JPS60501689A - 連鎖球菌ｍ蛋白質遺伝子及びその分子状プローブ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

連鎖球菌Ｍ蛋白免疫原及び分子状プローブここに記載されている発明は、その一 部につき厚生省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔ（ｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕ ｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　）　の国立衛生研究所からの補助金の援助を受けて なされたもので本発明はＡ群連鎖球菌のＭ６蛋白質のような抗食菌作用性連鎖球 菌蛋白質を診断用プローブとして用いるだめの、及びそれを免疫原として利用し たワクチンを製造するだめの組成物及び方法に関する。Ｍ蛋白質は繊維状表面分 子であって、それは連鎖球菌を、感染した宿主生物のマクロファージ及び多形核 （ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ　ｌ　好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅ ａ　）により、食菌作用に抵抗するようになしうる。 本発明′はＭ蛋白質又はその一部をコードするＤＮＡ配列をビールスＤＮＡ、プ ラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡのようなプラスミドＤＮＡに挿入するために 組換えＤＮＡ技術を利用し、これによりそのプラスミドは細菌の宿主又は他の単 細胞系中にＭ蛋白質の遺伝子を複製し発現させることができる。生ずる組換えＤ ＮＡ分子はＭ蛋白質、又はそのある部分又は分子の変化したものを製造しうるよ うに宿主細胞に導入される。産生じた蛋白質はついで分離され、精製され連鎖球 菌感染に対するワクチン中の免疫原として用いるために修飾される。 本発明はさらにＡ群、６群及びＧ群の連鎖球菌の検出法を提供する。かかる検出 はＡ群連鎖球劇のＭ蛋白質をコードする全遺伝子又はその遺伝子の断片に基づく 特定の分子状プローブを使用して達成される。交雑スクリーニング法において有 用なりＮＡプローブが連鎖球菌感染と疑われる場合の臨床的分離物の検査のため にここに記載されている。 ２、発明の背景 急性リウマチ熱や急性糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）が Ａ群連鎖球菌感染の後遺症であることは広く認められているところである。熱帯 及び亜熱帯の開発途上国においてはりウマチ性心臓疾患が現在心障害の最も普通 の形である。世界のある開発途上の都市部の貧民街における学齢児童についてこ の病気の流行率は１．０００人に対し２２−２３人もの高さであることが報告さ れている。インドたけでも６百万もの多くの子供が苦しんでいることとなる。こ の病気の正確な発病機構はわからないが、リウマチ熱、さらに急性腎炎がストレ プトコッカス・（オゲ不ス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　 ）（Ａ群連鎖球菌）の感染に伴うものであることは明らかである。 連鎖球菌Ｍ蛋白質は、それが食細胞攻撃に対する抵抗性を生物に与えるという事 実に基づいてこの細菌の重要な毒性因子でろる。抗原的変化は、それによりＡ群 連鎖球菌が宿主の免疫反応を避けることができ、その結果人間に病気を起こすと いう最初の機構である。ＡＮ連鎖球菌感染に対する抵抗性は、生物の表面に見い たされる繊維状分子であるＭ蛋白質に対する形質特異的（ｔｙｐｅ　−５ｐｅｃ ｉｆｉｃ　）な抗体の存在によるものでるる。分類し得ない（ｎｏｎｔｙｐａｂ ｌｅ　）株のいくつかに加えて、現在では約７０の明らかなＡ群連鎖球菌Ｍ形が 認められている。ある種のＭ型の間で交叉反応性があるのは普通であるという事 実にも拘わらず、同族の型に対してつくられた抗体のみが生体の食菌作用を発生 せしめうる（すなわち、それらはオブノニン抗体である）。さらに、すべての同 族体、又は形質特異性抗体が食菌性であるというわけではない。 特定の抗血清がＡ群連鎖球菌に対してつくられうるという事実は、咽喉洗滌によ って得られるもののような臨床上の分離物を血清学的な試験に利することにより 連鎖球菌感染を検出することを可能にした。感染におけるＡ群連鎖球菌の同定は 純粋培養中の生物の単離、酢物異的炭水化物の抽出、及び酢物異的抗血清との反 応とを必要とする。すべての病原性株に対してのみ共通な性質に基つきつる連鎖 球菌感染に対する臨床試験は、従って非常に゛望ましいものとなる。 ２１組換えＤＮＡ技術と遺伝子の発現 組換えＤＮＡ技術は、それにより特定のＤＮＡ断片が宿主細胞中で複製し、転写 しつるベクターと呼ばれる遺伝学的要素中に挿入されるＤＮＡクロー二／グの技 術を包含している。ベクターはプラスミド又はビールスのいづれでもありうる。 プラスミドは小さい環状の二重螺旋ＤＮＡの分子で、それは天然にバクテリアや 酵母中に見出され、そこで宿主細胞の繁殖とは無関係な単位として複製する。こ れらのプラスミドは通常全宿主細胞ＤＮＡのわずかなフラクションとしてのみ説 明され、しはしは抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を保廟している。 これらの遺伝子、そして比較的小さい大きさのプラスミドＤＮＡが組換えＤＮＡ 技術において利用される。 組換えＤＮＡ分子−の挿入されたＤＮＡ断片は自然には宿主生物と情報を交換し ない生物から誘導されつるものであり、また全体的にあるいは部分的に合成的に 作られつるものである。制限酵素及び結合方法（Ｉｉｇａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏ ｄ）を用いて組換えプラスミドを製造する方法はコーエン及びボイヤー発明にか メわる発行された米国特許第４．２３７，２２４号に記載されている。このよう にしてつくられた組換えプラスミドは形質転換の手段により浄細胞生物中に導入 され、複製される。