個体に、梅毒トレポネーマに対する免疫を付与しうるワクチンとして も使用できる。

組換えＤＮＡ法により、梅毒トレポネーマ反応性抗原を産生できると、兎の來丸 より育生・分離される梅毒トレポネーマから得られた抗原を精製するための、従 来の面倒な方法を改良することが可能となる。

大雑把に云って、本発明は、梅毒トレポネーマＤＮＡのクローニング断片を、適 当なベクターに入れ、かつ、クローン・ベクターを適当な宿主で増殖していく。

スクリーニング試験法は、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原を暗 号化しているこれらのクローンを同定するべく行なわれる。所望の抗原を暗号化 しているクローンを取り出し、更に、従来の方法によって増殖する。

本発明では、特に、ランダムに切断された梅毒トレポネーマＤＮＡ断片を、バク テリオファージ・ベクターであるＣｈａｒｏｎ　３０の適当に切断されたＤＮＡ と結合し、かつ、バクテリオファージ・クローンを形成するべく、発育可能なＣ ｈａｒｏｎ　３０粒子の中ヘパッケージすることを特徴としている。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃａｌコ）を感染させるべく使用すると、こ れらのクローンは、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原を含んでい るプラグを産生ずる。

反応性プラグは、梅毒トレポネーマに対する抗体を含んでいることが解かってい る血清によるスクリーニングによって同定される。

所望の反応性抗原を暗号化しているバクテリオファージ・クローンを、反応性プ ラグから精製し、かつ同定した。Ｔρ３Ａとして同定されたバクテリオファージ ・クローンは、ポリペプチド抗原を暗号化している代表的なバクテリオファージ ・クローンであることが分かった。ポリペブチ１へ抗原を暗号化しているクロー ンを産生でき、かつ、異常なポリペプチド抗原を暗号化していたクローンも産生 されていた。

この異常なポリペプチド抗原は、炭水化物と極めて共通した性質を示し、また、 梅毒トレポネーマに対する抗体を有する梅毒血清と特定的に反応する。これらの 異常抗原を暗号化しているクローンのうち、好適なバクテリオファージ・クロー ンを分離し、精製し、Ｔｐ４Ｄとして確認した。

バクテリオファージ・クローンは、市販の培地では、維持することも、増殖する ことも難しいので、　Ｔｐ３ＡバクテリオファージおよびＴＩ）４Ｄバクテリオ フアージを、プラスミドの中へサブクローンし、かつ、従来の方法で大腸菌に組 ３０５として同定され、Ｔｐ４Ｄからサブクローンされたプラスミドについては 、ＰＡＷ３２９として同定された。ｐＡＷ３０５およびｐＡＩｉ１３２９双方の プラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー９コレクシヨン（Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ）によって保管され 、それぞ九、ＡＴＣＣＮｏ、　３９２３７およびＡＴＣＣＮｏ、　３９２３８の 番号が付されている。

組換えプラスミドによって、本発明による梅毒トレポネーマに対する抗体と反応 しうる抗原を産生ずるための、便利で選択的な方法が可能である。

本発明による梅毒トレポネーマＤＮＡ誘導型抗原は、′梅毒の血清診断法におい て、幅広い用途を備えている。トレ７？！５ＢｒＪＨ９−５０ＺＬ３１　（５） ポネーマ抗原は、抗原によるビーズ外皮を含むいろいろな形状で使用でき、かつ 、凝集反応、ラジオイムノアッセイ。

および酵素連鎖式免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ　ｌｉｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓ ｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ、以下、Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａと略す）による測定が行 なわれる。

本発明に従って、単独か、若しくは組合わせて誘導されるトレポネーマ抗原の幾 つかを用いると、ＩｇＭ若しくはＩｇＧ梅毒抗体に関して、最も感度のよい血清 診断法が可能となる。

更に、本発明により誘導されるトレポネーマ抗原は、個体に梅毒トレポレーマ感 染に対する免疫を付与しうるワクチンとして使用できる。

トレポネーマ抗原は、個体に梅毒に対する皮下免疫を与えるべく、単独か、若し くはフロイント（Ｆｒｅｕｎｄｉ）の完全アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）と 組合わせて使用できる。

本発明について、これまで述べてきた特徴、およびその他の特徴、並びに利点は 、以下の詳細な説明によって、一層よく理解でき明白になるであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、好適なＣｈａｒｏｎ　３０クローン（Ｔｐ４Ｄ）、およびそのサブク ローンＰ、ＡＷ３２９のＤＮＡマツプを示す。いずれも、炭水化物に共通した性 質を示す異常蛋白質抗原を暗号化している。

第２図は、蛋白質抗原を暗号化している、好適な３つのＣｈａｒｏｎ　３０クロ ーン（Ｔｐ３Ａ、　ＴｐｌＣおよびＴｐ２Ｄ）のＤＮＡマツプを示す。

本発明の詳細な明 本発明は、基本的に、クローンをつくるため、梅毒トレポネーマＤＮＡの断片を 、適当なベクターに挿入するという従来の組換えＤＮＡ技術を用いている。

このクローンは、適当な宿主の中で増殖される。トレポネーマ抗原を暗号化して いるクローンは、梅毒トレポネーマに対する抗体を含む血清によるスクリーニン グによって同定される。トレポネーマ抗原を産生ずるものとして同定されたクロ ーンは１分離され１次に、トレポネーマ抗原を産生ずるため増殖される。

このトレポネーマ抗原は、分子量をもとに精製され、しかも梅毒トレポネーマと の反応、及びそれに対する抗体の同定を行なう血清診断法、即ち実験的手法に用 いられ、かつ梅毒に対する免疫をもたらすワクチンとして使用できる。

トレポネーマ抗原を産生ずるものとして同定されたクローンから得られたＤＮＡ は、適当なプラスミド、即ちベクターの中にサブクローンされ、かつ、従来の組 替えＤＮＡ技術によって適当な宿主の中で増殖される。勿論、梅毒トレポネーマ ＤＮＡ断片は、バクテリオファージの中への初期クローニングの代わり、従来の 技術によって、プラスミド、ニスミドまたは他の適当なベクターへ直接クローン できる。

次に、プラスミド若しくは他のベクターは、クローンを暗号化しているトレポネ ーマ抗原を見つけるために行なわれるスクリーニングによって、適当な宿主の中 で育生される。「プラス」のバクテリオファージ・クローンを同定し、次に、抗 原の産生を遅らせるため、この同定されたバクテリオファージを、プラスミドの 中へサブクローニングする本発明による方法が好ましい。

梅毒トレポネーマＤＮＡは、公知技術のいずれかによって調製できる。梅毒トレ ポネーマＤＮＡは、公知の技術によって、兎の阜丸から採取し、精製したものが 好ましい。

梅毒トレポネーマＤＮＡを断片に切断するには、多くの異なる制限酵素が用いら れる。

制限酵素ニスエイニー３エイアイ（Ｓａｕ　３ＡＩ）、および同じ型の制限酵素 を用いるのが好ましい。梅毒トレポネーマＤＮＡを消化するのに用いられる制限 酵素として、Ｓａｕ　３Ａ■を使用することが、特に好ましい。

切断された梅毒トレポネーマ断片を、パッケージするのに使用される適当なベク ターには、プラスミド、ニスミド、バクテリオファージＭ１３およびバクテリオ ファージ、ラムダがある。バクテリオファージ・ラムダを使用するのが好ましい 理由は、宿主と安定的に会合して存在する必要のあるクローン抗原を排除するこ とによって、トレポネーマ抗原を産生じているクローンを同定するのに使用され る特定のｊ５法に偏りを与えないからである。

カロン（Ｃｈａｒｏｎ）３０は、本発明において使用しうる特に好適なバクテリ オファージ・ラムダである。Ｃｈａｒｏｎ　３０は、よく知られ、しかも、容易 に入手しうるバクテリオ・ファージ・ラムダである。

梅毒トレポネーマＤＮＡ断片を、Ｃｈａｒｏｎ　３０の中ヘパッケージするには 、公知の組換えＤＮＡ技術のいずれかによればよい。

Ｃｈａｒｏｎ　３０から得られるＤＮＡを、制限酵素ビーエイエム　エイチアイ （Ｂａｍ　）ＩＩ）、若しくは同じ適当な制限酵素によって切断するのがよい。

異質の中央Ｃｈａｒｏｎ　３０　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を、物理的に取り除き、続いて 、補足的Ｃｈａｒｏｎ　３０ＤＮＡ端部の梅毒トレポネーマＤＮＡ断片への結紮 を行なう。

結果として生ずる組換えＤＮＡは、好適なＣｈａｒｏｎ　３０クローンについて 、第１図および第２図で示されているように、Ｃｈａｒｏｎ　３０　Ｄ　Ｎ　Ａ の補足腕相互の間に挿入されている中央梅毒トレポネーマ断片を含んでいる。

本発明により産生されるＣｈａｒｏｎ　３０クローンは、あらゆる適当な宿主の 中で増殖される。好適な宿主は、大腸菌（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）で ある。

