JP2614176B2 - 連鎖球菌ｍ蛋白免疫原の製造方法 - Google Patents
連鎖球菌ｍ蛋白免疫原の製造方法Info
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Description
【０００１】ここに記載されている発明は、その一部に
つき厚生省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）の国立衛生
研究所からの補助金の援助を受けてなされたものであ
る。 １．発明の分野 本発明はＡ群連鎖球菌のＭ６蛋白質のような抗食菌作用
性連鎖球菌蛋白質を診断用プローブとして用いるため
の、及びそれを免疫原として利用したワクチンを製造す
るためのＭ６蛋白質の製造方法に関する。Ｍ蛋白質は繊
維状表面分子であって、それは連鎖球菌が、感染した宿
主生物のマクロファージ及び多形核（ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈｏｎｕｃｌｅａｒ）好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅ
ｓ）による、食菌作用に抵抗することを可能にする。
つき厚生省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）の国立衛生
研究所からの補助金の援助を受けてなされたものであ
る。 １．発明の分野 本発明はＡ群連鎖球菌のＭ６蛋白質のような抗食菌作用
性連鎖球菌蛋白質を診断用プローブとして用いるため
の、及びそれを免疫原として利用したワクチンを製造す
るためのＭ６蛋白質の製造方法に関する。Ｍ蛋白質は繊
維状表面分子であって、それは連鎖球菌が、感染した宿
主生物のマクロファージ及び多形核（ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈｏｎｕｃｌｅａｒ）好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅ
ｓ）による、食菌作用に抵抗することを可能にする。
【０００２】本発明においてはＭ蛋白質又はその一部を
コードするＤＮＡ配列をビールスＤＮＡ、プラスミドＤ
ＮＡ又はコスミドＤＮＡのようなプラスミドＤＮＡに挿
入するために組換えＤＮＡ技術を利用し、これによりそ
のプラスミドは細菌の宿主又は他の単細胞系中にＭ蛋白
質の遺伝子を複製し発現させることができる。生ずる組
換えＤＮＡ分子はＭ蛋白質、又はそのある部分又は分子
の変化したものを製造しうるように宿主細胞に導入され
る。産生した蛋白質はついで分離され、精製される。
コードするＤＮＡ配列をビールスＤＮＡ、プラスミドＤ
ＮＡ又はコスミドＤＮＡのようなプラスミドＤＮＡに挿
入するために組換えＤＮＡ技術を利用し、これによりそ
のプラスミドは細菌の宿主又は他の単細胞系中にＭ蛋白
質の遺伝子を複製し発現させることができる。生ずる組
換えＤＮＡ分子はＭ蛋白質、又はそのある部分又は分子
の変化したものを製造しうるように宿主細胞に導入され
る。産生した蛋白質はついで分離され、精製される。
【０００３】
【従来の技術、発明が解決しようとする課題】２．発明の背景 急性リウマチ熱や急性糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏ
ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）がＡ群連鎖球菌感染の後遺症であ
ることは広く認められているところである。熱帯及び亜
熱帯の開発途上国においてはリウマチ性心臓疾患が現在
心障害の最も普通の形である。世界のある開発途上の都
市部の貧民街における学齢児童についてこの病気の流行
率は１，０００人に対し２２−２３人もの高さであるこ
とが報告されている。インドだけでも６百万もの多くの
子供が苦しんでいることとなる。この病気の正確な発病
機構はわからないが、リウマチ熱、さらに急性腎炎がス
トレプトコッカス・ピオゲネス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）の感染に
伴うものであることは明らかである。
ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）がＡ群連鎖球菌感染の後遺症であ
ることは広く認められているところである。熱帯及び亜
熱帯の開発途上国においてはリウマチ性心臓疾患が現在
心障害の最も普通の形である。世界のある開発途上の都
市部の貧民街における学齢児童についてこの病気の流行
率は１，０００人に対し２２−２３人もの高さであるこ
とが報告されている。インドだけでも６百万もの多くの
子供が苦しんでいることとなる。この病気の正確な発病
機構はわからないが、リウマチ熱、さらに急性腎炎がス
トレプトコッカス・ピオゲネス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）の感染に
伴うものであることは明らかである。
【０００４】連鎖球菌Ｍ蛋白質は、それが食細胞攻撃に
対する抵抗性をその微生物に与えるという事実に基づい
てこの細菌の重要な病原因子である。抗原変異は、Ａ群
連鎖球菌が宿主の免疫反応を避けることができ、その結
果人間に病気を起こす主要機構である。Ａ群連鎖球菌感
染に対する抵抗性は、菌の表面に見いだされる繊維状分
子であるＭ蛋白質に対する形質特異的（ｔｙｐｅ−ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ）な抗体の存在によるものである。分類し
得ない（ｎｏｎｔｙｐａｂｌｅ）株のいくつかに加え
て、現在では約７０の明らかなＡ群連鎖球菌Ｍ形が認め
られている。ある種のＭ型の間で交叉反応性があるのは
普通であるという事実にも拘わらず、同族の型に対して
つくられた抗体のみが生体の食菌作用を発生せしめうる
（すなわち、それらはオプソニン抗体である）。さら
に、すべての同族体、又は形質特異性抗体が食菌性であ
るというわけではない。
対する抵抗性をその微生物に与えるという事実に基づい
てこの細菌の重要な病原因子である。抗原変異は、Ａ群
連鎖球菌が宿主の免疫反応を避けることができ、その結
果人間に病気を起こす主要機構である。Ａ群連鎖球菌感
染に対する抵抗性は、菌の表面に見いだされる繊維状分
子であるＭ蛋白質に対する形質特異的（ｔｙｐｅ−ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ）な抗体の存在によるものである。分類し
得ない（ｎｏｎｔｙｐａｂｌｅ）株のいくつかに加え
て、現在では約７０の明らかなＡ群連鎖球菌Ｍ形が認め
られている。ある種のＭ型の間で交叉反応性があるのは
普通であるという事実にも拘わらず、同族の型に対して
つくられた抗体のみが生体の食菌作用を発生せしめうる
（すなわち、それらはオプソニン抗体である）。さら
に、すべての同族体、又は形質特異性抗体が食菌性であ
るというわけではない。
【０００５】特定の抗血清がＡ群連鎖球菌に対してつく
られうるという事実は、咽喉洗滌によって得られるもの
のような臨床上の分離物を血清学的な試験に付すること
により連鎖球菌感染を検出することを可能にした。感染
におけるＡ群連鎖球菌の同定は純粋培養中の生物の単
離、群特異的炭水化物の抽出、及び群特異的抗血清との
反応とを必要とする。すべての病原性株に対してのみ共
通な性質に基づきうる連鎖球菌感染に対する臨床試験
は、従って非常に望ましいものとなる。
られうるという事実は、咽喉洗滌によって得られるもの
のような臨床上の分離物を血清学的な試験に付すること
により連鎖球菌感染を検出することを可能にした。感染
におけるＡ群連鎖球菌の同定は純粋培養中の生物の単
離、群特異的炭水化物の抽出、及び群特異的抗血清との
反応とを必要とする。すべての病原性株に対してのみ共
通な性質に基づきうる連鎖球菌感染に対する臨床試験
は、従って非常に望ましいものとなる。
【０００６】２．１組換えＤＮＡ技術と遺伝子の発現 組換えＤＮＡ技術は、それにより特定のＤＮＡ断片が宿
主細胞中で複製し、転写しうるベクターと呼ばれる遺伝
学的要素中に挿入されるＤＮＡクローニングの技術を包
含している。ベクターはプラスミド又はビールスのいず
れでもありうる。プラスミドは小さい環状の二重螺旋Ｄ
ＮＡの分子で、それは天然にバクテリアや酵母中に見出
され、そこで宿主細胞の繁殖とは無関係な単位として複
製する。これらのプラスミドは通常全宿主細胞ＤＮＡの
わずかなフラクションとしてのみ説明され、しばしば抗
生物質に対する耐性を与える遺伝子を保有している。こ
れらの遺伝子、そして比較的小さい大きさのプラスミド
ＤＮＡが組換えＤＮＡ技術において利用される。
主細胞中で複製し、転写しうるベクターと呼ばれる遺伝
学的要素中に挿入されるＤＮＡクローニングの技術を包
含している。ベクターはプラスミド又はビールスのいず
れでもありうる。プラスミドは小さい環状の二重螺旋Ｄ
ＮＡの分子で、それは天然にバクテリアや酵母中に見出
され、そこで宿主細胞の繁殖とは無関係な単位として複
製する。これらのプラスミドは通常全宿主細胞ＤＮＡの
わずかなフラクションとしてのみ説明され、しばしば抗
生物質に対する耐性を与える遺伝子を保有している。こ
れらの遺伝子、そして比較的小さい大きさのプラスミド
ＤＮＡが組換えＤＮＡ技術において利用される。
【０００７】組換えＤＮＡ分子の挿入されたＤＮＡ断片
は自然には宿主生物と情報を交換しない生物から誘導さ
れうるものであり、また全体的にあるいは部分的に合成
的に作られうるものである。制限酵素及び結合方法（ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて組換えプラス
ミドを製造する方法はコーエン及びボイヤー発明にかか
わる発行された米国特許第４，２３７，２２４号に記載
されている。このようにしてつくられた組換えプラスミ
ドは形質転換の手段により単細胞生物中に導入され、複
製される。そこに記載されている技術の一般的適用性の
故に、米国特許第４，２３７，２２４号はここに本明細
書中に参考文献として包含される。
は自然には宿主生物と情報を交換しない生物から誘導さ
れうるものであり、また全体的にあるいは部分的に合成
的に作られうるものである。制限酵素及び結合方法（ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて組換えプラス
ミドを製造する方法はコーエン及びボイヤー発明にかか
わる発行された米国特許第４，２３７，２２４号に記載
されている。このようにしてつくられた組換えプラスミ
ドは形質転換の手段により単細胞生物中に導入され、複
製される。そこに記載されている技術の一般的適用性の
故に、米国特許第４，２３７，２２４号はここに本明細
書中に参考文献として包含される。
【０００８】単細胞生物中に組換えＤＮＡ分子を導入す
る別の方法は、コリンズ及びホーンにより、米国特許第
４，３０４，８６３号に記載されており、それもまたこ
こに参考文献として包含される。この方法は、バクテリ
オファージ・ベクターによるパッケージング／トランス
ダクション（ｐａｃｋａｇｉｎｇ／ｔｒａｎｓｄｕｃｔ
ｉｏｎ）システムを利用するものである。
る別の方法は、コリンズ及びホーンにより、米国特許第
４，３０４，８６３号に記載されており、それもまたこ
こに参考文献として包含される。この方法は、バクテリ
オファージ・ベクターによるパッケージング／トランス
ダクション（ｐａｃｋａｇｉｎｇ／ｔｒａｎｓｄｕｃｔ
ｉｏｎ）システムを利用するものである。
【０００９】プラスミドは高次螺旋であるので、宿主細
胞のＤＮＡから容易に分離することができ、精製するこ
とができる。クローニング・ベクターとして用いるに
は、このような精製プラスミドＤＮＡ分子は制限ヌクレ
アーゼで切断され、クローンさるべきＤＮＡ断片に結合
される。製造された雑種のプラスミドＤＮＡ分子は、次
いで一時的に大分子（合理的に）に対して浸透性を有す
るようにされたバクテリア中に再導入される。処理され
た細胞のいくつかだけがプラスミドを拾いあげ、これら
の細胞はプラスミドによってそれらが獲得している抗生
物質耐性によって選択できる。それはそれらのものだけ
が抗生物質の存在下に生育するからである。これらのバ
クテリアは分裂するから、プラスミドもまた当初のＤＮ
Ａ断片の多数のコピーをつくるように複製する。繁殖期
間の終りに、雑種のプラスミドＤＮＡ分子は精製され当
初のＤＮＡ断片のコピーは同じエンドヌクレアーゼによ
る第二の処理で切断される。
胞のＤＮＡから容易に分離することができ、精製するこ
とができる。クローニング・ベクターとして用いるに
は、このような精製プラスミドＤＮＡ分子は制限ヌクレ
アーゼで切断され、クローンさるべきＤＮＡ断片に結合
される。製造された雑種のプラスミドＤＮＡ分子は、次
いで一時的に大分子（合理的に）に対して浸透性を有す
るようにされたバクテリア中に再導入される。処理され
た細胞のいくつかだけがプラスミドを拾いあげ、これら
の細胞はプラスミドによってそれらが獲得している抗生
物質耐性によって選択できる。それはそれらのものだけ
が抗生物質の存在下に生育するからである。これらのバ
クテリアは分裂するから、プラスミドもまた当初のＤＮ
Ａ断片の多数のコピーをつくるように複製する。繁殖期
間の終りに、雑種のプラスミドＤＮＡ分子は精製され当
初のＤＮＡ断片のコピーは同じエンドヌクレアーゼによ
る第二の処理で切断される。
【００１０】構築に用いられた方法には無関係に、組換
えＤＮＡ分子は宿主細胞と両立し得なければならない。
すなわち、宿主細胞中で自律的に複製できなければなら
ない。組換えＤＮＡ分子は、その組換えＤＮＡ分子によ
り形質転換された宿主細胞を選択できるマーカーの機能
をも有していなければならない。さらに加えて、プラス
ミド上に適当な複製、転写及び翻訳のシグナルが正確に
配置されているならば、外来遺伝子は形質転換細胞及び
その子孫中に適切に発現するであろう。
えＤＮＡ分子は宿主細胞と両立し得なければならない。