そこに記載されている技術の一般的適用性の故に、米国特許 第４，２３７，２２４号はここに不明細書中に参考文献として包含される。 単細胞生物中に組換えＤＮＡ分子を等大する別の方法は、コリンズ及びホーンに より、米国特許第４，３０４．８６３号に記載されており、それも捷だここに参 考文献として包含される。この方法は、バクテリオファージ・ベクターによるパ ンケージング／トランスダクゾヨン（ｐａｃｋａｇｉｎｇ／　ｔｒａｎｓｄｕｃ ｔｉｏｎ　）システムを利用するものである。 ５ プラスミドは高次螺線であるので、宿主細胞のＩ）ＮＡから容易に分離すること ができ、精製することができる。 クローニング・ベクターとして用いるには、このような精製プラスミドＤＮＡ分 子は制限ヌクレアーゼで切断され、クローンさるべきＤＮＡ断片に結合される。 製造された雑種のプラスミドＤＮＡ分子は、次いで一時的に大分子（合理的に） に対して浸透性を有するようにされたバクテリア中に再導入される。処理された 細胞のいくつかだけがプラスミドを拾いあげ、これらの細胞はプラスミドによっ てそれらが獲得している抗生物質耐性によって選択できる。それはそれらのもの だけが抗生物質の存在下に生育するからでるる。これらのバクテリアは分裂する から、プラスミドもまた当初のＤＮＡ断片の多数のコピーをつくるように複製す る。繁殖期間の終りに、雑種のプラスミドＤＮＡ分子は精製され当初のＤＮＡ断 片のコピーは同じエンドヌクレアーゼによる第二の処理で切断される。 構築に用いられた方法には無関係に、組換えＤＮ−Ａ分子は宿主細胞と両立し得 なければならない。すなわち、宿主細胞中で自律的に複製できなければならない 。組換えＤＮＡ分子は、その組換えＤＮＡ分子により形質転換された部上細胞を 選択できるマーカーの機能をも有していなければならない。さらに加えて、プラ スミド上に適当な複製、転写及び翻訳の／グナルが正確に配置されているならば 、外来遺伝子は形質転換細胞及びその子孫中に適切に発現するであろう。 ２２ワクチン ワクチンは病気の制御と予防へのアプローチである。 ワクチンは抗原の免疫原部分をアジュ・ぐントと混合することにより製造できる 。この製剤は宿主の動物又はヒトに注射すると、その抗原に対する抗体の産生を 誘導し、その抗原を生ずる対象生物により起る病気に対する活性な免疫を与える 。 ペブタイド・ワクチンは、バクテリアおよびビールスの表面蛋白質の部分のよう な必要かつ適切な免疫原物質のみを含んでいる。ペブタイド・ワクチンは高度に 純化されたバクテリアの両分から該当するベブタイドを単離スルコトにより、又 は該当するポリペブタイドを合成することによってつくることができる。ペブタ イト・ワクチンの大きい利点は、バクテリア起原の無関係な物質や、宿主又は提 供主から導かれる障害となる物質の排除にある。しかし、現在において、これら の方法を用いてのベブタイド　ワクチンの製造は、一般的に広範囲の商業的使用 にはあまりにも高価につく。組換えＤＮＡ技術はペブタイド・ワクチンの製造に 多くを提供する。バクテリアの適切な免疫原部分をコードするバクテリア遺伝子 の分子クローニング及び宿主細胞での発現により、ペグタイト。ワクチンにおい て使用するための適切な免疫原の充分な量を製造することができる。 ワクチンは、しばしば棹々のアジュバントとともに乳化液として投与される。ア ジュバントは、免疫原それたけを投与するときよりも、よりわずかな投与量でよ り少ない量の抗原を用いて、より持続性があり、より高レベルの免疫を達成する ことに役立つ。アジュ・くンドの作用機序は複雑でアリ、完全にはわからない。 しかし２、それは細網内皮組織の食菌作用や他の活性を刺激するとともに、抗原 の放出と分解を遅延させることを含んでいるであろう。アジュバントの例として は、フロイントのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄ　ｊｕｖａｎｔ　）　 （完全又は不完全）、アジュバン）６５　（落花生油、マンナイド・七ノオレエ ート及びモノステアリン酸アルミニウムを含む）、及び水酸化アルミニウム、リ ン酸アルミニウム又は防音のような鉱物質ゲルが挙げられる。フロイントのアジ ュノ

【ントは、もはやヒ［・や食用動物のだめのワクチン製剤には用いられない 。それは代謝できない鉱物質油を含んていて、それ艇潜在的癌原性物質（ｐｏｔ ｅｎｔｉａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ　）でありうることによる。しかし、鉱物 質ゲルは商業上獣医用ワクチンに広く用いられている。 フォックス（ジャーナル・オブ・イムノロンーニ８２６−８３７（１９６４）） は、連鎖球菌から精製したＭ蛋白質を型特異的（ｔｙｐｅ　−５ｐｅｃｉｆ　ｉ ｃ　）な滅菌性抗体（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　）　 を誘導するためにウサギにおける免疫原として用いた。しかし、部分的精製連鎖 球菌Ｍ蛋白質でヒトにワクチン接種をする試みは常に被接種者に強い局所および 組織的反応が起ったため成功に至らなかった。／ユミノｌ−、ジャーナル・イン フエクンヤス・ディシーズ１０６　；２５０−２５５　（１，９６０）及びボッ ターら、ジャーナル・クリニカル・インベストメント４１　：３０１−３１０　 （１９６２）参照。フォックスら、ジャーナル・オブ・インフエクシャス　ティ シーズ１２０　：５９８−６０４　（１９６９）及びフォックスら、ジャーナル ・オブ・エクスペリメンタル・メジシン１２４：１１３５−１１５１　（１９６ ６）は、精製された酸抽出したＭ蛋白質を用い、一部についてそのワクチンを用 いて成功した。ワクチン接種を受けた２２名の成人のうち１５名は型特異性抗体 力価の二次上昇を伴う反応を示したが、５人についてのみ抗バクテリア抗体の上 昇を示したにすぎなかった。 ビーチエイら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン１５０：８６ ２−８７７’（１９７９）は、Ｍ２４蛋白質のペブ／ン誘導画分（ｐｅｐｓｉｎ −ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ、）（ＰｅｐＭ２４）の明奪沈澱製剤て１ ２名の成人にワク′ｙ−７接種を行なった。