以上述べたようにして調製された各種のＣｈａｒｏｎ　３０クローンは、大腸菌 の内部で増殖され、かつ、その結果生ずるプラグ（Ｐｌａｑｕｅ）は、公知のプ ラス血清による所望の抗原活性を得るためにスクリーニングされる。

梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原を産生ずるものとして同定され たＣｈａｒｏｎ　３０クーロンは、血清診断法などで使用できる抗原を産生ずる べく、更に増殖される。

前述の組換えＤＮＡ手法によって誘導されたトレポネーマ抗原は、抗原によるピ ース外皮、並びに、凝集反応、標識免疫検定（ラジオイムノアッセイ）およびＥ 　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａの測定を含む各種の形式で行なわれる血清診断法に用いること ができる。しかし、これらに限定されるものではない。

いくつかのトレポネーマ抗原を、単独が或いは絹み合わせて用いると、ＩｇＭ梅 毒抗体、若しくはＩｇＧ梅毒抗体の最適な比感応血清診断法を行なうことができ る。

先に述べた組換えＤＮＡ法により誘導されたトレポネーマ抗原は、個体に、梅毒 トレポネーマ感染に対する免疫を与えるワクチンとしても使用できる。１−レボ ネーマ抗原は、単独で、或いは、個体に梅毒トレポネーマ感染に対する皮下免疫 を与えるために、フロインディ　（Ｆｒｅｕｎｄｉ）　（７）　完全アジュバン トを含む様々なアジュバント（これに限定されるものではない。）と組み合わせ て用いることができる。

以下、Ｃｈａｒｏｎ　３０クローン、Ｃｈａｒｏｎ　３０により増殖されたプラ スミド若しくはそれによりサブクローンされたプラスミド、およびそれらの抗原 産生物につき、実施例によって詳細に説明する。

梅毒トレポネーマ、即ちニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）菌株を、２０匹の兎の李丸 中で発育させ、燐酸緩衝セーラインに浸漬し、更に、ハンプ（Ｈａｎｆｆ）等が 行なった前述の方法（文献名は既出）による２つの示差遠心分歴によって、来光 からトリボネーマを、兎の組織から精製した。この梅毒トリポネーマを、ｐＨ７ ，８のトリス塩酸５ｏＩＤＭ、ＮａＣ１１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸（以 後、ＥＤＴＡと略す。）１ｍＭ。

０．２％サーコシル（Ｓａｒｃｏｓｙｌ）、および、プロティナーゼ（Ｐｒｏｔ ｅｉｎａｓｅ）　Ｋ　２００　μｇ　／　ｍ　Ｑから成る溶液０．５ｍ　Ｑの中 に懸濁し、室温で一晩ふ卵させて、高分子量のＤＮＡを得た。

溶解性トリボネーマを、緩衝液（ｐＨ７，８のトリス塩酸５０ｍＭ、　ＮａＣ１ １０ｍＭを含む）によって飽和した１ｘ、／）Ｌ／を用いて２回抽出し、更に、 エチルエーテルを用いて、２回抽出を行なった。ＣｓＣ１濃度勾配による沈降平 衡によって、ＤＮＡを精製した。カットオフ式ピペットの先端を用いて、管の頂 部から留分を集め、レーン状の０．６％アガローズ（ａｇａｒｏｓｅ）ゲルでＤ ＮＡをモニターした。

勾配の中層から採取された留分には、５０ｋｂｐ（キロベース対）より大きいＤ ＮＡが含まれていた。これらの留分をプールし、ｐＨ７，８のトリス塩酸１０ｍ Ｍ、ＮａＣ１１０ｍＭ、およびＥＤＴＡ１ｍＭ４３対して、透析を行なった。

クローニングのため、２つの３μｇの試料を、リム（Ｒｉｍｍ）等〔リム、ディ ー・エル（Ｒｉｍｍ、　Ｄ、ｌ４．）、ディー・ホーネス（Ｄ、Ｈｏｒｎｅｓｓ ）　＋ジエイ１クセラ（、Ｊ＋Ｋｕｃｅｒａ）　およびエフ・アール・ブラット ナー（Ｆ、　Ｒ，Ｂｌａｌ、ｔｎｅｒ）　。

ｒＢａｍ　ＨＩのクローニング部位による大腸菌ファージ・う１５ダｃｈａｒｏ ｎベクターの構成Ｊ　（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｊｐｈａｇｅ ｌａｍｄａ　ｃｈａｒｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｉｔｈ　Ｂａｍ　ＨＩ　ｃｌｏ ｎｉｎｇ　５ｉｔｅｓ）、１９８０年、Ｇｅｎｅ、　１２　：　ｐ　３０１−３ ０９：ｌが発表しているように、ランダムに切断された重複型断片を産生するべ く　＋　Ｓａｕ　３Ａ工〔ニュー・イングランド・バイオラプス（ＮｅｔｉＥｎ ｇｌａｎｄ１３ｉｏ１ａｂｓ）　］を用い部分消化を行なった。

０．３ユニツトのＳａｕ　３ＡＩを用いて、一方の試料をカットし、１６℃で３ ０分間かけて、０．１５ユニソ１−により、他方の試料をカットした。緩衝液を 飽和したフェノールによる抽出によって消化を止め、引き続いて、エチルエーテ ルにより２回抽出を行なった。

試料を結合し、Ｓａｕ　３ＡＩの消化により、０．７％アガローズゲルで大きさ を揃えた。消化は、４０及至２　ｋｂｐの範囲であった。エタノールによる沈殿 によってＤＮＡを濃縮した。

エフ・ブラットナ−（Ｆ、　Ｂｌａｔｔｎｅｒ）　（文献名は既出）による方法 によって得られたバクテリオファージＣｈａｒｏｎ　３０を育生し、次に、ウォ ルフィールド（Ｗａｌｆｉｅｌｄ）等〔ウォルフィールド、エイ・エム（Ｗａｌ ｆｊ、ｅ］ｄ、　Ａ、Ｍ、　）、ニー・ストープ（Ｕ、　５ｔｏｒｂ）、イー・ セルシング（Ｅ、　Ｓｅｌｓｉｎｇ）、およびエイチ・ゼントグラフ（Ｈ，Ｚｅ ｎｔｇｒａｆ）、［電子鏡検法およびクローンＤＮＡの制限マツピングによる異 なる再配列骨Ｍ腫免疫グロブリン・カッパー遺伝子の比較二″対立形質排除”に 対する意味Ｊ　（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｒｅ−ａ ｒｒａｎｇｅｄ　ｉｍ＋ｎｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｋａｐｐａ　Ｇｅｎｅｓ　 ｏｆ　ａ　Ｍｙｅｌｏｍａ　ｂｙＥｌｅｃｔｒｏｒ＋ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｙ　ａ ｎｄ　Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｃ１ｏｎｅｄＤＮＡ　 ：　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　“Ａ１１ｅｌｉｃ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏ ｎ”）　、１９８０年、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８　：　ｐ４６８ ９−４７０７３が既に発表している方法に基づき、ＤＮＡを調製した。

Ｃｈａｒｏｎ　３０　Ｄ　Ｎ　Ａを、Ｂａｍ　ＨＩ　にニュー・イングランド・ バイオラプス）によって消化し、異質な中央Ｂａｍ　ＨＩ断片を、ニューウェル （Ｎｅｗａｌｌ）等〔ニューウェル、エヌ（ＮｅｗｅｌｌｙＮ）、ジェイ・イー ・リチャーズ（Ｊ、　Ｅ、　Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、ビー・ダブリュー・タッカ− （Ｐ、ＩＪ、Ｔｕｃｋｅｒ）、および二フ・アール・グラフトナー（Ｆ、　Ｒ， Ｂｌａｔｔｎｅｒ）、「マウスの重鎖式免疫グロブリンに関するＪ遺伝子Ｊ　（ Ｊ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉ ｎｓ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ）、１９８０年、５ｃｉｅｎｃｅ。

２０９、　ｐＨ２８〜１１３２］が発表している方法に基づき、ｃｏｓ部位のア ニール処理（ｃｏｓ　５ｉｔｅ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、およびＮａＣ１濃度勾 配による沈降により、ファージＤＮＡの外側の腕から物理的に取り除いた。

２．０μｇのアニールされたＣｈａｒｏｎ　３０の外側Ｂａｍ　ＨＩ断片を、Ｄ ＮＡ濃度１００μｇ／ｍＱにおいて、１０ユニツト（二ニー・イングランド・バ イオラプス）のＴ４ＤＮＡリガーゼを有する酵素発生的補足端部によって、１． ２μｇの梅毒トリボネーマＤＮＡのＳａｕ　３ＡＩ部分消化部に結紮させ、組換 えゲノムを形成した６ キメラＤＮＡをインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）にパッケージし、エヌゼッドシ ー（Ｎ、ＺＣ）アガーの入った１５０１ｍｌペトリ皿の大腸菌に８０２で、平板 培養し、グラフトナー（Ｂｌａｔｔｎｅｒ）等〔ブラットナー、エフ・アール（ Ｂｌａｔｔｎｅｒ。