すなわち、宿主細胞中で自律的に複製できなければなら
ない。組換えＤＮＡ分子は、その組換えＤＮＡ分子によ
り形質転換された宿主細胞を選択できるマーカーの機能
をも有していなければならない。さらに加えて、プラス
ミド上に適当な複製、転写及び翻訳のシグナルが正確に
配置されているならば、外来遺伝子は形質転換細胞及び
その子孫中に適切に発現するであろう。
【００１１】組換えＤＮＡ技術はペプタイド・ワクチン
の製造に多くを提供する。バクテリアの適切な免疫原部
分をコードするバクテリア遺伝子の分子クローニング及
び宿主細胞での発現により、ペプタイド・ワクチンにお
いて使用するための適切な免疫原の充分な量を製造する
ことができる。
の製造に多くを提供する。バクテリアの適切な免疫原部
分をコードするバクテリア遺伝子の分子クローニング及
び宿主細胞での発現により、ペプタイド・ワクチンにお
いて使用するための適切な免疫原の充分な量を製造する
ことができる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】３．発明の概要 連鎖球菌のＭ蛋白質遺伝子の単細胞生物中でのクローニ
ングと発現のための方法が提供される。また、これらの
新規な単細胞生物をＭ蛋白質を生産するために培養する
方法、Ｍ蛋白質ＤＮＡを発現する単一のコロニーを同定
する急速検定、及び遺伝子産物の特定のための方法も記
載されている。
ングと発現のための方法が提供される。また、これらの
新規な単細胞生物をＭ蛋白質を生産するために培養する
方法、Ｍ蛋白質ＤＮＡを発現する単一のコロニーを同定
する急速検定、及び遺伝子産物の特定のための方法も記
載されている。
【００１３】ここに記載されている特定の態様では、大
腸菌トランスダクタント（Ｅ．ｃｏｌｉｔｒａｎｓｄｕ
ｃｔａｎｔｓ）により生産される蛋白質はＡ群連鎖球菌
の細胞壁の可溶化によって単離されるＭ６蛋白質よりご
く少し大きいが、連鎖球菌のプロトプラストとＬ型によ
り分泌されるものと同程度の大きさを有している。免疫
学的に大腸菌トランスダクタントにより合成される分子
は連鎖球菌Ｍ６蛋白質と同じ型特異性決定部位を有して
いる。Ｍ蛋白質は、オクターロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌ
ｏｎｙ）二重融合実験により抗原的に、（ａ）オプソニ
ン抗体除去試験及び（ｂ）オプソニン抗体の生産誘導能
により免疫原的に特徴づけられる。クロン化されたＭ蛋
白質は単離され、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリ
ルアミド・ゲル電気泳動法で分画される。さらに発現さ
れた遺伝子産物の単離方法も記載されている。
腸菌トランスダクタント（Ｅ．ｃｏｌｉｔｒａｎｓｄｕ
ｃｔａｎｔｓ）により生産される蛋白質はＡ群連鎖球菌
の細胞壁の可溶化によって単離されるＭ６蛋白質よりご
く少し大きいが、連鎖球菌のプロトプラストとＬ型によ
り分泌されるものと同程度の大きさを有している。免疫
学的に大腸菌トランスダクタントにより合成される分子
は連鎖球菌Ｍ６蛋白質と同じ型特異性決定部位を有して
いる。Ｍ蛋白質は、オクターロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌ
ｏｎｙ）二重融合実験により抗原的に、（ａ）オプソニ
ン抗体除去試験及び（ｂ）オプソニン抗体の生産誘導能
により免疫原的に特徴づけられる。クロン化されたＭ蛋
白質は単離され、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリ
ルアミド・ゲル電気泳動法で分画される。さらに発現さ
れた遺伝子産物の単離方法も記載されている。
【００１４】本発明は連鎖球菌のオプソニン抗体及び抗
原の製造法を提供する。それらは、ヒトの医薬及び微生
物学的研究において一般的重要性を有するものである。
この用途は本発明で生産される連鎖球菌Ｍ蛋白質をラジ
オイムノアッセイのような超高感度検定のための高度に
再現性を有する標準抗原として用いることを含むもので
ある。これらの検定は生物学的標本中の連鎖球菌に対す
る抗体の発見のための診断的手段として用いられうる。
原の製造法を提供する。それらは、ヒトの医薬及び微生
物学的研究において一般的重要性を有するものである。
この用途は本発明で生産される連鎖球菌Ｍ蛋白質をラジ
オイムノアッセイのような超高感度検定のための高度に
再現性を有する標準抗原として用いることを含むもので
ある。これらの検定は生物学的標本中の連鎖球菌に対す
る抗体の発見のための診断的手段として用いられうる。
【００１５】４．発明の詳細な記載 ４．１Ｍ蛋白質免疫原 本発明はワクチン製剤における免疫原として用いられう
る連鎖球菌Ｍ蛋白質を製造する組変えＤＮＡ技術に関す
るものである。さらに特定すれば、Ｍ６蛋白質の製造が
記載されている。
る連鎖球菌Ｍ蛋白質を製造する組変えＤＮＡ技術に関す
るものである。さらに特定すれば、Ｍ６蛋白質の製造が
記載されている。
【００１６】ここに記載されているように構成された組
換えプラスミドは、宿主細胞（原核 ）に対し宿主細胞の
分解に対して安定かつ抵抗性のある連鎖球菌Ｍ蛋白質の
生産性を与える。かかるプラスミドは天然に存在するＭ
蛋白質の免疫学的、抗原的決定部位を含む多量の蛋白質
又はその画分を生成することができる。ここに記されて
いる特定の態様はＭ６蛋白質に関する。しかし、ここに
記載されるＤＮＡ分子はＭ６蛋白質の生産に限定される
ものではなく、いかなるＡ群連鎖球菌Ｍ蛋白の製造にも
用いうるものである。
換えプラスミドは、宿主細胞（原核 ）に対し宿主細胞の
分解に対して安定かつ抵抗性のある連鎖球菌Ｍ蛋白質の
生産性を与える。かかるプラスミドは天然に存在するＭ
蛋白質の免疫学的、抗原的決定部位を含む多量の蛋白質
又はその画分を生成することができる。ここに記されて
いる特定の態様はＭ６蛋白質に関する。しかし、ここに
記載されるＤＮＡ分子はＭ６蛋白質の生産に限定される
ものではなく、いかなるＡ群連鎖球菌Ｍ蛋白の製造にも
用いうるものである。
【００１７】Ｍ６蛋白質についてここに記載されている
組成物と方法とのすべてのＭ蛋白質への一般的応用可能
性はフィシェティ及びマンジュラの研究（１９８２，ロ
ビンス，ヒル及びサドフ（編集）、バクテリアル・ワク
チン中の４１１−４４８頁、連鎖球菌Ｍ蛋白質及び哺乳
動物トロポミオシン間の構造の関係の免疫学的連係）か
ら明らかである。たとえばこれまでに配列がきめられた
すべてのＭ蛋白質はＭ５、Ｍ６及びＭ２４を含んで明瞭
な同族性を示し、すべて多重コイル構造である。アミノ
末端及び他の配列がきめられた画分は３種のＭ分子のす
べてについて７個の残基の周期的くりかえしを示してい
る。さらに数種のＭ型の免疫学的分析は、各種の型の間
の交叉反応を示した。フィシェッティ，ジャーナル・オ
ブ・エクスペリメンタル・メジソン１４６：１１０８−
１１２３（１９７７）；マンジュラ及びフィシェッテ
ィ，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジソン
１５１：６９５−７０８（１９８０）；マンジュラ及び
フィシェッティ，ジャーナル・オブ・イムノロジー１２
４：２６１−２６７（１９８０）。さらに下記に示す交
雑のデータは試験した５６種のＭ蛋白質遺伝子のすべて
の間で構造の類似性を示している。
組成物と方法とのすべてのＭ蛋白質への一般的応用可能
性はフィシェティ及びマンジュラの研究（１９８２，ロ
ビンス，ヒル及びサドフ（編集）、バクテリアル・ワク
チン中の４１１−４４８頁、連鎖球菌Ｍ蛋白質及び哺乳
動物トロポミオシン間の構造の関係の免疫学的連係）か
ら明らかである。たとえばこれまでに配列がきめられた
すべてのＭ蛋白質はＭ５、Ｍ６及びＭ２４を含んで明瞭
な同族性を示し、すべて多重コイル構造である。アミノ
末端及び他の配列がきめられた画分は３種のＭ分子のす
べてについて７個の残基の周期的くりかえしを示してい
る。さらに数種のＭ型の免疫学的分析は、各種の型の間
の交叉反応を示した。フィシェッティ，ジャーナル・オ
ブ・エクスペリメンタル・メジソン１４６：１１０８−
１１２３（１９７７）；マンジュラ及びフィシェッテ
ィ，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジソン
１５１：６９５−７０８（１９８０）；マンジュラ及び
フィシェッティ，ジャーナル・オブ・イムノロジー１２
４：２６１−２６７（１９８０）。さらに下記に示す交
雑のデータは試験した５６種のＭ蛋白質遺伝子のすべて
の間で構造の類似性を示している。
【００１８】４．２Ｍ蛋白質分子プローブ ここに記載されるＭ蛋白質遺伝子又はその断片は連鎖球
菌に対する診断試験における分子プローブとして使用さ
れうる。この試験の原理は、病原性連鎖球菌は、本発明
のＭ蛋白質遺伝子の部分と相補的な遺伝子配列を有して
いるという事実である。かかる遺伝子の相補性は連鎖球
菌感染と疑われるものから微生物ＤＮＡを単離し、その
ＤＮＡを固状担体上又は液状媒体中で適切な条件下に分
子プローブと結合させることにより直ちに検出されう
る。交雑の生起は適当なリポーター群のプローブに対す
る添加により容易に検出されうる。
菌に対する診断試験における分子プローブとして使用さ
れうる。この試験の原理は、病原性連鎖球菌は、本発明
のＭ蛋白質遺伝子の部分と相補的な遺伝子配列を有して
いるという事実である。かかる遺伝子の相補性は連鎖球
菌感染と疑われるものから微生物ＤＮＡを単離し、その
ＤＮＡを固状担体上又は液状媒体中で適切な条件下に分
子プローブと結合させることにより直ちに検出されう
る。交雑の生起は適当なリポーター群のプローブに対す
る添加により容易に検出されうる。
【００１９】連鎖球菌状生物はいかなる体組織や体液中
の感染部位からも単離されうるが、単純な咽喉スワブは
最も好適な材料となろう。多分混合培養物であるこのよ
うにして得られた微生物は直接（すなわちスワブ上で）
又は当該技術の専門家によく知られている培地のいづれ
かの中で多数の細胞を生成するよう生育させて用いられ
うる。そして、混合培養物からのＤＮＡは、凍結−融
解、音波処理又は他の機械的手段によりおよび／または
一般的あるいは特異的な細菌細胞壁融解試薬で処理した
のち抽出されうる。
の感染部位からも単離されうるが、単純な咽喉スワブは
最も好適な材料となろう。多分混合培養物であるこのよ
うにして得られた微生物は直接（すなわちスワブ上で）
又は当該技術の専門家によく知られている培地のいづれ
かの中で多数の細胞を生成するよう生育させて用いられ
うる。そして、混合培養物からのＤＮＡは、凍結−融
解、音波処理又は他の機械的手段によりおよび／または
一般的あるいは特異的な細菌細胞壁融解試薬で処理した
のち抽出されうる。
【００２０】抽出されたＤＮＡは通常水性アルカリの添
加により変性され、ついで緩衝溶液で洗浄される。アル
カリの特定の濃度や緩衝液の組成等は実験の条件によ
り、通常実験により容易に決定しうる。本発明の変性Ｍ
蛋白質遺伝子プローブは、ついで微生物のＤＮＡ製剤に
加えられ、ＤＮＡ配列の点において相補的に交雑させら
れる。特異的結合は交雑混合物を充分に洗滌して非特異
的結合を除去したのちに残すことにより確認されよう。
加により変性され、ついで緩衝溶液で洗浄される。アル
カリの特定の濃度や緩衝液の組成等は実験の条件によ
り、通常実験により容易に決定しうる。本発明の変性Ｍ
蛋白質遺伝子プローブは、ついで微生物のＤＮＡ製剤に
加えられ、ＤＮＡ配列の点において相補的に交雑させら
れる。特異的結合は交雑混合物を充分に洗滌して非特異
的結合を除去したのちに残すことにより確認されよう。
【００２１】交雑はその目的のために開発され、認めら
れて来ている多数の溶液のひとつの中で行われる。ファ
ルコウらは米国特許第４，３５８，５３５号明細書に全
般的に溶液組成及び交雑工程の多くの考察を記載した。
この特許はその一般的有用性の故に、ここに参考文献と
して包含される。他の交雑の指標となる特定の数値、た
とえば時間や温度、および用いられる方法は本発明にと
って必須のものではない。たとえばゴール及びパーデュ
［プロシージングス・オブ・ナチュラル・アカデミー・
オブ・サイエンスＵ．Ｓ．Ａ．６３：３７８−３８３
（１９６９）］及びジョンら［ネイチュアー２２３：５
８２−５８７（１９６９）］によって記載された方法が
適用されうる。事実交雑のために選ばれる方法は技術水
準の進歩とともに変ってゆくものと期待される。
れて来ている多数の溶液のひとつの中で行われる。ファ
ルコウらは米国特許第４，３５８，５３５号明細書に全
般的に溶液組成及び交雑工程の多くの考察を記載した。
この特許はその一般的有用性の故に、ここに参考文献と
して包含される。他の交雑の指標となる特定の数値、た
とえば時間や温度、および用いられる方法は本発明にと
って必須のものではない。たとえばゴール及びパーデュ
［プロシージングス・オブ・ナチュラル・アカデミー・
オブ・サイエンスＵ．Ｓ．Ａ．６３：３７８−３８３
（１９６９）］及びジョンら［ネイチュアー２２３：５
８２−５８７（１９６９）］によって記載された方法が
適用されうる。事実交雑のために選ばれる方法は技術水
準の進歩とともに変ってゆくものと期待される。
【００２２】本発明の基礎となる分子プローブは、特定
の交雑を起しうるように遺伝子配列を保持するに充分で
あるかぎりは、Ｍ蛋白質遺伝子の全部又はその一部だけ
であってもよい。かかる交雑はごくわずかな程度であっ
てさえも、その分子プローブに適切なリポーター・グル
ープを結合させることによって検出されうる。そのプロ
ーブは放射性同位元素で標識を付しうる（たとえば３２
Ｐ，３Ｈ，１４Ｃ，３５Ｓ等による標識）し、また化学
的あるいは酵素的リポーター・グループで標識されう
る。たとえば、ビオチン化された（ｂｉｏｔｉｎｙｌａ
ｔｅｄ）プローブと組み合わされた比色検出手段を、た
とえばフルオレッセイン・アビジン，ローダミン・アピ
ジン又は酵素と結合したアビジン等のアビジン誘導体と
