JP2926180B2 - 連鎖球菌ｍ蛋白質遺伝子及びその分子状プローブ - Google Patents
連鎖球菌ｍ蛋白質遺伝子及びその分子状プローブInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
ここに記載されている発明は、その一部につき厚生省
（Department of Health and Human Services）の国立
衛生研究所からの補助金の援助を受けてなされたもので
ある。 発明の分野 本発明はＡ群連鎖球菌のM6蛋白質のような抗食菌作用
性連鎖球菌蛋白質を診断用プローブとして用いるため
の、及びそれを免疫原として利用したワクチンを製造す
るための組成物及び方法に関する。Ｍ蛋白質は繊維状表
面分子であつて、それは連鎖球菌を、感染した宿主生物
のマクロフアージ及び多形核（polymorphonuclear）好
中球（neutrophiles）により、食菌作用に抵抗するよう
になしうる。 本発明はＭ蛋白質又はその一部をコードするDNA配列
をビールスDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNAのよう
なプラスミドDNAに挿入するために組換えDNA技術を利用
し、これによりそのプラスミドは細菌の宿主又は他の単
細胞系中にＭ蛋白質の遺伝子を複製し発現させることが
できる。生ずる組換えDNA分子はＭ蛋白質、又はそのあ
る部分又は分子の変化したものを製造しうるように宿主
細胞に導入される。産生した蛋白質はついで分離され、
精製され連鎖球菌感染に対するワクチン中の免疫原とし
て用いるために修飾される。 本発明はさらにＡ群、Ｃ群及びＧ群の連鎖球菌の検出
法を提供する。かかる検出はＡ群連鎖球菌のＭ蛋白質を
コードする全遺伝子又はその遺伝子の断片に基づく特定
の分子状プローブを使用して達成される。交雑（DNAの
ハイブリダイゼーション）スクリーニング法において有
用なDNAプローブが連鎖球菌感染と疑われる場合の臨床
的分離物の検査のためにここに記載されている。 発明の背景 急性リウマチ熱や急性糸球体腎炎（glomerulonephrit
is）がＡ群連鎖球菌感染の後遺症であることは広く認め
られているところである。熱帯及び亜熱帯の開発途上国
においてはリウマチ性心臓疾患が現在心障害の最も普通
の形である。世界のある開発途上の都市部の貧民街にお
ける学齢児童についてこの病気の流行率は1,000人に対
し22−23人もの高さであることが報告されている。イン
ドだけでも６百万もの多くの子供が苦しんでいることと
なる。この病気の正確な発病機構はわからないが、リウ
マチ熱、さらに急性腎炎がストレプトコツカス・ピオゲ
ネス（streptococcus pyogenes）（Ａ群連鎖球菌）の感
染に伴うものであることは明らかである。 連鎖球菌Ｍ蛋白質は、それが食細胞攻撃に対する抵抗
性を生物に与えるという事実に基づいてこの細菌の重要
な毒性因子である。抗原変異は、Ａ群連鎖球菌が宿主の
免疫反応を避けることができ、その結果人間に病気を起
こす主要機構である。Ａ群連鎖球菌感染に対する抵抗性
は、生物の表面に見いだされる繊維状分子であるＭ蛋白
質に対する型特異的（type−specific）な抗体の存在に
よるものである。分類し得ない（nontypable）株のいく
つかに加えて、現在では約70の明らかなＡ群連鎖球菌Ｍ
形が認められている。ある種のＭ型の間で交叉反応性が
あるのは普通であるという事実にも拘わらず、同族の型
に対してつくられた抗体のみが生体の食菌作用を発生せ
しめうる（すなわち、それらはオプソニン抗体であ
る）。さらに、すべての同族体、又は型特異性抗体が食
菌性であるというわけではない。 特定の抗血清がＡ群連鎖球菌に対してつくられうると
いう事実は、咽喉洗滌によつて得られるもののような臨
床上の分離物を血清学的な試験に付することにより連鎖
球菌感染を検出することを可能にした。感染におけるＡ
群連鎖球菌の同定は純粋培養中の生物の単離、群特異的
炭水化物の抽出、及び群特異的抗血清との反応とを必要
とする。すべての病原性株に対してのみ共通な性質に基
づきうる連鎖球菌感染に対する臨床試験は、従つて非常
に望ましいものとなる。 2.1組換えDNA技術と遺伝子の発現 組換えDNA技術は、それにより特定のDNA断片が宿主細
胞中で複製し、転写しうるベクターと呼ばれる遺伝学的
要素中に挿入されるDNAクローニングの技術を包含して
いる。ベクターはプラスミド又はビールスのいづれでも
ありうる。プラスミドは小さい環状の二重螺旋DNAの分
子で、それは天然にバクテリアや酵母中に見出され、そ
こで宿主細胞の繁殖とは無関係な単位として複製する。
これらのプラスミドは通常全宿主細胞DNAのわずかなフ
ラクシヨンとしてのみ説明され、しばしば抗生物質に対
する耐性を与える遺伝子を保有している。これらの遺伝
子、そして比較的小さい大きさのプラスミドDNAが組換
えDNA技術において利用される。 組換えDNA分子の挿入されたDNA断片は自然には宿主生
物と情報を交換しない生物から誘導されうるものであ
り、また全体的にあるいは部分的に合成的に作られうる
ものである。制限酵素及び結合方法（ligation metho
d）を用いて組換えプラスミドを製造する方法はコーエ
ン及びボイヤー発明にかゝわる発行された米国特許第4,
237,224号に記載されている。このようにしてつくられ
た組換えプラスミドは形質転換の手段により単細胞生物
中に導入され、複製される。そこに記載されている技術
の一般的適用性の故に、米国特許第4,237,224号はここ
に本明細書中に参考文献として包含される。 単細胞生物中に組換えDNA分子を導入する別の方法
は、コリンズ及びホーンにより、米国特許第4,304,863
号に記載されており、それもまたここに参考文献として
包含される。この方法は、バクテリオフアージ・ベクタ
ーによるパツケージング／トランスダクシヨン（packag
ing/transduction）システムを利用するものである。 プラスミドは高次螺線であるので、宿主細胞のDNAか
ら容易に分離することができ、精製することができる。
クローニング・ベクターとして用いるには、このような
精製プラスミドDNA分子は制限ヌクレアーゼで切断さ
れ、クローンさるべきDNA断片に結合される。製造され
た雑種のプラスミドDNA分子は、次いで一時的に大分子
（コンピーテントに）に対して浸透性を有するようにさ
れたバクテリア中に再導入される。処理された細胞のい
くつかだけがプラスミドを拾いあげ、これらの細胞はプ
ラスミドによつてそれらが獲得している抗生物質耐性に
よつて選択できる。それはそれらのものだけが抗生物質
の存在下に生育するからである。これらのバクテリアは
分裂するから、プラスミドもまた当初のDNA断片の多数
のコピーをつくるように複製する。繁殖期間の終りに、
雑種のプラスミドDNA分子は精製され当初のDNA断片のコ
ピーは同じエンドヌクレアーゼによる第二の処理で切断
される。 構築に用いられた方法には無関係に、組換えDNA分子
は宿主細胞と両立し得なければならない。すなわち、宿
主細胞中で自律的に複製できなければならない。組換え
DNA分子は、その組換えDNA分子により形質転換された宿
主細胞を選択できるマーカーの機能をも有していなけれ
ばならない。さらに加えて、プラスミド上に適当な複
製、転写及び翻訳のシグナルが正確に配置されているな
らば、外来遺伝子は形質転換細胞及びその子孫中に適切
に発現するであろう。 2.2ワクチン ワクチンは病気の制御と予防へのアプローチである。
ワクチンは抗原の免疫原部分をアジユバントと混合する
ことにより製造できる。この製剤は宿主の動物又はヒト
に注射すると、その抗原に対する抗体の産生を誘導し、
その抗原を生ずる対象生物により起る病気に対する活性
な免疫を与える。 ペプタイド・ワクチンは、バクテリアおよびビールス
の表面蛋白質の部分のような必要かつ適切な免疫原物質
のみを含んでいる。ペプタイド・ワクチンは高度に純化
されたバクテリアの画分から該当するペプタイドを単離
することにより、又は該当するポリペプタイドを合成す
ることによつてつくることができる。ペプタイド・ワク
チンの大きい利点は、バクテリア起原の無関係な物質
や、宿主又は提供主から導かれる障害となる物質の排除
にある。しかし、現在において、これらの方法を用いて
のペプタイド・ワクチンの製造は、一般的に広範囲の商
業的使用にはあまりにも高価につく。組換えDNA技術は
ペプタイド・ワクチンの製造に多くを提供する。バクテ
リアの適切な免疫原部分をコードするバクテリア遺伝子
の分子クローニング及び宿主細胞での発現により、ペプ
タイド・ワクチンにおいて使用するための適切な免疫原
の充分な量を製造することができる。 ワクチンは、しばしば種々のアジユバンドとともに乳
化液として投与される。アジユバンドは、免疫原それだ
けを投与するときよりも、よりわずかな投与量でより少
ない量の抗原を用いて、より持続性があり、より高レベ
ルの免疫を達成することに役立つ。アジユバンドの作用
機序は複雑であり、完全にはわからない。しかし、それ
は細網内皮組織の食菌作用や他の活性を刺激するととも
に、抗原の放出と分解を遅延させることを含んでいるで
あろう。アジユバンドの例としては、フロインドのアジ
ユバンド（Freund′s adjuvant）（完全又は不完全）、
アジユバンド65（落花生油、マンナイド・モノオレエー
ト及びモノステアリン酸アルミニウムを含む）、及び水
酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は明礬のよう
な鉱物質ゲルが挙げられる。フロインドのアジユバント
は、もはやヒトや食用動物のためのワクチン製剤には用
いられない。それは代謝できない鉱物質油を含んでい
て、それが潜在的癌原性物質（potential carcinogen）
でありうることによる。しかし、鉱物質ゲルは商業上獣
医用ワクチンに広く用いられている。 2.3M蛋白質抗原を用いる連鎖球菌ワクチン開発の試み フオツクス（ジヤーナル・オブ・イムノロジー93:826
−837（1964））は、連鎖球菌から精製したＭ蛋白質を
型特異的（type−specific）な滅菌性抗体（bactericid
al antibodies）を誘導するためにウサギにおける免疫
原として用いた。しかし、部分的精製連鎖球菌Ｍ蛋白質
でヒトにワクチン接種をする試みは常に被接種者に強い
局所および組織的反応が起つたため成功に至らなかつ
た。シユミツト、ジヤーナル・インフエクシヤス・デイ
ジーズ106;250−255（1960）及びポツターら、ジヤーナ
ル・クリニカル・インベストメント41:301−310（196
2）参照。フオツクスら、ジヤーナル・オブ・インフエ
クシヤス・デイジーズ120:598−604（1969）及びフオツ
クスら、ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジ
シン124:1135−1151（1966）は、精製された酸抽出した
Ｍ蛋白質を用い、一部についてそのワクチンを用いて成
功した。ワクチン接種を受けた22名の成人のうち15名は
型特異性抗体力価の二次上昇を伴う反応を示したが、５
人についてのみ抗バクテリア抗体の上昇を示したにすぎ
なかつた。 ビーチエイら、ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メジシン150:862−877（1979）は、M24蛋白質のペ
プシン誘導画分（pepsin−derived fragment）（Pep M2
4）の明礬沈澱製剤で12名の成人にワクチン接種を行な
つた。局所的又は全身的反応が観察されなかつたから、
これは充分に親和性があるものと考えられた。ワクチン
接種を受けた12名のうち10名がM24型特異的オプソニン
抗体を産生することにより反応を示した。 デイルらによる免疫学的研究、ジヤーナル・オブ・エ
クスペリメンタル・メジシン151:1026−1037（1980）に
よれば、12名のボランテアのうちの２名がM24で免疫さ
れたがM5及びM6蛋白質の両者に結合するように改良され
た抗体のM6だけがオプソニツクであつた。しかし、ビー
チイらは、シンポジウム・オン・バクテリアル・ワクチ
ン、ジエイ・ビー・ロビンス編、ジエイ・シー・ヒル、
ブライアン・デツカー・パブリシヤー、ニユーヨーク、
401−410頁（1981）で、精製されたPep M5蛋白質（M5蛋
白質のペプシン誘導画分）で免疫された４匹の兎のうち
の１匹が高い力価で心臓組織に対する抗体を生成したこ
とを見出した。この抗血清は、M5型蛋白質と心臓組織と
交叉名疫反応を起した。 2.4DNA交雑検定 病原微生物の検出のための通常の診断的方法は、かか
る生物中に見出されると思われるゲノムのDNA断片が純
粋な形態で入手できるならば、創案できるだろう。もし
そうならば、化学的、酵素的又は放射性同位原素的レポ
ーター・グループで標識をつけることにより、そのDNA
断片を交雑プローブとして用いることができよう。 グルンスタイン及びホグネス〔プロシージングス・オ
ブ・ナチユラル・アカデミー・オブ・サイエンス,U.S.