Ｆ、　Ｒ，）、エイ・イー・ブレチル（Ａ、　Ｅ、　Ｂｌｅｃｈｌ）、ケイ・デ ニストンートンプソン（Ｋ、　Ｄｅｎｎｉｓｔｏｎ　−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、エ イチ・イー・フェイバー（Ｈ，Ｅ、　Ｆａｂｅｒ）　、ジェイ・イー・リチャー ズ（Ｊ、　Ｅ、　Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、ジェイ・エル・スライトム（Ｊ。

Ｌ、　Ｓｌｉｇｈｔｏｍ）、ピー・ダブリュー・タッカ−ｃｐ、　ｗ。

Ｔｕｃｋｅｒ）、およびオー・スミシース（０，Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ）、「クロー ン他人胎児グロビン及びマウスａ−型グロビンＤＮＡ：調製及びショットガン収 集のスクリーニングＪ　（Ｃｌｏｎｉｎｇｈｕｍａｎ　ｆｅｔａｌ　ｇｌｏｂｉ ｎ　ａｎｄ　ｍｏｕｓｅ　ａ　−ｔｙｐｅ　ｇｌｏｂｉｎ　Ｄ　Ｎ　Ａ　：Ｐｒ ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｓｈｏｔｇｕｎ　ｃ ｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ＋）、１９７８年、５ｃｉｅｎｃｅ、　２０２　：　ｐ１ ２７９〜１２８４）が発表している方法に基づき、−晩ふ卵した。強度を大きく するため、頂部の柔かいアガーには、アガロースを用いた。

約１５０のプラク形成ユニットが培養された。梅毒トリポネーマ抗原を得るため 、その場所のラジオイムノアッセイによって、これらのプラクをスクリーンした 。

スクリーニングは、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）等〔エイチ・トウビン（Ｈ，Ｔｏ ｗｂｉｎ）、ティー・ステへリン（Ｔ、　５ｔａｅｈｅｌｉｎ）。

およびジェイ・ゴートン（Ｊ、　Ｇｏｒｄｏｎ）　、　１９７９年、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７６、　ｐ４３５０］ によって発表されている変法によって実施した。

ニトロセルローズ・ディスクを、ファージ・プラグの上に置き、１０乃至２０分 間、ディスクに蛋白質を吸収させた。芝の不溶解性大腸菌からは、殆んど蛋白質 が吸収されなかった。

次に、ニトロセルロース・フィルターを、ｐＨ７，５のトリス塩酸５０ｍＭ、　 ＮａＣ１１５０ｍＭ、および０．１５％アジ化ナトリウム（ＴＳＡ−５パーセン トＯＡ）の入った５％オバルブミン中に、１０分間浸漬した。

プラグ・プロットを、人の第２期梅毒血清か、ＴＳＡ−１パーセントＯＡで、１ 　：　３００に希釈された正常の人血清のいずれかの中で一晩ふ卵し、洗浄し、 １２５工がラベルされた黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ ｅｕｓ）蛋白質Ａに曝し１次に、洗浄を行なった。

前記の文献においてトウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）等が発表している方法によって、 オートラジオグラフを作成した。

第２期の梅毒血清に対し強い反応を示したＴｐ３ａプラグを選び、更に実験を行 なった。このプラグから得られたファージを希釈し、大腸菌シーエスエイチ・（ Ｃ５Ｈ）１８で、再び平板培養した。

異なる３つの第２期梅毒血清を用いてスクリーンしたところ、すべてのプラグは 放射性を示し、一方、クローニング・ベクター、即ちＣｈａｒｏｎ　３０の制御 プラクは全くと云っていい位反応を示さなかった。第２期の梅毒血清は、Ｔｐ３ ａプラクと強い反応を示したが、梅毒を持たない個体から得られた血清は、Ｔｐ ３ａプラグと何等反応を示さない。

Ｔｐ３ａのポリペプチド・トレポネーマ抗原に対し、前記文献に記載のトウビン 等による、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　−ポリアクリルアミド・ゲルを 用いた電気泳動法によって、全溶解性蛋白質のニトロセルローズ°フィルターに 対する電気泳動移動量を測定し、抗原の分子量を決定した。

Ｔｐ３ａは、それぞれ、４６，０００．４３，０００．３８，０００．２４　、 ０００．２３．０００．２０，０００、および１８，５００の分子量を有し、し かも、梅毒血清と特異的に反応する、はっきり識別しつる少なくとも７つのポリ ペプチドを暗号化していることが分かった。

これらの抗原が持つ分子量は、梅毒トレポネーマの持つ抗原蛋白質の分子量に対 応している。同じか、若しくはそれより大きい量のＣｈａｒｏｎ　３０溶解性蛋 白質は、梅毒血清と反応しない。

Ｔｐ３ａから分離されたＤＮＡの特徴は、制限エンドヌクレアーゼ分析によって 示された。バクテリオファージＴｐ３ａは、梅毒トレポネーマＤＮＡの１６ｋｂ Ｐインサートを持っている。梅毒トレポネーマ抗原の全分子量は、クローンＤＮ Ａのこの１６ｋｂｐインサートの暗号容量以内が適当である。

クローンＴｐ３ａの梅毒トレポネーマＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ・マツプ の一部を、第２図に示しである。

１６ｋｂｐインサートは、Ｘで示されているインサート−ベクター接続部におい て、Ｓａｕ　３ＡＩ部位若しくはＢａｍ　ＨＩ部位によって境界線がつれられて いる。左方の外側Ｅｃｏ　ＲＴ部位は、Ｃｈａｒｏｎ　３０の長いＢａｍ　ＨＩ 腕にのっており、がっ、右方の最外部のＢｇｌ　Ｕ部位は、Ｃｈａｒｏｎ　３０ の短かい腕にのっている。

本願の発明者が、最初に調製した梅毒トレポネーマは、兎の来光から採られたも のであることからして、兎ＤＮＡの汚染連鎖をクローンしていたということはあ り得ないものと考えられる。

しかし、　Ｔｐ３ａ　ＤＮＡのトレポネーマ・オリジンは、人の梅毒血清との、 その産生物の抗原性を基準にしてつくられた。第２期梅毒血清は、正常な兎の来 光組織、及び正常な兎の血清の蛋白斑と反応しないので、これらの血清は、トレ ポネーマ抗原の検出に対し特異的であった。更にＴｐ３ａ抗原を産生ずる２つの 付加クローンは、前述したようにして調製した５００のクローンを順次スクリー ニングする間に同定された。

従って、全部で、７５０のクローンから同一のＤＮＡ連鎖を持つ３つの分離体を 得ることができ、かつ、ＤＮＡがクローンされた微生物のゲノムの大きさは、１ ０８乃至１０ｇダルトンの原始核範囲を示している〔エル・クラーク（Ｉ、。

Ｃ１ａｒｋｅ）およびジェイ・カーボン（Ｊ、　Ｃａｒｂｏｎ）、１９７６年。

Ｃｅ１ｌ　９．　ｐ９１）。

実施例２： 梅毒トレポネーマＤＮＡ断片を、Ｃｈａｒｏｎ　３０バクテリオフアージにパッ ケージし、かつ、実施例１で説明した方法に基づき、大腸菌に８０２にて平板培 養した。

凡そ５００のプラグが得られた。結紮されたＣｈａｒｏｎ　３０の腕自体をパッ ケージすることにより形成されるプラグのバックグラウンド濃度は、事実上Ｏで あったことがら、各プラグは、梅毒トレポネーマＤＮＡのクローンを表わしてい た。

プラグから得られた蛋白質を、前と同じようにプロットして、ニトロセルローズ ・ディスクの上に移した。この操作によって、ニトロセルローズ・フィルターの 上にプラグの抗原像をつくった。

第２期梅毒から得られた抗血清と、黄色葡萄球菌から得られた１２５■がラベル された蛋白質Ａとを有する梅毒トレポネーマに対して抗原的であったプラグに関 し、フィルターをスクリーンした。

米国のファーマシア・ファイン・ケミカル（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ）社製の蛋白質Ａを、マーチャロニス、ジェイ・ジェイ（Ｍａｒｃ ｈａｌｏｎｉｓ、　Ｊ、　Ｊ、）　（マーチャロニス、ジェィ・ジェイ（Ｍａｒ ｃｈａｌｏｎｉｓ、　Ｊ、　Ｊ、）、［免疫グロブリン及びその他の蛋白質のヨ ウ素化追跡のための酵素法Ｊ　（Ａｎｅｎｚｙｍｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　 ｔｒａｃｅ　１ｏｄｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　ａ ｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、１９６９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ＋Ｊ、１ １．３　：　ｐ２９９〜３０５〕が発表している方法に基づき、ラクトペルオキ シダーゼ（ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）反応により、アメルシャム（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）社製の１２５工でラベルした。