共に用いることができる。
の交雑を起しうるように遺伝子配列を保持するに充分で
あるかぎりは、Ｍ蛋白質遺伝子の全部又はその一部だけ
であってもよい。かかる交雑はごくわずかな程度であっ
てさえも、その分子プローブに適切なリポーター・グル
ープを結合させることによって検出されうる。そのプロ
ーブは放射性同位元素で標識を付しうる（たとえば３２
Ｐ，３Ｈ，１４Ｃ，３５Ｓ等による標識）し、また化学
的あるいは酵素的リポーター・グループで標識されう
る。たとえば、ビオチン化された（ｂｉｏｔｉｎｙｌａ
ｔｅｄ）プローブと組み合わされた比色検出手段を、た
とえばフルオレッセイン・アビジン，ローダミン・アピ
ジン又は酵素と結合したアビジン等のアビジン誘導体と
共に用いることができる。
【００２３】Ｍ６蛋白質のエシエリヒア・コリ（大腸
菌）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ）中でのクロー
ニングと発現の方法及び連鎖球菌感染を特徴づけるため
のプローブとしてのＭ６蛋白質遺伝子の使用法の下記す
る実施例は、例示の目的で記されるもので、発明の範囲
についての限定の意図によるものではない。
菌）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ）中でのクロー
ニングと発現の方法及び連鎖球菌感染を特徴づけるため
のプローブとしてのＭ６蛋白質遺伝子の使用法の下記す
る実施例は、例示の目的で記されるもので、発明の範囲
についての限定の意図によるものではない。
【００２４】
５．実施例：連鎖球菌Ｍ蛋白質遺伝子を含むクロンの製
造、及び該遺伝子の連 鎖球菌感染の診断的試験における
分子プローブとしての使用 ５．１ 連鎖球菌ＤＮＡの単離 Ｍ６蛋白質遺伝子の起原は、ストレプトコッカス・ピオ
ゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）Ｄ４７１株（Ａ群連鎖球菌）であった。Ｃ群連鎖球
菌ファージ細胞溶解素（Ｇｒｏｕｐ Ｃ ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃａｌｐｈａｇｅ ｌｙｓｉｎ）が、３０％ラ
フイノーズの存在下に、安定なプロトプラストを残して
Ａ群連鎖球菌の細胞壁を溶解するために用いられた（フ
ィリップスら、プロシージングス・オブ・ナチュラル・
アカデミー・オブ・サイエンス，Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：４
６８９（１９８１））。ついでそのプロトプラストは充
分に洗浄され連鎖球菌のデオキシリボヌクレアーゼ（Ｄ
ＮＡｓｅ）を除去するため蛋白分解酵素Ｋで処理され
た。プロトプラストはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）中に希釈して溶菌され、抽出物がＲＮＡを消化する
ためリボヌクレアーゼＩで処理された。塩化セシウムが
加えられた。この製品は蛋白質を除去するために約１０
０ｘｇで遠心分離され、一夜透析された。ＤＮＡはエタ
ノールにより沈澱させられた。使用のために選択された
ＤＮＡ画分は消化前に充分１００キロベース（ｋｂ）以
上であった（Ｐ１ファージＤＮＡを１００ｋｂの標準と
し、Ｐ１分子の半分を５０ｋｂの標準として０．４％ア
ガローズ・ゲル上でのアガローズ・ゲル電気泳動で検定
した）。
造、及び該遺伝子の連 鎖球菌感染の診断的試験における
分子プローブとしての使用 ５．１ 連鎖球菌ＤＮＡの単離 Ｍ６蛋白質遺伝子の起原は、ストレプトコッカス・ピオ
ゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）Ｄ４７１株（Ａ群連鎖球菌）であった。Ｃ群連鎖球
菌ファージ細胞溶解素（Ｇｒｏｕｐ Ｃ ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃａｌｐｈａｇｅ ｌｙｓｉｎ）が、３０％ラ
フイノーズの存在下に、安定なプロトプラストを残して
Ａ群連鎖球菌の細胞壁を溶解するために用いられた（フ
ィリップスら、プロシージングス・オブ・ナチュラル・
アカデミー・オブ・サイエンス，Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：４
６８９（１９８１））。ついでそのプロトプラストは充
分に洗浄され連鎖球菌のデオキシリボヌクレアーゼ（Ｄ
ＮＡｓｅ）を除去するため蛋白分解酵素Ｋで処理され
た。プロトプラストはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）中に希釈して溶菌され、抽出物がＲＮＡを消化する
ためリボヌクレアーゼＩで処理された。塩化セシウムが
加えられた。この製品は蛋白質を除去するために約１０
０ｘｇで遠心分離され、一夜透析された。ＤＮＡはエタ
ノールにより沈澱させられた。使用のために選択された
ＤＮＡ画分は消化前に充分１００キロベース（ｋｂ）以
上であった（Ｐ１ファージＤＮＡを１００ｋｂの標準と
し、Ｐ１分子の半分を５０ｋｂの標準として０．４％ア
ガローズ・ゲル上でのアガローズ・ゲル電気泳動で検定
した）。
【００２５】５．２大腸菌へのクローニング Ｍ蛋白質生成のスクリーニングに必要な大腸菌クロンの
候補の数を減らし、かつＭ蛋白質の構造遺伝子に結合す
る調節部位を残すために、連鎖球菌ＤＮＡを大きい断片
としてクローン化することにした。従って、３５ないし
４０ｋｂのＤＮＡの挿入を受け入れるコスミド・ベクタ
ーが必要であった。クローニング・ビヒクルとして５．
４ｋｂのベクター，ｐＪＢ８が選ばれた。このベクター
は、イッシューホロウイッツ及びバーク、ヌクレイック
・アシッヅ・リサーチ９（１３）：２９８９−２９９８
（１９８１）が記載した方法によりアンピシリン耐性プ
ラスミドＨｏｍｅｒ Ｉと合成Ｂａｍ ＨＩリンカーと
から構成された。
候補の数を減らし、かつＭ蛋白質の構造遺伝子に結合す
る調節部位を残すために、連鎖球菌ＤＮＡを大きい断片
としてクローン化することにした。従って、３５ないし
４０ｋｂのＤＮＡの挿入を受け入れるコスミド・ベクタ
ーが必要であった。クローニング・ビヒクルとして５．
４ｋｂのベクター，ｐＪＢ８が選ばれた。このベクター
は、イッシューホロウイッツ及びバーク、ヌクレイック
・アシッヅ・リサーチ９（１３）：２９８９−２９９８
（１９８１）が記載した方法によりアンピシリン耐性プ
ラスミドＨｏｍｅｒ Ｉと合成Ｂａｍ ＨＩリンカーと
から構成された。
【００２６】本発明においては、ベクターｐＪＢ８は、
ベクターを特有な位置で切断し「粘着末端」を生成する
Ｂａｍ ＨＩ（マニアティスら、上掲書、１０４−１０
６頁が一般的に記載）で消化された。切断されたベクタ
ーは、ベクター・ベクター間の再結合や再環形成を防ぐ
ために、アルカリ性フォスファターゼで処理され（たと
えばマニアティスら、上掲書、１３３−１３４）、線状
化されたベクターの５′−フォスフェートが除去され
た。ランダムなＤＮＡ断片を生成させるため、第５．１
節に記載したようにして単離された連鎖球菌ＤＮＡを部
分的に消化するためにＳａｕ ３ａ制限酵素が用いられ
た（たとえばマニアティスら、前掲書、２９８）。分画
された連鎖球菌ＤＮＡはｐＪＢ８ベクター上のＢａｍ
ＨＩの部分に結合された（第１図参照、たとえばマニア
ティスら、上掲書、２９８−２９９）。
ベクターを特有な位置で切断し「粘着末端」を生成する
Ｂａｍ ＨＩ（マニアティスら、上掲書、１０４−１０
６頁が一般的に記載）で消化された。切断されたベクタ
ーは、ベクター・ベクター間の再結合や再環形成を防ぐ
ために、アルカリ性フォスファターゼで処理され（たと
えばマニアティスら、上掲書、１３３−１３４）、線状
化されたベクターの５′−フォスフェートが除去され
た。ランダムなＤＮＡ断片を生成させるため、第５．１
節に記載したようにして単離された連鎖球菌ＤＮＡを部
分的に消化するためにＳａｕ ３ａ制限酵素が用いられ
た（たとえばマニアティスら、前掲書、２９８）。分画
された連鎖球菌ＤＮＡはｐＪＢ８ベクター上のＢａｍ
ＨＩの部分に結合された（第１図参照、たとえばマニア
ティスら、上掲書、２９８−２９９）。
【００２７】連鎖球菌ＤＮＡが挿入されたベクターは試
験管内でラムダ・ファージの頭部にとりこまれた［ホー
ン及びコリンズ，ジーン１１：２９１（１９８０）］。
とりこまれたキメラＤＮＡを包含するファージは、熱的
に誘起されうるプロファージを有する大腸菌Ｋ１２の制
限機構のない株Ｃ６００（ｌａｍｂｄａｃ Ｉ８５７）
ｒｅｃ Ａを形質導入するために用いられた。アンピシ
リン耐性コロニーが３０°Ｃで選び出され、同じ選択培
地に移され、一夜３００Ｃで培養されて、マスター・プ
レートをつくった。
験管内でラムダ・ファージの頭部にとりこまれた［ホー
ン及びコリンズ，ジーン１１：２９１（１９８０）］。
とりこまれたキメラＤＮＡを包含するファージは、熱的
に誘起されうるプロファージを有する大腸菌Ｋ１２の制
限機構のない株Ｃ６００（ｌａｍｂｄａｃ Ｉ８５７）
ｒｅｃ Ａを形質導入するために用いられた。アンピシ
リン耐性コロニーが３０°Ｃで選び出され、同じ選択培
地に移され、一夜３００Ｃで培養されて、マスター・プ
レートをつくった。
【００２８】大腸菌中にクロンされたほとんどのグラム
陽性遺伝子は発現しているので、Ｍ蛋白質遺伝子が大腸
菌中で発現するという可能性は高かった。しかし、Ｍ蛋
白質はペリプラスム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）と外膜とい
ういずれも連鎖球菌には存在しないものを通して移送さ
れなければならないから、Ｍ蛋白質が大腸菌の表面に現
われるとは思われなかった。この理由から、その大腸菌
のマスター・プレートはプロファージを誘起し、宿主細
胞を溶菌するために４２℃に移され、クロン化された遺
伝子の発現を確認した。［シャルカ及びシャピロ，ジー
ン１：６５（１９７６）］
陽性遺伝子は発現しているので、Ｍ蛋白質遺伝子が大腸
菌中で発現するという可能性は高かった。しかし、Ｍ蛋
白質はペリプラスム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）と外膜とい
ういずれも連鎖球菌には存在しないものを通して移送さ
れなければならないから、Ｍ蛋白質が大腸菌の表面に現
われるとは思われなかった。この理由から、その大腸菌
のマスター・プレートはプロファージを誘起し、宿主細
胞を溶菌するために４２℃に移され、クロン化された遺
伝子の発現を確認した。［シャルカ及びシャピロ，ジー
ン１：６５（１９７６）］
【００２９】５．３Ｍ蛋白質の発現のための単一コロニ
ーの高速検定 Ｍ蛋白質を発現する大腸菌のクロンを認識するため高速
検定法を開発した。この技術はＭ蛋白質を発現する単一
のコロニーを容易に見分けうる。
ーの高速検定 Ｍ蛋白質を発現する大腸菌のクロンを認識するため高速
検定法を開発した。この技術はＭ蛋白質を発現する単一
のコロニーを容易に見分けうる。
【００３０】この検定法は、試験さるべき溶菌されたコ
ロニーをニトロセルローズフィルターに移し、蛋白質に
対するフィルターの非特異的親和性を減少させるため牛
血清アルブミン中で該フィルターを洗滌し、そのフィル
ターを大腸菌細胞で充分に予備吸収（ｐｒｅ−ａｂｓｏ
ｒｂｅｄ）した精製されたＬｙｓ Ｍ６に対する抗血清
と反応させ、適宜に洗浄し、１２５Ｉ−連鎖球菌蛋白質
Ａ（抗原−抗体複合体に結合している）と反応させ、再
び洗浄し、ついでオートラジオグラフィーで測定するこ
とからなる。
ロニーをニトロセルローズフィルターに移し、蛋白質に
対するフィルターの非特異的親和性を減少させるため牛
血清アルブミン中で該フィルターを洗滌し、そのフィル
ターを大腸菌細胞で充分に予備吸収（ｐｒｅ−ａｂｓｏ
ｒｂｅｄ）した精製されたＬｙｓ Ｍ６に対する抗血清
と反応させ、適宜に洗浄し、１２５Ｉ−連鎖球菌蛋白質
Ａ（抗原−抗体複合体に結合している）と反応させ、再
び洗浄し、ついでオートラジオグラフィーで測定するこ
とからなる。
【００３１】Ｍ６蛋白質を検出するには抗血清は１００
０倍以上に希釈される。抗血清が１０倍希釈（さらに１
００倍以上濃縮された）で用いられたときは大腸菌と検
出しうる反応を起さない。この方法により、親の連鎖球
菌中に生産された１％未満の量のＭ６蛋白質の大腸菌ク
ロンによる生成が検出されうる。
０倍以上に希釈される。抗血清が１０倍希釈（さらに１
００倍以上濃縮された）で用いられたときは大腸菌と検
出しうる反応を起さない。この方法により、親の連鎖球
菌中に生産された１％未満の量のＭ６蛋白質の大腸菌ク
ロンによる生成が検出されうる。
【００３２】スクリーンされた３３５のコロニーのう
ち、１つが精製Ｍ６蛋白質に対する抗血清と強く反応し
た。この株のうちに存在するキメラ・プラスミドはｐＪ
ＲＳ４２と名づけられた。この大腸菌クロンのＭ６蛋白
質の生産能はアンピシリン含有培地中のサブ・カルチュ
ア上で安定に維持された。プラスミドｐＪＲＳ ４２は
ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼで処理され、連鎖球菌Ｄ
ＮＡの画分を除去しｐＪＲＳ ４２．１３を生成した。
このプラスミドはすべての必要な複製機能とそのプロモ
ーター系とともにＭ６蛋白質をコードする完全な配列を
保持している。
ち、１つが精製Ｍ６蛋白質に対する抗血清と強く反応し
た。この株のうちに存在するキメラ・プラスミドはｐＪ
ＲＳ４２と名づけられた。この大腸菌クロンのＭ６蛋白
質の生産能はアンピシリン含有培地中のサブ・カルチュ
ア上で安定に維持された。プラスミドｐＪＲＳ ４２は
ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼで処理され、連鎖球菌Ｄ
ＮＡの画分を除去しｐＪＲＳ ４２．１３を生成した。
このプラスミドはすべての必要な複製機能とそのプロモ
ーター系とともにＭ６蛋白質をコードする完全な配列を
保持している。