局所的又は全身的反応が観察されな かったから、これは充分に親和性があるものと考えられた。 ワクチン接種を受けた１２名のうち１０名がＭ２４型特異的オプソニン抗体を産 生ずることにより反応を示した。 ディルらによる免疫学的研究、ジャーナル・スブ・工（１９８０）によれば、１ ２名のボランテアのうちの２名がＭ２４で免疫されたがＭ５及びＭ６蛋白質の両 者に結合するように改良された抗体のＭ６だけがオンソニックでおった。［２か し、ビーチイらは、シンポジウム・オン・バクチリアル・ワクチン、ジエイ・ビ ー・ロビンス−、ジエイ・シー・ヒル、ブライアン・デツカ−・パブリ／ヤー、 ニューヨーク、４０１−４１０頁（１９８Ｎで、精製されたｐｅｐＭ５蛋白質（ Ｍ５蛋白質のペプシン誘導画分）で免疫された４匹の兎のうちの１匹が高い力価 で心臓組織に対する抗体を生成したことを見出した。 この抗血清は、Ｍ５型蛋白質と心臓組織と交叉名疫反応病原微生物の検出のため の通常の診断的方法は、かかる生物中に見出されると思われるゲノムのＤＮＡ断 片が純粋な形態で入手できるならば、創案できるだろう。もしそうならば、化学 的、酵素的又は放射性同位原素的レポーター・グループで標識をつけることによ り、そのＤＮＡ断片を交雑プローブとして用いることができよら。 グルンスタイン及びホグネス〔プロシージンゲス・オ、ブ・ナチュラル・アカデ ミ−・オン・サイエンス。 Ｕ、Ｓ、Ａ、７２　：３９６１　（１９７５））は、このアプローチヲコロニー ・ハイブリダイセイションと呼ばれる方法で使用した。この方法では、検定され るべきバクテリアはニトロセルロース・フィルターに移すレタ。フィルター上の コロニーはついで分解され、溶出するゲノムＤＮＡはフィルターに固定された。 ３２ｐで標識されたプローブの配列に補充的に付加されたＤＮＡ中のヌクレオチ ド配列の存在はオートラジオグラフィーによって追跡された。ＤＮＡの交雑の他 の一般的態様はファルコウらにより米国特許第４，３５８．５３５号明細書に記 載されて連鎖球菌のＭ蛋白質遺伝子の単細胞生物中でのクローニングと発現のだ めの方法と組成物とが提供される。また、これらの新規な単細胞生物をＭ蛋白質 を生産するために培養する方法、Ｍ蛋白質ＤＮＡを発現する単一のコロニーを同 定する急速検定、及び遺伝子産物の特定のだめの方法も記載されている。ここに 記されている組換えＤＮＡ技術により製造されるＭ蛋白質は、ストレプトコッカ ス自ピオゲネス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｐｙｏｇｅｎｅｓ　＞感染に対 して保護するためワクチン中の免疫原として用いるために調製されうるものであ る。 ここに記載されている特定の態様では、大賜菌トランスダクタント（工、凹ｔｒ ａｎｓｄｕｃｔａｎｔｓ　）により生産される蛋白質はＡ群連鎖球菌の細胞壁の 可溶化によって単離されるＭ６蛋白質よりごく少し大きいが、連鎖球菌のプロト プラストとＬ型により分泌されるものと同程度の大きさを有している。免疫学的 に大腸菌トランスダクタントにより合成される分子は連鎖球菌Ｍ６蛋白質と同じ 型特異性決定部位を有している。Ｍ蛋白質は、オクターロ１ ＝　（０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　）二重融合実験により抗原的に、（ａ）オンソ ニン抗体除去試験及び（ｂ）オンソニン抗体の生産誘導能に、Ｊ：！ｌｌ免疫原 的に特徴づけられる。クロン化されたＮ１蛋白質は即離され、ドテンル硫酸ナト リウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法で分画される。さらに発現された 遺伝子産物の単離方法も記載されている。 本発明は連鎖球菌のオプソニン抗体及び抗原の製造法を提供する。それらは、ヒ トの医薬及び微生物学的研究において一般的重要性を有するものである。この用 途は本発明で生産される連鎖球菌Ｍ蛋白質をラジオイムノアッセイのような超高 感度検定のための高度に再現性を有する標準抗原として用いることを含むもので ある。こ才］らの検定は生物学的標本中の連鎖球菌に対する抗体の発見のだめの 診断的手段として用いられうる。 ：＋１・鎖球菌Ｍ蛋白質遺伝子又はその両分の分子プローブとしての使用を通じ て、生体組織及び体液中の病原性連鎖球菌の診断的同定のための方法も提供され ている。不方法においては、ＤＮＡが微生物的即離物から抽出きれ、分−了状ブ （＋−ブへの交雑により相補的ヌクレオチド配列が試験される。この手段によっ て多数の単離物中の、比較的容易に連鎖球菌の存在を高感度、高信頼度でスクリ ーニングできる。その結果は現在用いられているより厄介な血清学的診断検査よ りも顕著に有利なスクリーニング・テストを提供するものである。 ４、面の簡単な説明 とによりより充分に理解しうるであろう。図面において：第１図（大きさは比例 していない）は連鎖球菌ＤＮＡ断片とｐＪＢ８から導かれた組換えプラスミドで あるｐＪＲＳ４　２の構造を示している。（第６２節参照）連鎖法ｉＤＮＡ中の 種々の制限部位に示されていない。 第２図はｐＪＲｓ４２．１３の制限地図を示す。本ブラスミドはｐＪＲＳ４　２ から不必要な連鎖球菌を除くため．シ４Ｒ　Ｔで消化し再結合することにより誘 導された。プラスミドｐＪＲ８４２．１３はシュＲ　Ｉ部位を一箇所のみ有して いる。 （第６３節参照） 第３図は６型Ａ群連鎖球菌のＭ６蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ ＪＲ３４２．１３の種々のサブクロノの制限地図である。白色の四角形はＭ６蛋 白質を発現するクロンを示し、斜線を施した四角形は発現しないクロンを示して いる。ベクターｐＢＲ３２２は４２２１及び４２】９を除くずべての場合に用い らねた。それらはそれぞれＭ１３において及びｐｕｃｓ及びｐ　Ｕ　Ｃ　９にお い文である。制限地図の上方の矢印は６型Ｍ蛋白質（ｅｍｍ６）をコートする遺 伝子の転写の方向及び遺伝子の概略の範囲を示している。蛋白質のアミン末端に 相当する分子の末端はＮ“で示しである。 