希釈物は、反応性プラグの寒天プラグ（ａｇａｒ　ｐｌｕｇ）がらつくり、かつ 、２次スクリーニングのため、ファージを、大腸菌Ｃ３Ｈ１８（リム、ディー・ エル（Ｒｉｍｍ、　Ｄ、　Ｌ、）、ディー・ホーネス（Ｄ、　Ｈａｒｎｅｓｓ） 、ジェイ・クセラ（Ｊ。

Ｋｄｃｅｒａ）、およびエフ・アール・プラグトナー（Ｆ、　Ｒ。

Ｂｌａｔｔｎｅｒ）、　ｒＢａＩＩＩＨＩクローニング・サイトを有する］　リ ファージλＣｈａｒｏｎ仲介物の構造Ｊ　（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｊｏｎ　ｏｆｃ ｏｌｉｐｈａｇｅ　ｌａｍｂｄａ　Ｃｈａｒｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｉｔｈ　 Ｂａｍ　ＨＩ　ｃｌｏｎｉｎｇｓｊｔｅｓ）、１９８０年、Ｇｅｎｅ、　１２　 ：　ｐ３０１−３０９］で、平板培養した。

１次スクリーニングのオー１−ラジオグラムをとった。信、号に標識をつけた。

中でもより強い信号を、クローンＴｐｌＣ。

Ｔｐ３Ｃ，ＴｐｌＤ、　Ｔｐ２Ｄ、　Ｔｐ３Ｄ、　Ｔｐ４Ｄ、　Ｔｐ５Ｄ、　Ｔ ｐ６ＤおよびＴｐｌ、Ｅとして区別した。標識化信号のすべてを、はっきり識別 でき、しかもよく分離されたプラグに従って並べることができた。これらの組換 えクローンは、梅毒トレポネーマに特異的な抗原をつくっていた。

初期の結果を確かめ、かつ、クローンの純度を確実にするため、前述の同定され たプラクの２次スクリーニングを行なった。

２次スクリーニングを行なうため、組換え物を、大腸菌Ｃ３Ｈ１８の上で再平板 培養することによって、これらのクローンのそわぞれをプラグ精製した。２次ス クリーニングから得られた平板上のプラグは、どれも、梅毒血清と、１２５■て ラベルした蛋白質Ａとの反応に対して、オー１〜ラジオグラム上でプラス信号を 表示した。

２次スクリーニングに対する信号の強さは、１次スクリーニングについて観測さ れたそ九よりも概ね強かった。これは、　Ｃｈａｒｏｎ　３０誘導紺換え物が、 １次選択に対して要求された非制限に８０２菌株（ｈｓｒ−、ｈｓｍ−）のプラ クより、大腸菌Ｃ３Ｈ１８（ｈｓｒ＋、　ｈｓｍ”）の方が大きいプラクを形成 したためであった。２次スクリーニング信号の相対的強度は、最初に観測された 相対的強度の大きさに対応していた。

前述の同定された各クローンの抗原性は、特徴的である。

Ｃｈａｒｏｎ　３０プラクの対照、および実施例１で既に説明したクローンであ るＴｐ３Ａのプラクを、本実施例において調製したクローンとともに実験した。

人の梅毒血清の組換えプラクとの反応は、特異的であり、かつ大腸菌、即ちＣｈ ａｒｏｎ　３０の蛋白質に対して向けられる抗体を表わしていないことは明白で ある。

実施例２の組換え物を、前述の文献において、ウォルフイールド、エイ・エム（ Ｗａｌｆｉｅｌｄ、　Ａ、　Ｍ、）等が発表している方法に基づき、大腸菌Ｄ　 Ｐ　５０／ｓｕｐ　Ｆを用いて、肉汁中で育生した。

細胞及び残渣を遠心分離機にかげた。特に、梅毒血清と反応性しうるクローンの ポリペプチド産生物の特徴を明らかにするため、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ アクリルアミド−ゲル（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏ ｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｓ、以後、５ＤＳ−ＰＡＧＥと略す）によって 溶解したクローンのポリペプチドを、電気泳動にかけるべく、ニトロセルローズ ・シートに移し、抗原蛋白質のパン下に対するこれらの電気泳動移動量、即ちプ ロットを調べた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動によって分析するため、トウビン（Ｔｏｗｂｉ ｎ）等〔トウビン、エイチ（Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｈ，）、ティー・ステへリン（Ｔ 、　５ｔａｅｈｅｌｉｎ）　、およびジェイ・ゴートン（Ｊ、　Ｇｏｒｄｏｎ） 、［ポリアクリルアミド・ゲルがら得られた蛋白質のニトロセルロース・シート に対する電気泳動プロットと応用例Ｊ　（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｔ ｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉ ｄｅ　ｇｅｌｓ　ｔｏ　ｎ１ｔｒｏｃｅ１１．ｕｌｏｓｅｓｈｅｅｔｓ　：　Ｐ ｒｏｃｅｄｕｒｅ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　、１９７ ９年、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｊ−、ＵＳＡ、　７６　：　 ｐ４３５０〜４３５４）が発表している方法に基づき、溶解質を、２％のドデシ ル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）、５％のメルカプトエタノール、１０％ のグリセロールおよびブロモフェノールブルーを含む２容積中で、沈殿によって ２０層に濃縮し、ゲルの上に載せる前に５分間煮沸した。

２ｍｆｌに濃縮した溶解質を、２１］ｌｌ］のくぼみに詰、め、４０田０に濃縮 した溶解質を、１１８ｍｍのくぼみに入れた。真正の梅毒トレポネーマ抗原を含 んでいるレーンに、２％のＳＤＳ、５％のメルカプトエタノールおよび１０％の グリセロールを含んだ溶液中に懸濁し、かつ煮沸したｌＸ１０９の微生物を負荷 した。

米国のファーマシア・ファイン・ケミカルス（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌｓ）　＋若しくはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔ ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した分子 量マーカーを同じように処理した。前述の文献において、ハンフ（Ｈａｎｆｆ） 等が発表している方法に基づき、試料を、８乃至２０％の５ＤＳ−ＰＡＧＥの中 を通した。

１９５ｍＡで１／２時間、移動を行なわせ、引き続いて、５０ｍＡで一晩移動さ せたほかは、前述のハンフ（Ｈａｎｆｆ）等が行なった方法に基づき、電気泳動 にかけるべく、蛋白質をニトロセルローズ・シート［孔の大きさ＝０．２ミクロ ン、サートリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）　］　ヘ移した。

一つの血清で調べる際には、電気泳動プロットは、全体を残し、また、個々の血 清で調べるためには、それを、６乃至８ｍのストリップにカットした。全体のプ ロット及びストリップを、１　：　１００に希釈された血清によって調べ、人の 血清は、前述のハンフ（Ｈａｎｆｆ）・等の行なった方法に基づいて評価し、か つ取得した二兎の免疫血清は、実験的梅毒が治癒して１−年経った兎から集めた 。

血清には、ポリアクリルアミドに結合された大腸菌の超音波処理された溶解質を 、予め吸着させておいた［キャレル、ニス（ＣａｒｒｅＬ　Ｓ、）およびニス・ バランダン（Ｓ。

Ｂａｒａｎｄｕ口）、「ポリアクリルアミド・ゲルを含有する蛋白質：高容量の 免疫吸着剤としてのその用途Ｊ　（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐ ｏｌｙａｃｒｙｌａｍｊｄｅ　ｇｅｌｓ　：　Ｔｈｅｉｒ　ｕｓｅ　ａｓｉｍｍ ｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎむ　ｏｆ　ｈｊ、ｇｈ　ｃａｐａｃｉｔｙ）　＋　１９ ７１年、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ４ｓｔｒｙ、　８　：　ｐ３９　４１３）。

クローンＴｐ２Ｄおよび丁Ｐ１．Ｅのａ相溶解質に対する電気泳動プロットのオ ートラジオグラムを作成した。これらの電気泳動プロットを大腸菌溶解性蛋白質 が予め吸着されて更に、クローン溶解質の各電気泳動レーンは、梅毒トレポネー マの方へ伸び、かつ、既に述べたように、全梅毒トレポネーマの典型的な抗原パ ターンを示していた〔ハンフ。

ピー・エイ（Ｈａｎｆｆ、　Ｐ、　Ａ、）　、ティー・イー・フエーニガ−（Ｔ 、　Ｅ、　Ｆｅｈｎｉ、ｇｅｒ）　、ジエイ・エヌ・ミラー（Ｊ、　Ｎ。

Ｍｉｌｌｅｒ）　、およびエム・エイ・ロベット（Ｍ、　Ａ、　Ｌｏｖｅｔｔ） 、「梅毒トレポネーマのポリペプチドに対する人の梅毒における体液免疫応答Ｊ 　（Ｈｕｍｏｒａｌ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｓｙ ｐｈｉｌｉｓ　ｔｏ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｆ　Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　 ｐａｌｌｉｄｕｍ）、１９８２年、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｖｏｌ、１２９．　 Ｎｏ、３］。