A.72:3961（1975）〕は、このアプローチをコロニー・
ハイブリダイゼイシヨンと呼ばれる方法で使用した。こ
の方法では、検定されるべきバクテリアはニトロセルロ
ース・フイルターに移された。フイルター上のコロニー
はついで分解され、溶出するゲノムDNAはフイルターに
固定された。32Pで標識されたプローブの配列に補充的
に付加されたDNA中のヌクレオチド配列の存在はオート
ラジオグラフイーによつて追跡された。DNAの交雑の他
の一般的態様はフアルコウらにより米国特許第4,358,53
5号明細書に記載されている。 発明の概要 連鎖球菌のＭ蛋白質遺伝子の単細胞生物中でのクロー
ニングと発現のための方法と組成物とが提供される。ま
た、これらの新規な単細胞生物をＭ蛋白質を生産するた
めに培養する方法、Ｍ蛋白質DNAを発現する単一のコロ
ニーを同定する急速検定、及び遺伝子産物の特定のため
の方法も記載されている。ここに記されている組換えDN
A技術により製造されるＭ蛋白質は、ストレプトコツカ
ス・ピオゲネス（Streptococcus Pyogenes）感染に対し
て保護するためワクチン中の免疫原として用いるために
調製されうるものである。 ここに記載されている特定の態様では、大腸菌トラン
スダクタント（E.coli transductants）により生産され
る蛋白質はＡ群連鎖球菌の細胞壁の可溶化によつて単離
されるM6蛋白質よりごく少し大きいが、連鎖球菌のプロ
トプラストとＬ型により分泌されるものと同程度の大き
さを有している。免疫学的に大腸菌トランスダクタント
により合成される分子は連鎖球菌M6蛋白質と同じ型特異
性決定部位を有している。Ｍ蛋白質は、オクターロニー
（Ouchterlony）二重融合実験により抗原的に、（ａ）
オプソニン抗体除去試験及び（ｂ）オプソニン抗体の生
産誘導能により免疫原的に特徴づけられる。クロン化さ
れたＭ蛋白質は単離され、ドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミド・ゲル電気泳動法で分画される。さら
に発現された遺伝子産物の単離方法も記載されている。 本発明は連鎖球菌のオプソニン抗体及び抗原の製造法
を提供する。それらは、ヒトの医薬及び微生物学的研究
において一般的重要性を有するものである。この用途は
本発明で生産される連鎖球菌Ｍ蛋白質をラジオイムノア
ツセイのような超高感度検定のための高度に再現性を有
する標準抗原として用いることを含むものである。これ
らの検定は生物学的標本中の連鎖球菌に対する抗体の発
見のための診断的手段として用いられうる。 連鎖球菌Ｍ蛋白質遺伝子又はその画分の分子プローブ
としての使用を通じて、生体組織及び体液中の病原性連
鎖球菌の診断的同定のための方法も提供されている。本
方法においては、DNAが微生物的単離物から抽出され、
分子状プローブへの交雑により相補的ヌクレオチド配列
が試験される。この手段によつて多数の単離物中の、比
較的容易に連鎖球菌の存在を高感度、高信頼度でスクリ
ーニングできる。その結果は現在用いられているより厄
介な血清学的診断検査よりも顕著に有利なスクリーニン
グ・テストを提供するものである。 図面の簡単な説明 本発明は以下の詳細な発明の記載と図面を参照するこ
とによりより充分に理解しうるであろう。図面におい
て： 第１図（大きさは比例していない）は連鎖球菌DNA断
片とpJB8から導かれた組換えプラスミドであるpJRS42の
構造を示している。（第6.2節参照）連鎖球菌DNA中の種
々の制限部位は示されていない。 第２図はpJRS42.13の制限地図を示す。本プラスミド
はpJRS42から不必要な連鎖球菌DNAを除くためEcoR Iで
消化し再結合することにより誘導された。プラスミドpJ
RS42.13はEcoR I部位を一箇所のみ有している。（第6.3
節参照） 第３図は６型Ａ群連鎖球菌のM6蛋白質をコードする遺
伝子を含むプラスミドpJRS42.13の種々のサブクロンの
制限地図である。白色の四角形はM6蛋白質を発現するク
ロンを示し、斜線を施した四角形は発現しないクロンを
示している。ベクターは、それぞれM13並びにpUC8及びp
UC9を用いた42.21及び42.19を除き、すべての場合pBR32
2を用いた。制限地図の上方の矢印は６型Ｍ蛋白質（emm
6）をコードする遺伝子の転写の方向及び遺伝子の概略
の範囲を示している。蛋白質のアミノ末端に相当する分
子の末端は“N"で示してある。 第４図は、サンガーら〔プロシージングス・オブ・ナ
チユラル・アカデミー・オブ・サイエンス、U.S.A.74:5
463（1977）〕の方法によつて決定されるM6蛋白質のア
ミノ末端をコードするemm 6遺伝子のDNA配列の部分及び
そのDNA配列から予測される蛋白質のアミノ酸配列を示
している。連続的エドマン分解により決定されたアミノ
末端アミノ酸はアミノ酸配列の下の“N"で示されてい
る。 第５図は第３図のプラスミどpJRS42.13の制限酵素消
化で得られるNci I/Pvu II emm 6DNAプローブによるDNA
交雑の寒天ゲル電気泳動分析を示している。各レーン中
のDNAは次のとうりである：レーン1,オリゴヌクレオチ
ドの大きさの10.90,7.74,5.15,2.44,1.80及び0.60kbの
標準，レーン2,M6株D471;レーン3,M47;レーン4,M5;レー
ン5,M19;レーン6,M26,レーン7,M11;レーン8,M24;レーン
9,M12;レーン10,M23,レーン11,M28（Ｍ株T28/51/4か
ら）；及びレーン12,M28（M+株T28/150A/5から）。 発明の詳細な記載 5.1M蛋白質免疫原 本発明はワクチン製剤における免疫原として用いられ
うる連鎖球菌Ｍ蛋白質を製造する組換えDNA技術に関す
るものである。さらに特定すれば、M6蛋白質の製造が記
載されている。 ここに記載されているように構成された組換えプラス
ミドは、宿主細胞（原核又は真核）に対し宿主細胞の分
解に対して安定かつ抵抗性のある連鎖球菌Ｍ蛋白質の生
産性を与える。かかるプラスミドは天然に存在するＭ蛋
白質の免疫学的、抗原的決定部位を含む多量の蛋白質又
はその画分を生成することができる。ここに記されてい
る特定の態様はM6蛋白質に関する。しかし、ここに記載
されるDNA分子はM6蛋白質の生産に限定されるものでは
なく、いかなるＡ群連鎖球菌Ｍ蛋白の製造にも用いうる
ものである。 M6蛋白質についてここに記載されている組成物と方法
とのすべてのＭ蛋白質への一般的応用可能性はフイシエ
テイ及びマンジユラの研究（1982,ロビンス，ヒル及び
サドフ（編集）、バクテリアル・ワクチン中の411−448
頁、連鎖球菌Ｍ蛋白質及び哺乳動物トロポミオシン間の
構造の関係の免疫学的連係）から明らかである。たとえ
ばこれまでに配列がきめられたすべてのＭ蛋白質はM5、
M6及びM24を含んで明瞭な同族性を示し、すべて多重コ
イル構造である。アミノ末端及び他の配列がきめられた
画分は３種のＭ分子のすべてについて７個の残基の周期
的くりかえしを示している。さらに数種のＭ型の免疫学
的分析は、各種の型の間の交叉反応を示した。フイシエ
ツテイ，ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジ
シン146:1108−1123（1977）；マンジユラ及びフイシエ
ツテイ，ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジ
シン151:695−708（1980）；マンジユラ及びフイシエツ
テイ，ジヤーナル・オブ・イムノロジー124:261−267
（1980）。さらに下記に示す交雑のデータは試験した56
種のＭ蛋白質遺伝子のすべての間で構造の類似性を示し
ている。 この技術における熟達者にとつては、種々の免疫原及
びワクチン製剤をつくりうることを直ちに知ることがで
きよう。 5.2M蛋白質分子プローブ ここに記載されるＭ蛋白質遺伝子又はその断片は連鎖
球菌に対する診断試験における分子プローブとして使用
されうる。この試験の原理は、病原性連鎖球菌は、本発
明のＭ蛋白質遺伝子の部分と相補的な遺伝子配列を有し
ているという事実である。かかる遺伝子の相補性は連鎖
球菌感染と疑われるものから微生物DNAを単離し、そのD
NAを固状担体上又は液状媒体中で適切な条件下に分子プ
ローブと結合させることにより直ちに検出されうる。交
雑の生起は適当なリポーター群のプローブに対する添加
により容易に検出されうる。 連鎖球菌状生物はいかなる体組織や体液中の感染部位
からも単離されうるが、単純な咽喉洗滌物は最も好適な
材料となろう。多分混合培養物であろうこのようにして
得られた微生物は直接（すなわち洗滌物上で）又は当該
技術の専門家によく知られている培養液体のいづれかの
中で多数の細胞を生成するよう生育させて用いられう
る。そして、混合培養物からのDNAは、凍結−融解、音
波処理又は他の機械的手段によりおよび／または一般的
あるいは特異的な細菌細胞壁分解試薬で処理したのち抽
出されうる。 抽出されたDNAは通常水性アルカリの添加により変性
され、ついで緩衝溶液で洗浄される。アルカリの特定の
濃度や緩衝液の組成等は実験の条件により、通常実験に
より容易に決定しうる。本発明の変性Ｍ蛋白質遺伝子プ
ローブは、ついで微生物のDNA製剤に加えられ、DNA配列
の点において相補的に交雑させられる。特異的結合は交
雑混合物を充分に洗滌して非特異的結合を除去したのち
に残すことにより確認されよう。 交雑はその目的のために開発され、認められて来てい
る多数の溶液のひとつの中で行われる。フアルコウらは
米国特許第4,358,535号明細書に全般的に溶液組成及び
交雑工程の多くの考察を記載した。この特許はその一般
的有用性の故に、ここに参考文献として包含される。他
の交雑の指標となる特定の数値、たとえば時間や温度、
および用いられる方法は本発明にとつて必須のものでは
ない。たとえばゴール及びパーデユ〔プロシージングス
・オブ・ナチユラル・アカデミー・オブ・サイエンスU.
S.A.63:378−383（1969）〕及びジヨンら〔ネイチユア
ー223:582−587（1969）〕によつて記載された方法が適
用されうる。事実交雑のために選ばれる方法は技術水準
の進歩とともに変つてゆくものと期待される。 本発明の基礎となる分子プローブは、特定の交雑を起
しうるように遺伝子配列を保持するに充分であるかぎり
は、Ｍ蛋白質遺伝子の全部又はその一部だけであっても
よい。かかる交雑はごくわずかな程度であつてさえも、
その分子プローブに適切なリポーター・グループを結合
させることによつて検出されうる。そのプローブは放射
性同位元素で標識を付しうる（たとえば32P,3H,14C,35S
等による標識）し、また化学的あるいは酵素的リポータ
ー・グループで標識されうる。たとえば、ビオチン化さ
れた（biotinylated）プローブと組み合わされた比色検
出手段を、たとえばフルオレツセイン・アビジン，ロー
ダミン・アビジン又は酵素と結合したアビジン等のアビ
ジン誘導体と共に用いることができる。 M6蛋白質のエシエリヒア・コリ（大腸菌）（Escheric
hiacoli）中でのクローニングと発現の方法及び連鎖球
菌感染を特徴づけるためのプローブとしてのM6蛋白質遺
伝子の使用法の下記する実施例は、例示の目的で記され
るもので、発明の範囲についての限定の意図によるもの
ではない。 6.実施例：連鎖球菌Ｍ蛋白質遺伝子を含むクロンの製
造、及び該遺伝子の連鎖球菌感染の診断的試験における
分子プローブとしての使用 6.1連鎖球菌DNAの単離 M6蛋白質遺伝子の起原は、ストレプトコツカス・ピオ
ゲネス（Streptococcus Pyogenes）D471株（Ａ群連鎖球
菌）であつた。Ｃ群連鎖球菌フアージ細胞溶解素（Grou
p C streptococcal phage lysin）が、30％ラフイノー
ズの存在下に、安定なプロトプラストを残してＡ群連鎖
球菌の細胞壁を溶解するために用いられた（フイリツプ
スら、プロシージングス・オブ・ナチユラル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス,U.S.A.78:4689（1981））。つい
でそのプロトプラストは充分に洗浄され連鎖球菌のデオ
キシリボヌクレアーゼ（DNAse）を除去するため蛋白分
解酵素Ｋで処理された。プロトプラストはドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）中に希釈して溶菌され、抽出物がRNA
を消化するためリボヌクレアーゼＩで処理された。塩化
セシウムが加えられた。この製品は蛋白質を除去するた
めに約100xgで遠心分離され、一夜透析された。DNAはエ
タノールにより沈澱させられた。使用のために選択され
たDNA画分は消化前に充分100キロベース（kb）以上であ
つた（P1フアージDNAを100kbの標準とし、P1分子の半分
を50kbの標準として0.4％アガローズ・ゲル上でのアガ
ローズ・ゲル電気泳動で検定した）。 6.2大腸菌へのクローニング Ｍ蛋白質生成のスクリーニングに必要な大腸菌クロン
の候補の数を減らし、かつＭ蛋白質の構造遺伝子に結合
する調節部位を残すために、連鎖球菌DNAを大きい断片
としてクローン化することにした。従つて、35ないし40
kbのDNAの挿入を受け入れるコスミド・ベクターが必要
であつた。クローニング・ビヒクルとして5.4kbのベク
ター,pJB8が選ばれた。このベクターは、イツシユーホ
ロウイツツ及びバーク、ヌクレイツク・アシツヅ・リサ
ーチ９（13）:2989−2998（1981）が記載した方法によ
りアンピシリン耐性プラスミドHomer Iと合成BamH Iリ
ンカーとから構成された。 本発明においては、ベクターpJB8は、ベクターを特有
な位置で切断し「粘着末端」を生成するBamH I（マニア
テイスら、上掲書、104−106頁が一般的に記載）で消化
された。切断されたベクターは、ベクター・ベクター間
の再結合や再環形成を防ぐために、アルカリ性フオスフ
アターゼで処理され（たとえばマニアテイスら、上掲
書、133−134）、線状化されたベクターの5'−フオスフ
エートが除去された。ランダムなDNA断片を生成させる
ため、第6.1節に記載したようにして単離された連鎖球
菌DNAを部分的に消化するためにSau 3a制限酵素が用い
られた（たとえばマニアテイスら、前掲書、298）。分
画された連鎖球菌DNAはpJB8ベクター上のBamH Iの部分
に結合された（第Ｉ図参照、たとえばマニアテイスら、
上掲書、298−299）。 連鎖球菌DNAが挿入されたベクターは試験管内でラム
ダ・フアージの頭部にとりこまれた〔ホーン及びコリン
ズ，ジーン11:291（1980）〕。とりこまれたキメラDNA
を包含するフアージは、熱的に誘起されうるプロフアー
ジを有する大腸菌K12の制限機構のない株C600（lambdac
I857）rec Aを形質導入するために用いられた。アンピ
シリン耐性コロニーが30℃で選び出され、同じ選択培地
に移され、一夜30℃で培養されて、マスター・プレート