第４図は、サンカーら〔プロシージンゲス・オン・ナチュラル・アカテミー・オ ン・サイエンス、Ｕ．Ｓ．Ａ。 るＭ６蛋白質のアミノ末端をコードするｅｍｍ　６−遺伝子の１）　Ｎ　Ａ配列 の部分及びそのＤＮＡ配列から予測される蛋白質のアミノ酸配列を示している。 連続的エドマン分解により決定されたアミン末端アミノ酸はアミノ酸配列の下の “Ｎ“で示されている。 第５図は第３図のプラスミドｐＪＲ３４２，１３の制限酵素消化で得られる％ｃ 　ｉ　ｒ／ｐｖユＩＴ　ｅｍｍ　６　Ｄ　Ｎ　ＡプローブによるＤＮＡ交雑の寒 天ゲル電気泳動分析を示している。各レーン中のＤＮＡは次のとうりである：レ ーン１．オリゴヌクレオチドの大きさの１０．９０　、７．７４　、５．１５　 、２．４４　。 １８０及び０．６０ｋｂ　の標準、レーン２１Ｍ６株Ｄ４７］；レーン３．Ｍ４ ７；レーン４．Ｍ５；レーン５．Ｍ１９；レーン６、Ｍ２６．レーン７、Ｍｌｌ ：レーン８．Ｍ２４ニレ−／９．ＭＩ２；レー、ｚｌＯ，Ｍ２３．レーン１．１ −、Ｍｚｓ（Ｍ株Ｔ２８１５１−／４から）；及びレーン１２’、％＋乙５．（ Ｍ＋株’ｒ　２８／１．５０　Ａ１５から）。 不発明はワクチン製剤における免疫原として用いられうる連鎖球菌Ｍ蛋白質を製 造する組換えＤＮＡ技術に関するものである。さらに特定すれは、Ｍ６蛋白質の 製造が記載されている。 ここに記載さハているように構成された糺換えプラスミドｉｔ　Ｘ宿主細胞（原 核又は真核）に対し宿主細胞の分二かつ抵抗性のある連鎖球菌Ｍ蛋白質の生産性 を与える。かかるプラスミドは天然に存在するＭ蛋白質の免疫学的、抗原的決定 部位を含む多量の蛋白質又はその両分を生成することができる。ここに記されて いる特定の態様はＭ６蛋白質に関する。しかし、ここに記載されるＤＮＡ分子は Ｍ６蛋白質の生産に限定されるものではなく、いかなるＡ群連鎖球菌Ｍ蛋白の製 造にも用いうるものである。 Ｍ６蛋白質についてここに記載されている組成物と方法とのすべてのＭ蛋白質へ の一般的応用可能性はフィゾエテイ及びマンジュラの研究（１９ｓ　２．　、ロ ビンス、ヒル及びサドフ（編集）、ハクテリアル・ワクチン中の４１１−４４８ 頁、連鎖球菌Ｍ蛋白質及び哨乳動物トロポミオンン間の構造の関係の免疫学的連 係）から明らかである。たとえばこれまでに配列がきめられたすべてのＭ蛋白質 はＭ５、Ｍ６及びＭ２４を含んて明瞭な同族性を示し、すべて多重コイル構造で ある。アミン末端及び他の配列がきめられた画分は３種のＭ分子のすべてについ て７個の残基の周期的くりかえしを示している。さらに数種のＭ型の免疫学的分 析は、各種の型の間の交叉反応ヲ示した。フイシエノテイ、ジャーナル・牙ブ・ エクスベリメンタル・メジシン１４６：１１０８−１１２３（１９７７１；マン ジュラ及びフィシエソティ、ジャーナル・オン・エクスペリメンタル・メジノン １５１：６９５−７０８　（１９８０）；マンジュラ及びフィンエ２６］−２６ ７（１９８０）。さらに下記に示す交雑のテークは試験した５６棟のＭ蛋白質遺 伝子のすべての間で構造の類似性を示している。 この技術における熟達者にとっては、種々の免疫原及びワクチン製剤をつくりう ることを直ちに知ることかでここに記載されるＭ蛋白質遺伝子又はその両分は連 鎖球菌に対する診断試験における分子プローブとして使用されつる。この試験の 原理は、病原性連鎖球菌は、本発明のＭ蛋白質の両分に対し相補的な遺伝子配列 を有しているという事実である。かかる遺伝子の相補性は連鎖球菌感染と疑われ るものから微生物ＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを固状担体よ又は液状媒体中で適 切な条件下に分子プローブと結合させることにより直ちに検出されうる。 交雑の生起は適当なリポータ一群のプローブに対する添加により容易に検出され うる。 連鎖球菌状生物はいかなる体組織や体液中の感染部位からも単離されうるが、単 純な咽喉洗滌物は最も好適な相打となろう。多分混合培養物てあろうこのように して得られた微生物は直接（すなわち洗滌物上で）又は当該技術の専門家によく 知られている培養媒体のいづれかの中で多数の細胞を生成するよう生育させて用 いられうる。 そして、混合培養物からのＤＮＡは、凍結−融解、音波処理又は他の機械的手段 によりおよび７才たけ一般的あるいは特異的な細菌細胞壁分解試薬ての処理によ り分裂させたのち抽出されうる。 抽出されたＤＮＡは通常水性アルカリの添加により変性され、ついで緩衝溶液で 洗浄される。−アルカリの特定の濃度や緩両液の組成等は実験の条件により、通 常実験により容易に決定しうる。本発明の変性Ｍ蛋白質遺伝子プローブは、つい で微生物のＤＮＡ製剤に加えられ、ＤＮＡ配列の点において相補的に交雑さぜら れる。特異的結合は交雑混合物を充分に洗滌して非特異的結合を除去したのちに 残すことにより確認されよう。 交雑はその目的のために開発され、認められて来ている多数の溶液のひとつの中 で行われる。ファルコウらは米国特許第４，３５８，５３５号明細書に全般的に 溶液組成及び交雑工程の多くの考察を記載した。この特許はその一般的有用性の 故に、ここに参考文献とし２て包含される１、他の交雑の指標となる特定の数値 、たとえば時間や温塵、および用いられる方法は不発明にとって必煩のものでは ナイ。タトえハコール及ヒハーテユ〔プロシーノン−ゲス・オン・ナチュラル・ アカデミ−・オン・ザイエンスＵ、　Ｓ、　Ａ、って記載された方法が適用され うる。事実交雑のために選ばれる方法は技術水準の進歩とともに変ってゆくもの と期待される。 本発明の基砺となる分子プローブは、特定の交雑を起しつるように遺伝子配列を 保持するに充分であるかぎりは、Ｍ蛋白質遺伝子の全部又はその一部だけをも色 柄するものである。かかる交雑はごくわずかな程度であってさえも、その分子プ ローブに適切なリポータ−・グループを結合させることによって検出されうる。 そのプローブは放射性同位原素で標識を付しつる（たとえば３２Ｐ。 、ｌＨ、＋４ｃ　、　３５ｓ　等による標識）シ、捷た化学的あるいは酵素的リ ポータ−・グループで標識されうる。