プロットは、クローンＴＰ　２Ｄが、１６，０００乃至２０，０００ダルトンの 一群の抗原バンドをつくり、また、より高い分子量においては、約４３，０００ ダルトンの群をつくっており、しかも、ＴＰＩＥが６４，０００ダルトンと、　 ４０，０００ダルトンの９反応性の強い少なくとも２つの抗原をつくっているこ とを示していた。

異なる段階の梅毒から得られた血清スペクトルを用い、クローン溶解質を分析す ることによって、これら２つのクローンにより示される抗原について、更に詳細 な分析を行なった。

実験は並行させ、一方のストリップを未吸着の血清でふ卵し、かつ、他方のスト リップを、大腸菌の溶解性蛋白質が予め吸着された同じ血清で、ふ卵するように して行なった。

大腸菌およびバクテリオファージ・ラムダ蛋白質は、大部分が、組換えファージ 溶解質である。人の血清は、大腸菌蛋白質に対する抗体を含んでおり、しかも、 既に述べた大腸菌免疫吸着剤を用いて、吸着させることができる。

吸着処理を行なうと、大腸菌およびバクテリオファージ・ラムダ蛋白質による妨 害が少なくなって、電気泳動の結果を良くすることが分かった。

免疫兎から得られた血清、３人の第２期梅毒患者から得られた血清、並びに潜伏 初期における患者から得られた血清を用いて、ストリップを調べた。第１期患者 、潜伏後期の梅毒患者、並びに後期梅毒患者から得られた血清は、反応が弱いか 、または殆んど反応を示さなかった。

このことは、これらの段階の患者から得られる血清に関して通常見られるトレポ ネーマの低反応性と一致している。

正常な人の血清に対しては全く反応しなかった。

従って、溶解質が、アメリカ性病研究所（ＶＤＲＬ）式試験法で生物学的プラス 誤差を与えた血清と、何ら特定の抗原性を示さなかったことは注目しこ値する。

梅毒１〜レポネーマーＣｈａｒｏｎ　３０キメラの蛋白質ブロク１〜を調へてい た際に、クローンは、何層かのグループに分けられることが明白になった。その 一つの組が、クローンＴｐ３Ａ。

ＴρＩＣおよびＴｐ２Ｄである。

Ｔｐ３Ａ、　ＴｐｔｃおよびＴｐ２Ｄの３つのクローンは、それぞれ、４６．０ ００ダルトン、３７，０００ダルトン程度、および２３，０００乃至１８．００ ０ダルトンの抗原群による特徴的抗原「指紋」をつくっている。このプロットは 、第２期梅毒患者の未吸着血清によって調べたので、Ｃｈａｒｏｎ　３０溶解性 蛋白質の制御剤が入れられた。結果は、３つのクローンが、梅毒トレポネーマの ゲノムの中で重複しているＤＮＡ断片を含んでいることを示している。

これらのクローンの共通のＤＮＡ連鎖を識別するため、３つの組換えＤＮＡの制 限エンドヌクレアーゼの部位マツプをつくった。マツピングした結果を第２図に 示す。

マツプは、太線で示されている約９　ｋｂｐの領域において、３つのクローンが 重複連鎖を表わしている様子を示している。従って、ＤＮＡのこの共通領域は、 ３つのクローンによって表わされている抗原を暗号化している梅毒トレポネーマ ・ゲノムのセグメン１−を含んでいる。

結論として、第２図に示されている共通の領域の大部分を含んでいる、Ｔｐ２Ｄ の６．２　ｋｂｐのｔｌｉｎｄ　ＩＩＩ断片を、プラスミドｐＢＲ３２２の中へ サブクローンすることにより、がっ、大腸菌に変えられる際、組換えプラスミド がトレポネーマ抗原を暗号化したことを決めることによって、確認できた。

第２図は、連鎖が、両方の可能な方向において、ジクテリオファージ・ベクター に挿入された様子を示す。

クローンＴρ２Ｄを、別の２つのクローンのものであったバクテリオファージＢ ａｍ　ＨＩの腕に対し対向する方向に挿入した。ＤＮＡの挿入方向は、梅毒トレ ポネーマ抗原に対する遺伝子の表現に悪影響を及ぼすとは考えられない。

このことは、トレポネーマ抗原を暗号化している構造遺伝子が、それら自身のプ ロモータ一連鎖とともにクローン化されたことを大いに示唆している。クローン Ｔｐ３ＡおよびＴｐ２Ｄ両方の挿入ＤＮＡは、共通の連鎖を越えて右方へ伸びか っ、反応することができない。これによって、これらの挿入ＤＮＡの一つ若しく は両方が、梅毒トレポネーマＤＮＡの少なくとも２つのより小さく、かつ無関係 な５ａｕ３ＡＩ断片のインビトロ（ｉｎ　ｖｊｔｒｏ）組換えにより形成された ものであることが解かる。

Ｔｐ３Ａ　クローンは、ｐＢＲ３２２プラスミドに入れてサブクローンされ、か つ、大腸菌の中で増殖した。

サブクローニングは、クローンＴａｐ３ＡのＨｉｎｄ丁ＩＩ消化型ＤＮＡを、Ｈ ｉｎｄ　ＩＩＩで切断するとともに、１：２のモル比で、アルカリンホスファタ ーゼ（ａｌｋａ］、１ｎｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理されたｐＢＲ３２２ に対して結紮し、大腸菌ＲＲＩの中で変化させ、アムピシリン耐性で、かつテト ラサイクリン感受性の形質転換子を選び、同じ場所のコロニーのレプリカを溶解 し〔エーリッヒ、エイチ・エイ（Ｅｒｌｉｃｈ、　ｌ（、Ａ、）、ニス・エヌ・ コーエン（Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ）、およびエイチ・オー・ノクデヴイット（ Ｈ，０，ＭｃＤｅｖｉｔｔ）、「クローンＤＮＡフラグメントから翻訳された産 生物を検出するための高感度ラジオイムノアッセイＪ　（Ａ　ｓｅｎｓｉｔｉｖ ｅｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｌｎｇ　ｐｒｏ ｄｕｃｔｓ　ｔｒａｎｓｌａｔｅｄｆｒｏｍ　ｃｌｏｎｅｄ　ＤＮＡ　ｆｒａｇ ｍｅｎｔｓ）、１９７８年、Ｃｅ１Ｌ　１３　：　ｐ６３１〜６８９〕、更に、 梅毒トレポネーマ抗原の存在をスクリーニングし、かつ、既に述べたトレポネー マ抗原をスクリーニングすることによって行った〔アルカリンホスファターゼは 、ボーリンガ−・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社か ら入手し、また、ＨＩＮＤ　ＩＩＩは、二ニー・イングランド・バイオラプス（ Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）社から入手した〕。

サブクローンされたプラスミドは、Ｔｐ３Ａ型クローンによって産生された抗原 と同一の抗原を暗号化する。Ｔｐ３Ａのサブクローン・プラスミドは、ｐＡＷ　 ３０５として確認された。

このプラスミドは、アメリカ合衆国メリーランド州２０８５２０ックヴイルパー クローンドライブ１２３０に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョン（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｊ、ｏｒ＋ 、以下、ＡＴＣＣと略す）に現在保管されており、Ａ　Ｔ　ＣＣＮｏ、　３９２ ３７の名称がつけられている。

Ｔｐ４Ｄとして区別されたＣｈａｒｏｎ　３０クローンは、Ｔｐ３Ａ型クローン より約１００倍の反応性を有する、特に反応性に富んだプラグを産生じた。

Ｔ　ｐ　４　Ｄによって暗号化されたトレポネーマ抗原は、炭水化物にますます 共通した性質を示す異常な蛋白質であった。

Ｔ　ｐ　４　Ｄ抗原は、プロテアーゼ処理に耐えることができ、可成り高い等電 点を示し、かつ、炭水化物に対して選択的であると思われる染料により染色さ力 、る。

これらの性質から結論できることは、基本的に、ＴＩ）４Ｄ抗原はムコ多糖類で あった。しかし、更に分析すると、この異常なＴＰ４Ｄ抗原は、大部分が天然の 蛋白質であるが、推定的に、抗原組成物の２乃至３％は、標準的な性質をもった 中性糖と、多分、より異常な性質をもった幾つかの炭水化物とから成っているこ とを示している。

Ｔｐ４Ｄによって産生されたトレポネーマ抗原は、アセトンとの沈殿により溶解 質を１０倍に濃縮して、Ｔｐ４Ｄクローンの溶解質から精製し、引き続いて、セ ファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ　−２００カラムを用いてクロマトグラ フにかけた。プロティナーゼＫによる処理を行なった。