【００３３】５．４遺伝子産物の同定 ｐＪＢ ８を含む大腸菌Ｃ６００ＮＲ株とｐＪＲＳ ４
２を含むＣ６００ＮＲトランスダクタントを、アンピシ
リン含有のトッド−ヘウイット肉汁（牛心臓添加肉汁
（ｂｅｅｆ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏｔ
ｈ））中で対数増殖期の終期まで３０℃で生育させた。
細胞はペレット化され、二度洗浄され、ついでエチレン
・ジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）−リゾチームで溶菌
され、乾燥氷−エタノール中で凍結し、３７℃で急速に
解凍された。ＤＮＡ−アーゼ（ＤＮＡ ｓｅ）処理にひ
きつづき、１０，０００ｘｇで３０分間遠心分離して細
胞の破片を除去し、抽出物を０．４５ミクロンのミリボ
ア・フィルターに通し、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム
に対して透析した。
２を含むＣ６００ＮＲトランスダクタントを、アンピシ
リン含有のトッド−ヘウイット肉汁（牛心臓添加肉汁
（ｂｅｅｆ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏｔ
ｈ））中で対数増殖期の終期まで３０℃で生育させた。
細胞はペレット化され、二度洗浄され、ついでエチレン
・ジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）−リゾチームで溶菌
され、乾燥氷−エタノール中で凍結し、３７℃で急速に
解凍された。ＤＮＡ−アーゼ（ＤＮＡ ｓｅ）処理にひ
きつづき、１０，０００ｘｇで３０分間遠心分離して細
胞の破片を除去し、抽出物を０．４５ミクロンのミリボ
ア・フィルターに通し、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム
に対して透析した。
【００３４】大腸菌中に生成したＭ蛋白質分子の同定は
免疫吸収分析（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉ
ｓ）で決定された。フォリンの反応［ロウリーら、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー１９３：
２６５（１９５１）］で決定された当量蛋白質濃度がＳ
ＤＳ含有の１２％ポリアクリルアミド・ゲルに適用され
た。６型連鎖球菌からファージ細胞溶解素で細胞壁を可
溶化することにより、６型連鎖球菌から抽出された精製
Ｍ６蛋白質の標準製品が対照として隣接するウェル（ｗ
ｅｌｌ）に対して適用された。電気泳動後、分離された
蛋白質はニトロセルローズ上に移され、フィルター上の
未反応部位はツイーン２０（ポリオキシエチレン・ソル
ビタン・モノラウレート）を用いて保護され、大腸菌で
吸収された連鎖球菌から得られた細胞溶解素で抽出され
たＭ６蛋白質に対して向けられた抗血清とともにフィル
ターがインキュベートされた。山羊の抗ウサギＩｇＧに
結合したアルカリ性フォスファターゼを用いる酵素結合
免疫検定法が結合抗体を検出するために用いられた。ア
ルカリ性フォスファターゼの基質としてインドキソル・
フォスフェイトが、発色団としてニトロブルー・テトラ
ゾリウムが用いられ、ブレイクらの方法［アナリティカ
ル・バイオケミストリー１３６：１７５−１７９（１９
８４）］でバンドが可視化された。Ｍ６抗血清は対照の
Ｍ６とｐＪＲＳ ４２を含む大腸菌クロンの抽出物のい
づれとも反応したが、ｐＪＢ ８ベクターのみを含む親
の大腸菌の抽出物とは反応しなかった。
免疫吸収分析（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉ
ｓ）で決定された。フォリンの反応［ロウリーら、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー１９３：
２６５（１９５１）］で決定された当量蛋白質濃度がＳ
ＤＳ含有の１２％ポリアクリルアミド・ゲルに適用され
た。６型連鎖球菌からファージ細胞溶解素で細胞壁を可
溶化することにより、６型連鎖球菌から抽出された精製
Ｍ６蛋白質の標準製品が対照として隣接するウェル（ｗ
ｅｌｌ）に対して適用された。電気泳動後、分離された
蛋白質はニトロセルローズ上に移され、フィルター上の
未反応部位はツイーン２０（ポリオキシエチレン・ソル
ビタン・モノラウレート）を用いて保護され、大腸菌で
吸収された連鎖球菌から得られた細胞溶解素で抽出され
たＭ６蛋白質に対して向けられた抗血清とともにフィル
ターがインキュベートされた。山羊の抗ウサギＩｇＧに
結合したアルカリ性フォスファターゼを用いる酵素結合
免疫検定法が結合抗体を検出するために用いられた。ア
ルカリ性フォスファターゼの基質としてインドキソル・
フォスフェイトが、発色団としてニトロブルー・テトラ
ゾリウムが用いられ、ブレイクらの方法［アナリティカ
ル・バイオケミストリー１３６：１７５−１７９（１９
８４）］でバンドが可視化された。Ｍ６抗血清は対照の
Ｍ６とｐＪＲＳ ４２を含む大腸菌クロンの抽出物のい
づれとも反応したが、ｐＪＢ ８ベクターのみを含む親
の大腸菌の抽出物とは反応しなかった。
【００３５】大腸菌クロンにより生成されるＭ蛋白質の
分子量が、精製されたＬｙｓＭ６蛋白質の標準製品と免
疫吸収分析（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉ
ｓ）で比較された。この分子はファージ細胞溶解素とい
う酵素によるストレプトコッカスの細胞壁の可溶化とカ
ラム・クロマトグラフィーによる精製の結果物である。
それは連鎖球菌の細胞壁から分離された最大のＭ蛋白質
分子であることを示している。
分子量が、精製されたＬｙｓＭ６蛋白質の標準製品と免
疫吸収分析（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉ
ｓ）で比較された。この分子はファージ細胞溶解素とい
う酵素によるストレプトコッカスの細胞壁の可溶化とカ
ラム・クロマトグラフィーによる精製の結果物である。
それは連鎖球菌の細胞壁から分離された最大のＭ蛋白質
分子であることを示している。
【００３６】このＭ６蛋白質はつぎのようにして精製さ
れた。プラスミドｐＪＲＳ ４２．１３を含む大腸菌を
ＥＤＴＡ及び２０％のショ糖の存在下にリゾチームで処
理した。これによりペリプラズムの内容物が周辺の液体
中に溶出される。菌体の遠心分離によりペリプラズムの
内容物を他の大腸菌関連蛋白質とともに上澄液中にのこ
す。この技術を用いて、Ｍ蛋白質はペリプラズム空間に
は高濃度で存在するが、実質上は細胞質には存在しない
ことが知られた。従って、この方法はＭ蛋白質精製の出
発原料を生成させるのに用いられた。
れた。プラスミドｐＪＲＳ ４２．１３を含む大腸菌を
ＥＤＴＡ及び２０％のショ糖の存在下にリゾチームで処
理した。これによりペリプラズムの内容物が周辺の液体
中に溶出される。菌体の遠心分離によりペリプラズムの
内容物を他の大腸菌関連蛋白質とともに上澄液中にのこ
す。この技術を用いて、Ｍ蛋白質はペリプラズム空間に
は高濃度で存在するが、実質上は細胞質には存在しない
ことが知られた。従って、この方法はＭ蛋白質精製の出
発原料を生成させるのに用いられた。
【００３７】粗製のペリプラズム内容物中のＭ蛋白質は
他の夾雑する蛋白質からカラム・クロマトグラフィーで
精製された。粗製のペリプラズム調製品は５ｍＭ重炭酸
アンモニウムのｐＨ５．５緩衝液で透析され、カルボキ
ソメチルセルロースのカラムにかけられた。カラムは同
じ緩衝液の３倍量で洗浄し、ｐＨ７．０で１００ｍＭリ
ン酸ナトリウムで１段で付着する蛋白質を溶出した。遊
離蛋白（Ｍ蛋白を含む）は２５ｍＭ濃度のリン酸ナトリ
ウムｐＨ７．０で平衡化したヒドロキシアパタイトに直
接使用した。カラムをカラムの２倍量のｐＨ７．０の２
００ｍＭリン酸ナトリウムで洗浄し、ついで付着するＭ
蛋白質をｐＨ７．０のリン酸ナトリウム４００ｍＭ溶液
で溶出した。この方法によって、高度に精製されたＭ蛋
白質製品が得られ、それはＳＤＳ−ポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動法と配列分析法（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａ
ｎａｌｙｓｉｓ）で決定された。
他の夾雑する蛋白質からカラム・クロマトグラフィーで
精製された。粗製のペリプラズム調製品は５ｍＭ重炭酸
アンモニウムのｐＨ５．５緩衝液で透析され、カルボキ
ソメチルセルロースのカラムにかけられた。カラムは同
じ緩衝液の３倍量で洗浄し、ｐＨ７．０で１００ｍＭリ
ン酸ナトリウムで１段で付着する蛋白質を溶出した。遊
離蛋白（Ｍ蛋白を含む）は２５ｍＭ濃度のリン酸ナトリ
ウムｐＨ７．０で平衡化したヒドロキシアパタイトに直
接使用した。カラムをカラムの２倍量のｐＨ７．０の２
００ｍＭリン酸ナトリウムで洗浄し、ついで付着するＭ
蛋白質をｐＨ７．０のリン酸ナトリウム４００ｍＭ溶液
で溶出した。この方法によって、高度に精製されたＭ蛋
白質製品が得られ、それはＳＤＳ−ポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動法と配列分析法（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａ
ｎａｌｙｓｉｓ）で決定された。
【００３８】アミノ末端配列分析で精製大腸菌合成Ｍ６
蛋白質から単一のフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）
−アミノ酸が各分解段階で得られ、最終製品の均質性が
証明された。さらに、アミノ末端の配列は、アミノ末端
の残基を除く最初の配列された３５箇の残基によってＬ
ｙｓ Ｍ６のアミノ末端配列と同一であることがわかっ
た。大腸菌の分子はリジン分子の精製の間に脱離されう
るアミノ末端に余分にアルギニン残基を有している。精
製されたＬｙｓ Ｍ６製品はさきにＭ６分子でみられた
多重バンドの模様を有しているが、それはおそらく抽出
と精製との過程での分解によるものであろう。３つの大
きいバンドは５１，０００、５２，０００及び５３，０
００ダルトンのはっきりした分子量に相当する。Ｍ６製
品の大きさの異質さは、おそらく蛋白質のカルボキシ末
端部分の相違からくるものであろう。この理由は、配列
の分解による本製品のアミノ末端配列分析の間に各段階
ごとに一つのアミノ酸残基のみが放出されることによ
る。抗Ｍ６抗体と反応するｐＪＲＳ４２を含むクロンに
よるバンドはすべて連鎖球菌製品からのものに比して大
きい（分子量５５，０００、５７，０００、５９，００
０ダルトン）。このことは、ｐＪＲＳ４２はＭ６蛋白質
の全構造遺伝子を含んでいることを示唆していた。この
ことは、この分子の大きさが１２型連鎖球菌のプロトプ
ラスト及びＬ型から分泌されるＭ蛋白質の大きさとして
報告されているもの（分子量５８，０００ダルトン）と
よく一致しているという事実によってうらづけられた。
従って、大腸菌製品中の蛋白質は、連鎖球菌の細胞溶解
素抽出により放出されるものより完全な自然のＭ分子の
大きさにより近いものであろう。
蛋白質から単一のフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）
−アミノ酸が各分解段階で得られ、最終製品の均質性が
証明された。さらに、アミノ末端の配列は、アミノ末端
の残基を除く最初の配列された３５箇の残基によってＬ
ｙｓ Ｍ６のアミノ末端配列と同一であることがわかっ
た。大腸菌の分子はリジン分子の精製の間に脱離されう
るアミノ末端に余分にアルギニン残基を有している。精
製されたＬｙｓ Ｍ６製品はさきにＭ６分子でみられた
多重バンドの模様を有しているが、それはおそらく抽出
と精製との過程での分解によるものであろう。３つの大
きいバンドは５１，０００、５２，０００及び５３，０
００ダルトンのはっきりした分子量に相当する。Ｍ６製
品の大きさの異質さは、おそらく蛋白質のカルボキシ末
端部分の相違からくるものであろう。この理由は、配列
の分解による本製品のアミノ末端配列分析の間に各段階
ごとに一つのアミノ酸残基のみが放出されることによ
る。抗Ｍ６抗体と反応するｐＪＲＳ４２を含むクロンに
よるバンドはすべて連鎖球菌製品からのものに比して大
きい（分子量５５，０００、５７，０００、５９，００
０ダルトン）。このことは、ｐＪＲＳ４２はＭ６蛋白質
の全構造遺伝子を含んでいることを示唆していた。この
ことは、この分子の大きさが１２型連鎖球菌のプロトプ
ラスト及びＬ型から分泌されるＭ蛋白質の大きさとして
報告されているもの（分子量５８，０００ダルトン）と
よく一致しているという事実によってうらづけられた。
従って、大腸菌製品中の蛋白質は、連鎖球菌の細胞溶解
素抽出により放出されるものより完全な自然のＭ分子の
大きさにより近いものであろう。
【００３９】さらに、分泌性の連鎖球菌Ｌ型及びプロト
プラストから分離されたＭ蛋白質はもっと均質性がある
と思われる。抗Ｍ６抗体と反応性を有する大腸菌蛋白質
と精製された標準Ｍ蛋白質のバンドとの泳動性における
差異については、いくつかの説明がありうる。たとえ
ば：１）蛋白質は、大腸菌では除去されていないリーダ
ー・配列を含みうるが、連鎖球菌では通常除去されてい
る。２）そのＬｙｓ Ｍ６分子は連鎖球菌細胞壁に付着
する間に生成する分解産物に相当する。３）そのＬｙｓ
Ｍ６分子は蛋白の精製過程で生成した部分分解物かも
知れない。４）その大腸菌蛋白質はベクター中のプロモ
ータから生成した「融合」物質かも知れない。５）連鎖
球菌では機能できない翻訳開始配列が大腸菌中では活性
なのかも知れない。及び／又は６）連鎖球菌中では通常
機能的な「停止」コドンが大腸菌の株中ではｓｕｐＥ変
異によりおさえられているのかも知れない。
プラストから分離されたＭ蛋白質はもっと均質性がある
と思われる。抗Ｍ６抗体と反応性を有する大腸菌蛋白質
と精製された標準Ｍ蛋白質のバンドとの泳動性における