たとえば、生物的に細分化された（　ｂｉ ｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　）プローグと組み合わされた比色検出装置を、たとえば フルオレノナイン・アビジン、ローダミン・アビジン又は酵素と結合したアビジ ン等のアビジン誘導体と共に用いることかてきる。 Ｍ６蛋白質の工７エリヒ゛ア・コリ（大腸菌）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｅｒｃｏ ｌｉ）中でのクローニングと発現の方法及び連鎖球菌感染を特・徴づけるための プローブとしてのＭ６蛋白質遺伝イの使用法の下記する実施例は、例示の目的で 記されるもので、発明の範囲についての限定の意図によるもめでｄない。 ６実施例゛連鎖球菌Ｍ蛋白質遺伝子を含むクロ／の製造、及び該遺伝子の連鎖球 菌感染の診断的試験にＭ６蛋白η遺伝子の超厚は、ストレプトコッカス・ピオゲ ネス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｐｙｏｇｅｎｅｓ　）Ｄ　４７１株（Ａ群 連鎖球菌）であった。Ｃ群連鎖球菌ファージ細胞溶解素（Ｇｒｏｕｐ　Ｃ５ｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｐｈａｇｅ　１ｙｓｉｎ）が、３０％ラフイノーズの存 在下に、安定なプロトプラストを残してＡ群連鎖球菌の細胞壁を溶解するために 用いられた（フィリップスら、プロシージンゲス・オン・ナチュラル・アカデミ −・オン・ザイエンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８　：４６８９（１９８１））。つい でそのプロトプラストは充分に洗浄され連鎖球菌のデオギ／リボヌクレアーゼ（ ＤＮＡｓ＋ｊ　金除去するため蛋白分解酵素にで処理された。プロトプラストは ドデシル硫酸すトリウム（ＳＤＳ）中に希釈して溶菌され、抽出物がＲＮＡを消 化するためリボヌクレアーゼＩで処理された。塩化セシウムが加えられた。この 製品は蛋白質を除去するために約１００ｘ＆で遠心分離され、−夜透析された。 ＤＮＡはエタノールにより沈澱させられた。使用のために選択されたＤＮＡ画分 は消化前に充分１００キロベース（ｋｂ）以上であった（ｐｌファージＤＮＡを １００　ｋｂの標準とし、２１分子の半分を５０ｋｂ　の標準として０４％アガ ローズ・ゲルーヒでの７−４゜−ズ・ゲル電気泳動で検定した）。 ６２大腸菌へのクローニング Ｍ蛋白質生成のためにスクリーニングされるのに必要であり、かつＭ蛋白質の構 造遺伝子に結合される調節部位を残すのに必要な大腸菌クロンの候補の数を減ら すために、連鎖球菌ＤＮＡの大きい断片がクローンされなければならなかった。 従って、３５ないし４０　ｋｂのＤＮＡの挿入を受け入れるコスミド・ベクター が必要であった。 クローニング・ビヒクルとして５．４ｋｂ　のベクター。 ｐＪＢ８が選ばれた。このベクターは、イッシューホロウイノソ及びバーク、ヌ クレイツク・アー／ソヅ・リサーチ９（１３）：２９８９−２９９８（１９８１ ）が記載した方法によりアンピンリン耐性プラスミドＨｏｍｅｒ　Ｔと合成りａ ｍ　Ｔ−（Ｉリンカ−とから構成された。 本発明においては、ベクターｐＪＢ８は、ベクターヲ特有な位置で切断し「粘着 末端」を生成するマごアテイスら、−Ｌ掲書、１．０４−１０６頁）が一般的に 記載したとこイ）によりＢａｎ　ＨＴで消化された。切断されたベクターは、ベ クター・ベクター間の再結合や再環形成を防くだめに、−ｊ′ルカリ性フオスフ ァターセで処理され（たとえけマ；−７’ディスら、上掲書、１３３−１３４） 、粉状化されたべ久ターの５′−フメスノエートが除去された。ランタン、なＩ ）　Ｎ　Ａ断片を生成させるため、第６１節に記載したようにして単離された連 鎖球菌ＤＮＡを部分的に消化するために３ａｕ　３　ａ制限酵素が用いられた（ たとえはマニアライスら、前掲書、２９８）。分画された連鎖球菌Ｄ　Ｎ　Ａは ｐＪＢ８ベクター上のＢａｍ　ＨＩの部分に結合さｔｌだ（第１図参照、たとえ はマニアライスら、上掲書、２９８−２９９）。 連鎖球菌ＤＮＡが挿入されたベクターは試験管内てラムダ・ファー−／の頭部に とりこ寸れた〔ホー／及びコリたキメラＤＮＡを包含するファージは、熱的に誘 起されつるプロファージを有する大腸菌に１２の制限部位のない株Ｃ’６００　 （ｌａｍｂｄａｃＴ８５７＞ｒｅｃＡを形質導入するために用いられた。アンピ シリン耐性コロニーが３０℃で選び出され、同じ選択培地に移され、−夜３０℃ で培養されて、マスター・プレートをつくった。 大腸菌中にクロンされたほとんどのグラノ・陽性遺伝子は発現しているので、Ｍ 蛋白質遺伝子が大腸菌中て発現するという可能性は高かった。しかし、Ｍ蛋白質 はペリプラスム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）と外膜といういずれも連鎖球菌には存在 しないものを通して移送されなければならないから、Ｍ蛋白質が大腸菌の表面に 現われるとＣ［思われなかった。この理由から、その大腸菌のマスター・プレー トけプロファー／を誘起し、宿主細胞を溶菌するために４２℃に移され、クロン 化された遺伝子の発現を確認しＭ蛋白質を発現する大腸菌のクロンを認識するた め高速検定法を開発した。この技術はＭ蛋白質を発現する学−ノコロニーを容易 に見分けうる。 この検定法は、試験さるべき溶菌されたコロニーをニトロセルローズフィルター に移し、蛋白質に対するフィルターの非特異的親和性を減少させるためｌＩ′血 清アルブミン中で該フィルターを洗滌し、そのフィルターを大腸菌細胞で充分に 予備吸収（ｐｒｅ　−ａｂｓｏｒｂｅｄ　）　Ｌだ精製された［、ｙｓ　Ｍ　６ に対する抗血清と反応させ、適宜に洗浄し、１２５Ｉ一連鎖球附蛋白質Ａ（抗原 −抗体複合体に結合している）と反応させ、再び洗浄し、ついでオートラジオグ ラフィーで測定することからなる。 Ｍ６蛋白質を検出するには抗血清は１ｏｏｏ倍以上に希釈される。抗血清が１０ 倍希釈（さらに１００倍以上濃縮された）で用いられたときは大腸菌と検出しう る反応を起さない。この方法により、親の連鎖球菌中に生産された１係未満の量 のＭ６蛋白質の大腸菌クロンによる生成が検出されうる。 