Ｓ−２００クロマトグラフイーの結果から得られたＴｐ４Ｄ抗原の推定的大きさ は、１５０，０００の分子量を持つ蛋白質の大きさに相当する。過ヨウ素酸銀（ Ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｓｉｌｖｅｒ）による５ＤＳ−ＰＡＧＥの染色により、Ｔ ｐ４Ｄ抗原は、分子量約１８０，０００乃至２００　、０００の分子であること が確認された。プロティアーゼにで処理を行なうと、Ｔｐ４Ｄ抗原の大きさが、 分子量９０，０００のものに減少する、このことについては、後で詳しく説明す る。

ＴＰ３Ａクローンに関し既に述べた如く、Ｔｐ４Ｄ　Ｃｈａｒｏｎ　３０クロー ンは、ｐＢＲ３２２の中へサブクローンし、かつ大腸菌の中で増殖した。Ｔｐ４ Ｄのサブクローン・プラスミドは、ｐＡＷ３２７として確認された。ＰＡＷ　３ ２７を更に、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ　ＩＩＩおよびＥｃｏ　ＲＩを用 いて消化させ、かつ、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼと自己結紮させることによってサブ クローンし、また、結紮されたＤＮＡを使用し、大腸菌ＲＲＩを変えた。

分離され、かつｐＡｌｌ　３３０によって代表される１組の抗原クローンは、ト レポネーマＤ）ＮＡの３．２ｋｂのＥｃｏ　ＲＩ／　ＨｉｎｄＩＩＩ断片のみを 含み、しかも、ｐｉ　３２７と同量の抗原を産生じた。

ｐＡｗ　３３０は又、それが別のＰＡＷ　３２７サブクローン中に見出される際 、梅毒トレポネーマ抗原の合成を命令しない０．６　ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩ　 ／　Ｂａｍ　ＨＩ断片を含んでいた。

別のサブクローンｐＡｗ　３２９が分離された。これは、明らかに複製遺伝子を 持っているｐＡυ３２９サブクローン・プラスミドは、ｐＡＷ　３２７を、　Ｈ ｉｎｄＩＩＩ　／　Ｅｃｏ　ＲＩによる２重消化、並びに、自己結紮によってつ くられ、また、トレポネーマＤＮＡの１．８ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　／　Ｅｃ ｏ　ＲＩを含んでいる。

ｐＡＪＩ　３２９は、Ｔｐ４Ｄ抗原をつくるのに優れており、その産生能力は、 ｐＡＷ　３２７が産生ずる抗原の量の１０倍以上である。ＰＡＷ３２９サブクロ ーンも又、前出のＡＴＣ，Ｃにおいて、ＡＴＣＣＮｏ、　３９２３８の番号で保 管されている。

サブクローンされたプラスミドによって産生されたＴｐ４Ｄ抗原を、エタノール による分別沈殿と、７５％エタノールではなくて、４０％エタノールにおけるＴ Ｐ４Ｄ抗原の溶解度を利用して精製し、引き続いて、プロティアーゼＫによる処 理と、セタヴアロン（ｃｅｔａｖａｌｏｎ　）による沈殿を行なった。

過ヨウ素酸銀により染色されたゲルを、濃度計によって調べたところ、産生物の 純度は、９９％以上であった〔ツァイ、シー・エム（Ｔｓａｉ、　Ｃ０Ｍ、）お よびフラッシュ、シー・イー（Ｆｒａｓｃｈ、　Ｃ，Ｅ、）　、　１９８２年、 Ａｎａｌｙｔ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１１９　：１１５〕。

コオマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）による染色法は、８５％ の純度を示した。主として天然の蛋白質であるが、クローンされたＴｐ４Ｄ抗原 は、驚くほど親水性に富み、４０％エタノールに完全に溶解する。

更に精製を行ない、かつ、３．５乃至１０のｐＨ勾配を用い、フラットベッド式 の等重合わせを行なって、Ｔｐ４Ｄ抗原の等電点を決定した。そのｐＨは、４． ６乃至４．８の間であった。

以上述べたように、Ｔｐ４Ｄ抗原の分子量は、約１８０，０００である。プロテ ィアーゼＫにより処理すると、Ｔρ４Ｄ抗原の大きさは、０．ｌ５ＤＳ中で、９ ６時間６０℃に保っても、プロティアーゼＫにより蛋白質分解されない分子量９ ０，０００の形のものに低下する。プロティアーゼＫによる処理を行なったにも 拘わらず、Ｔｐ４Ｄ抗原の抗原性は全く落ちていない。

プロティナーゼＫにより処理されたＴρ４Ｄ抗原は、熱に対して不安定で、かつ 還元剤を用いずに５分間煮沸すると、分子量１４　、０００乃至１９，０００の 形に変化する。

この分子量１４，０００乃至１９，０００のものは、も早や、梅毒血清と反応せ ず、しかも、更にプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）による分解を受け易くなる 。

梅毒トレポネーマのネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）抗原、及びクローン抗原の両方 を評価するために用いられる標準的方法では、分析の前に煮沸段階があるため、 最初の頃は、梅毒トレポネーマのＴｐ４Ｄ抗原遺伝子産生物を同定しようとして も、うまく出来なかった。それは、Ｔｐ４Ｄ抗原が、分子量１４．０００乃至１ ９，０００のサブユニットの多量体会合物であり、かつその合成が、Ｔρ４Ｄサ ブクローン・プラスミドに含まれている１、８　ｋｂのトレポネーマＤＮＡ断片 によって決められることによると信じられる。

ＴＰ４Ｄのクローン抗原は、簡単に銀染料だけで染色できるが、前出の文献にお いて、ツアイ（Ｔｓａｉ）およびプラッシュ（Ｆｒａｓｃｈ）がリポ多糖類に関 し記載しているように、染色は従来の過ヨウ素酸塩の前処理によって、数層に増 えている。

コオマッシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）を用いて、簡単に染色 できる。ルテニウム赤、トルイジン青および過ヨウ素酸シッフ（ｐｅｒｉｏｄｉ ｃ−ａｃｉｄ　５ｃｈｉｆｆ、以下ＰＡＳと略す）も又、Ｔｐ４Ｄ抗原を染色で きる。ルテニウム赤による染色は、水溶性のルテニウム赤が、ニトロセルローズ ではなくポリアクリルアミドに非常に良く結合することから、ニトロセルローズ の上で行なった。ニトロセルローズを用いると、Ｐ　Ａ　Ｓによる染色も簡単に できる。ニトロセルローズでのシッフの試薬による発色は、専ら過ヨウ素塩によ る前処理に左右さ九、かつ、水洗が簡単にでき、しかも、低いバックグラウンド で行なうことができる。

Ｔｐ４Ｄクローン抗原は、あらゆる期の病人から得られる人の梅毒患者の血清と 反応する一方、偽陽性および正常な人の血清とは反応しない。プロティナーゼに で処理したＴＰ４Ｄクローン抗原も、処理しなかったものも、第２期梅毒の患者 から得られた血清とは反応する。

プロティアーゼＫにより処理すると、ＴＰ４Ｄ抗原の分子量は、近似的に半分に なる。しかし、この処理をしても、抗原性の損失は全く見られない。Ｔｐ４Ｄク ローン抗原は、潜伏初期の梅毒をもっている患者から得られた血清と強く反応し 、かつ、同じ条件のもとで、未感染の人から得られた血清とは反応しない。

ＴＰ４Ｄクローン抗原は又は、超音波処理された梅毒トレポネーマにより免疫に なった兎から得られた血清とは反応するが、対照の兎から得られた血清とは反応 しない。熱に不安定なプロティアーゼにで処理されたＴρ４Ｄ抗原を煮沸すると 、最早や人の梅毒患者の血清とは反応しない分子量１４．０００乃至１９，００ ０のものに変化する。

運動性があり、かつ激しい梅毒トレポネーマを、既に述べた如く兎の李丸から精 製し、かつアリコートを一７０℃で凍結した。超音波処理直後、デオキシリボヌ クレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）及びプロティアー ゼＫにより処理をし、更に、電気泳動にかけ、ゲルを過ヨウ素酸銀を用いて染色 した。

梅毒トレポネーマは、ＴＰ４Ｄクローン抗原の大きさに匹敵する大きさをもった 抗プロティアーゼに分子を有している。

非病原性のティー・ファージデンテイス（Ｔ、　ｐｈａｇｅｄｅｎｔｉｓ）［ラ イチル・トレポネーム（Ｒｅｉｔｅｒ　Ｔｒｅｐｏｎｅｍｅ）］は、このような 分子を含んでいないが、梅毒トレポネーマと異なり。

大きさの類似性により、また、前出の文献において、ツアイ（Ｔｓａｊ）および フラッシュ（Ｆｒａｓｃｈ）が発表しているグラム陰性リボ多糖類（ＬＰＳ）に 対する染色性によって判断できるように、滑らかなリポ多糖類（ＬＰＳ）物質を 持っていると児なされる。

ニトロセルローズに移すと、梅毒トレポネーマ分子は、Ｔｐ４Ｄクローン抗原と 同じく、第２期梅毒血清によって免疫学的に検出さ九る。梅毒患者の血清は、テ ィー・ファージデンティスの抗プロテアーゼ成分とは反応しない。