差異については、いくつかの説明がありうる。たとえ
ば：１）蛋白質は、大腸菌では除去されていないリーダ
ー・配列を含みうるが、連鎖球菌では通常除去されてい
る。２）そのＬｙｓ Ｍ６分子は連鎖球菌細胞壁に付着
する間に生成する分解産物に相当する。３）そのＬｙｓ
Ｍ６分子は蛋白の精製過程で生成した部分分解物かも
知れない。４）その大腸菌蛋白質はベクター中のプロモ
ータから生成した「融合」物質かも知れない。５）連鎖
球菌では機能できない翻訳開始配列が大腸菌中では活性
なのかも知れない。及び／又は６）連鎖球菌中では通常
機能的な「停止」コドンが大腸菌の株中ではｓｕｐＥ変
異によりおさえられているのかも知れない。
【００４０】５．５遺伝子産物の免疫原的特徴づけ 大腸菌のＭ蛋白質と連鎖球菌の細胞溶解素での抽出によ
るＭ蛋白質のオクテルロニー・イムノディフュージョン
（Ｏｃｈｔｅｒｌｏｎｙ ｉｍｍｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏ
ｎ）での比較を行った。ウェル１（ｗｅｌｌ １）には
連鎖球菌で合成された細胞溶解素抽出Ｍ６に対して製造
された吸収されていないウサギの抗血清を入れた。ウェ
ル２には精製された細胞溶解素抽出Ｍ６蛋白質を入れ
た。ウェル３にはＤＥＡＥとＣＭセルロース上のクロマ
トグラフィーで部分的に精製されたエスチェリチアコリ
ー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ＮＲ（ｐＪＲＳ４２）株か
ら得られたＭ６蛋白質を入れた。反応はｐＨ８．６で５
０ｍＭバルビトール緩衝液中で調製した１％寒天ゲル中
で行われた。ゲルは乾燥し、クーマシー・ブルー（Ｃｏ
ｏｍａｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染色した。
るＭ蛋白質のオクテルロニー・イムノディフュージョン
（Ｏｃｈｔｅｒｌｏｎｙ ｉｍｍｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏ
ｎ）での比較を行った。ウェル１（ｗｅｌｌ １）には
連鎖球菌で合成された細胞溶解素抽出Ｍ６に対して製造
された吸収されていないウサギの抗血清を入れた。ウェ
ル２には精製された細胞溶解素抽出Ｍ６蛋白質を入れ
た。ウェル３にはＤＥＡＥとＣＭセルロース上のクロマ
トグラフィーで部分的に精製されたエスチェリチアコリ
ー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ＮＲ（ｐＪＲＳ４２）株か
ら得られたＭ６蛋白質を入れた。反応はｐＨ８．６で５
０ｍＭバルビトール緩衝液中で調製した１％寒天ゲル中
で行われた。ゲルは乾燥し、クーマシー・ブルー（Ｃｏ
ｏｍａｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染色した。
【００４１】この二重拡散実験の結果は（ゲルは示され
ていない）、ｐＪＲＳ４２を有する大腸菌の抽出物（挿
入なしのプラスミドのそれではない）は、少なくとも連
鎖球菌Ｍ６蛋白質のそれらのあるものには共通な抗原決
定部位を含んでいるという結論を裏付けた。そこで、大
腸菌製品はより高い見かけの分子量を有しているけれど
も、大腸菌中で合成されたＭ６蛋白質は６型連鎖球菌か
ら抽出されたＭ蛋白質と同じ型特異性決定部位を有して
いる。
ていない）、ｐＪＲＳ４２を有する大腸菌の抽出物（挿
入なしのプラスミドのそれではない）は、少なくとも連
鎖球菌Ｍ６蛋白質のそれらのあるものには共通な抗原決
定部位を含んでいるという結論を裏付けた。そこで、大
腸菌製品はより高い見かけの分子量を有しているけれど
も、大腸菌中で合成されたＭ６蛋白質は６型連鎖球菌か
ら抽出されたＭ蛋白質と同じ型特異性決定部位を有して
いる。
【００４２】５．６クロン化Ｍ蛋白質の減菌効果 大腸菌の生産したＭ蛋白質がウサギ及びヒトのオプソニ
ン抗血清の両者からのオプソニン抗体を除去するに要す
る抗原決定部位を含むかどうかを決定するため、次の吸
収実験を行った。
ン抗血清の両者からのオプソニン抗体を除去するに要す
る抗原決定部位を含むかどうかを決定するため、次の吸
収実験を行った。
【００４３】精製した大腸菌で合成したＭ６蛋白質が３
０μｇづつ２つに分けて凍結乾燥された。一方にウサギ
の６型オプソニン抗血清（０．５ｍｌ）を加え、同様の
量の６型連鎖球菌に対するヒト血清オプソニンを他の乾
燥蛋白質標本に加えて溶液をつくった。これらの試験管
を３７℃で１時間培養し、４℃で一夜放置した。かくし
て得られた沈澱を２０，０００ｘｇで遠心分離し、得ら
れた上澄液を６型連鎖球菌を用いる滅菌検定に使用し
た。
０μｇづつ２つに分けて凍結乾燥された。一方にウサギ
の６型オプソニン抗血清（０．５ｍｌ）を加え、同様の
量の６型連鎖球菌に対するヒト血清オプソニンを他の乾
燥蛋白質標本に加えて溶液をつくった。これらの試験管
を３７℃で１時間培養し、４℃で一夜放置した。かくし
て得られた沈澱を２０，０００ｘｇで遠心分離し、得ら
れた上澄液を６型連鎖球菌を用いる滅菌検定に使用し
た。
【００４４】間接的滅菌検定は当初ランスフィールドに
よって記載されたように（ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・メジシン１１０：２７１（１９５９））し
て行った。正常な提供者（ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｏｒ
ｓ）から得たペパリン処理された全人血を食細胞原とし
て用いた。６型連鎖球菌の希釈物（１００μｌ）を、吸
収され又は吸収されていない血清（１００μｌ）の存在
又は不存在下に、人血４００μｌに混合した。混合物を
３７℃で３時間回転させた。生存している生物を埋没平
板法で決定した。抗血清なしで回転させた対照について
提供者の血液中で連鎖球菌が生育する能力のテストを行
なった。大腸菌トランスダクタントが生成したＭ蛋白質
は、ウサギ及びヒトの血清からオプソニン抗体を除去し
た。第１表参照。従って、大腸菌Ｍ蛋白質の抗食菌作用
性決定部位は自然のＭ６分子のそれと同様に機能する。
よって記載されたように（ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・メジシン１１０：２７１（１９５９））し
て行った。正常な提供者（ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｏｒ
ｓ）から得たペパリン処理された全人血を食細胞原とし
て用いた。６型連鎖球菌の希釈物（１００μｌ）を、吸
収され又は吸収されていない血清（１００μｌ）の存在
又は不存在下に、人血４００μｌに混合した。混合物を
３７℃で３時間回転させた。生存している生物を埋没平
板法で決定した。抗血清なしで回転させた対照について
提供者の血液中で連鎖球菌が生育する能力のテストを行
なった。大腸菌トランスダクタントが生成したＭ蛋白質
は、ウサギ及びヒトの血清からオプソニン抗体を除去し
た。第１表参照。従って、大腸菌Ｍ蛋白質の抗食菌作用
性決定部位は自然のＭ６分子のそれと同様に機能する。
【００４５】
【表１】
【００４６】５．７６型食菌性抗体の生産 精製された大腸菌が生産したＭ６蛋白質による免疫後の
ウサギ中での６型オプソニン抗体の生産は次のようにし
て行われた。精製された大腸菌が生産したＭ６蛋白質に
対する抗血清がニュージーランドシロウサギ中で作られ
た。。一次接種は完全フロインド担体で乳化した１００
μｇのＭ６蛋白質から成り、複数部位に皮下投与され
た。動物は４週間後に不完全フロインド担体中の同用量
のＭ６蛋白質で増強された。動物は１０日後採血され
た。
ウサギ中での６型オプソニン抗体の生産は次のようにし
て行われた。精製された大腸菌が生産したＭ６蛋白質に
対する抗血清がニュージーランドシロウサギ中で作られ
た。。一次接種は完全フロインド担体で乳化した１００
μｇのＭ６蛋白質から成り、複数部位に皮下投与され
た。動物は４週間後に不完全フロインド担体中の同用量
のＭ６蛋白質で増強された。動物は１０日後採血され
た。
【００４７】滅菌検定（上記）により認められたところ
によれば、大腸菌Ｍ６蛋白質で免疫されたウサギは６型
連鎖球菌の食菌作用性を認める抗体を産生した。第２表
参照。
によれば、大腸菌Ｍ６蛋白質で免疫されたウサギは６型
連鎖球菌の食菌作用性を認める抗体を産生した。第２表
参照。
【００４８】
【表２】
【００４９】５．８連鎖球菌に対する診断試験 ５．８．１Ｍ遺伝子ＤＮＡプローブの製造と精製 Ｍ６型蛋白質をコードする遺伝子（ｅｍｍ ６）をつき
とめるため、上記第５．３節中に記載されたプラスミド
ｐＪＲＳ ４２．１３を種々の制限酵素又はその複合体
による消化に付した。かくして得られたＤＮＡ断片は上
記マニアチスらの文献１５０−１６１頁に記載されてい
るところにより０．８％アガロース・ゲルを通して電気
泳動に付して分画され、ついで種々のベクター中に結合
された。熱誘導性（ｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｉ
ｂｌｅ）ラムダ・ファージに対し溶原性エスチェリチア
・コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌中に、これらの組換
えベクターが組み込まれ、第５．４節に記載したように
抗Ｍ６蛋白質抗血清と反応性を有する蛋白質の生産につ
いてスクリーニングされた。
とめるため、上記第５．３節中に記載されたプラスミド
ｐＪＲＳ ４２．１３を種々の制限酵素又はその複合体
による消化に付した。かくして得られたＤＮＡ断片は上
記マニアチスらの文献１５０−１６１頁に記載されてい
るところにより０．８％アガロース・ゲルを通して電気
泳動に付して分画され、ついで種々のベクター中に結合
された。熱誘導性（ｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｉ
ｂｌｅ）ラムダ・ファージに対し溶原性エスチェリチア
・コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌中に、これらの組換
えベクターが組み込まれ、第５．４節に記載したように
抗Ｍ６蛋白質抗血清と反応性を有する蛋白質の生産につ
いてスクリーニングされた。
【００５０】多数のこれらのクロン化されたＤＮＡ断片
についてのＭ６蛋白質発現分析結果を第３図に示す。白
色のブロックで示されているクロンは抗Ｍ６抗血清と反
応性があったが、斜線を施したブロックで示されたもの
は反応性がなかった。ｐＪＲＳ４２．１９のようないく
つかの反応性クロンは全Ｍ６蛋白質をコードする連鎖球
菌ＤＮＡをごくわずかしか含んでいなかったが、その発
現する物質はあきらかにポリクロナール抗血清と抗原性
反応性を示すに充分な大きさであった。
についてのＭ６蛋白質発現分析結果を第３図に示す。白
色のブロックで示されているクロンは抗Ｍ６抗血清と反
応性があったが、斜線を施したブロックで示されたもの
は反応性がなかった。ｐＪＲＳ４２．１９のようないく
つかの反応性クロンは全Ｍ６蛋白質をコードする連鎖球
菌ＤＮＡをごくわずかしか含んでいなかったが、その発
現する物質はあきらかにポリクロナール抗血清と抗原性
反応性を示すに充分な大きさであった。
【００５１】クロン化されたＤＮＡ断片中のｅｍｍ ６
遺伝子の配置についてさらに検討するため、プラスミド
ｐＪＲＳ ４２．１９中の連鎖球菌ＤＮＡをプラスミド
ｐＵＣ９及びｐＵＣ ８のＢａｍ ＨＩ部分に挿入した
［メッシング及びベイラ，ジーン１９：２６９−２７６
（１９８２）］。これらプラスミド相互間の関係は挿入
されたＤＮＡがプラスミド中で反対の方向に配列されて
いる。抗Ｍ６抗血清は、これらクロンの両方の製品と反
応し、連鎖球菌ＤＮＡがこれらのベクターのいづれの配
列中にも存在するときにＭ６蛋白質画分が合成されるこ
とを示している。従って、挿入された連鎖球菌ＤＮＡは
それ自身のプロモータを有しているものと思われる。も
しこの結論が正しければ、ｐＪＲＳ４２．１９はＭ６蛋
白質のＮ末端をコードするもののはずである。
遺伝子の配置についてさらに検討するため、プラスミド
ｐＪＲＳ ４２．１９中の連鎖球菌ＤＮＡをプラスミド
ｐＵＣ９及びｐＵＣ ８のＢａｍ ＨＩ部分に挿入した
［メッシング及びベイラ，ジーン１９：２６９−２７６
（１９８２）］。これらプラスミド相互間の関係は挿入
されたＤＮＡがプラスミド中で反対の方向に配列されて
いる。抗Ｍ６抗血清は、これらクロンの両方の製品と反
応し、連鎖球菌ＤＮＡがこれらのベクターのいづれの配
列中にも存在するときにＭ６蛋白質画分が合成されるこ
とを示している。従って、挿入された連鎖球菌ＤＮＡは
それ自身のプロモータを有しているものと思われる。も
しこの結論が正しければ、ｐＪＲＳ４２．１９はＭ６蛋
白質のＮ末端をコードするもののはずである。
【００５２】ｐＪＲＳ４２．１９の連鎖球菌ＤＮＡ断片
をＭ１３ ｍｐ ８及びｍｐ ９中に挿入［メシング及
びベイラル，上掲書］したのち、サンガーのジデオキシ
法［サンガーら、プロシージングス・オブ・ナチュラル
・アカデミー・オブ・サイエンス・Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：
５４６３（１９７７）］で挿入されたＤＮＡの配列が決
定された。Ｍ６蛋白質のアミノ末端をコードする部分配
列をそれにより特定されるアミノ酸配列とともに第４図
に示す。逐次的エドマン分解により決定された（参考文
献）アミノ末端アミノ酸は、アミノ酸配列の下に「Ｎ」
で示してある。この方法で決定されたアミノ酸配列はペ
プシン処理により、又はファージ溶菌により連鎖球菌ス
トレインＤ４７１［参考］から抽出されたＭ６蛋白質の
アミノ末端について確立されている配列と同一であっ
た。それはまた、上記第５．４節中の大腸菌における組
換えＤＮＡ方法により生成されたＭ蛋白質のアミノ末端
部分とも同一であった。
をＭ１３ ｍｐ ８及びｍｐ ９中に挿入［メシング及