スクリーンされた３３５のコロニーのうち、１つが精ｍＭ６蛋白質に対する抗血 清と強く反応した。この株のうちに存在するキメラ・プラスミドはｐＪＲ３４２ と名づけられた。この大腸菌クロンのＭ６蛋白質の生産能はアンピシリン宵有培 地中のサブ・カルデユア上で安定に維持された。プラスミドｐＪＲ３４２はＥｃ ｏ　ＲＩエントヌクレアーゼで処理され、連鎖球（ｉ４ＤＮＡの両分を除去しｐ ＪＲ３４２，１３を生成した。このプラスミドはすべでの必要な複製機能とその プロモーター系とともにＭ６蛋白質をコードする完全な配列を保持している。 ６４遺伝子産物の同定 ｐ　ＪＢ８とｐ　ＪＲＳ４２を含むＣ６００ＮＲトラン、ｚ、ダクタントを含む 大腸菌Ｃ６００ＮＲ株は、アンピシリン含有のトッド−へウィツト肉汁（牛心域 添加肉７＋（ｂｅｅｆｈｅａｒｔ　１ｎｆｕｓｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　）　）中で 対数増殖期の終期捷で３０℃で生育させた。細胞はベレット化され、二鹿洗浄さ れ、ついでエチレン・シアミンチＦう酢酸（Ｅｌ）ＴＡ）ＩＪゾチートで溶菌さ れ、乾燥氷−エタノール中で凍結し、３７℃で急速に解凍された。ＤＮＡ−アー セ（ＤＮＡｓｅ）処理にひきつづき、１０，０００ｘりで３０分間遠心分離して 細胞の破片を除去し、抽出物を０４５ミクロンのミリポア・フィルターに通し、 ５０ｍＭの沖−炭酸アンモニウムに対して透析した。 大腸菌中に生成したＭ蛋白質分子の同定は免疫吸収分析いｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　 ａｎａｌｙｓｉｓ）で決定された。フォリンの反応〔ロウリーら、ジャーナル・ オン・バイオロジカル・ケミストリー１９３　：２６５　（１９５１ｍｌて決定 された当量蛋白質濃度がＳＤＳ含有の１２係ポリアクリルアミド・ゲルに適用さ れた。６型連鎖球菌からファージ細胞溶解素で細胞壁を可溶化することにより、 ６型連鎖球菌から抽出された精製Ｍ６蛋白質の標準製品が対象として隣接するウ ェル（ｗｅｌｌ、）に対して適用された。電気泳動後、分離された蛋白質はニト ロセルローズ上に移され、フィルター上の未反応部位はツイーン２ｏ（ポリオキ ／エチレン・ソルビタン・モノラウレート）を用いて保腰され、大腸菌で吸収さ れた連鎖球菌から得られた細胞溶解素で抽出されたＭ６蛋白質に対して向けられ た抗血清とともにフィルターが培養された。山羊の抗ウサギＩｇＧに結合したア ルカリ性フォスファターセを用いる酵素結合免疫検定法が結合抗体を検出するた めに用いられた。 アルカリ性フオスファターセの基質としてインドキシル・フォスフエイトが、発 色団としてニトロブルー・テトラゾリウムが用いられ、ブレイクらの方法〔アナ リテイカル・バイオケミストリー１３６　：　１７５−１７９　（１９８４）、 １でバンドが可視化された。Ｍ６抗血渭は対照のＭ６とｐＪＲ３４２を含む大腸 菌クロンの抽出物のいづれとも反応したが、ｐＪ８８ベクターのみを含む親の大 腸菌の抽出物とは反応し７なかった。 大腸菌クロンに、ｒ、り生成されるＭ蛋白質の分子量が、精製されたＬ！／Ｓ　 Ｍ　６蛋白質の標Ｇ製品と免疫吸収分析（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓ ｉｓ）で比較された。この分子はファージ細胞溶解素という酵素によるストレプ トコッカスの細胞壁のり溶化とカラノ・・クロマトグラフィーによる精製の結果 物である。それは連鎖球菌の細胞壁から分離された最大のＭ蛋白質分子であるこ とを示している。 このＭ６蛋白質はつぎのようにして精製された。プラスミドｐ　Ｊ　ＲＳ　４２ ．１３を含む大腸菌をＥＤＴＡ及び２０条の／ヨ糖の存在下にリゾチームで処理 した。これにより原形質をとり−まく内容物が周辺の液体中に溶出さｆｚる。生 物の遠心分離により原形質外（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ）の内容物を他の大腸菌 関連蛋白質とともに上澄液中にのこす。この技術を用いて、Ｍ蛋白質は原形質外 空間には高濃度で育存するが、実質上は細胞質には存在しないことが知ら第１だ 。従って、この方法はＭ蛋白質精製の出発原料を生成させるのに用いられた。 粗製の原形質外の内容物中のＭ蛋白質は他の夾雑する蛋白質からカラム・クロマ トグラフィーで精製された。 粗製の原形質外空間品は５ｍＭ重炭酸アンモニウノ・のｐ）Ｔ５５緩衝液で透析 され、カルボキシメチルセルロースツカラムにかけられた。カラムは同じ緩衝液 の３倍量で洗ｐＨ７，０の２００ｍＭリン酸ナトリウムで洗浄し、ついて付着す るＭｉ白質をｐＨ７，０のり／酸すトリウム４００ｍ　ｌｖＴ溶液で溶出した。 この方法によって、高度に精製されたＭ蛋白質製品か得ら７′■、それけ５ＤＳ −ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法と配列分析法（５ｅｑｕｅｎｃｅａｎａ ｌｙｓｉｓ　）で決定された。 アミノ末端配列分析で精製大腸菌合成Ｍ６蛋白質からや−のフェニルチオヒダノ ドイン（Ｆ’　Ｔ　Ｈ）−アミノ酸が各分解段階で得られ、最終製品の均質性が 証明された。 さらに、アミノ末端の配列は、アミノ末端の残基を除く最初の配列された３５箇 の残基によってＬｙｓ　Ｍ　６のアミノ末端配列と同一であると七がわかった。 大腸菌の分子はり７７分子の精製の間に脱離されうるア辷ノ末端に命分にアルギ ニン残基を有している。３梢製されたＴ、、ｙｓ　Ｍ　６製品はさきにＭ６分子 てみられた多重バントの模様を有しているが、それはおそらく抽出と精製との過 程ての分解によるものてあろう。３つの大きいハントは５１，０００゜５２．０ ００及び５３，０００ダルトンのはっきりした分子量に相当する。Ｍ６製品の大 きさの異質さは、おそらく蛋白質のカルボキン末端部分の相違からくるものであ ろう。この理由は、配列の分解による本製品のアミン末端配列分析の間に各段階 ごとに一つのアミノ酸残基のみが放出されることによる。抗開６抗 ４２を含むクロンによるバンドはすべて連鎖球菌製品からのものに比して大きい （分子量５５，０００，５７，０００。 ５９、０００ダルトン）。