既に述べた如く、クローン抗原に対する血清学的反応のパターンは、真正の梅毒 １〜レポネーマ抗原に対する反応に似ている。潜伏初期および第２期の、血清学 的に最も反応的な梅毒段階から得られた抗血清、および兎における実験的梅毒が 、クローン抗原と最もよく反応した。また、クローン溶解物における抗原バンド は、梅毒トレポネーマの抗原指紋に見られるのと同じ電気泳動的移動度のバンド と概ね関連している。

トレポネーマーファージ組換え物、およびサブクローン・プラスミドによって合 成された抗原に関する上記の特性と同定が示すように、このようなりローンは、 あらゆる段階の梅毒に対し、各種公知の血清診断試験法に採用しうる様々な抗原 を提供することができる。

組換えクローンは、体液系及び細胞系双方の免疫原性に関する系統的研究のため の純粋抗原の源にすることができる。更に、このクローンおよびそれらの純粋抗 原産生物は、微生物に基礎生物学、例えば、微細構造、生理学、および遺伝学の 解明に大賢役立つものとなる筈である。

クローンから産生された抗原産生物は、個体を梅毒トレポネーマの感染から守る 免疫ワクチンとして用いられる。

例えば、Ｔ’ｐ４Ｄクローン抗原の免疫原性は、既に確立されている。プロテイ ナーゼＫによる処理と、セタヴアロン（ｃｅｔａｖａｌ、ｏｎ）沈澱によって精 製した、凡そ２００μｇと８００μｇのＴｐ４Ｄ抗原を、フロインディ（Ｆｒｅ ｕｎｄｉ）の完全アジュバントと一緒に用い、２匹の感熱した雄の兎に皮下免疫 性を与えた。免疫ができて２週間後、各兎から採血した。

各兎は、人の潜伏初期の梅毒において検出されたものと、見分けのつかない程度 の抗体を発見した。これらの兎から採られた免疫前の血清は、Ｔｐ４Ｄクローン 抗原と何ら反応を示さなかった。

同様に、Ｔｐ４Ｄクローン抗原による免疫は、激しいインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔ ｒｏ）梅毒トレポネーマを不動化しうる兎の血清活性を誘発する。

２匹の兎には、プロテイナーゼＫにより処理されたＴｐ４Ｄ抗原による１回の注 射で、免疫が与えられた。兎から、３週間、８週間、１０週問および１２週間ご とに採血した。

血清は、Ｔｐ４Ｄ抗原と強く反応した。免疫前の血清は、ベネリール・ディシー ズ・リサーチ・ラボラトリ−（ＶｅｎｅｒｅａｌＤｅｓｅａｓｅ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｖ　Ｄ　ＲＬ　）の抗体と、山羊杭先蛍光抱合 体を、２次抗体ならびに市販されている梅毒トレポネーマのスライド標本〔ベッ クマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））として使用しているフルオレラセン１〜・トレポネ ーマル・アンチゲン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｔｒｅｐｏｒ＋Ｃｍａｌ　Ａｎ ｔｉｇｅｎ、ＦＴＡ）の抗体を欠いていた。

補足的かつ従属的不動化活性は、−回免疫が与えられてから、８週経過した第１ の兎に存在したが、これに対して、第２の兎は、１０週後の採血物に、不動化活 性を示した。

免疫前の血清、および他の経時点で採られた血清は、不動化活性に対して陰性で あった。Ｔｐ４Ｄ抗原により不動化抗体が誘発されるということは、抗原が、梅 毒トレポネーマの上に表面的位置分担を持っているものと考えられる。

以上述べた実施例は、大きさが約１．８ｋｂでかつ３．４　ｋｂより大きくない 梅毒トレポネーマＤＮＡセグメントの大腸菌におけるクローニングが、予想外に 、炭水化物と関連する性質を示す蛋白質分子の産生を決定すけていることを示し ている。

このＴＰ４Ｄクローン抗原分子が、］組のトレポネーマ抗原を表わしており、か つ、熱不安定的性質により、これまで５ＤＳ−ＰＡＧＥによって確定されなかっ たものと信する。

この約１．８　ｋｂの断片が不足しているクローン・プラスミドは、悉く、この Ｔｐ４Ｄ抗原の産生を示さない。梅毒トレポネーマＤＮＡの約１．．８　ｋｂ断 片は、凡そ１８，０００乃至２２、ｏｏｏの分子量を持つペプチドだけを暗号化 しているので、このＴｐ４Ｄ抗原が、これらの小さい単量的サブユニットの・　 多量体会合となり、疎水的相互作用により結合されて゛いるものと確信する。

Ｔｐ４Ｄ抗原分子は、感トリプシン結合を持っているが、プロテアーゼに、プロ ナーゼ（Ｐｒｏｎａｓａ）、パパイン（Ｐａｐａｉｎ）のようなプロテアーゼに よっては、それ以上分解されず、しかも、キモトリプシン（ｃｈｙｍｏｒｔｒｙ ｐｓｉｎ　）によっては、全く分解°されない。プロテアーゼ処理によると、抗 原性に大きな損失があるか否かについては、確証はない。

以上、好適実施例を挙げて本発明を説明してきたが、当業者なら、それが好適な ものに限られていること、また、本発明の目的の範囲内であれば、更に、変形し たり、他に適用しうるちのであることに思い至る筈である。従って、本発明は、 この明細書において説明した特定の実施例に制約されるものではない。