をつくつた。 大腸菌中にクロンされたほとんどのグラム陽性遺伝子
は発現しているので、Ｍ蛋白質遺伝子が大腸菌中で発現
するという可能性は高かつた。しかし、Ｍ蛋白質はペリ
プラスム（periplasm）と外膜といういずれも連鎖球菌
には存在しないものを通して移送されなければならない
から、Ｍ蛋白質が大腸菌の表面に現われるとは思われな
かつた。この理由から、その大腸菌のマスター・プレー
トはプロフアージを誘起し、宿主細胞を溶菌するために
42℃に移され、クロン化された遺伝子の発現を確認し
た。〔シヤルカ及びシヤピロ，ジーン１:65（1976）〕 6.3M蛋白質の発現のための単一コロニーの高速検定 Ｍ蛋白質を発現する大腸菌のクロンを認識するため高
速検定法を開発した。この技術はＭ蛋白質を発現する単
一のコロニーを容易に見分けうる。 この検定法は、試験さるべき溶菌されたコロニーをニ
トロセルローズフイルターに移し、蛋白質に対するフイ
ルターの非特異的親和性を減少させるため牛血清アルブ
ミン中で該フイルターを洗滌し、そのフイルターを大腸
菌細胞で充分に予備吸収（pre−absorbed）した精製さ
れたLys M6に対する抗血清と反応させ、適宜に洗浄し、
125I−連鎖球菌蛋白質Ａ（抗原−抗体複合体に結合して
いる）と反応させ、再び洗浄し、ついでオートラジオグ
ラフイーで測定することからなる。 M6蛋白質を検出するには抗血清は1000倍以上に希釈さ
れる。抗血清が10倍希釈（さらに100倍以上濃縮され
た）で用いられたときは大腸菌と検出しうる反応を起さ
ない。この方法により、親の連鎖球菌中に生産された１
％未満の量のM6蛋白質の大腸菌クロンによる生成が検出
されうる。 スクリーンされた335のコロニーのうち、１つが精製M
6蛋白質に対する抗血清と強く反応した。この株のうち
に存在するキメラ・プラスミドはpJRS42と名づけられ
た。この大腸菌クロンのM6蛋白質の生産能はアンピシリ
ン含有培地中のサブ・カルチユア上で安定に維持され
た。プラスミドpJRS42はEcoR Iエンドヌクレアーゼで処
理され、連鎖球菌DNAの画分を除去しpJRS42.13を生成し
た。このプラスミドはすべての必要な複製機能とそのプ
ロモーター系とともにM6蛋白質をコードする完全な配列
を保持している。 6.4遺伝子産物の同定 pJB8を含む大腸菌C600NR株とpJRS42を含むC600NRトラ
ンスダクタントを、アンピシリン含有のトツド−ヘウイ
ツト肉汁（牛心臓添加肉汁（beefheart infusion brot
h））中で対数増殖期の終期まで30℃で生育させた。細
胞はペレツト化され、二度洗浄され、ついでエチレン・
ジアミンテトラ酢酸（EDTA）−リゾチームで溶菌され、
ドライアイス−エタノール中で凍結し、37℃で急速に解
凍された。DNA−アーゼ（DNAse）処理にひきつづき、1
0,000xgで30分間遠心分離して細胞の破片を除去し、抽
出物を0.45ミクロンのミリポア・フイルターに通し、50
mMの重炭酸アンモニウムに対して透析した。 大腸菌中に生成したＭ蛋白質分子の同定は免疫吸収分
析（immunoblot analysis）で決定された。フオリンの
反応〔ロウリーら、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー193:265（1951）〕で決定された当量蛋
白質濃度がSDS含有の12％ポリアクリルアミド・ゲルに
適用された。６型連鎖球菌からフアージ細胞溶解素で細
胞壁を可溶化することにより、６型連鎖球菌から抽出さ
れた精製M6蛋白質の標準製品が対照として隣接するウエ
ル（well）に対して適用された。電気泳動後、分離され
た蛋白質はニトロセルローズ上に移され、フイルター上
の未反応部位はツイーン20（ポリオキシエチレン・ソル
ビタン・モノラウレート）を用いて保護され、大腸菌で
吸収された連鎖球菌から得られた細胞溶解素で抽出され
たM6蛋白質に対して向けられた抗血清とともにフイルタ
ーがインキュベートされた。山羊の抗ウサギIgGに結合
したアルカリ性フオスフアターゼを用いる酵素結合免疫
検定法が結合抗体を検出するために用いられた。アルカ
リ性フオスフアターゼの基質としてインドキシル・フオ
スフエイトが、発色団としてニトロブルー・テトラゾリ
ウムが用いられ、ブレイクらの方法〔アナリテイカル・
バイオケミストリー136:175−179（1984）〕でバンドが
可視化された。M6抗血清は対照のM6とpJRS42を含む大腸
菌クロンの抽出物のいづれとも反応したが、pJB8ベクタ
ーのみを含む親の大腸菌の抽出物とは反応しなかつた。 大腸菌クロンにより生成されるＭ蛋白質の分子量が、
精製されたLys M6蛋白質の標準製品と免疫吸収分析（im
munoblot analysis）で比較された。この分子はフアー
ジ細胞溶解素という酵素によるストレプトコツカスの細
胞壁の可溶化とカラム・クロマトグラフイーによる精製
の結果物である。それは連鎖球菌の細胞壁から分離され
た最大のＭ蛋白質分子であることを示している。 このM6蛋白質はつぎのようにして精製された。プラス
ミドpJRS42.13を含む大腸菌をEDTA及び20％のシヨ糖の
存在下にリゾチームで処理した。これによりペリプラズ
ムの内容物が周辺の液体中に溶出される。菌体の遠心分
離によりペリプラズムの内容物を他の大腸菌関連蛋白質
とともに上澄液中にのこす。この技術を用いて、Ｍ蛋白
質はペリプラズム空間には高濃度で存在するが、実質上
は細胞質には存在しないことが知られた。従つて、この
方法はＭ蛋白質精製の出発原料を生成させるのに用いら
れた。 粗製のペリプラズム内容物中のＭ蛋白質は他の夾雑す
る蛋白質からカラム・クロマトグラフイーで精製され
た。粗製のペリプラズム調製品は5mM重炭酸アンモニウ
ムのpH5.5緩衝液で透析され、カルボキシメチルセルロ
ースのカラムにかけられた。カラムは同じ緩衝液の３倍
量で洗浄し、pH7.0で100mMリン酸ナトリウムで１段で付
着する蛋白質を溶出した。溶離蛋白（Ｍ蛋白を含む）は
25mM濃度のリン酸ナトリムウPH7.0で平衝化したヒドロ
キシアパタイトに直接使用した。カラムをカラムの２倍
量のPH7.0の200mMリン酸ナトリウムで洗浄し、ついで付
着するＭ蛋白質をpH7.0のリン酸ナトリウム400mM溶液で
溶出した。この方法によつて、高度に精製されたＭ蛋白
質製品が得られ、それはSDS−ポクアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動法と配列分析法（sequence analysis）で決
定された。 アミノ末端配列分析で精製大腸菌合成M6蛋白質から単
一のフエニルチオヒダントイン（PTH）−アミノ酸が各
分解段階で得られ、最終製品の均質性が証明された。さ
らに、アミノ末端の配列は、アミノ末端の残基を除く最
初の配列された35箇の残基によつてLys M6のアミノ末端
配列と同一であることがわかつた。大腸菌の分子はリジ
ン分子の精製の間に脱離されうるアミノ末端に余分にア
ルギニン残基を有している。精製されたLys M6製品はさ
きにM6分子でみられた多重バンドの模様を有している
が、それはおそらく抽出と精製との過程での分解による
ものであろう。３つの大きいバンドは51,000,52,000及
び53,000ダルトンのはつきりした分子量に相当する。M6
製品の大きさの異質さは、おそらく蛋白質のカルボキシ
末端部分の相違からくるものであろう。この理由は、配
列の分解による本製品のアミノ末端配列分析の間に各段
階ごとに一つのアミノ酸残基のみが放出されることによ
る。抗M6抗体と反応するpJRS42を含むクロンによるバン
ドはすべて連鎖球菌製品からのものに比して大きい（分
子量55,000,57,000,59,000ダルトン）。このことはpJRS
42はM6蛋白質の全構造遺伝子を含んでいることを示唆し
ていた。このことは、この分子の大きさが12型連鎖球菌
のプロトプラスト及びＬ型から分泌されるＭ蛋白質の大
きさとして報告されているもの（分子量58,000ダルト
ン）とよく一致しているという事実によつてうらづけら
れた。従つて、大腸菌製品中の蛋白質は、連鎖球菌の細
胞溶解素抽出により放出されるものより完全な自然のＭ
分子の大きさにより近いものであろう。 さらに、分泌性の連鎖球菌Ｌ型及びプロトプラストか
ら分離されたＭ蛋白質はもつと均質性があると思われ
る。抗M6抗体と反応性を有する大腸菌蛋白質と精製され
た標準Ｍ蛋白質のバンドとの泳動性における差異につい
ては、いくつかの説明がありうる。たとえば:1）蛋白質
は、大腸菌では除去されていないリーダー・配列を含み
うるが、連鎖球菌では通常除去されている。２）そのLy
s M6分子は連鎖球菌細胞壁に付着する間に生成する分解
産物に相当する。３）そのLys M6分子は蛋白の精製過程
で生成した部分分解物かも知れない。４）その大腸菌蛋
白質はベクター中のプロモータから生成した「融合」物
質かも知れない。５）連鎖球菌では機能できない翻訳開
始配列が大腸菌中では活性なのかも知れない。及び／又
は６）連鎖球菌中では通常機能的な「停止」コドンが大
腸菌の株中ではsup E変異によりおさえられているのか
も知れない。 6.5遺伝子産物の免疫原的特徴づけ 大腸菌のＭ蛋白質と連鎖球菌の細胞溶解素での抽出に
よるＭ蛋白質のオクテルロニー・イムノデイフユージヨ
ン（Ochterlony immnodiffusion）での比較を行つた。
ウエル１（well1）には連鎖球菌で合成された細胞溶解
素抽出M6に対して製造された吸収されていないウサギの
抗血清を入れた。ウエル２には精製された細胞溶解素抽
出M6蛋白質を入れた。ウエル３にはDEAEとCMセルロース
上のクロマトグラフイーで部分的に精製されたエスチエ
リチアコリー（E.coli）C600NR（pJRS42）株から得られ
たM6蛋白質を入れた。反応はpH8.6で50mMバルビトール
緩衝液中で調製した１％寒天ゲル中で行われた。ゲルは
乾燥し、クーマシー・ブルー（Coomasie blue）で染色
した。 この二重拡散実験の結果は（ゲルは示されていな
い）、pJRS42を有する大腸菌の抽出物（挿入なしのプラ
スミドのそれではない）は、少なくとも連鎖球菌M6蛋白
質のそれらのあるものには共通な抗原決定部位を含んで
いるという結論を裏付けた。そこで、大腸菌製品はより
高い見かけの分子量を有しているけれども、大腸菌中で
合成されたM6蛋白質は６型連鎖球菌から抽出されたＭ蛋
白質と同じ型特異性決定部位を有している。 6.6クロン化Ｍ蛋白質の減菌効果 大腸菌の生産したＭ蛋白質がウサギ及びヒトのオプソ
ニン抗血清の両者からのオプソニン抗体を除去するに要
する抗原決定部位を含むかどうかを決定するため、次の
吸収実験を行つた。 精製した大腸菌で合成したM6蛋白質が30μｇづつ２つ
に分けて凍結乾燥された。一方にウサギの６型オプソニ
ン抗血清（0.5ml）を加え、同様の量の６型連鎖球菌に
対するヒト血清オプソニンを他の乾燥蛋白質標本に加え
て溶液をつくつた。これらの試験管を37℃で１時間培養
し、４℃で一夜放置した。かくして得られた沈澱を20,0
00xgで遠心分離し、得られた上澄液を６型連鎖球菌を用
いる滅菌検定に使用した。 間接的滅菌検定は当初ランスフイールドによつて記載
されたように（ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル
・メジシン110:271（1959））して行つた。正常な提供
者（normal donors）から得たペパリン処理された全人
血を食細胞原として用いた。６型連鎖球菌の希釈物（10
0μ）を、吸収され又は吸収されていない血清（100μ
）の存在又は不存在下に、人血400μに混合した。
混合物を37℃で３時間回転させた。存在している生物を
埋没平板法で決定した。抗血清なしで回転させた対照に
ついて提供者の血液中で連鎖球菌が生育する能力のテス
トを行なつた。大腸菌トランスダクタントが生成したＭ
蛋白質は、ウサギ及びヒトの血清からオプソニン抗体を
除去した。第１表参照。従つて、大腸菌Ｍ蛋白質の抗食
菌作用性決定部位は自然のM6分子のそれと同様に機能す
る。 6.76型食菌性抗体の生産 精製された大腸菌が生産したM6蛋白質による免疫後の
ウサギ中での６型オプソニン抗体の生産は次のようにし
て行われた。精製された大腸菌が生産したM6蛋白質に対
する抗血清がニユージーランドシロウサギ中で作られ
た。一次接種は完全フロインド担体で乳化した100μｇ
のM6蛋白質から成り、複数部位に皮下投与された。動物
は４週間後に不完全フロインド担体中の同用量のM6蛋白
質で増強された。動物は10日後採血された。 滅菌検定（上記）により認められたところによれば、
大腸菌M6蛋白質で免疫されたウサギは６型連鎖球菌の食
菌作用性を認める抗体を産生した。第２表参照。6.8連鎖球菌に対する診断試験 6.8.1M遺伝子DNAプローブの製造と精製 M6型蛋白質をコードする遺伝子（emm6）をつきとめる
ため、上記第6.3節中に記載されたプラスミドpJRS42.13
を種々の制限酵素又はその複合体による消化に付した。
かくして得られたDNA断片は上記マニアチスらの文献150
−161頁に記載されているところにより0.8％アガロース
・ゲルを通して電気泳動に付して分画され、ついで種々
のベクター中に結合された。熱誘導性（thermally indu
cible）ラムダ・フアージに対し溶原性エスチエリチア
・コリー（E.coli）K12菌中に、これらの組換えベクタ
ーが組み込まれ、第6.4節に記載したように抗M6蛋白質
抗血清と反応性を有する蛋白質の生産についてスクリー
ニングされた。 多数のこれらのクロン化されたDNA断片についてのM6
蛋白質発現分析結果を第３図に示す。白色のブロツクで
示されているクロンは抗M6抗血清と反応性があつたが、
斜線を施したブロツクで示されたものは反応性がなかつ
た。pJRS42.19のようないくつかの反応性クロンは全M6
蛋白質をコードする連鎖球菌DNAをごくわずかしか含ん
でいなかつたが、その発現する物質はあきらかにポリク
ロナール抗血清と抗原性反応性を示すに充分な大きさで
あつた。 クロン化されたDNA断片中のemm6遺伝子の配置につい
てさらに検討するため、プラスミドpJRS42.19中の連鎖
球菌DNAをプラスミドpUC9及びpUC8のBamH I部分に挿入
した〔メツシング及びベイラ，ジーン19:269−276（198
2）〕。これらプラスミド相互間の関係は挿入されたDNA
がプラスミド中で反対の方向に配列されている。抗M6抗
血清は、これらクロンの両方の製品と反応し、連鎖球菌
DNAがこれらのベクターのいづれの配列中にも存在する
ときにM6蛋白質画分が合成されることを示している。従
つて、挿入された連鎖球菌DNAはそれ自身のプロモータ
を有しているものと思われる。もしこの結論が正しけれ
ば、pJRS42.19はM6蛋白質のＮ末端をコードするものの
はずである。 pJRS42.19の連鎖球菌DNA断片をM13mp8及びmp9中に挿
入〔メシング及びベイラル，上掲書〕したのち、サンガ
ーのジデオキシ法〔サンガーら、プロシージングス・オ
ブ・ナチユラル・アカデミー・オブ・サイエンス・U.S.