びベイラル，上掲書］したのち、サンガーのジデオキシ
法［サンガーら、プロシージングス・オブ・ナチュラル
・アカデミー・オブ・サイエンス・Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：
５４６３（１９７７）］で挿入されたＤＮＡの配列が決
定された。Ｍ６蛋白質のアミノ末端をコードする部分配
列をそれにより特定されるアミノ酸配列とともに第４図
に示す。逐次的エドマン分解により決定された（参考文
献）アミノ末端アミノ酸は、アミノ酸配列の下に「Ｎ」
で示してある。この方法で決定されたアミノ酸配列はペ
プシン処理により、又はファージ溶菌により連鎖球菌ス
トレインＤ４７１［参考］から抽出されたＭ６蛋白質の
アミノ末端について確立されている配列と同一であっ
た。それはまた、上記第５．４節中の大腸菌における組
換えＤＮＡ方法により生成されたＭ蛋白質のアミノ末端
部分とも同一であった。
【００５３】これらの結果は、ｅｍｍ ６遺伝子はｐＪ
ＲＳ ４２．１９中に含まれるＤＮＡ中に始まることを
示した。第４図に示されるＤＮＡ配列とアミノ酸配列の
比較は、さらに、第３図に示すように、Ｍ６蛋白質のＮ
末端はＮｃｉ Ｉ部位の左へ３２塩基目の点であること
を示している。
ＲＳ ４２．１９中に含まれるＤＮＡ中に始まることを
示した。第４図に示されるＤＮＡ配列とアミノ酸配列の
比較は、さらに、第３図に示すように、Ｍ６蛋白質のＮ
末端はＮｃｉ Ｉ部位の左へ３２塩基目の点であること
を示している。
【００５４】大腸菌中で生成されたＭ６蛋白質は、ドデ
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動［フィシエッチら、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メジシン１５９：１０８３−１０９５（１９８
４）］により明らかに５９，０００ダルトンの分子量を
有することが示された。この事実は遺伝子配列の他の末
端を第３図におけるＰｖｕ ＩＩ部位またはその付近に
定めることとなる。さらに配列の分析をつづけたとこ
ろ、蛋白質を終了する無意味なコドンＴＡＡがＰｖｕＩ
Ｉ部位の右へ３８塩基目に位置していることが明らかと
なった（ホリングシードら、原稿作成中）。
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動［フィシエッチら、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メジシン１５９：１０８３−１０９５（１９８
４）］により明らかに５９，０００ダルトンの分子量を
有することが示された。この事実は遺伝子配列の他の末
端を第３図におけるＰｖｕ ＩＩ部位またはその付近に
定めることとなる。さらに配列の分析をつづけたとこ
ろ、蛋白質を終了する無意味なコドンＴＡＡがＰｖｕＩ
Ｉ部位の右へ３８塩基目に位置していることが明らかと
なった（ホリングシードら、原稿作成中）。
【００５５】プラスミドｐＪＲＳ ４２．１３をＮｃｉ
Ｉ及びＰｖｕ ＩＩで処理してｅｍｍ６遺伝子の大部
分を含む適当なプローブを作成した。ｐＪＲＳ４２．１
３の制限酵素地図中でのこのプローブの位置を第３図に
太い矢印で示す。このプローブ断片は、０．８％アガロ
ース・ゲル中での電気泳動法、電気的溶出及びエルチッ
プ−ｄ（Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ）のカラム（シュライヘル及
びシュエル）を通過させることにより精製された。
Ｉ及びＰｖｕ ＩＩで処理してｅｍｍ６遺伝子の大部
分を含む適当なプローブを作成した。ｐＪＲＳ４２．１
３の制限酵素地図中でのこのプローブの位置を第３図に
太い矢印で示す。このプローブ断片は、０．８％アガロ
ース・ゲル中での電気泳動法、電気的溶出及びエルチッ
プ−ｄ（Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ）のカラム（シュライヘル及
びシュエル）を通過させることにより精製された。
【００５６】５．８．２細菌のＤＮＡの単離 Ａ群連鎖球菌の細胞をフィシエッチらの方法［ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン１３３：１１
０５（１９７１）］で溶菌するのにはファージ細菌溶解
素を用いた。他の連鎖球菌については、一夜のトッド・
ヘウイット・酵母肉汁培養物（酵母抽出物を添加した牛
心臓浸出肉汁）を１０倍に希釈し、３７℃で細胞濃度を
１ｍｌあたり約５×１０６細胞となるまで生育させた。
３％（ｗ／ｖ）の濃度までグリセリンを添加し、細胞を
さらに２時間３７℃で培養した。ついで細胞を洗浄し、
１５秒のパルスで２度音波処理し、庶糖３０％（ｗ／
ｖ）とリゾチーム１０ｍｇ／ｍｌを含む１０ｍＭトリス
・塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中に分散させた。
ル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン１３３：１１
０５（１９７１）］で溶菌するのにはファージ細菌溶解
素を用いた。他の連鎖球菌については、一夜のトッド・
ヘウイット・酵母肉汁培養物（酵母抽出物を添加した牛
心臓浸出肉汁）を１０倍に希釈し、３７℃で細胞濃度を
１ｍｌあたり約５×１０６細胞となるまで生育させた。
３％（ｗ／ｖ）の濃度までグリセリンを添加し、細胞を
さらに２時間３７℃で培養した。ついで細胞を洗浄し、
１５秒のパルスで２度音波処理し、庶糖３０％（ｗ／
ｖ）とリゾチーム１０ｍｇ／ｍｌを含む１０ｍＭトリス
・塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中に分散させた。
【００５７】３７℃で３０分間インキュベートしたの
ち、最終濃度１０ｍＭまでエチレンジアミンテトラ酢酸
を加え、さらに３７℃で３０分間インキュベートを続け
た。ついでプロテアーゼＫ［０．１ｍｇ／ｍｌ）源（ｓ
ｏｕｒｃｅ）］及びドデシル硫酸ナトリウム（１％ｗ／
ｖ）を加え、これらの成分をゆっくりと回転させて混合
し、さらに３７℃で３０分間インキュベートを続けた。
この工程につづいて、混濁を示さない細胞懸濁液を界面
に蛋白質がみえなくなるまでフェノール：クロロフォル
ム（１０：１）で抽出した。抽出されたＤＮＡは、つい
でエタノールで沈澱させた。
ち、最終濃度１０ｍＭまでエチレンジアミンテトラ酢酸
を加え、さらに３７℃で３０分間インキュベートを続け
た。ついでプロテアーゼＫ［０．１ｍｇ／ｍｌ）源（ｓ
ｏｕｒｃｅ）］及びドデシル硫酸ナトリウム（１％ｗ／
ｖ）を加え、これらの成分をゆっくりと回転させて混合
し、さらに３７℃で３０分間インキュベートを続けた。
この工程につづいて、混濁を示さない細胞懸濁液を界面
に蛋白質がみえなくなるまでフェノール：クロロフォル
ム（１０：１）で抽出した。抽出されたＤＮＡは、つい
でエタノールで沈澱させた。
【００５８】試験した細菌株は、スタフィロコッカス・
アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ），バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）（ＣＵ１０６５株）、ストレプトコッカス・プノイ
モニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ）及びロックフェラー大学のコレクションから得
られた次の連鎖球菌株であって、それぞれ特異的抗血清
をつくるに用いられる標準タイピング及びグルーピング
株である。Ｍ１，Ｔ１／１９５／２；Ｍ３，Ｂ９３０／
６１／５；Ｍ３Ｒ，Ｄ５８Ｘ；Ｍ４，Ｔ４／９５／ＲＢ
５；Ｍ５，Ｔ５Ｂ／１２６／４；Ｍ６，Ｓ４３／１９２
／３；Ｍ８，Ｃ２５６／８６／３；Ｍ１１，Ｔ１１／１
３７／３；Ｍ１２，Ｔ１２／１２６／４（ＣＯＬ６）；
Ｍ１４，Ｔ１４／４６／８，Ｍ１５，Ｔ１５／２３／
７，Ｍ１８，Ｊ１７Ｃ／５５／４；Ｍ２２，Ｔ２２／１
４６／１；Ｍ２３，Ｔ２３／１０２／ＲＢ５；Ｍ２４，
Ｃ９８／１３５／２；Ｍ２５，Ｂ３４６／１３６／１；
Ｍ２７，Ｔ２７／８７／１；Ｍ２８，Ｔ２８／１５０Ａ
／５；Ｍ２９，Ｄ２３；Ｍ３０，Ｄ２４／１２６／３；
Ｍ３１，Ｊ１３７／６９／３；Ｍ３２，Ｃ１２１／３９
／８；Ｍ３３，Ｃ１０７／１０２／２；Ｍ３６，Ｃ１１
９／８３／２；Ｍ３７，Ｃ２４２；Ｍ３８，Ｃ９４／８
０／２；Ｍ３９，Ｃ９５／９５／１；Ｍ４０，Ｃ１４３
／２５／９；Ｍ４１，Ｃ１０１／１０３／４；Ｍ４２，
Ｃ１１３／５５／５；Ｍ４３，Ｃ１２６／１７０／２；
Ｍ４６，Ｃ１０５／４１／５；Ｍ４７，Ｃ７４４／ＲＢ
４／６／５；Ｍ４８，Ｂ４０３／４８／５；Ｍ４９，Ｂ
７３７／１３７／２；Ｍ５０，Ｂ５１４／３３／６；Ｍ
５１，Ａ３０９／７７／１；Ｍ５２，Ａ８７１／１０６
／２；Ｍ５３，Ａ９５２／９４／３；Ｍ５４，Ａ９５３
／８７／３；Ｍ５５，Ａ９２８／７３／１；Ｍ５６，Ａ
９６３；Ｍ５７，Ａ９９５／９１／２；Ｍ５８，Ｄ３１
５／８７／３；Ｍ６０，Ｄ３３５／３８／３；Ｍ６３，
Ｄ４５９／５０／２；Ｍ６６，Ｄ７９４／７６／２；Ｍ
６７，Ｄ７９５／９５／１；Ａ群，Ｊ１７Ａ４；Ｂ群，
０９０Ｒ；Ｃ群，Ｃ７４；Ｄ群，Ｄ７６；Ｅ群，Ｋ１３
１；Ｆ群，Ｆ６８Ｃ；Ｇ群，Ｄ１６６Ｂ；Ｈ群，Ｆ９０
Ａ；Ｌ群，Ｄ１６７Ａ；Ｍ群，Ｄ１６８Ａ″Ｘ″；Ｎ
群，Ｃ５５９；Ｏ群，Ｂ３６１。次のＡ群でＭ型にタイ
ピングされるジョージア州アトランタのセンター・フォ
ー・デイジーズ・コントロールから入手された株も使用
された。Ｍ２，ＳＳ６３３；Ｍ９，ＳＳ７５４；Ｍ１
３，ＳＳ９３６；Ｍ１７，ＳＳ６３１；Ｍ１９，ＳＳ４
００；Ｍ３４，ＳＳ１３４；Ｍ５９，ＳＳ９１３及びＭ
６２，ＳＳ９８４。
アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ），バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）（ＣＵ１０６５株）、ストレプトコッカス・プノイ
モニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ）及びロックフェラー大学のコレクションから得
られた次の連鎖球菌株であって、それぞれ特異的抗血清
をつくるに用いられる標準タイピング及びグルーピング
株である。Ｍ１，Ｔ１／１９５／２；Ｍ３，Ｂ９３０／
６１／５；Ｍ３Ｒ，Ｄ５８Ｘ；Ｍ４，Ｔ４／９５／ＲＢ
５；Ｍ５，Ｔ５Ｂ／１２６／４；Ｍ６，Ｓ４３／１９２
／３；Ｍ８，Ｃ２５６／８６／３；Ｍ１１，Ｔ１１／１
３７／３；Ｍ１２，Ｔ１２／１２６／４（ＣＯＬ６）；
Ｍ１４，Ｔ１４／４６／８，Ｍ１５，Ｔ１５／２３／
７，Ｍ１８，Ｊ１７Ｃ／５５／４；Ｍ２２，Ｔ２２／１
４６／１；Ｍ２３，Ｔ２３／１０２／ＲＢ５；Ｍ２４，
Ｃ９８／１３５／２；Ｍ２５，Ｂ３４６／１３６／１；
Ｍ２７，Ｔ２７／８７／１；Ｍ２８，Ｔ２８／１５０Ａ
／５；Ｍ２９，Ｄ２３；Ｍ３０，Ｄ２４／１２６／３；
Ｍ３１，Ｊ１３７／６９／３；Ｍ３２，Ｃ１２１／３９
／８；Ｍ３３，Ｃ１０７／１０２／２；Ｍ３６，Ｃ１１
９／８３／２；Ｍ３７，Ｃ２４２；Ｍ３８，Ｃ９４／８
０／２；Ｍ３９，Ｃ９５／９５／１；Ｍ４０，Ｃ１４３
／２５／９；Ｍ４１，Ｃ１０１／１０３／４；Ｍ４２，
Ｃ１１３／５５／５；Ｍ４３，Ｃ１２６／１７０／２；
Ｍ４６，Ｃ１０５／４１／５；Ｍ４７，Ｃ７４４／ＲＢ
４／６／５；Ｍ４８，Ｂ４０３／４８／５；Ｍ４９，Ｂ
７３７／１３７／２；Ｍ５０，Ｂ５１４／３３／６；Ｍ
５１，Ａ３０９／７７／１；Ｍ５２，Ａ８７１／１０６
／２；Ｍ５３，Ａ９５２／９４／３；Ｍ５４，Ａ９５３
／８７／３；Ｍ５５，Ａ９２８／７３／１；Ｍ５６，Ａ
９６３；Ｍ５７，Ａ９９５／９１／２；Ｍ５８，Ｄ３１
５／８７／３；Ｍ６０，Ｄ３３５／３８／３；Ｍ６３，
Ｄ４５９／５０／２；Ｍ６６，Ｄ７９４／７６／２；Ｍ
６７，Ｄ７９５／９５／１；Ａ群，Ｊ１７Ａ４；Ｂ群，
０９０Ｒ；Ｃ群，Ｃ７４；Ｄ群，Ｄ７６；Ｅ群，Ｋ１３
１；Ｆ群，Ｆ６８Ｃ；Ｇ群，Ｄ１６６Ｂ；Ｈ群，Ｆ９０
Ａ；Ｌ群，Ｄ１６７Ａ；Ｍ群，Ｄ１６８Ａ″Ｘ″；Ｎ
群，Ｃ５５９；Ｏ群，Ｂ３６１。次のＡ群でＭ型にタイ
ピングされるジョージア州アトランタのセンター・フォ
ー・デイジーズ・コントロールから入手された株も使用
された。Ｍ２，ＳＳ６３３；Ｍ９，ＳＳ７５４；Ｍ１
３，ＳＳ９３６；Ｍ１７，ＳＳ６３１；Ｍ１９，ＳＳ４
００；Ｍ３４，ＳＳ１３４；Ｍ５９，ＳＳ９１３及びＭ
６２，ＳＳ９８４。
【００５９】５．８．３ドット・ブロット（Ｄｏｔ ｂ
ｌｏｔ）交雑実験 カファトスら［ヌクレイック・アシッド・リサーチ７；
１５４１−１５５２（１９７９）］が記載した特異的Ｄ
ＮＡ配列をみつける手段を用いて、抽出されたＤＮＡの
標本についてドット・ハイブリダイゼーションが行われ
た。ボッチャンらの方法［セル，９：２６９−２８７
（１９７６）］でニック翻訳により３２Ｐで標識したの
ち、プローブに対してｅｍｍ６遺伝子の大部分を含むＮ
ｃｉ Ｉ／Ｐｖｕ ＩＩＤＮＡ画分（第５．８．１節）
が用いられた。
ｌｏｔ）交雑実験 カファトスら［ヌクレイック・アシッド・リサーチ７；
１５４１−１５５２（１９７９）］が記載した特異的Ｄ
ＮＡ配列をみつける手段を用いて、抽出されたＤＮＡの
標本についてドット・ハイブリダイゼーションが行われ
た。ボッチャンらの方法［セル，９：２６９−２８７
（１９７６）］でニック翻訳により３２Ｐで標識したの
ち、プローブに対してｅｍｍ６遺伝子の大部分を含むＮ
ｃｉ Ｉ／Ｐｖｕ ＩＩＤＮＡ画分（第５．８．１節）
が用いられた。
【００６０】交雑を行うにあたって、種々の微生物原か
ら得られたＤＮＡ抽出物は室温で１５分間０．６ＮＮａ
ＯＨ中で変性され、ついで０℃で１０分間変性された。
さらに、試料は２Ｍ酢酸アンモニウムで中和され、ＤＮ
Ａの画分はペセスダ・リサーチ・ラボラトリーの多枝管
中のバイオダインＡ０．２ミクロン・ナイロン・フィル
ター（ニューヨーク州グレン・コープ，ポール・フィル