Ｉ−−一 国際調査報告 ｌｎｍｎａ＋１ｏｎａｌＡｏａｌｉｅａｌｌａｎＮａ、ＰＣＴ／ＵＳ８３１０１ ７１８１ｎｌ＃１Ｍ１ｏ６１ＩＩＩＡｏＤｌｉ７Ａ１１６ｆｉＮ６．　ＰＣＴ／ ＵＳ８３１０１７＋８第１頁の続き ■Ｉｎ、ｔ、　Ｃ１，３識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｐ　２１１００ ＣＩ２　Ｒ１／１９　） （Ｃ１２Ｎ　１／２０ Ｃ１２Ｒ１／１９　） （Ｃ１２Ｎ　７１００ Ｃ１２Ｒ１／９１　） （Ｃ１２Ｎ　１５１００ Ｃ１２Ｒ１／１９　）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原を産生ずるための方法で あって、 バクテリオファージ・ベクターのＤＮＡを切断し、第１のＤＮＡ断片を産生ずる 段階と、 組換え可能な前記ＤＮＡ断片を、梅毒トレポネーマから得られる組換え可能な第 ２のＤＮＡ断片と結合させて、組換えＤＮＡを形成する段階と、 前記組換えＤＮＡを、発育可能なバクテリオファージ粒子の中ヘパッケージし、 バクテリオファージを形成する段階と、 前記バクテリオファージ・クローンにより適当な宿主を感染し、プラク（ｐｉａ ｑｕｅ）を形成する段階と、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原を 有するプラグを選択する段階 とから成ることを特徴とする、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原 を産生ずるための方法。 （２）第１゛のＤＮＡ断片が、バクテリオファージＤＮＡを、左腕断片、中央ス タッファ・−（ｓｔｕｆｆｅｒ）断片、および右腕断片に切断することにより提 供され、かつ、前記中央スタッファ−断片を、前記左腕断片及び右腕断片から取 り除き。 第１のＤＮＡ断片を提供しうろことを特徴とする請求の範囲第（１）項に記載の 方法。 （３）バクテリオファージ・ベクターが、Ｃｈａｒｏｎ　３０であることを特徴 とする請求の範囲第（２）項に記載の方法。 （４）宿主が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特徴 とする請求の範囲第（３）項に記載の方法。 （５）選択されたプラグにおいて梅毒トレポネーマ抗体と反応しうる抗原を、蛋 白質抗原、および、抗プロテアーゼ・熱不安定性蛋白質抗原に分離することを特 徴とする請求の範囲第（１）項に記載の方法。 （６）バクテリオファージのＤＮＡを、制限酵素Ｂａ、ｍ　ＨＩによって切断す ることを特徴とする請求の範囲第（４）項に記載の方法。 （７）第２のＤＮＡ断片が、制限酵素Ｓａｕ　３ＡＩにより、梅毒トレポネーマ のＤＮＡを切断することによって調製されることを特徴とする請求の範囲第（４ ）項に記載の方法。 （８）生体液における梅毒トレポネーマに対する抗体の存在を検出するための方 法であって、 組換えＤＮＡ法によって産生された梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる 抗原を、生体液試料に加える段階と、 前記抗原が、前記試料中に存在する梅毒トレポネーマに対する抗体と反応する否 かを決める段階とから成ることを特徴とする、生体液における梅毒トレポネーマ に対する抗体の存在を検出するための方法。 （９）梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原であって、組換えＤＮＡ 法によって産生される抗原から成ることを特徴とする材料組成物。 （１０）バクテリオファージであって、前記バクテリオファージのＤＮＡに組込 まれる梅毒トレポネーマ遺伝子をその中に含み、かつ、梅毒トレポネーマに対す る抗体と反応しうる抗原を産生できるようになっていることを特徴とするバクテ リオファージ。 （１，１，）バクテリオファージが、Ｃｈａｒｏｎ　３０であることを特徴とす る請求の範囲第（１０）項に記載のバクテリオファージ。 （１２）バクテリオファージが、それぞれ、　４６，０００ダルトン、３７．０ ００ダルトン、２３，０００ダルトン、および１８，０００ダルトンの分子量を 有する蛋白質抗原を産生でき、がっ、該抗原が、梅毒トレポネーマに対する抗体 と特異的に反応することを特徴とする請求の範囲第（１１）項に記載のハクテリ 万ファージ。 （１３）梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原を産生ずることが可能 なバクテリオファージ・クローンを提供するべく、Ｃｈａｒｏｎ　３０を調製す る方法であって、第１のＤＮＡ断片を産生するべく、前記Ｃ）１ａｒｏｎ　３０ のＤＮＡを切断する段階と、 前記第１のＤＮＡ断片を、梅毒トレポネーマから得られた第２のＤＮＡ断片と結 合させ、がっ組換えＤＮＡを形成するべく、前記第１及び第２の断片を組換えで きるようにする段階と、 梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しろる抗原を産生できるバクテリオファー ジ・クローンを形成するべく、前記組換えＤＮＡを、発育可能なＣｈａｒｏｎ　 ３０粒子の中ヘパッケージする段階 とから成ることを特徴とする、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原 を産生ずることが可能なバクテリ（１４）Ｃｈａｒｏｎ　３０　Ｄ　Ｎ　Ａを、 制限酵素Ｂａｎ　ＨＩによって切断することを特徴とする請求の範囲第（１３） 項に記載の方法。 （１５）梅毒トレポネーマから得られたＤＮＡ断片を、制限酵素Ｓａｕ　ＡＩを 用い、梅毒ト　ポネーマＤＮＡを切断することによって産生させることを特徴と する請求の範囲第（ｊ４）項に記載の方法。 （Ｉ６）梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しつる抗原を産生可能な修正Ｃｈ ａｒｏｎ　３０バクテリオフアージであって、前記Ｃｈａｒｏｎ　３０のＤＮＡ を切断し、第１のＤＮＡ断片を産生させる段階と、 組換え可能な前記第１のＤＮＡ断片を、梅毒トレポネーマから得られる組換え可 能な第２のＤＮＡ断片と結合させて、組換えＤＮＡを形成する段階と、 前記組換えＤＮＡを、発育可能なＣｈａｒｏｎ　、３０粒子の中ヘパッケージし 、Ｃｈａｒｏｎ　３０クローンを産生させる段階と、前記Ｃｈａｒｏｎ　３０ク ローンを、適当な宿主を感染させて、プラグを形成する段階と、 梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原を有する前記プラグから、前記 修正Ｃｈａｒｏｎ　３０バクテリオフアージを選択する段階 とによって産生されることを特徴とする、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応 的な抗原を産生しうる修正Ｃｈａｒｏｎ３０バクテリオファージ。 （１７）Ｃｈａｒｏｎ　３０　Ｄ　Ｎ　Ａを、制限酵素Ｂａｍ　ＨＩによって切 断することを特徴とする請求の範囲第（１６）項に記載の改良型Ｃｈａａｒｏｎ 　３０バクテリオフアージ。 （１８）梅毒トレポネーマから得られたＤＮＡ断片が、制限酵素Ｓａｕ　ＡＩを 用いて、梅毒トレポネーマＤＮＡを切断することにより調製されることを特徴と する請求の範囲第（１６）項に記載の改良型Ｃｈａａｒｏｎ　３０バクテリオフ アージ。 （１９）梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる蛋白質抗原であって、請求 の範囲第（５）項に記載の方法により産生される蛋白質抗原から成ることを特徴 とする材料組成物。 （２０）梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗プロテアーゼ・熱不安定 性蛋白質抗原であって、請求の範囲第（５）項に記載の方法により調製される抗 プロテアーゼ・熱不安定性蛋白質抗原から成ることを特徴とする材料組成物。 （２１）梅毒トレポネーマの感染を決めるための方法であって、 生体液試料に対し、請求の範囲第（１）項に記載の方法により産生された抗原を 加える段階と、 前記抗原が、前記試料中に存在する前記梅毒トレポネーマに対する抗体と反応す るか否かを決める段階とから成ることを特徴とする、梅毒トレポネーマ感染を決 めるための方法。 （２２）染色性大腸菌の微生物であって、ＡＴＣＣＮｏ、　３９２３７と同じ特 性を有し、かつ、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる蛋白質抗原を産生 ずることができることを特徴とする染色性大腸菌の微生物。 （２３）染色性大腸菌の微生物であって、ＡＴＣＣＮｏ、　３９２３８と同じ特 性を有し、かつ、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗プロテアーゼ・ 熱不安定性蛋白質抗原を産生ずることができることを特徴とする、染色性大腸菌 の微生物。 （２４）凍結乾燥状態になっていることを特徴とする請求の範囲第（２２）項ま たは第（２３）項に記載の微生物。 （２５）請求の範囲第（２２）項または第（２３）項による微生物によって産生 されることを特徴とする、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原。 （２６）抗原が、請求の範囲第（１）項に記載の方法により産生されることを特 徴とする請求の範囲第（８）項に記載の方法。 （２７）請求の範囲第（１）項に記載の方法により産生されたことを特徴とする 請求の範囲第（９）項に記載の抗原。 （２８）梅毒トレポネーマと免疫反応性のある抗体を、動物体内で育生する方法 であって、 梅毒トレポネーマと免疫反応しうる抗体を、その体内で育生するべく、請求の範 囲第（９）項による免疫学的に有効な量の抗原を、動物に投与する段階を有する ことを特徴とする動物体内で抗体を育生する方法。 （２９）抗原が、請求の範囲第（２５）項に記載の抗原であることを特徴とする 請求の範囲第（２８）項に記載の方法。 （３０）染色性大腸菌の微生物であって。 前記微生物のプラスミドＤＮＡに取込まれる梅毒トレポネーマ遺伝子を、その中 に有し、かつ、前記遺伝子が、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原 を符号化していることを特徴とする染色性大腸菌の微生物。 （３１）梅毒トレポネーマの抗プロテアーゼ・熱不安定性蛋白質抗原から成るこ とを特徴とするワクチン剤。 （３２）フロインディ（Ｆｒｅｕｎｄｉ）のアジュバントを含むことを特徴とす る請求の範囲第（３１）項に記載のワクチン剤。 （３３）梅毒トレポネーマに対する抗体との反応性を有する抗プロテアーゼ・熱 不安定性蛋白質抗原から成ることを特徴とする材料組成物。 （３４）抗プロテアーゼ・熱不安定性抗原が、約９０，０００ダルトンの分子量 を有することを特徴とする請求の範囲第（３３）項に記載の材料組成物。 （３５）請求の範囲第（２３）項に記載の微生物によって産生される抗プロテア ーゼ・熱不安定性抗原から成ることを特徴とする材料組成物。 （３６）梅毒トレポネーマ感染を決めるための方法であって、梅毒トレポネーマ の抗原を、二Ｉ−口セルローズ・シートに移す段階と、 前記ニトロセルローズ・シートを、生体液試料によって調へる段階と、 前記抗原が、前記試料中に存在する梅毒トレポネーマに対する抗体と反応するか 否かを決める段階とから成ることを特徴とする梅毒トレポネーマ感染を決めるた めの方法。 （３７）抗原が、請求の範囲第（３３）項による抗原であることを特徴とする請 求の範囲第（３６）項に記載の方法。 （３８）梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しつる抗原を産生ずる方法であっ て、 プラスミド・ベクターのＤＮＡを切断し、第１のＤＮＡ断片を産生ずる段階と、 組換え可能な前記第１のＤＮＡ断片を、梅毒トレポネーマから得られる組換え可 能な第２のＤＮＡ断片と結合させ、組換えＤＮＡを形成する段階と、 前記組換えＤＮＡを適当な宿主へ転写する段階と、前記転写宿主のコロニーを増 殖する段階と、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応性を有する抗原を産生じて いるコロニーを選ぶ段階 とから成ることを特徴とする梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原を 産生ずる方法。 （３９）梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原を産生ずる方法であっ て、 適当なベクターのＤＮＡを切断し、第１のＤＮＡ断片を産生ずる段階と、 組換え可能な前記第１のＤ　Ｎ　Ａ断片を、梅毒トレポネーマから得られる組換 え可能な第２のＤＮＡ断片と結合させて、組換えＤＮＡを形成する段階と、 前記組換えＤＮＡを適当な宿主に転写する段階と、前記転写された宿主を増殖す る段階 とから成ることを特許とする、梅毒トレポネーマに対する抗体と反応しうる抗原 を産生ずる方法。