A.74:5463（1977）〕で挿入されたDNAの配列が決定され
た。M6蛋白質のアミノ末端をコードする部分配列をそれ
により特定されるアミノ酸配列とともに第４図に示す。
逐次的エドマン分解により決定された（参考文献）アミ
ノ末端アミノ酸は、アミノ酸配列の下に「Ｎ」で示して
ある。この方法で決定されたアミノ酸配列はペプシン処
理により、又はフアージ溶菌により連鎖球菌ストレイン
D471〔参考〕から抽出されたM6蛋白質のアミノ末端につ
いて確立されている配列と同一であつた。それはまた、
上記第6.4節中の大腸菌における組換えDNA方法により生
成されたＭ蛋白質のアミノ末端部分とも同一であつた。 これらの結果は、emm6遺伝子はpJRS42.19中に含まれ
るDNA中に始まることを示した。第４図に示されるDNA配
列とアミノ酸配列の比較は、さらに、第３図に示すよう
に、M6蛋白質のＮ末端はNci I部位の左へ32番目の塩基
の点であることを示している。 大腸菌中で生成されたM6蛋白質は、ドデシル硫酸ナト
リウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動〔フイシエ
ツチら、ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジ
シン159:1083−1095（1984）〕により明らかに59,000ダ
ルトンの分子量を有することが示された。この事実は遺
伝子配列の他の末端を第３図におけるPvu II部位または
その付近に定めることとなる。さらに配列の分析をつづ
けたところ、蛋白質を終了する無意味なコドンTAAがPvu
II部位の右へ38番目の塩基に位置していることが明ら
かとなつた（ホリングシードら、原稿作成中）。 プラスミドpJRS42.13をNci I及びPvu IIで処理してem
m6遺伝子の大部分を含む適当なプローブを作成した。pJ
RS42.13の制限酵素地図中でのこのプローブの位置を第
３図に太い矢印で示す。このプローブ断片は、0.8％ア
ガロース・ゲル中での電池泳動法、電気的溶出及びエル
チツプ−ｄ（Elutip−ｄ）のカラム（シユライヘル及び
シユエル）を通過させることにより精製された。 6.8.2細菌のDNAの単離 Ａ群連鎖球菌の細胞をフイシエツチらの方法〔ジヤー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン133:1105
（1971）〕で溶菌するのにはフアージ細菌溶解素を用い
た。他の連鎖球菌については、一夜のトツド・ヘウイツ
ト・酵母肉汁培養物（酵母抽出物を添加した牛心臓浸出
肉汁）を10倍に希釈し、37℃で細胞濃度を1mlあたり約
５×106細胞となるまで生育させた。３％（w/v）の濃度
までグリセリンを添加し、細胞をさらに２時間37℃で培
養した。ついで細胞を洗浄し、15秒のパルスで２度音波
処理し、庶糖30％（w/v）とリゾチーム10mg/mlを含む10
mMトリス・塩酸塩緩衝液PH8.0中に分散させた。 37℃で30分間インキュベートしたのち、最終濃度10mM
までエチレンジアミンテトラ酢酸を加え、さらに37℃で
30分間インキュベートを続けた。ついでプロテアーゼＫ
〔0.1mg/ml、源（source）〕及びドデシル硫酸ナトリウ
ム（１％w/v）を加え、これらの成分をゆつくりと回転
させて混合し、さらに37℃で30分間インキュベートを続
けた。この工程につづいて、混濁を示さない細胞懸濁液
を界面に蛋白質がみえなくなるまでフエノール：クロロ
フオルム（10:1）で抽出した。抽出されたDNAは、つい
でエタノールで沈澱させた。 試験した細菌株は、スタフィロコツカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus），バチルス・スブチリス
（B.subtilis）（CU1065株）、ストレプトコツカス・プ
ノイモニエ（Streptococcus pneumoniae）及びロツクフ
エラー大学のコレクシヨンから得られた次の連鎖球菌株
であつて、それぞれ特異的抗血清をつくるのに用いられ
る標準タイピング及びグルーピング株である。M1,T1/19
5/2;M3,B930/61/5;M3R,D58X;M4,T4/95/RB5;M5,T5B/126/
4;M6,S43/192/3;M8,C256/86/3;M11,T11/137/3;M12,T12/
126/4（COL6）;M14,T14/46/8,M15,T15/23/7,M18,J17C/5
5/4;M22,T22/146/1;M23,T23/102/RB5;M24,C98/135/2;M2
5,B346/136/1;M27,T27/87/1;M28,T28/150A/5;M29,D23;M
30,D24/126/3;M31,J137/69/3;M32,C121/39/8;M33,C107/
102/2;M36,C119/83/2;M37,C242;M38,C94/80/2;M39,C95/
95/1;M40,C143/25/9;M41,C101/103/4;M42,C113/55/5;M4
3,C126/170/2;M46,C105/41/5;M47,C744/RB4/6/5;M48,B4
03/48/5;M49,B7371/137/2;M50,B514/33/6;M51,A309/77/
1;M52,A871/106/2;M53,A952/94/3;M54,A953/87/3;M55,A
928/73/1;M56,A963;M57,A995/91/2;M58,D315/87/3;M60,
D335/38/3;M63,D459/50/2;M66,D794/76/2;M67,D795/95/
1;A群,J17A4;B群,090R;C群,C74;D群,D76;E群,K131;F群,
F68C;G群,D166B;H群,F90A;L群,D167A;M群,D168A“X";N
群,C559;O群,B361。次のＡ群でＭ型にタイピングされる
ジヨージア州アトランタのセンター・フオー・デイジー
ズ・コントロールから入手された株も使用された。M2,S
S633;M9,SS754;M13,SS936;M17,SS631;M19,SS400;M34,SS
134;M59,SS913及びM62,SS984. 6.8.3ドツト・ブロツト（Dot blot）交雑実験 カフアトスら〔ヌクレイツク・アシツド・リサーチ
７;1541−1552（1979）〕が記載した特異的DNA配列をみ
つける手段を用いて、抽出されたDNAの標本についてド
ツト・ハイブリダイゼーシヨンが行われた。ボツチヤン
らの方法〔セル９:269−287（1976）〕でニツク翻訳に
より32Pで標識したのち、プローブに対してemm6遺伝子
の大部分を含むNci I/Pvu IIDNA画分（第6.8.1節）が用
いられた。 交雑を行うにあたつて、種々の微生物原から得られた
DNA抽出物は室温で15分間0.6NNaOH中で変性され、つい
で０℃で10分間変性された。さらに、試料は2M酢酸アン
モニウムで中和され、DNAの画分はベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーの多枝管中のバイオダインA0.2ミクロン
・ナイロン・フイルター（ニユーヨーク州グレン・コー
ブ，ポール・フイルトレーシヨン・コーポレーシヨン）
上にスポツトされた。交雑は1.8Mトリス塩酸塩を含み、
0.2Mのトリス塩基を含む緩衝液中でニツク翻訳された32
Pプローブを少なくとも２×106cpm/フイルターの割合で
加え、フイルターを一夜64℃に保持することにより行わ
れた。フイルターは、ついで同じ緩衝液を用いて64℃で
10回洗浄され、乾燥され、増感スクリーンを用いコダツ
クXAR−５フイルム上でオートラジオグラフイーに付さ
れた。露光は−80℃で２−４日行われた。 これらの実験結果の要約を第３表に示す。 全体としてドツト・ブロツト実験は、emm6プローブと
Ａ群連鎖球菌の56種中の56の異なるＭ型から得られるDN
A、及びＡ群株のタイプ分けできない４種及びすでにM-
と特徴づけられている２つの株との間に交雑が認められ
た。グラム陽性菌であるスタフイロコツカス・オウレウ
ス（Staphylococcus aureus）又はバチルス・スブチリ
ス（Bacillus subtilis）からのDNA、連鎖球菌ランスフ
イールドB,D,E,F,H,L,M,N又はＯ群からのDNA、又はスト
レプトコツカス・プノイモニエ（Streptococcus pneumo
niae）からのDNAとは交雑は見られなかつた。しかし、
Ｃ群及びＧ群連鎖球菌DNAとは交雑がみられた。この知
見は、Ｃ群連鎖球菌はしばしばヒトの感染に関係し、あ
る株はその外面に機能的にＭ蛋白質と同様な分子を有し
ているらしいので予期し得ない知見ではなかつた〔ウー
ルコツク，インフエクシヨン・アンド・インムノロジー
10:568（1974）〕。 Ｇ群連鎖球菌もまた広範囲のヒトへの感染を起すこと
が報告されている。これらの生物の毒性が必ずＭ様細胞
表面蛋白質の存在によるかどうかははつきりしないが、
そういうこともありうるところである。ヒト感染物から
分離したＧ群連鎖球菌の３株を試験したところ、12型Ｍ
細胞蛋白質が株中に存在することがわかつた〔マクステ
ツド及びポター，ジヤーナル・オブ・ゼネラル・マイク
ロバイオロジー49:119（1967）〕。 試験されたＡ群株の中に、機能的にM-（すなわち、保
護的Ｍ蛋白質を生成せず食菌性化されたもの）が３株あ
つた。これらのM-株の２種からのDNAは、それにも拘わ
らずemm6遺伝子プローブと交雑し、少なくともいくらか
のemm遺伝子を完全に保持していることを示した。おそ
らく、これらの株は、そのemm遺伝子産物が無機能的（n
onfunctional）であるかわずかな量しか合成しないよう
な変異株であろう。１つのM-株からのDNAはプローブと
交雑せず、その株中ではemm遺伝子は実質的に除去され
ていることを示唆していた。 ドツト・ブロツト実験の結果は、種々のＭ型Ａ群連鎖
球菌株から得られるDNAを抽出し、Nci I及びHind IIIで
消化する実験により確かめられた。得られるDNA断片の
試料は、マニアテイスら、上掲書、150−161に記載のア
ガロース・ゲル・電気泳動で分離され、emm6の32Pで標
識されたプローブと交雑され、雑種DNA断片の位置がオ
ートラジオグラフイーで示された。結果は第５図に示
す。 第５図において、第１列は32Pで標識された10.9,7.7
4,5.15,2.44,1.80及び0.60kbのDNA分子サイズのマーカ
ーを示す。第２列ないし第10列は連鎖球菌Ｍの型6,47,
5,19,26,11,24,12及び23のそれぞれから得られたDNAの
プローブ交雑Nci I/Hind III画分を含んでいる。各々の
場合、プローブで交雑された２種または以上のDNAフラ
グメントが含まれていた。ドツト・ブロツト試験から予
期されたように、T28/51/4のM-株からのDNAは交雑しな
かつた（第11列）が、T28/150A/5のM+株（第12列）は交
雑した。 7.微生物の寄託 次表に示すプラスミドを有する次表の大腸菌は、イリ
ノイ州ペオリアのアグリカルチユラル・リサーチ・カル
チユア・コレクシヨン（NRRL）に寄託されており、次の
寄託番号を付与されている。 寄託微生物は本発明の幾多の態様を代表することを意
図したものであるから、本発明は寄託された微生物によ
り範囲として限定されるべきものではない。事実、ここ
に示され、記載されたところに加えて、この発明の種々
の修飾は、以上の記載と添付の図面から、当該技術の専
門家にとつては明らかとなるであろう。かかる修飾は、
下記する請求の範囲のうちに入るべきことを意図してい
る。 本明細書中でヌクレオタイドについての塩基対の大き
さは概略のものであつて、記載の目的のために使用され
たものである。
（Department of Health and Human Services）の国立
衛生研究所からの補助金の援助を受けてなされたもので
ある。 発明の分野 本発明はＡ群連鎖球菌のM6蛋白質のような抗食菌作用
性連鎖球菌蛋白質を診断用プローブとして用いるため
の、及びそれを免疫原として利用したワクチンを製造す
るための組成物及び方法に関する。Ｍ蛋白質は繊維状表
面分子であつて、それは連鎖球菌を、感染した宿主生物
のマクロフアージ及び多形核（polymorphonuclear）好
中球（neutrophiles）により、食菌作用に抵抗するよう
になしうる。 本発明はＭ蛋白質又はその一部をコードするDNA配列
をビールスDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNAのよう
なプラスミドDNAに挿入するために組換えDNA技術を利用
し、これによりそのプラスミドは細菌の宿主又は他の単
細胞系中にＭ蛋白質の遺伝子を複製し発現させることが
できる。生ずる組換えDNA分子はＭ蛋白質、又はそのあ
る部分又は分子の変化したものを製造しうるように宿主
細胞に導入される。産生した蛋白質はついで分離され、
精製され連鎖球菌感染に対するワクチン中の免疫原とし
て用いるために修飾される。 本発明はさらにＡ群、Ｃ群及びＧ群の連鎖球菌の検出
法を提供する。かかる検出はＡ群連鎖球菌のＭ蛋白質を
コードする全遺伝子又はその遺伝子の断片に基づく特定
の分子状プローブを使用して達成される。交雑（DNAの
ハイブリダイゼーション）スクリーニング法において有
用なDNAプローブが連鎖球菌感染と疑われる場合の臨床
的分離物の検査のためにここに記載されている。 発明の背景 急性リウマチ熱や急性糸球体腎炎（glomerulonephrit
is）がＡ群連鎖球菌感染の後遺症であることは広く認め
られているところである。熱帯及び亜熱帯の開発途上国