このことはｐＪＲ８４２はＭ６蛋白質の全構造遺伝子 を含んでいることを示唆していた。 このことは、この分子の大きさが１２型連鎖球菌のプロトプラスト及び■，型か ら分泌されるＭ蛋白質の大きさとし１報告されているもの（分子量５８，０００ ダルトン）とよくτ致しているという事実によってうらづけられた。 従って、大腸菌製品中の蛋白質は、連鎖球菌の細胞＠析素抽−出により放出され るものより完全な自然のＭ分子の大きさにより近いものであろう。 さらに、分泌性の連鎖球菌■，型及びプロトプラストから分離されたＭ蛋白質は もつと均質性があると思わーれる。 抗開６抗 標準Ｍ蛋白質のバンドとの泳動性における差異については、いくつかの説明があ りうる。たとえば　１）蛋白質は、大腸菌では除去されていないリーダー・配列 を含みうるが、連鎖球菌では通常除去されている。２）そのＬｙｓ　Ｍ　６分子 は連鎖球菌細胞壁に何遍する間に生成する分解産物に相当する。３）そのＬｙｓ 　Ｍ　６分子は蛋白の精製過程で生成した部分分解物かも知れない。４）その大 腸菌蛋白質はベクター中のプロモータから生成した「融合」物質かも知れない。 ５）連鎖球菌では機能できない翻訳開始配列が大腸菌中では活性なのかも知れな い。及び／又は６）連鎖球菌中では通常機能的な「停止」コドンが大腸菌の株中 ではｍＥ変異によりおさえられているのかも知れない。 ６５遺伝子産物の免疫原的特徴づけ 大腸菌のＭ蛋白質と連鎖球菌の細胞溶解素ての抽出によるＭ蛋白質のオフテルロ ニー・イムノディフュージョン（　０ｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　ｉｍｍｎｏｄｉｆｆ ｕｓｉｏｎ）での比較を行った。ウェル１（ｗｅ＋＋１）には連鎖球菌で合成さ れた細胞溶解素抽出Ｍ６に対して製造された吸収されていないウサギの抗血清を 入れた。ウェル２には精製された細胞溶解素抽出Ｍ６蛋白質を入れた。ウェル３ にはＤＥＡＥとＣＭセルロース上のクロマトグラフィーで部分的に精製されたニ スチェリチアコリー（　Ｅ．　ｃｏｌｉ）　Ｃ　６　０　０　Ｎ　Ｒ　（ｐＪ’ Ｒ８４２）株から得られたＭ６蛋白質を入れた。反，応は一ｐＨ８６で５０ｍＭ バルビトール緩衝液中で調製した１係寒天ゲル中で行われた。ゲルは乾燥し、ク ーマ／−・ブルー　（　Ｃｏｏｍａｓｉｅ　ｂｌｕｅ）で染色した。 この二重拡散実験の結果は（ゲルは示されていない）、ｐＪＲ８４２を有する大 腸菌の抽出物（挿入なしのプラスミドのそれではない）は、少なくとも連鎖球菌 Ｍ６Ｑ白質のそれらのあるものには共通な抗原決定部位を含，（。 でいるという結論を裏付けた。そこで、大腸菌製品はより高い明瞭な分子量を有 しているけれども、大腸菌中で合成されたＭ６蛋白質は６型連鎖球菌から抽出さ れたＭ蛋白質と同じ型特異性決定部位を有している。 ６、６クロン化Ｍ蛋白質の滅菌効果 大腸菌の生産したＭ蛋白質がウサギ及びヒトのオプソニン抗血清の両者〃・らの オプソニン抗体を除去するに要する抗原決定部位を含むかどうかを決定するため 、次の吸収実験を行った。 精製した大腸菌で合成したＭ６蛋白質が３０μ２　つつ２つに分けて凍結乾燥さ れた。一方にウサギの６型オプソニン抗血ｍ　（　０．　５　ｍｌ　）を加え、 同様の犀の６型連鎖球加えて溶液をつくった。これらの試験管を３７℃で１時間 培養し、４℃で一夜放置した。かくして得られた沈澱を２”０　、　０００　ｘ 　９で遠心分離し、得られたよ澄液を６型連鎖球菌を用いる滅菌検定に使用した 。 間接的滅菌検定は当初ランスフィールドによって一記載されたように（ジャーナ ル・オン・エクスペリメンタル・メジシン１１０：２７１（１９５９））して行 った。正常な提供者（　ｎｏｒｍａｌ　ｃｌｏｎｏｒｓ）から得たペバリノ処理 された全人血を食細胞原として用いた。６型連鎖球菌の希釈物（　１．００　ｔ ｉｔ　）を、吸収され又は吸収されていない血清（１００１１／．）の存在又は 不存在下に、人血４００μｔに混合した。混合物を３７℃で３時間回転させた。 生存している生物を埋没平板法で決定した。抗血清なしで回転させた対照につい て提供者の血液中で連鎖球菌が生育する能力のテストを行なった。大腸菌トラン スダクタントか生成したＭ蛋白質は、ウサギ及びヒトの血清からオンノニン抗体 を除去した。第１表参照。従って、大腸菌Ｍ蛋白質の抗食菌作用性決定部位は自 然のＭ６分子のそれと大腸菌産生Ｍ６蛋白質によるヒト及びウサギの食菌性接種 物　２０１８ 無皿清（対照）　７９０　９３０ 非吸収血清　８。 大腸菌Ｍ６ｆ吸収　］、　８　０　０　２　８　９　０＊数字は３時間回転後の 埋没平板法によって検定した精製された大腸菌が生産したＭ６蛋白質による免疫 後のウサギ中での６をオプノニン抗体の生産は次のようにして行われた。精製さ れた大腸菌が生産したＭ６蛋白質に対する抗血清がニューシーラント／ロウザギ 中で作られた。−次接橿は完全フロイント担体で乳化した１００７１９　のＭ６ 蛋白質から成り、複数部位に皮下投与された。 動物は４週間後に不完全７０インド担体中の同用量のＭ６蛋白質で増強された。 動物は１０日後採血された。 滅菌検定（上記）により認められたところによれば、大腸菌Ｍ６蛋白質で免疫さ れたウサギは６型連鎖球菌の食菌作用性を認める抗体を産生じた。第２表参照。 大腸菌Ｍ６ｉ白質で免疫された 接種物　４３ 無血清（対照）　１１１２ ＊意味は上記６．６節に記載したとうり。以字は３時間回転後のボア・プレイド 法によって検定したコロニＭ６型蛋白質をコードする遺伝子（ｅｍｍ　６１をっ −きとめるため、上記第６．３節中に記載されたプラスミドｐ　Ｊ　ＲＳ　４２ ．１３を種々の制限酵素又はその複合体による消化に付した。かくして得られた ＤＮＡ断片は上記マニアチスらの文献１５０−１６１頁に記載されているところ により０．８％アガロース・ゲルを通して電気泳動に付して分画され、ついで種 々のベクター中に結合された。 熱誘導性（ｔｈｅｒｍａｌｌｙ　１ｎｄｕｃｉｂｌｅ）ラムダ・ファージに対し 溶原性ニスチェリチア・コリー（−４ｃｏｊ　ｉ　）　Ｋ　１２菌中に、これら の組換えベクターが組み込１れ、第６４節に記載したように抗Ｍ６蛋白質抗血清 と反応性を有する蛋白質の生産についてスクリーニングされた。 