トレーション・コーポレーション）上にスポットされ
た。交雑は１．８Ｍトリス塩酸塩を含み、０．２Ｍのト
リス塩基を含む緩衝液中でニック翻訳された３２Ｐプロ
ーブを少なくとも２×１０６ｃｐｍ／フィルターの割合
で加え、フィルターを一夜６４℃に保持することにより
行われた。フィルターは、ついで同じ緩衝液を用いて６
４℃で１０回洗 浄され、乾燥され、増感スクリーンを
用いコダックＸＡＲ−５フィルム上でオートラジオグラ
フィーに付された。露光は−８０℃で２−４日行われ
た。これらの実験結果の要約を第３表に示す。
ら得られたＤＮＡ抽出物は室温で１５分間０．６ＮＮａ
ＯＨ中で変性され、ついで０℃で１０分間変性された。
さらに、試料は２Ｍ酢酸アンモニウムで中和され、ＤＮ
Ａの画分はペセスダ・リサーチ・ラボラトリーの多枝管
中のバイオダインＡ０．２ミクロン・ナイロン・フィル
ター（ニューヨーク州グレン・コープ，ポール・フィル
トレーション・コーポレーション）上にスポットされ
た。交雑は１．８Ｍトリス塩酸塩を含み、０．２Ｍのト
リス塩基を含む緩衝液中でニック翻訳された３２Ｐプロ
ーブを少なくとも２×１０６ｃｐｍ／フィルターの割合
で加え、フィルターを一夜６４℃に保持することにより
行われた。フィルターは、ついで同じ緩衝液を用いて６
４℃で１０回洗 浄され、乾燥され、増感スクリーンを
用いコダックＸＡＲ−５フィルム上でオートラジオグラ
フィーに付された。露光は−８０℃で２−４日行われ
た。これらの実験結果の要約を第３表に示す。
【００６１】
【表３】
【００６２】全体としてドット・ブロット実験は、ｅｍ
ｍ ６プローブとＡ群連鎖球菌の５６種中の５６の異な
るＭ型から得られるＤＮＡ、及びＡ群株のタイプ分けで
きない４種及びすでにＭ−と特徴づけられている２つの
株との間に交雑が認められた。グラム陽性菌であるスタ
フィロコッカス・オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）又はバチルス・スブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのＤＮＡ、連
鎖球菌ランスフィールドＢ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｌ，Ｍ，
Ｎ又はＯ群からのＤＮＡ、又はストレプトコッカス・プ
ノイモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ）からのＤＮＡとは交雑は見られなかった。
しかし、Ｃ群及びＧ群連鎖球菌ＤＮＡとは交雑がみられ
た。この知見は、Ｃ群連鎖球菌はしばしばヒトの感染に
関係し、ある株はその外面に機能的にＭ蛋白質と同様な
分子を有しているらしいので予期し得ない知見ではなか
った［ウールコック，インフェクション・アンド・イン
ムノロジー１０：５６８（１９７４）］。
ｍ ６プローブとＡ群連鎖球菌の５６種中の５６の異な
るＭ型から得られるＤＮＡ、及びＡ群株のタイプ分けで
きない４種及びすでにＭ−と特徴づけられている２つの
株との間に交雑が認められた。グラム陽性菌であるスタ
フィロコッカス・オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）又はバチルス・スブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのＤＮＡ、連
鎖球菌ランスフィールドＢ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｌ，Ｍ，
Ｎ又はＯ群からのＤＮＡ、又はストレプトコッカス・プ
ノイモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ）からのＤＮＡとは交雑は見られなかった。
しかし、Ｃ群及びＧ群連鎖球菌ＤＮＡとは交雑がみられ
た。この知見は、Ｃ群連鎖球菌はしばしばヒトの感染に
関係し、ある株はその外面に機能的にＭ蛋白質と同様な
分子を有しているらしいので予期し得ない知見ではなか
った［ウールコック，インフェクション・アンド・イン
ムノロジー１０：５６８（１９７４）］。
【００６３】Ｇ群連鎖球菌もまた広範囲のヒトへの感染
を起すことが報告されている。これらの生物の毒性が必
ずＭ様細胞表面蛋白質の存在によるかどうかははっきり
しないが、そういうこともありうるところである。ヒト
感染物から分離したＧ群連鎖球菌の３株を試験したとこ
ろ、１２型Ｍ細胞蛋白質が株中に存在することがわかっ
た［マクステッド及びポター，ジャーナル・オブ・ゼネ
ラル・マイクロバイオロジー４９：１１９（１９６
７）］。
を起すことが報告されている。これらの生物の毒性が必
ずＭ様細胞表面蛋白質の存在によるかどうかははっきり
しないが、そういうこともありうるところである。ヒト
感染物から分離したＧ群連鎖球菌の３株を試験したとこ
ろ、１２型Ｍ細胞蛋白質が株中に存在することがわかっ
た［マクステッド及びポター，ジャーナル・オブ・ゼネ
ラル・マイクロバイオロジー４９：１１９（１９６
７）］。
【００６４】試験されたＡ群株の中に、機能的にＭ
−（すなわち、保護的Ｍ蛋白質を生成せず食菌性化され
たもの）が３株あった。これらのＭ−株の２種からのＤ
ＮＡは、それにも拘わらずｅｍｍ６遺伝子プローブと交
雑し、少なくともいくらかのｅｍｍ遺伝子を完全に保持
していることを示した。おそらく、これらの株は、その
ｅｍｍ遺伝子産物が無機能的（ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎ
ａｌ）であるかわずかな量しか合成しないような変異株
であろう。１つのＭ−株からのＤＮＡはプローブと交雑
せず、その株中ではｅｍｍ遺伝子は実質的に除去されて
いることを示唆していた。
−（すなわち、保護的Ｍ蛋白質を生成せず食菌性化され
たもの）が３株あった。これらのＭ−株の２種からのＤ
ＮＡは、それにも拘わらずｅｍｍ６遺伝子プローブと交
雑し、少なくともいくらかのｅｍｍ遺伝子を完全に保持
していることを示した。おそらく、これらの株は、その
ｅｍｍ遺伝子産物が無機能的（ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎ
ａｌ）であるかわずかな量しか合成しないような変異株
であろう。１つのＭ−株からのＤＮＡはプローブと交雑
せず、その株中ではｅｍｍ遺伝子は実質的に除去されて
いることを示唆していた。
【００６５】ドット・ブロット実験の結果は、種々のＭ
型Ａ群連鎖球菌株から得られるＤＮＡを抽出し、Ｎｃｉ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化する実験により確かめら
れた。得られるＤＮＡ断片の試料は、アミアティスら、
上掲書、１５０−１６１に記載のアガロース・ゲル・電
気泳動で分離され、ｅｍｍ ６の３２Ｐで標識されたプ
ローブと交雑され、雑種ＤＮＡ断片の位置がオートラジ
オグラフィーで示された。結果は第５図に示す。
型Ａ群連鎖球菌株から得られるＤＮＡを抽出し、Ｎｃｉ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化する実験により確かめら
れた。得られるＤＮＡ断片の試料は、アミアティスら、
上掲書、１５０−１６１に記載のアガロース・ゲル・電
気泳動で分離され、ｅｍｍ ６の３２Ｐで標識されたプ
ローブと交雑され、雑種ＤＮＡ断片の位置がオートラジ
オグラフィーで示された。結果は第５図に示す。
【００６６】第５図において、第１列は３２Ｐで標識さ
れた１０．９，７．７４，５．１５，２．４４，１．８
０及び０．６０ｋｂのＤＮＡ分子サイズのマーカーを示
す。第２列ないし第１０列は連鎖球菌Ｍの型６，４７，
５，１９，２６，１１，２４，１２及び２３のそれぞれ
から得られたＤＮＡのプローブ交雑Ｎｃｉ Ｉ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ画分を含んでいる。各々の場合プローブで交雑
された２種または以上のＤＮＡフラグメントが含まれて
いた。ドット・ブロット試験から予期されたように、Ｔ
２８／５１／４のＭ−株からのＤＮＡは交雑しなかった
（第１１列）が、Ｔ２８／１５０Ａ／５のＭ＋株（第１
２列）は交雑した。
れた１０．９，７．７４，５．１５，２．４４，１．８
０及び０．６０ｋｂのＤＮＡ分子サイズのマーカーを示
す。第２列ないし第１０列は連鎖球菌Ｍの型６，４７，
５，１９，２６，１１，２４，１２及び２３のそれぞれ
から得られたＤＮＡのプローブ交雑Ｎｃｉ Ｉ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ画分を含んでいる。各々の場合プローブで交雑
された２種または以上のＤＮＡフラグメントが含まれて
いた。ドット・ブロット試験から予期されたように、Ｔ
２８／５１／４のＭ−株からのＤＮＡは交雑しなかった
（第１１列）が、Ｔ２８／１５０Ａ／５のＭ＋株（第１
２列）は交雑した。
【００６７】６．微生物の寄託 次表に示すプラスミドを有する次表の大腸菌は、イリノ
イ州ペオリアのアグリカルチュラル・リサーチ・カルチ
ュア・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託されており、次
の寄託番号を付与されている。
イ州ペオリアのアグリカルチュラル・リサーチ・カルチ
ュア・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託されており、次
の寄託番号を付与されている。
【００６８】 大腸菌株 プラスミド 寄託番号 Ｋ−１２，Ｃ６００ＮＲ ｐＪＲＳ４２．１３ ＮＲＲＬ Ｂ−１５５２９ ラムダ ｃＩ８５７ Ｋ−１２，Ｃ６００ＮＲ ｐＪＲＳ４２ ＮＲＲＬ Ｂ−１５５３５ ラムダ ｃＩ８５７
【００６９】寄託微生物は本発明の幾多の態様を代表す
ることを意図したものであるから、本発明は寄託された
微生物により範囲として限定さるべきものではない。事
実、ここに示され、記載されたところに加えて、この発
明の種々の修飾は、以上の記載と添付の図面から、当該
技術の専門家にとっては明らかとなるであろう。かかる
修飾は、上記特許請求の範囲のうちに入るべきことを意
図している。
ることを意図したものであるから、本発明は寄託された
微生物により範囲として限定さるべきものではない。事
実、ここに示され、記載されたところに加えて、この発
明の種々の修飾は、以上の記載と添付の図面から、当該
技術の専門家にとっては明らかとなるであろう。かかる
修飾は、上記特許請求の範囲のうちに入るべきことを意
図している。
【００７０】本明細書中でヌクレオタイドについての塩
基対の大きさは概略のものであって、記載の目的のため
に使用されたものである。
基対の大きさは概略のものであって、記載の目的のため
に使用されたものである。
【図１】図１（大きさは比例していない）は連鎖球菌Ｄ
ＮＡ断片とｐＪＢ８から導かれた組換えプラスミドであ
るｐＪＲＳ ４２の構造を示している。（第５．２節参
照）連鎖球菌ＤＮＡ中の種々の制限部位は示されていな
い。
ＮＡ断片とｐＪＢ８から導かれた組換えプラスミドであ
るｐＪＲＳ ４２の構造を示している。（第５．２節参
照）連鎖球菌ＤＮＡ中の種々の制限部位は示されていな
い。
【図２】図２はｐＪＲＳ ４２．１３の制限地図を示
す。本プラスミドはｐＪＲＳ ４２から不必要な連鎖球
菌ＤＮＡを除くためＥｃｏ ＲＩで消化し再結合するこ
とにより誘導された。プラスミドｐＪＲＳ ４２．１３
はＥｃｏ ＲＩ部位を一箇所のみ有している。（第５．
３節参照）
す。本プラスミドはｐＪＲＳ ４２から不必要な連鎖球
菌ＤＮＡを除くためＥｃｏ ＲＩで消化し再結合するこ
とにより誘導された。プラスミドｐＪＲＳ ４２．１３
はＥｃｏ ＲＩ部位を一箇所のみ有している。（第５．
３節参照）
【図３】図３は６型Ａ群連鎖球菌のＭ６蛋白質をコード
する遺伝子を含むプラスミドｐＪＲＳ４２．１３の種々
のサブクロンの制限地図である。白色の四角形はＭ６蛋
白質を発現するクロンを示し、斜線を施した四角形は発
現しないクロンを示している。ベクターは、それぞれＭ
１３並びにｐＵＣ８及びｐＵＣ９を用いた４２．２１及
び４２．１９を除き、すべての場合にｐＢＲ３２２を用
いた。制限地図の上方の矢印は６型Ｍ蛋白質（ｅｍｍ
６）をコードする遺伝子の転写の方向及び遺伝子の概略
の範囲を示している。蛋白質のアミノ末端に相当する分
子の末端は″Ｎ″で示してある。
する遺伝子を含むプラスミドｐＪＲＳ４２．１３の種々
のサブクロンの制限地図である。白色の四角形はＭ６蛋
白質を発現するクロンを示し、斜線を施した四角形は発
現しないクロンを示している。ベクターは、それぞれＭ
１３並びにｐＵＣ８及びｐＵＣ９を用いた４２．２１及
び４２．１９を除き、すべての場合にｐＢＲ３２２を用
いた。制限地図の上方の矢印は６型Ｍ蛋白質（ｅｍｍ
６）をコードする遺伝子の転写の方向及び遺伝子の概略
の範囲を示している。蛋白質のアミノ末端に相当する分
子の末端は″Ｎ″で示してある。
【図４】図４は、サンガーら［プロシージングス・オブ
・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエンス、Ｕ．
Ｓ．Ａ．７４：５４６３（１９７７）］の方法によって
決定されるＭ６蛋白質のアミノ末端をコードするｅｍｍ
６遺伝子のＤＮＡ配列の部分及びそのＤＮＡ配列から
予測される蛋白質のアミノ酸配列を示している。連続的
エドマン分解により決定されたアミノ末端アミノ酸はア
ミノ酸配列の下の″Ｎ″で示されている。
・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエンス、Ｕ．
Ｓ．Ａ．７４：５４６３（１９７７）］の方法によって
決定されるＭ６蛋白質のアミノ末端をコードするｅｍｍ
６遺伝子のＤＮＡ配列の部分及びそのＤＮＡ配列から
予測される蛋白質のアミノ酸配列を示している。連続的
エドマン分解により決定されたアミノ末端アミノ酸はア
ミノ酸配列の下の″Ｎ″で示されている。