においてはリウマチ性心臓疾患が現在心障害の最も普通
の形である。世界のある開発途上の都市部の貧民街にお
ける学齢児童についてこの病気の流行率は1,000人に対
し22−23人もの高さであることが報告されている。イン
ドだけでも６百万もの多くの子供が苦しんでいることと
なる。この病気の正確な発病機構はわからないが、リウ
マチ熱、さらに急性腎炎がストレプトコツカス・ピオゲ
ネス（streptococcus pyogenes）（Ａ群連鎖球菌）の感
染に伴うものであることは明らかである。 連鎖球菌Ｍ蛋白質は、それが食細胞攻撃に対する抵抗
性を生物に与えるという事実に基づいてこの細菌の重要
な毒性因子である。抗原変異は、Ａ群連鎖球菌が宿主の
免疫反応を避けることができ、その結果人間に病気を起
こす主要機構である。Ａ群連鎖球菌感染に対する抵抗性
は、生物の表面に見いだされる繊維状分子であるＭ蛋白
質に対する型特異的（type−specific）な抗体の存在に
よるものである。分類し得ない（nontypable）株のいく
つかに加えて、現在では約70の明らかなＡ群連鎖球菌Ｍ
形が認められている。ある種のＭ型の間で交叉反応性が
あるのは普通であるという事実にも拘わらず、同族の型
に対してつくられた抗体のみが生体の食菌作用を発生せ
しめうる（すなわち、それらはオプソニン抗体であ
る）。さらに、すべての同族体、又は型特異性抗体が食
菌性であるというわけではない。 特定の抗血清がＡ群連鎖球菌に対してつくられうると
いう事実は、咽喉洗滌によつて得られるもののような臨
床上の分離物を血清学的な試験に付することにより連鎖
球菌感染を検出することを可能にした。感染におけるＡ
群連鎖球菌の同定は純粋培養中の生物の単離、群特異的
炭水化物の抽出、及び群特異的抗血清との反応とを必要
とする。すべての病原性株に対してのみ共通な性質に基
づきうる連鎖球菌感染に対する臨床試験は、従つて非常
に望ましいものとなる。 2.1組換えDNA技術と遺伝子の発現 組換えDNA技術は、それにより特定のDNA断片が宿主細
胞中で複製し、転写しうるベクターと呼ばれる遺伝学的
要素中に挿入されるDNAクローニングの技術を包含して
いる。ベクターはプラスミド又はビールスのいづれでも
ありうる。プラスミドは小さい環状の二重螺旋DNAの分
子で、それは天然にバクテリアや酵母中に見出され、そ
こで宿主細胞の繁殖とは無関係な単位として複製する。
これらのプラスミドは通常全宿主細胞DNAのわずかなフ
ラクシヨンとしてのみ説明され、しばしば抗生物質に対
する耐性を与える遺伝子を保有している。これらの遺伝
子、そして比較的小さい大きさのプラスミドDNAが組換
えDNA技術において利用される。 組換えDNA分子の挿入されたDNA断片は自然には宿主生
物と情報を交換しない生物から誘導されうるものであ
り、また全体的にあるいは部分的に合成的に作られうる
ものである。制限酵素及び結合方法（ligation metho
d）を用いて組換えプラスミドを製造する方法はコーエ
ン及びボイヤー発明にかゝわる発行された米国特許第4,
237,224号に記載されている。このようにしてつくられ
た組換えプラスミドは形質転換の手段により単細胞生物
中に導入され、複製される。そこに記載されている技術
の一般的適用性の故に、米国特許第4,237,224号はここ
に本明細書中に参考文献として包含される。 単細胞生物中に組換えDNA分子を導入する別の方法
は、コリンズ及びホーンにより、米国特許第4,304,863
号に記載されており、それもまたここに参考文献として
包含される。この方法は、バクテリオフアージ・ベクタ
ーによるパツケージング／トランスダクシヨン（packag
ing/transduction）システムを利用するものである。 プラスミドは高次螺線であるので、宿主細胞のDNAか
ら容易に分離することができ、精製することができる。
クローニング・ベクターとして用いるには、このような
精製プラスミドDNA分子は制限ヌクレアーゼで切断さ
れ、クローンさるべきDNA断片に結合される。製造され
た雑種のプラスミドDNA分子は、次いで一時的に大分子
（コンピーテントに）に対して浸透性を有するようにさ
れたバクテリア中に再導入される。処理された細胞のい
くつかだけがプラスミドを拾いあげ、これらの細胞はプ
ラスミドによつてそれらが獲得している抗生物質耐性に
よつて選択できる。それはそれらのものだけが抗生物質
の存在下に生育するからである。これらのバクテリアは
分裂するから、プラスミドもまた当初のDNA断片の多数
のコピーをつくるように複製する。繁殖期間の終りに、
雑種のプラスミドDNA分子は精製され当初のDNA断片のコ
ピーは同じエンドヌクレアーゼによる第二の処理で切断
される。 構築に用いられた方法には無関係に、組換えDNA分子
は宿主細胞と両立し得なければならない。すなわち、宿
主細胞中で自律的に複製できなければならない。組換え
DNA分子は、その組換えDNA分子により形質転換された宿
主細胞を選択できるマーカーの機能をも有していなけれ
ばならない。さらに加えて、プラスミド上に適当な複
製、転写及び翻訳のシグナルが正確に配置されているな
らば、外来遺伝子は形質転換細胞及びその子孫中に適切
に発現するであろう。 2.2ワクチン ワクチンは病気の制御と予防へのアプローチである。
ワクチンは抗原の免疫原部分をアジユバントと混合する
ことにより製造できる。この製剤は宿主の動物又はヒト
に注射すると、その抗原に対する抗体の産生を誘導し、
その抗原を生ずる対象生物により起る病気に対する活性
な免疫を与える。 ペプタイド・ワクチンは、バクテリアおよびビールス
の表面蛋白質の部分のような必要かつ適切な免疫原物質
のみを含んでいる。ペプタイド・ワクチンは高度に純化
されたバクテリアの画分から該当するペプタイドを単離
することにより、又は該当するポリペプタイドを合成す
ることによつてつくることができる。ペプタイド・ワク
チンの大きい利点は、バクテリア起原の無関係な物質
や、宿主又は提供主から導かれる障害となる物質の排除
にある。しかし、現在において、これらの方法を用いて
のペプタイド・ワクチンの製造は、一般的に広範囲の商
業的使用にはあまりにも高価につく。組換えDNA技術は
ペプタイド・ワクチンの製造に多くを提供する。バクテ
リアの適切な免疫原部分をコードするバクテリア遺伝子
の分子クローニング及び宿主細胞での発現により、ペプ
タイド・ワクチンにおいて使用するための適切な免疫原
の充分な量を製造することができる。 ワクチンは、しばしば種々のアジユバンドとともに乳
化液として投与される。アジユバンドは、免疫原それだ
けを投与するときよりも、よりわずかな投与量でより少
ない量の抗原を用いて、より持続性があり、より高レベ
ルの免疫を達成することに役立つ。アジユバンドの作用
機序は複雑であり、完全にはわからない。しかし、それ
は細網内皮組織の食菌作用や他の活性を刺激するととも
に、抗原の放出と分解を遅延させることを含んでいるで
あろう。アジユバンドの例としては、フロインドのアジ
ユバンド（Freund′s adjuvant）（完全又は不完全）、
アジユバンド65（落花生油、マンナイド・モノオレエー
ト及びモノステアリン酸アルミニウムを含む）、及び水
酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は明礬のよう
な鉱物質ゲルが挙げられる。フロインドのアジユバント
は、もはやヒトや食用動物のためのワクチン製剤には用
いられない。それは代謝できない鉱物質油を含んでい
て、それが潜在的癌原性物質（potential carcinogen）
でありうることによる。しかし、鉱物質ゲルは商業上獣
医用ワクチンに広く用いられている。 2.3M蛋白質抗原を用いる連鎖球菌ワクチン開発の試み フオツクス（ジヤーナル・オブ・イムノロジー93:826
−837（1964））は、連鎖球菌から精製したＭ蛋白質を
型特異的（type−specific）な滅菌性抗体（bactericid
al antibodies）を誘導するためにウサギにおける免疫
原として用いた。しかし、部分的精製連鎖球菌Ｍ蛋白質
でヒトにワクチン接種をする試みは常に被接種者に強い
局所および組織的反応が起つたため成功に至らなかつ
た。シユミツト、ジヤーナル・インフエクシヤス・デイ
ジーズ106;250−255（1960）及びポツターら、ジヤーナ
ル・クリニカル・インベストメント41:301−310（196
2）参照。フオツクスら、ジヤーナル・オブ・インフエ
クシヤス・デイジーズ120:598−604（1969）及びフオツ
クスら、ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジ
シン124:1135−1151（1966）は、精製された酸抽出した
Ｍ蛋白質を用い、一部についてそのワクチンを用いて成
功した。ワクチン接種を受けた22名の成人のうち15名は
型特異性抗体力価の二次上昇を伴う反応を示したが、５
人についてのみ抗バクテリア抗体の上昇を示したにすぎ
なかつた。 ビーチエイら、ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メジシン150:862−877（1979）は、M24蛋白質のペ
プシン誘導画分（pepsin−derived fragment）（Pep M2
4）の明礬沈澱製剤で12名の成人にワクチン接種を行な
つた。局所的又は全身的反応が観察されなかつたから、
これは充分に親和性があるものと考えられた。ワクチン
接種を受けた12名のうち10名がM24型特異的オプソニン
抗体を産生することにより反応を示した。 デイルらによる免疫学的研究、ジヤーナル・オブ・エ
クスペリメンタル・メジシン151:1026−1037（1980）に
よれば、12名のボランテアのうちの２名がM24で免疫さ
れたがM5及びM6蛋白質の両者に結合するように改良され
た抗体のM6だけがオプソニツクであつた。しかし、ビー
チイらは、シンポジウム・オン・バクテリアル・ワクチ
ン、ジエイ・ビー・ロビンス編、ジエイ・シー・ヒル、
ブライアン・デツカー・パブリシヤー、ニユーヨーク、
401−410頁（1981）で、精製されたPep M5蛋白質（M5蛋
白質のペプシン誘導画分）で免疫された４匹の兎のうち
の１匹が高い力価で心臓組織に対する抗体を生成したこ
とを見出した。この抗血清は、M5型蛋白質と心臓組織と
交叉名疫反応を起した。 2.4DNA交雑検定 病原微生物の検出のための通常の診断的方法は、かか
る生物中に見出されると思われるゲノムのDNA断片が純
粋な形態で入手できるならば、創案できるだろう。もし
そうならば、化学的、酵素的又は放射性同位原素的レポ
ーター・グループで標識をつけることにより、そのDNA
断片を交雑プローブとして用いることができよう。 グルンスタイン及びホグネス〔プロシージングス・オ
ブ・ナチユラル・アカデミー・オブ・サイエンス,U.S.
A.72:3961（1975）〕は、このアプローチをコロニー・
ハイブリダイゼイシヨンと呼ばれる方法で使用した。こ
の方法では、検定されるべきバクテリアはニトロセルロ
ース・フイルターに移された。フイルター上のコロニー
はついで分解され、溶出するゲノムDNAはフイルターに
固定された。32Pで標識されたプローブの配列に補充的
に付加されたDNA中のヌクレオチド配列の存在はオート
ラジオグラフイーによつて追跡された。DNAの交雑の他
の一般的態様はフアルコウらにより米国特許第4,358,53
5号明細書に記載されている。 発明の概要 連鎖球菌のＭ蛋白質遺伝子の単細胞生物中でのクロー
ニングと発現のための方法と組成物とが提供される。ま
た、これらの新規な単細胞生物をＭ蛋白質を生産するた
めに培養する方法、Ｍ蛋白質DNAを発現する単一のコロ
ニーを同定する急速検定、及び遺伝子産物の特定のため
の方法も記載されている。ここに記されている組換えDN
A技術により製造されるＭ蛋白質は、ストレプトコツカ
ス・ピオゲネス（Streptococcus Pyogenes）感染に対し
て保護するためワクチン中の免疫原として用いるために
調製されうるものである。 ここに記載されている特定の態様では、大腸菌トラン
スダクタント（E.coli transductants）により生産され
る蛋白質はＡ群連鎖球菌の細胞壁の可溶化によつて単離
されるM6蛋白質よりごく少し大きいが、連鎖球菌のプロ
トプラストとＬ型により分泌されるものと同程度の大き
さを有している。免疫学的に大腸菌トランスダクタント
により合成される分子は連鎖球菌M6蛋白質と同じ型特異
性決定部位を有している。Ｍ蛋白質は、オクターロニー
（Ouchterlony）二重融合実験により抗原的に、（ａ）
オプソニン抗体除去試験及び（ｂ）オプソニン抗体の生
産誘導能により免疫原的に特徴づけられる。クロン化さ
れたＭ蛋白質は単離され、ドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミド・ゲル電気泳動法で分画される。さら
に発現された遺伝子産物の単離方法も記載されている。 本発明は連鎖球菌のオプソニン抗体及び抗原の製造法
を提供する。それらは、ヒトの医薬及び微生物学的研究
において一般的重要性を有するものである。この用途は
本発明で生産される連鎖球菌Ｍ蛋白質をラジオイムノア
ツセイのような超高感度検定のための高度に再現性を有
する標準抗原として用いることを含むものである。これ
らの検定は生物学的標本中の連鎖球菌に対する抗体の発
見のための診断的手段として用いられうる。 連鎖球菌Ｍ蛋白質遺伝子又はその画分の分子プローブ
としての使用を通じて、生体組織及び体液中の病原性連
鎖球菌の診断的同定のための方法も提供されている。本
方法においては、DNAが微生物的単離物から抽出され、
分子状プローブへの交雑により相補的ヌクレオチド配列
が試験される。この手段によつて多数の単離物中の、比
較的容易に連鎖球菌の存在を高感度、高信頼度でスクリ
ーニングできる。その結果は現在用いられているより厄
介な血清学的診断検査よりも顕著に有利なスクリーニン
グ・テストを提供するものである。 図面の簡単な説明 本発明は以下の詳細な発明の記載と図面を参照するこ
とによりより充分に理解しうるであろう。図面におい
て： 第１図（大きさは比例していない）は連鎖球菌DNA断
片とpJB8から導かれた組換えプラスミドであるpJRS42の
構造を示している。（第6.2節参照）連鎖球菌DNA中の種
々の制限部位は示されていない。 第２図はpJRS42.13の制限地図を示す。本プラスミド
はpJRS42から不必要な連鎖球菌DNAを除くためEcoR Iで
消化し再結合することにより誘導された。プラスミドpJ
RS42.13はEcoR I部位を一箇所のみ有している。（第6.3
節参照） 第３図は６型Ａ群連鎖球菌のM6蛋白質をコードする遺
伝子を含むプラスミドpJRS42.13の種々のサブクロンの
制限地図である。白色の四角形はM6蛋白質を発現するク
ロンを示し、斜線を施した四角形は発現しないクロンを
示している。ベクターは、それぞれM13並びにpUC8及びp
UC9を用いた42.21及び42.19を除き、すべての場合pBR32
2を用いた。制限地図の上方の矢印は６型Ｍ蛋白質（emm
6）をコードする遺伝子の転写の方向及び遺伝子の概略
の範囲を示している。蛋白質のアミノ末端に相当する分
子の末端は“N"で示してある。 第４図は、サンガーら〔プロシージングス・オブ・ナ
チユラル・アカデミー・オブ・サイエンス、U.S.A.74:5
463（1977）〕の方法によつて決定されるM6蛋白質のア
ミノ末端をコードするemm 6遺伝子のDNA配列の部分及び
そのDNA配列から予測される蛋白質のアミノ酸配列を示
している。連続的エドマン分解により決定されたアミノ
末端アミノ酸はアミノ酸配列の下の“N"で示されてい
る。 第５図は第３図のプラスミどpJRS42.13の制限酵素消
化で得られるNci I/Pvu II emm 6DNAプローブによるDNA
交雑の寒天ゲル電気泳動分析を示している。各レーン中
のDNAは次のとうりである：レーン1,オリゴヌクレオチ
ドの大きさの10.90,7.74,5.15,2.44,1.80及び0.60kbの
標準，レーン2,M6株D471;レーン3,M47;レーン4,M5;レー
ン5,M19;レーン6,M26,レーン7,M11;レーン8,M24;レーン
9,M12;レーン10,M23,レーン11,M28（Ｍ株T28/51/4か
ら）；及びレーン12,M28（M+株T28/150A/5から）。 発明の詳細な記載 5.1M蛋白質免疫原 本発明はワクチン製剤における免疫原として用いられ
うる連鎖球菌Ｍ蛋白質を製造する組換えDNA技術に関す
るものである。さらに特定すれば、M6蛋白質の製造が記
載されている。 ここに記載されているように構成された組換えプラス
ミドは、宿主細胞（原核又は真核）に対し宿主細胞の分
解に対して安定かつ抵抗性のある連鎖球菌Ｍ蛋白質の生
産性を与える。かかるプラスミドは天然に存在するＭ蛋
白質の免疫学的、抗原的決定部位を含む多量の蛋白質又
はその画分を生成することができる。ここに記されてい
る特定の態様はM6蛋白質に関する。しかし、ここに記載
されるDNA分子はM6蛋白質の生産に限定されるものでは
なく、いかなるＡ群連鎖球菌Ｍ蛋白の製造にも用いうる
ものである。 M6蛋白質についてここに記載されている組成物と方法
とのすべてのＭ蛋白質への一般的応用可能性はフイシエ
テイ及びマンジユラの研究（1982,ロビンス，ヒル及び
サドフ（編集）、バクテリアル・ワクチン中の411−448
頁、連鎖球菌Ｍ蛋白質及び哺乳動物トロポミオシン間の
構造の関係の免疫学的連係）から明らかである。たとえ
ばこれまでに配列がきめられたすべてのＭ蛋白質はM5、
M6及びM24を含んで明瞭な同族性を示し、すべて多重コ
イル構造である。アミノ末端及び他の配列がきめられた
画分は３種のＭ分子のすべてについて７個の残基の周期
的くりかえしを示している。さらに数種のＭ型の免疫学
的分析は、各種の型の間の交叉反応を示した。フイシエ
ツテイ，ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジ
シン146:1108−1123（1977）；マンジユラ及びフイシエ
ツテイ，ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジ
シン151:695−708（1980）；マンジユラ及びフイシエツ
テイ，ジヤーナル・オブ・イムノロジー124:261−267
（1980）。さらに下記に示す交雑のデータは試験した56
種のＭ蛋白質遺伝子のすべての間で構造の類似性を示し
ている。 この技術における熟達者にとつては、種々の免疫原及
びワクチン製剤をつくりうることを直ちに知ることがで
きよう。 5.2M蛋白質分子プローブ ここに記載されるＭ蛋白質遺伝子又はその断片は連鎖
球菌に対する診断試験における分子プローブとして使用
されうる。この試験の原理は、病原性連鎖球菌は、本発
明のＭ蛋白質遺伝子の部分と相補的な遺伝子配列を有し
ているという事実である。かかる遺伝子の相補性は連鎖
球菌感染と疑われるものから微生物DNAを単離し、そのD
NAを固状担体上又は液状媒体中で適切な条件下に分子プ
ローブと結合させることにより直ちに検出されうる。交
雑の生起は適当なリポーター群のプローブに対する添加
により容易に検出されうる。 連鎖球菌状生物はいかなる体組織や体液中の感染部位
からも単離されうるが、単純な咽喉洗滌物は最も好適な
材料となろう。多分混合培養物であろうこのようにして
得られた微生物は直接（すなわち洗滌物上で）又は当該
技術の専門家によく知られている培養液体のいづれかの
中で多数の細胞を生成するよう生育させて用いられう
る。そして、混合培養物からのDNAは、凍結−融解、音
波処理又は他の機械的手段によりおよび／または一般的
あるいは特異的な細菌細胞壁分解試薬で処理したのち抽
出されうる。 抽出されたDNAは通常水性アルカリの添加により変性
され、ついで緩衝溶液で洗浄される。アルカリの特定の
濃度や緩衝液の組成等は実験の条件により、通常実験に
より容易に決定しうる。本発明の変性Ｍ蛋白質遺伝子プ
ローブは、ついで微生物のDNA製剤に加えられ、DNA配列
の点において相補的に交雑させられる。特異的結合は交
雑混合物を充分に洗滌して非特異的結合を除去したのち
に残すことにより確認されよう。 交雑はその目的のために開発され、認められて来てい
る多数の溶液のひとつの中で行われる。フアルコウらは
米国特許第4,358,535号明細書に全般的に溶液組成及び
交雑工程の多くの考察を記載した。この特許はその一般
的有用性の故に、ここに参考文献として包含される。他
の交雑の指標となる特定の数値、たとえば時間や温度、
および用いられる方法は本発明にとつて必須のものでは
ない。たとえばゴール及びパーデユ〔プロシージングス
・オブ・ナチユラル・アカデミー・オブ・サイエンスU.
S.A.63:378−383（1969）〕及びジヨンら〔ネイチユア
ー223:582−587（1969）〕によつて記載された方法が適
用されうる。事実交雑のために選ばれる方法は技術水準
の進歩とともに変つてゆくものと期待される。 本発明の基礎となる分子プローブは、特定の交雑を起
しうるように遺伝子配列を保持するに充分であるかぎり
は、Ｍ蛋白質遺伝子の全部又はその一部だけであっても
よい。かかる交雑はごくわずかな程度であつてさえも、
その分子プローブに適切なリポーター・グループを結合
させることによつて検出されうる。そのプローブは放射
性同位元素で標識を付しうる（たとえば32P,3H,14C,35S
等による標識）し、また化学的あるいは酵素的リポータ
ー・グループで標識されうる。たとえば、ビオチン化さ
れた（biotinylated）プローブと組み合わされた比色検
出手段を、たとえばフルオレツセイン・アビジン，ロー
ダミン・アビジン又は酵素と結合したアビジン等のアビ
ジン誘導体と共に用いることができる。 M6蛋白質のエシエリヒア・コリ（大腸菌）（Escheric
hiacoli）中でのクローニングと発現の方法及び連鎖球
菌感染を特徴づけるためのプローブとしてのM6蛋白質遺
伝子の使用法の下記する実施例は、例示の目的で記され
るもので、発明の範囲についての限定の意図によるもの
ではない。 6.実施例：連鎖球菌Ｍ蛋白質遺伝子を含むクロンの製
造、及び該遺伝子の連鎖球菌感染の診断的試験における
分子プローブとしての使用 6.1連鎖球菌DNAの単離 M6蛋白質遺伝子の起原は、ストレプトコツカス・ピオ
ゲネス（Streptococcus Pyogenes）D471株（Ａ群連鎖球
菌）であつた。Ｃ群連鎖球菌フアージ細胞溶解素（Grou
p C streptococcal phage lysin）が、30％ラフイノー
ズの存在下に、安定なプロトプラストを残してＡ群連鎖
球菌の細胞壁を溶解するために用いられた（フイリツプ
スら、プロシージングス・オブ・ナチユラル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス,U.S.A.78:4689（1981））。つい
でそのプロトプラストは充分に洗浄され連鎖球菌のデオ
キシリボヌクレアーゼ（DNAse）を除去するため蛋白分
解酵素Ｋで処理された。プロトプラストはドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）中に希釈して溶菌され、抽出物がRNA
を消化するためリボヌクレアーゼＩで処理された。塩化
セシウムが加えられた。この製品は蛋白質を除去するた
めに約100xgで遠心分離され、一夜透析された。DNAはエ
タノールにより沈澱させられた。使用のために選択され
たDNA画分は消化前に充分100キロベース（kb）以上であ
つた（P1フアージDNAを100kbの標準とし、P1分子の半分
を50kbの標準として0.4％アガローズ・ゲル上でのアガ
ローズ・ゲル電気泳動で検定した）。 6.2大腸菌へのクローニング Ｍ蛋白質生成のスクリーニングに必要な大腸菌クロン
の候補の数を減らし、かつＭ蛋白質の構造遺伝子に結合
する調節部位を残すために、連鎖球菌DNAを大きい断片
としてクローン化することにした。従つて、35ないし40
kbのDNAの挿入を受け入れるコスミド・ベクターが必要
であつた。クローニング・ビヒクルとして5.4kbのベク
ター,pJB8が選ばれた。このベクターは、イツシユーホ
ロウイツツ及びバーク、ヌクレイツク・アシツヅ・リサ
ーチ９（13）:2989−2998（1981）が記載した方法によ
りアンピシリン耐性プラスミドHomer Iと合成BamH Iリ
ンカーとから構成された。 本発明においては、ベクターpJB8は、ベクターを特有
な位置で切断し「粘着末端」を生成するBamH I（マニア
テイスら、上掲書、104−106頁が一般的に記載）で消化
された。切断されたベクターは、ベクター・ベクター間
の再結合や再環形成を防ぐために、アルカリ性フオスフ
アターゼで処理され（たとえばマニアテイスら、上掲
書、133−134）、線状化されたベクターの5'−フオスフ
エートが除去された。ランダムなDNA断片を生成させる
ため、第6.1節に記載したようにして単離された連鎖球
菌DNAを部分的に消化するためにSau 3a制限酵素が用い
られた（たとえばマニアテイスら、前掲書、298）。分
画された連鎖球菌DNAはpJB8ベクター上のBamH Iの部分
に結合された（第Ｉ図参照、たとえばマニアテイスら、
上掲書、298−299）。 連鎖球菌DNAが挿入されたベクターは試験管内でラム
ダ・フアージの頭部にとりこまれた〔ホーン及びコリン
ズ，ジーン11:291（1980）〕。とりこまれたキメラDNA
を包含するフアージは、熱的に誘起されうるプロフアー
ジを有する大腸菌K12の制限機構のない株C600（lambdac
I857）rec Aを形質導入するために用いられた。アンピ
シリン耐性コロニーが30℃で選び出され、同じ選択培地
に移され、一夜30℃で培養されて、マスター・プレート
をつくつた。 大腸菌中にクロンされたほとんどのグラム陽性遺伝子
は発現しているので、Ｍ蛋白質遺伝子が大腸菌中で発現
するという可能性は高かつた。しかし、Ｍ蛋白質はペリ
プラスム（periplasm）と外膜といういずれも連鎖球菌
には存在しないものを通して移送されなければならない
から、Ｍ蛋白質が大腸菌の表面に現われるとは思われな
かつた。この理由から、その大腸菌のマスター・プレー
トはプロフアージを誘起し、宿主細胞を溶菌するために
42℃に移され、クロン化された遺伝子の発現を確認し
た。〔シヤルカ及びシヤピロ，ジーン１:65（1976）〕 6.3M蛋白質の発現のための単一コロニーの高速検定 Ｍ蛋白質を発現する大腸菌のクロンを認識するため高
速検定法を開発した。この技術はＭ蛋白質を発現する単
一のコロニーを容易に見分けうる。 この検定法は、試験さるべき溶菌されたコロニーをニ
トロセルローズフイルターに移し、蛋白質に対するフイ
ルターの非特異的親和性を減少させるため牛血清アルブ
ミン中で該フイルターを洗滌し、そのフイルターを大腸
菌細胞で充分に予備吸収（pre−absorbed）した精製さ
れたLys M6に対する抗血清と反応させ、適宜に洗浄し、
125I−連鎖球菌蛋白質Ａ（抗原−抗体複合体に結合して
いる）と反応させ、再び洗浄し、ついでオートラジオグ
ラフイーで測定することからなる。 M6蛋白質を検出するには抗血清は1000倍以上に希釈さ