【図５】図５は図３のプラスミドｐＪＲＳ ４２．１３
の制限酵素消化で得られるＮｃｉ Ｉ／Ｐｖｕ ＩＩ
ｅｍｍ６ ＤＮＡプローブによるＤＮＡ交雑の寒天ゲル
電気泳動分析を示している。各レーン中のＤＮＡは次の
とうりである：レーン１，オリゴヌクレオチドの大きさ
の１０．９０，７．７４，５．１５，２．４４，１．８
０及び０．６０ｋｂの標準，レーン２，Ｍ６株Ｄ４７
１；レーン３，Ｍ４７；レーン４，Ｍ５；レーン５，Ｍ
１９；レーン６，Ｍ２６，レーン７，Ｍ１１；レーン
８，Ｍ２４；レーン９，Ｍ１２；レーン１０，Ｍ２３，
レーン１１，Ｍ２８（Ｍ株Ｔ２８／５１／４から）；及
びレーン１２，Ｍ２８（Ｍ＋株Ｔ２８／１５０Ａ／５か
ら）。
の制限酵素消化で得られるＮｃｉ Ｉ／Ｐｖｕ ＩＩ
ｅｍｍ６ ＤＮＡプローブによるＤＮＡ交雑の寒天ゲル
電気泳動分析を示している。各レーン中のＤＮＡは次の
とうりである：レーン１，オリゴヌクレオチドの大きさ
の１０．９０，７．７４，５．１５，２．４４，１．８
０及び０．６０ｋｂの標準，レーン２，Ｍ６株Ｄ４７
１；レーン３，Ｍ４７；レーン４，Ｍ５；レーン５，Ｍ
１９；レーン６，Ｍ２６，レーン７，Ｍ１１；レーン
８，Ｍ２４；レーン９，Ｍ１２；レーン１０，Ｍ２３，
レーン１１，Ｍ２８（Ｍ株Ｔ２８／５１／４から）；及
びレーン１２，Ｍ２８（Ｍ＋株Ｔ２８／１５０Ａ／５か
ら）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 ジューン アール． スコット アメリカ合衆国、30329 ジョージア、 アトランタ、リバリー リッジ ロード 1500 (72)発明者 ビンセント エイ．フィシェッティ アメリカ合衆国、11552 ニューヨーク、 ウエスト ヘンプステッド、ジョーン コート 448
Claims (11)
- 【請求項１】 連鎖球菌Ｍ蛋白質又はＭ様蛋白質の免疫
反応性抗原決定部位を有するポリペプタイドの製造方法
であって、 （ａ）ＮＲＲＬに寄託され受託番号Ｂ−１５５２９を付
与された大腸菌のプラスミドｐＪＲＳ４２．１３のＮｃ
ｉＩ部位の５´方向に１５８番目の塩基から当該Ｎｃｉ
Ｉ部位の３´側に隣接するＰｖｕＩＩ部位の３´方向に
３８塩基目までの配列の遺伝子を備えてなる組換えプラ
スミド、または当該遺伝子とナイロンフィルター上で
０．２Ｍトリス塩基を含む１．８Ｍトリス塩酸塩緩衝液
中にて交雑し且つ上記Ｍ蛋白質と同様の抗原性を示す蛋
白質をコードする遺伝子を備えてなる組換えプラスミド
を、複製、転写及び翻訳可能な状態で含む単細胞生物を
培養し、 （ｂ）該単細胞生物が該プラスミドから生成するポリペ
プタイドを該培養物から単離する、 ことを含むポリペプタイドの製造方法。 - 【請求項２】 そのポリペプタイドが免疫原性である請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 そのポリペプタイドが抗原として用いら
れたとき、オプソニック抗体を誘出しうるポリペプタイ
ドである請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 組換えプラスミドが形質転換により単細
胞生物中に導入される請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 組換えプラスミドが形質導入により単細
胞生物に導入される請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 組換えプラスミドがトランスフェクショ
ンにより単細胞生物に導入される請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 Ｍ蛋白質がＡ群連鎖球菌の１員から得ら
れるものである請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 プラスミドｐＪＲＳ４２．１３の上記遺
伝子とナイロンフィルター上で０．２Ｍトリス塩基を含
む１．８Ｍトリス塩酸塩緩衝液中にて交雑し且つ上記Ｍ
蛋白質と同様の抗原性を示す蛋白質をコードする上記遺
伝子が、Ｃ群連鎖球菌の１員から得られるものである請
求項１記載の方法。 - 【請求項９】 プラスミドｐＪＲＳ４２．１３の上記遺
伝子とナイロンフィルター上で０．２Ｍトリス塩基を含
む１．８Ｍトリス塩酸塩緩衝液中にて交雑し且つ上記Ｍ
蛋白質と同様の抗原性を示す蛋白質をコードする上記遺
伝子が、Ｇ群連鎖球菌の１員から得られるものである請
求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 単細胞生物が原核生物である請求項１
記載の方法。 - 【請求項１１】 原核生物が大腸菌である請求項１０記
載の方法。
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|---|---|---|---|
| US52196283A | 1983-08-10 | 1983-08-10 | |
| US06/621,716 US4784948A (en) | 1983-08-10 | 1984-06-18 | Production of streptococcal m protein immunogens and molecular probes |
| US521,962 | 1984-06-18 | ||
| US621,716 | 1990-12-05 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59503195A Division JP2926180B2 (ja) | 1983-08-10 | 1984-08-09 | 連鎖球菌ｍ蛋白質遺伝子及びその分子状プローブ |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06233693A JPH06233693A (ja) | 1994-08-23 |
| JP2614176B2 true JP2614176B2 (ja) | 1997-05-28 |
Family
ID=27060649
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59503195A Expired - Lifetime JP2926180B2 (ja) | 1983-08-10 | 1984-08-09 | 連鎖球菌ｍ蛋白質遺伝子及びその分子状プローブ |
| JP5172076A Expired - Lifetime JP2614176B2 (ja) | 1983-08-10 | 1993-06-21 | 連鎖球菌ｍ蛋白免疫原の製造方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59503195A Expired - Lifetime JP2926180B2 (ja) | 1983-08-10 | 1984-08-09 | 連鎖球菌ｍ蛋白質遺伝子及びその分子状プローブ |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0152468B1 (ja) |
| JP (2) | JP2926180B2 (ja) |
| AU (1) | AU574385B2 (ja) |
| CA (1) | CA1339266C (ja) |
| DE (1) | DE3485267D1 (ja) |
| DK (1) | DK158585A (ja) |
| WO (1) | WO1985000832A1 (ja) |
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| DE3678702D1 (de) * | 1985-12-28 | 1991-05-16 | Ohgen Research Lab Ltd | Antitumorprotein-gen von streptococcus pyogenes su, plasmide, die das gen enthalten, transformantenzellen, die die plasmide beherbergen, und verfahren zur herstellung des antitumorproteins. |
| CA1301645C (en) * | 1986-10-08 | 1992-05-26 | David Bernstein | Method for exposing group a streptococcal antigens and an improved diagnostictest for the identification of group a streptococci |
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| US5162226A (en) * | 1987-08-24 | 1992-11-10 | University Of Tennessee Research Corp. (U.T.R.C.) | Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products |
| US5124153A (en) * | 1987-08-24 | 1992-06-23 | University Of Tennessee Research Corp. | Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products |
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| JP2577280B2 (ja) * | 1989-06-21 | 1997-01-29 | ザ ロツクフェラー ユニバーシティ | 組換えポックスウイルス及び連鎖球菌ｍタンパク質ワクチン |
| US5616686A (en) * | 1990-05-11 | 1997-04-01 | The Rockefeller University | Polypeptide of a hybrid surface protein by bacteria |
| US5476929A (en) * | 1991-02-15 | 1995-12-19 | Uab Research Foundation | Structural gene of pneumococcal protein |
| NL9100510A (nl) * | 1991-03-21 | 1992-10-16 | Centraal Diergeneeskundig Inst | Dna-sequenties die coderen voor kenmerken van virulentie van streptococcus suis en delen daarvan, daarvan afgeleide polypeptiden en antilichamen, alsmede toepassing daarvan bij de diagnose van en de bescherming tegen infectie met s. suis bij zoogdieren, waaronder de mens. |
| US5232831A (en) * | 1991-06-28 | 1993-08-03 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes to streptococcus pyogenes |
| ATE211654T1 (de) * | 1992-09-16 | 2002-01-15 | Univ Tennessee Res Corp | Antigene des hybriden m-proteins und träger für gruppe a streptokokkenimpfstoff |
| WO1994006421A1 (en) * | 1992-09-16 | 1994-03-31 | The University Of Tennessee Research Corporation | Recombinant multivalent m protein vaccine |
| WO1994007469A1 (en) * | 1992-09-25 | 1994-04-14 | Dynagen, Inc. | An immunobooster for delayed release of immunogen |
| DK0832241T3 (da) | 1995-06-07 | 2005-08-01 | Univ Minnesota | Streptokoktoksin A-mutanter og anvendelsesfremgangsmåder |
| DE19535321A1 (de) * | 1995-09-22 | 1997-03-27 | Max Planck Gesellschaft | Neues Adhäsin aus Helicobacter pylori |
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| BR9713679A (pt) | 1996-12-06 | 2001-07-17 | Univ Minnesota | Mutantes de toxina c de estreptococo e métodos de uso |
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| CN1211487C (zh) | 1996-12-06 | 2005-07-20 | 明尼苏达大学董事会 | 链球菌毒素a突变体及其使用方法 |
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-
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