れる。抗血清が10倍希釈（さらに100倍以上濃縮され
た）で用いられたときは大腸菌と検出しうる反応を起さ
ない。この方法により、親の連鎖球菌中に生産された１
％未満の量のM6蛋白質の大腸菌クロンによる生成が検出
されうる。 スクリーンされた335のコロニーのうち、１つが精製M
6蛋白質に対する抗血清と強く反応した。この株のうち
に存在するキメラ・プラスミドはpJRS42と名づけられ
た。この大腸菌クロンのM6蛋白質の生産能はアンピシリ
ン含有培地中のサブ・カルチユア上で安定に維持され
た。プラスミドpJRS42はEcoR Iエンドヌクレアーゼで処
理され、連鎖球菌DNAの画分を除去しpJRS42.13を生成し
た。このプラスミドはすべての必要な複製機能とそのプ
ロモーター系とともにM6蛋白質をコードする完全な配列
を保持している。 6.4遺伝子産物の同定 pJB8を含む大腸菌C600NR株とpJRS42を含むC600NRトラ
ンスダクタントを、アンピシリン含有のトツド−ヘウイ
ツト肉汁（牛心臓添加肉汁（beefheart infusion brot
h））中で対数増殖期の終期まで30℃で生育させた。細
胞はペレツト化され、二度洗浄され、ついでエチレン・
ジアミンテトラ酢酸（EDTA）−リゾチームで溶菌され、
ドライアイス−エタノール中で凍結し、37℃で急速に解
凍された。DNA−アーゼ（DNAse）処理にひきつづき、1
0,000xgで30分間遠心分離して細胞の破片を除去し、抽
出物を0.45ミクロンのミリポア・フイルターに通し、50
mMの重炭酸アンモニウムに対して透析した。 大腸菌中に生成したＭ蛋白質分子の同定は免疫吸収分
析（immunoblot analysis）で決定された。フオリンの
反応〔ロウリーら、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー193:265（1951）〕で決定された当量蛋
白質濃度がSDS含有の12％ポリアクリルアミド・ゲルに
適用された。６型連鎖球菌からフアージ細胞溶解素で細
胞壁を可溶化することにより、６型連鎖球菌から抽出さ
れた精製M6蛋白質の標準製品が対照として隣接するウエ
ル（well）に対して適用された。電気泳動後、分離され
た蛋白質はニトロセルローズ上に移され、フイルター上
の未反応部位はツイーン20（ポリオキシエチレン・ソル
ビタン・モノラウレート）を用いて保護され、大腸菌で
吸収された連鎖球菌から得られた細胞溶解素で抽出され
たM6蛋白質に対して向けられた抗血清とともにフイルタ
ーがインキュベートされた。山羊の抗ウサギIgGに結合
したアルカリ性フオスフアターゼを用いる酵素結合免疫
検定法が結合抗体を検出するために用いられた。アルカ
リ性フオスフアターゼの基質としてインドキシル・フオ
スフエイトが、発色団としてニトロブルー・テトラゾリ
ウムが用いられ、ブレイクらの方法〔アナリテイカル・
バイオケミストリー136:175−179（1984）〕でバンドが
可視化された。M6抗血清は対照のM6とpJRS42を含む大腸
菌クロンの抽出物のいづれとも反応したが、pJB8ベクタ
ーのみを含む親の大腸菌の抽出物とは反応しなかつた。 大腸菌クロンにより生成されるＭ蛋白質の分子量が、
精製されたLys M6蛋白質の標準製品と免疫吸収分析（im
munoblot analysis）で比較された。この分子はフアー
ジ細胞溶解素という酵素によるストレプトコツカスの細
胞壁の可溶化とカラム・クロマトグラフイーによる精製
の結果物である。それは連鎖球菌の細胞壁から分離され
た最大のＭ蛋白質分子であることを示している。 このM6蛋白質はつぎのようにして精製された。プラス
ミドpJRS42.13を含む大腸菌をEDTA及び20％のシヨ糖の
存在下にリゾチームで処理した。これによりペリプラズ
ムの内容物が周辺の液体中に溶出される。菌体の遠心分
離によりペリプラズムの内容物を他の大腸菌関連蛋白質
とともに上澄液中にのこす。この技術を用いて、Ｍ蛋白
質はペリプラズム空間には高濃度で存在するが、実質上
は細胞質には存在しないことが知られた。従つて、この
方法はＭ蛋白質精製の出発原料を生成させるのに用いら
れた。 粗製のペリプラズム内容物中のＭ蛋白質は他の夾雑す
る蛋白質からカラム・クロマトグラフイーで精製され
た。粗製のペリプラズム調製品は5mM重炭酸アンモニウ
ムのpH5.5緩衝液で透析され、カルボキシメチルセルロ
ースのカラムにかけられた。カラムは同じ緩衝液の３倍
量で洗浄し、pH7.0で100mMリン酸ナトリウムで１段で付
着する蛋白質を溶出した。溶離蛋白（Ｍ蛋白を含む）は
25mM濃度のリン酸ナトリムウPH7.0で平衝化したヒドロ
キシアパタイトに直接使用した。カラムをカラムの２倍
量のPH7.0の200mMリン酸ナトリウムで洗浄し、ついで付
着するＭ蛋白質をpH7.0のリン酸ナトリウム400mM溶液で
溶出した。この方法によつて、高度に精製されたＭ蛋白
質製品が得られ、それはSDS−ポクアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動法と配列分析法（sequence analysis）で決
定された。 アミノ末端配列分析で精製大腸菌合成M6蛋白質から単
一のフエニルチオヒダントイン（PTH）−アミノ酸が各
分解段階で得られ、最終製品の均質性が証明された。さ
らに、アミノ末端の配列は、アミノ末端の残基を除く最
初の配列された35箇の残基によつてLys M6のアミノ末端
配列と同一であることがわかつた。大腸菌の分子はリジ
ン分子の精製の間に脱離されうるアミノ末端に余分にア
ルギニン残基を有している。精製されたLys M6製品はさ
きにM6分子でみられた多重バンドの模様を有している
が、それはおそらく抽出と精製との過程での分解による
ものであろう。３つの大きいバンドは51,000,52,000及
び53,000ダルトンのはつきりした分子量に相当する。M6
製品の大きさの異質さは、おそらく蛋白質のカルボキシ
末端部分の相違からくるものであろう。この理由は、配
列の分解による本製品のアミノ末端配列分析の間に各段
階ごとに一つのアミノ酸残基のみが放出されることによ
る。抗M6抗体と反応するpJRS42を含むクロンによるバン
ドはすべて連鎖球菌製品からのものに比して大きい（分
子量55,000,57,000,59,000ダルトン）。このことはpJRS
42はM6蛋白質の全構造遺伝子を含んでいることを示唆し
ていた。このことは、この分子の大きさが12型連鎖球菌
のプロトプラスト及びＬ型から分泌されるＭ蛋白質の大
きさとして報告されているもの（分子量58,000ダルト
ン）とよく一致しているという事実によつてうらづけら
れた。従つて、大腸菌製品中の蛋白質は、連鎖球菌の細
胞溶解素抽出により放出されるものより完全な自然のＭ
分子の大きさにより近いものであろう。 さらに、分泌性の連鎖球菌Ｌ型及びプロトプラストか
ら分離されたＭ蛋白質はもつと均質性があると思われ
る。抗M6抗体と反応性を有する大腸菌蛋白質と精製され
た標準Ｍ蛋白質のバンドとの泳動性における差異につい
ては、いくつかの説明がありうる。たとえば:1）蛋白質
は、大腸菌では除去されていないリーダー・配列を含み
うるが、連鎖球菌では通常除去されている。２）そのLy
s M6分子は連鎖球菌細胞壁に付着する間に生成する分解
産物に相当する。３）そのLys M6分子は蛋白の精製過程
で生成した部分分解物かも知れない。４）その大腸菌蛋
白質はベクター中のプロモータから生成した「融合」物
質かも知れない。５）連鎖球菌では機能できない翻訳開
始配列が大腸菌中では活性なのかも知れない。及び／又
は６）連鎖球菌中では通常機能的な「停止」コドンが大
腸菌の株中ではsup E変異によりおさえられているのか
も知れない。 6.5遺伝子産物の免疫原的特徴づけ 大腸菌のＭ蛋白質と連鎖球菌の細胞溶解素での抽出に
よるＭ蛋白質のオクテルロニー・イムノデイフユージヨ
ン（Ochterlony immnodiffusion）での比較を行つた。
ウエル１（well1）には連鎖球菌で合成された細胞溶解
素抽出M6に対して製造された吸収されていないウサギの
抗血清を入れた。ウエル２には精製された細胞溶解素抽
出M6蛋白質を入れた。ウエル３にはDEAEとCMセルロース
上のクロマトグラフイーで部分的に精製されたエスチエ
リチアコリー（E.coli）C600NR（pJRS42）株から得られ
たM6蛋白質を入れた。反応はpH8.6で50mMバルビトール
緩衝液中で調製した１％寒天ゲル中で行われた。ゲルは
乾燥し、クーマシー・ブルー（Coomasie blue）で染色
した。 この二重拡散実験の結果は（ゲルは示されていな
い）、pJRS42を有する大腸菌の抽出物（挿入なしのプラ
スミドのそれではない）は、少なくとも連鎖球菌M6蛋白
質のそれらのあるものには共通な抗原決定部位を含んで
いるという結論を裏付けた。そこで、大腸菌製品はより
高い見かけの分子量を有しているけれども、大腸菌中で
合成されたM6蛋白質は６型連鎖球菌から抽出されたＭ蛋
白質と同じ型特異性決定部位を有している。 6.6クロン化Ｍ蛋白質の減菌効果 大腸菌の生産したＭ蛋白質がウサギ及びヒトのオプソ
ニン抗血清の両者からのオプソニン抗体を除去するに要
する抗原決定部位を含むかどうかを決定するため、次の
吸収実験を行つた。 精製した大腸菌で合成したM6蛋白質が30μｇづつ２つ
に分けて凍結乾燥された。一方にウサギの６型オプソニ
ン抗血清（0.5ml）を加え、同様の量の６型連鎖球菌に
対するヒト血清オプソニンを他の乾燥蛋白質標本に加え
て溶液をつくつた。これらの試験管を37℃で１時間培養
し、４℃で一夜放置した。かくして得られた沈澱を20,0
00xgで遠心分離し、得られた上澄液を６型連鎖球菌を用
いる滅菌検定に使用した。 間接的滅菌検定は当初ランスフイールドによつて記載
されたように（ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル
・メジシン110:271（1959））して行つた。正常な提供
者（normal donors）から得たペパリン処理された全人
血を食細胞原として用いた。６型連鎖球菌の希釈物（10
0μ）を、吸収され又は吸収されていない血清（100μ
）の存在又は不存在下に、人血400μに混合した。
混合物を37℃で３時間回転させた。存在している生物を
埋没平板法で決定した。抗血清なしで回転させた対照に
ついて提供者の血液中で連鎖球菌が生育する能力のテス
トを行なつた。大腸菌トランスダクタントが生成したＭ
蛋白質は、ウサギ及びヒトの血清からオプソニン抗体を
除去した。第１表参照。従つて、大腸菌Ｍ蛋白質の抗食
菌作用性決定部位は自然のM6分子のそれと同様に機能す
る。 6.76型食菌性抗体の生産 精製された大腸菌が生産したM6蛋白質による免疫後の
ウサギ中での６型オプソニン抗体の生産は次のようにし
て行われた。精製された大腸菌が生産したM6蛋白質に対
する抗血清がニユージーランドシロウサギ中で作られ
た。一次接種は完全フロインド担体で乳化した100μｇ
のM6蛋白質から成り、複数部位に皮下投与された。動物
は４週間後に不完全フロインド担体中の同用量のM6蛋白
質で増強された。動物は10日後採血された。 滅菌検定（上記）により認められたところによれば、
大腸菌M6蛋白質で免疫されたウサギは６型連鎖球菌の食
菌作用性を認める抗体を産生した。第２表参照。6.8連鎖球菌に対する診断試験 6.8.1M遺伝子DNAプローブの製造と精製 M6型蛋白質をコードする遺伝子（emm6）をつきとめる
ため、上記第6.3節中に記載されたプラスミドpJRS42.13
を種々の制限酵素又はその複合体による消化に付した。
かくして得られたDNA断片は上記マニアチスらの文献150
−161頁に記載されているところにより0.8％アガロース
・ゲルを通して電気泳動に付して分画され、ついで種々
のベクター中に結合された。熱誘導性（thermally indu
cible）ラムダ・フアージに対し溶原性エスチエリチア
・コリー（E.coli）K12菌中に、これらの組換えベクタ
ーが組み込まれ、第6.4節に記載したように抗M6蛋白質
抗血清と反応性を有する蛋白質の生産についてスクリー
ニングされた。 多数のこれらのクロン化されたDNA断片についてのM6
蛋白質発現分析結果を第３図に示す。白色のブロツクで
示されているクロンは抗M6抗血清と反応性があつたが、
斜線を施したブロツクで示されたものは反応性がなかつ
た。pJRS42.19のようないくつかの反応性クロンは全M6
蛋白質をコードする連鎖球菌DNAをごくわずかしか含ん
でいなかつたが、その発現する物質はあきらかにポリク
ロナール抗血清と抗原性反応性を示すに充分な大きさで
あつた。 クロン化されたDNA断片中のemm6遺伝子の配置につい
てさらに検討するため、プラスミドpJRS42.19中の連鎖
球菌DNAをプラスミドpUC9及びpUC8のBamH I部分に挿入
した〔メツシング及びベイラ，ジーン19:269−276（198
2）〕。これらプラスミド相互間の関係は挿入されたDNA
がプラスミド中で反対の方向に配列されている。抗M6抗
血清は、これらクロンの両方の製品と反応し、連鎖球菌
DNAがこれらのベクターのいづれの配列中にも存在する
ときにM6蛋白質画分が合成されることを示している。従
つて、挿入された連鎖球菌DNAはそれ自身のプロモータ
を有しているものと思われる。もしこの結論が正しけれ
ば、pJRS42.19はM6蛋白質のＮ末端をコードするものの
はずである。 pJRS42.19の連鎖球菌DNA断片をM13mp8及びmp9中に挿
入〔メシング及びベイラル，上掲書〕したのち、サンガ
ーのジデオキシ法〔サンガーら、プロシージングス・オ
ブ・ナチユラル・アカデミー・オブ・サイエンス・U.S.
A.74:5463（1977）〕で挿入されたDNAの配列が決定され
た。M6蛋白質のアミノ末端をコードする部分配列をそれ
により特定されるアミノ酸配列とともに第４図に示す。
逐次的エドマン分解により決定された（参考文献）アミ
ノ末端アミノ酸は、アミノ酸配列の下に「Ｎ」で示して
ある。この方法で決定されたアミノ酸配列はペプシン処
理により、又はフアージ溶菌により連鎖球菌ストレイン
D471〔参考〕から抽出されたM6蛋白質のアミノ末端につ
いて確立されている配列と同一であつた。それはまた、
上記第6.4節中の大腸菌における組換えDNA方法により生
成されたＭ蛋白質のアミノ末端部分とも同一であつた。 これらの結果は、emm6遺伝子はpJRS42.19中に含まれ
るDNA中に始まることを示した。第４図に示されるDNA配
列とアミノ酸配列の比較は、さらに、第３図に示すよう
に、M6蛋白質のＮ末端はNci I部位の左へ32番目の塩基
の点であることを示している。 大腸菌中で生成されたM6蛋白質は、ドデシル硫酸ナト
リウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動〔フイシエ
ツチら、ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジ
シン159:1083−1095（1984）〕により明らかに59,000ダ
ルトンの分子量を有することが示された。この事実は遺
伝子配列の他の末端を第３図におけるPvu II部位または
その付近に定めることとなる。さらに配列の分析をつづ
けたところ、蛋白質を終了する無意味なコドンTAAがPvu
II部位の右へ38番目の塩基に位置していることが明ら
かとなつた（ホリングシードら、原稿作成中）。 プラスミドpJRS42.13をNci I及びPvu IIで処理してem
m6遺伝子の大部分を含む適当なプローブを作成した。pJ
RS42.13の制限酵素地図中でのこのプローブの位置を第
３図に太い矢印で示す。このプローブ断片は、0.8％ア
ガロース・ゲル中での電池泳動法、電気的溶出及びエル
チツプ−ｄ（Elutip−ｄ）のカラム（シユライヘル及び
シユエル）を通過させることにより精製された。 6.8.2細菌のDNAの単離 Ａ群連鎖球菌の細胞をフイシエツチらの方法〔ジヤー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン133:1105
（1971）〕で溶菌するのにはフアージ細菌溶解素を用い
た。他の連鎖球菌については、一夜のトツド・ヘウイツ
ト・酵母肉汁培養物（酵母抽出物を添加した牛心臓浸出
肉汁）を10倍に希釈し、37℃で細胞濃度を1mlあたり約
５×106細胞となるまで生育させた。３％（w/v）の濃度
までグリセリンを添加し、細胞をさらに２時間37℃で培
養した。ついで細胞を洗浄し、15秒のパルスで２度音波
処理し、庶糖30％（w/v）とリゾチーム10mg/mlを含む10
mMトリス・塩酸塩緩衝液PH8.0中に分散させた。 37℃で30分間インキュベートしたのち、最終濃度10mM
までエチレンジアミンテトラ酢酸を加え、さらに37℃で
30分間インキュベートを続けた。ついでプロテアーゼＫ
〔0.1mg/ml、源（source）〕及びドデシル硫酸ナトリウ
ム（１％w/v）を加え、これらの成分をゆつくりと回転
させて混合し、さらに37℃で30分間インキュベートを続
けた。この工程につづいて、混濁を示さない細胞懸濁液
を界面に蛋白質がみえなくなるまでフエノール：クロロ
フオルム（10:1）で抽出した。抽出されたDNAは、つい
でエタノールで沈澱させた。 試験した細菌株は、スタフィロコツカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus），バチルス・スブチリス
（B.subtilis）（CU1065株）、ストレプトコツカス・プ
ノイモニエ（Streptococcus pneumoniae）及びロツクフ
エラー大学のコレクシヨンから得られた次の連鎖球菌株
であつて、それぞれ特異的抗血清をつくるのに用いられ
る標準タイピング及びグルーピング株である。M1,T1/19
5/2;M3,B930/61/5;M3R,D58X;M4,T4/95/RB5;M5,T5B/126/
4;M6,S43/192/3;M8,C256/86/3;M11,T11/137/3;M12,T12/
126/4（COL6）;M14,T14/46/8,M15,T15/23/7,M18,J17C/5
5/4;M22,T22/146/1;M23,T23/102/RB5;M24,C98/135/2;M2
5,B346/136/1;M27,T27/87/1;M28,T28/150A/5;M29,D23;M
30,D24/126/3;M31,J137/69/3;M32,C121/39/8;M33,C107/
102/2;M36,C119/83/2;M37,C242;M38,C94/80/2;M39,C95/
95/1;M40,C143/25/9;M41,C101/103/4;M42,C113/55/5;M4
3,C126/170/2;M46,C105/41/5;M47,C744/RB4/6/5;M48,B4
03/48/5;M49,B7371/137/2;M50,B514/33/6;M51,A309/77/
1;M52,A871/106/2;M53,A952/94/3;M54,A953/87/3;M55,A
928/73/1;M56,A963;M57,A995/91/2;M58,D315/87/3;M60,
D335/38/3;M63,D459/50/2;M66,D794/76/2;M67,D795/95/
1;A群,J17A4;B群,090R;C群,C74;D群,D76;E群,K131;F群,
F68C;G群,D166B;H群,F90A;L群,D167A;M群,D168A“X";N
群,C559;O群,B361。次のＡ群でＭ型にタイピングされる
ジヨージア州アトランタのセンター・フオー・デイジー
ズ・コントロールから入手された株も使用された。M2,S
S633;M9,SS754;M13,SS936;M17,SS631;M19,SS400;M34,SS
134;M59,SS913及びM62,SS984. 6.8.3ドツト・ブロツト（Dot blot）交雑実験 カフアトスら〔ヌクレイツク・アシツド・リサーチ
７;1541−1552（1979）〕が記載した特異的DNA配列をみ
つける手段を用いて、抽出されたDNAの標本についてド
ツト・ハイブリダイゼーシヨンが行われた。ボツチヤン
らの方法〔セル９:269−287（1976）〕でニツク翻訳に
より32Pで標識したのち、プローブに対してemm6遺伝子
の大部分を含むNci I/Pvu IIDNA画分（第6.8.1節）が用
いられた。 交雑を行うにあたつて、種々の微生物原から得られた
DNA抽出物は室温で15分間0.6NNaOH中で変性され、つい
で０℃で10分間変性された。さらに、試料は2M酢酸アン
モニウムで中和され、DNAの画分はベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーの多枝管中のバイオダインA0.2ミクロン
・ナイロン・フイルター（ニユーヨーク州グレン・コー
ブ，ポール・フイルトレーシヨン・コーポレーシヨン）
上にスポツトされた。交雑は1.8Mトリス塩酸塩を含み、
0.2Mのトリス塩基を含む緩衝液中でニツク翻訳された32
Pプローブを少なくとも２×106cpm/フイルターの割合で
加え、フイルターを一夜64℃に保持することにより行わ
れた。フイルターは、ついで同じ緩衝液を用いて64℃で
10回洗浄され、乾燥され、増感スクリーンを用いコダツ
クXAR−５フイルム上でオートラジオグラフイーに付さ
れた。露光は−80℃で２−４日行われた。 これらの実験結果の要約を第３表に示す。 全体としてドツト・ブロツト実験は、emm6プローブと
Ａ群連鎖球菌の56種中の56の異なるＭ型から得られるDN
A、及びＡ群株のタイプ分けできない４種及びすでにM-
と特徴づけられている２つの株との間に交雑が認められ
た。グラム陽性菌であるスタフイロコツカス・オウレウ
ス（Staphylococcus aureus）又はバチルス・スブチリ
ス（Bacillus subtilis）からのDNA、連鎖球菌ランスフ
イールドB,D,E,F,H,L,M,N又はＯ群からのDNA、又はスト
レプトコツカス・プノイモニエ（Streptococcus pneumo
niae）からのDNAとは交雑は見られなかつた。しかし、
Ｃ群及びＧ群連鎖球菌DNAとは交雑がみられた。この知
見は、Ｃ群連鎖球菌はしばしばヒトの感染に関係し、あ
る株はその外面に機能的にＭ蛋白質と同様な分子を有し
ているらしいので予期し得ない知見ではなかつた〔ウー
ルコツク，インフエクシヨン・アンド・インムノロジー
10:568（1974）〕。 Ｇ群連鎖球菌もまた広範囲のヒトへの感染を起すこと
が報告されている。これらの生物の毒性が必ずＭ様細胞
表面蛋白質の存在によるかどうかははつきりしないが、
そういうこともありうるところである。ヒト感染物から
分離したＧ群連鎖球菌の３株を試験したところ、12型Ｍ
細胞蛋白質が株中に存在することがわかつた〔マクステ
ツド及びポター，ジヤーナル・オブ・ゼネラル・マイク
ロバイオロジー49:119（1967）〕。 試験されたＡ群株の中に、機能的にM-（すなわち、保
護的Ｍ蛋白質を生成せず食菌性化されたもの）が３株あ
つた。これらのM-株の２種からのDNAは、それにも拘わ
らずemm6遺伝子プローブと交雑し、少なくともいくらか
のemm遺伝子を完全に保持していることを示した。おそ
らく、これらの株は、そのemm遺伝子産物が無機能的（n
onfunctional）であるかわずかな量しか合成しないよう
な変異株であろう。１つのM-株からのDNAはプローブと
交雑せず、その株中ではemm遺伝子は実質的に除去され
ていることを示唆していた。 ドツト・ブロツト実験の結果は、種々のＭ型Ａ群連鎖
球菌株から得られるDNAを抽出し、Nci I及びHind IIIで
消化する実験により確かめられた。得られるDNA断片の
試料は、マニアテイスら、上掲書、150−161に記載のア
ガロース・ゲル・電気泳動で分離され、emm6の32Pで標
識されたプローブと交雑され、雑種DNA断片の位置がオ
ートラジオグラフイーで示された。結果は第５図に示
す。 第５図において、第１列は32Pで標識された10.9,7.7
4,5.15,2.44,1.80及び0.60kbのDNA分子サイズのマーカ
ーを示す。第２列ないし第10列は連鎖球菌Ｍの型6,47,
5,19,26,11,24,12及び23のそれぞれから得られたDNAの
プローブ交雑Nci I/Hind III画分を含んでいる。各々の
場合、プローブで交雑された２種または以上のDNAフラ
グメントが含まれていた。ドツト・ブロツト試験から予
期されたように、T28/51/4のM-株からのDNAは交雑しな
かつた（第11列）が、T28/150A/5のM+株（第12列）は交
雑した。 7.微生物の寄託 次表に示すプラスミドを有する次表の大腸菌は、イリ
ノイ州ペオリアのアグリカルチユラル・リサーチ・カル
チユア・コレクシヨン（NRRL）に寄託されており、次の
寄託番号を付与されている。 寄託微生物は本発明の幾多の態様を代表することを意
図したものであるから、本発明は寄託された微生物によ
り範囲として限定されるべきものではない。事実、ここ
に示され、記載されたところに加えて、この発明の種々
の修飾は、以上の記載と添付の図面から、当該技術の専
門家にとつては明らかとなるであろう。かかる修飾は、
下記する請求の範囲のうちに入るべきことを意図してい
る。 本明細書中でヌクレオタイドについての塩基対の大き
さは概略のものであつて、記載の目的のために使用され
たものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１５５３５
(72)発明者 フイシエツテイ，ビンセント エイ
アメリカ合衆国、11552 ニユーヨーク、
ウエスト ヘンプステツド、ジヨーン
コート 448
(56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌ．11，Ｎｏ．４（1978）ｐ．453
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．少くとも下式のDNA配列より成るポリヌクレオチド
を含むDNA配列を有し、ストレプトコッカス・ピオゲネ
ス（Streptococcus pyogenes）Ｍ蛋白質をコードする遺
伝子２．上記遺伝子がＡ群連鎖球菌の一員に由来するもので
ある請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ３．上記遺伝子がＣ群連鎖球菌の一員に由来するもので
ある請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ４．上記遺伝子がＧ群連鎖球菌の一員に由来するもので
ある請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ５．少くとも下記のDNA配列より成るポリヌクレオチド
を含むDNA配列を有し、ストレプトコッカス・ピオゲネ
ス（Streptococcus pyogenes）Ｍ蛋白質をコードする遺
伝子を含む組換えプラスミド６．NRRLに寄託され受託番号Ｂ−15535を付与された大
腸菌のプラスミドpJRS42のレプリコン必須部分を含む請
求の範囲第５項記載の組換えプラスミド。 ７．上記DNA配列が発現制御要素の制御下にある請求の
範囲第５項記載の組換えプラスミド。 ８．NRRLに寄託され受託番号Ｂ−15535を付与された大
腸菌のプラスミドpJRS42である請求の範囲第５項記載の
組換えプラスミド。 ９．NRRLに寄託され受託番号Ｂ−15529を付与された大
腸菌のプラスミドpJRS42.13である請求の範囲第５項記
載の組換えプラスミド。 １０．少くとも下式のDNA配列より成るポリヌクレオチ
ドを含むDNA配列を有し、ストレプトコッカス・ピオゲ
ネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ蛋白質をコードする
遺伝子を含む組換えプラスミドを含む単細胞生物１１．組換えプラスミドがさらにNRRLに寄託され受託番
号Ｂ−15535を付与された大腸菌のプラスミドpJRS42の
レプリコン必須部分を含む請求の範囲第10項記載の単細
胞生物。 １２．組換えプラスミドの上記DNA配列が発現制御要素
の制御下にある請求の範囲第10項記載の単細胞生物。 １３．組換えプラスミドがNRRLに寄託され受託番号Ｂ−
15535を付与された大腸菌のプラスミドpJRS42である請
求の範囲第10項記載の単細胞生物。 １４．組換えプラスミドがNRRLに寄託され受託番号Ｂ−
15529を付与された大腸菌のプラスミドpJRS42.13である
請求の範囲第10項記載の単細胞生物。 １５．大腸菌（Escherichia coil bacterium）である請
求の範囲第10項記載の単細胞生物。 １６．NRRLに寄託され、受託番号Ｂ−15535を付与され
た大腸菌、その変異株、組換え体、又は生体内あるいは
試験管内での遺伝子工学的誘導体である請求の範囲第15
項記載の単細胞生物。 １７．NRRLに寄託され、受託番号Ｂ−15529を付与され
た大腸菌、その変異株、組換え体、又は生体内あるいは
試験管内での遺伝子工学的誘導体である請求の範囲第15
項記載の単細胞生物。 １８．下記を含んでなる病原性連鎖球菌の含有が疑われ
る臨床的試料中の病原性連鎖球菌を検出する方法。 （ａ） 少くとも下式のDNA配列より成るポリヌクレオ
チドを含むDNA配列を有し、ストレプトコッカス・ピオ
ゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ蛋白質をコードす
る遺伝子をプローブして、相補的配列と交雑せしめうる
条件下に該試料の溶菌物と接触せしめ、 （ｂ） 該臨床試料溶菌物中のヌクレオチド配列と上記
プローブとが交雑するかどうかを検出する１９．交雑が液体培地中で行われる請求の範囲第18項記
載の方法。 ２０．交雑が固体担体中で行われる請求の範囲第18項記
載の方法。 ２１．該プローブが放射線的に標識される請求の範囲第
18項記載の方法。 ２２．該プローブがビオチン化され、該交雑が比色検定
指示薬に結合するアビジンを用いて検出される請求の範
囲第18項記載の方法。 ２３．該プローブがビオチン化され、該交雑が蛍光性分
子に結合するアビジンを用いて検出される請求の範囲第
18項記載の方法。 ２４．該プローブがM6蛋白質をコードする遺伝子である
請求の範囲第18項記載の方法。 ２５．検出される病原性連鎖球菌がＡ群である請求の範
囲第18項記載の方法。 ２６．検出される病原性連鎖球菌がＣ群である請求の範
囲第18項記載の方法。 ２７．検出される病原性連鎖球菌がＧ群である請求の範
囲第18項記載の方法。 ２８．該試料が咽喉洗滌液から採取されて得られる請求
の範囲第18項記載の方法。 ２９．少くとも下式のDNA配列より成るポリヌクレオチ
ドを含むDNA配列を有し、ストレプトコッカス・ピオゲ
ネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ蛋白質をコードする
遺伝子から成るDNAプローブ３０．該プローブがNRRLに寄託され、受託番号Ｂ−1552
9を付与された大腸菌、その変異株、組換え体、又は生
体内若しくは試験管内での遺伝子工学的誘導株から得ら
れたものである請求の範囲第29項記載のDNAプローブ。 ３１．該プローブがNRRLに寄託され、受託番号Ｂ−1553
5を付与された大腸菌、その変異株、組換え体、又は生
体内若しくは試験管内での遺伝子工学的誘導株から得ら
れたものである請求の範囲第29項記載のDNAプローブ。 ３２．該プローブがNRRLに寄託され、受託番号Ｂ−1552
9を付与された大腸菌のプラスミドpJRS42.13のNci I/Pv
u II消化産物のDNA配列を含むものである請求の範囲第2
9項記載のDNAプローブ。 ３３．該プローブが比色定量インジケーターに結合する
アビジンと結合するものである請求の範囲第29項記載の
DNAプローブ。 ３４．プローブが蛍光性分子と結合するアビジンと結合
するものである請求の範囲第29項記載のDNAプローブ。 ３５．該プローブが放射性同位元素で標識されたもので
ある請求の範囲第29項記載のDNAプローブ。
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