多数のこれらのクロン化されたＤＮＡ断片についてのＭ６６蛋白質現分析結果を 第３図に示す。白色のブロックで示されているクロンは抗Ｍ６抗血清と反応性が あったが、斜線を施したブロックで示されたものは反応性がなかった。ｐ　Ｊ　 ＲＳ　４２．１９のようないくつかの反応性クロンは全Ｍ６蛋白質をコードする 連鎖球菌ＤＮＡをごくわずかしか含んでいなかったが、その発現する物質はあき らかにポリクロナール抗血清と抗原性反応性を示すに充分な大きさであった。 クロン化されたＤＮＡ断片中のｅｍｍ　６遺伝子の配置についてさらに検討する ため、プラスミドｐ　Ｊ　ＲＳ　４２．１−９中の連鎖球菌ＤＮＡをプラスミド ｐＵＣ９及びｐＵＣ８のＢａｍ　Ｈ１部分に挿入した［メッシング及びベイラ、 シーン上ユニ２６（１−２７６（１９８２）］。これらヅラスミド相互間の関係 は挿入されたＤＮＡがプラスミド中で反対の方向に配列されている。抗Ｍ６抗血 清は、これらクロンの両方の製品と反応し、沸鎖球菌ＤＮＡがこれらのベクター のいづれの配列中にも存在するときにＭ６６蛋白質分が合成されることを示して いる。従って、挿入された連鎖球菌ＤＮＡはそれ自身のプロモータを有している ものと思われる。もしこの結論が正しければ、ｐ　Ｊ　Ｒ８４２，１９はＭ６蛋 白質のＮ末端をコードするもののはずである。 ｐ　Ｊ　Ｒ３４２，１９の連鎖球菌ＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ８及びｍｐ　９　中 に挿入〔メジシン及びベイラル、上掲書〕したのち、サンガーのジテオキシ法〔 サンカーら、プロシーノンゲス・オン・ナチュラル・アカテミー・オン・ザイエ ンス・Ｕ、Ｓ、Ａ、７４　：５４６３　（１ｃ＋７７）：］で挿入されたＤＮＡ の配列が決定された。Ｍ６蛋白ｈ−のアミノ末端をコードする部分配列をそれに より特定されるアミノ酸配列とともに第４図に示す。逐次的エドマン分解により 決定された（参考文献）アミン末へアミノ酸は、アミノ酸配列の下に「Ｎ」で示 しである。この方法で決定されたアミノ酸配列はペプシン処理により、又はファ ージ溶菌により連鎖球菌ストレインＤ４７１　（参考〕から抽出さｔ′ｌたＭ６ 蛋白質のアミン末端について確立されている配列と同一であった。それはまた、 上記第６４節中の大腸菌における組換えＤＮＡ方法により生成されたＭ蛋白質の アミン末端部分とも同一であった。 とわらの結果は、ｅｍｍ６遺伝子はｐ　Ｊ　ＲＳ　４２．１９中に金膜れるＤＮ Ａ中に如才ることを示した。第４図に示されるＩ）　Ｎ　Ａ配列とアミノ酸配列 の比較は、さらに、第３図に示すように、Ｍ６蛋白質のＮ末端は％ｃｉＩ部位の 左へ３２ｊ４基目の点であることを示している。 大腸菌中てヰ成されたＭ　６　Ｚ白質Ｈ，ｉ、　、）テンル仙酸すトリウノ、・ ポリアクリルアミド・ゲル電気体動〔フィ／２ エッチら、ジャーナル・オン・エクスペリメンタル・メジシン１５９：１０８３ −１０９５（１９８４））により明らかに５９，０００ダルトンの分子量を有す ることが示された。この事実は遺伝子配列の他の末端を第３図におけるＬ二ＩＩ 部位−またはその付近に定めることとなる。 さらに配列の分相をつづけたところ、蛋白質を終了する無意味なコドンＴＡＡが Ｐｖｕ　Ｉ−Ｉ部位の右へ３８塩基目に位置していることが明らかとなった（ホ リング／−ドら、原稿作成中）。 プラスミドｐ　Ｊ　ＲＳ　４２．１３を−ＮシェＩ及び二ＩＩで処理してｅｍｍ ６遺伝子の大部分を含む適当なプローブを作成した。ｐ　、Ｊ　Ｒ８４２，１３ の制限酵素地図中でのこのプローブの位置を第３図に太い矢印で示す。このプロ ーブ断片は、０８ｃＩ）アガロース・ゲル中での電気泳動法、電気的溶出及びエ ルチップ−ｄ　（Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ　）のカラム（ンユライヘル及びシュエル） を通過させることにより精製された。 ６８２細菌のＤＮＡの単離 Ａ群連鎖球菌の細胞をフィンエッチらの方法〔ジャーナル・オン・エクスペリメ ンタル・メジシン］　３　：３　：１、１０５　（１９７１）　：］で溶菌する のＵ（はファージ細菌溶解素を用いた。他の連鎖球菌については、−夜のドツト ・ヘウイノト・酵Ｕ肉汁培養物（酵旬抽出物を添加した牛心趨浸出肉／１）を１ ０倍に弄釈し、３７℃で、ｆ［ｉ１胞（ｆ′一度を１．　ｍｉあたり杓５　Ｘ　 １０’　細胞となる寸で中有させた。 ３％（ｗ／ｖ）の濃度１でグリセリンを添加し、細胞をさらに２時間３７℃で培 養した。ついで細胞を洗浄し、１５秒のパルスで２度音波処理し、蔗糖３０％（ ｗ／ｖ）３７℃で３０分間培養したのち、最終濃度１０ｍＭｔでエチレンジアミ ンテトラ酢酸を加え、さらに３７℃でえ、これらの成分をゆっくりと回転させて 混合し、さらに３７℃で３０分間培養を続けた。この工程につづいて、混濁を示 さない細胞懸濁液を界面に蛋白質がみえなくなＺ＋ｔｆフェノール、クロロフォ ルム（１０：１）で抽出した。抽出されたＤＮＡは、ついてエタノールで沈澱さ せ之。 試験した細菌株は、ストレプＩ・コツカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ ｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）　、バチルス・スブチリス（Ｂ。 ５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　（ＣＵ　１．０６５株）、ストレフトコツカス・ブノイ モニエ（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）及びロックフ ェラー大学のコレクションから得られた次の連鎖球菌株であって、それぞれ特異 的抗血清をつくるに用いられる標準タイピング及びグルービング株である。Ｍｌ 。 Ｔｌ／１９５／２；　Ｍ３　、Ｂ９３０／６１１５　；　Ｍ３　Ｒ、Ｄ５８Ｘ； Ｍ４．Ｔ４／９５／ＲＢ５　；　Ｍ５　、Ｔ１２／１２６／４　；　Ｍ６　。 Ｓ４３／１９２／３　；　Ｍ８　、Ｃ２５６／８６／３　；　Ｍ　１１　。 Ｔｌｌ／１３７／３　：Ｍｌ２　、Ｔ１２／１２６／４　（ＣＯＬ６）；Ｍｌ４ 　。 Ｔ１４／４６／８　、Ｍｌ　５　、Ｔ１５／２３／７　、Ｍｌ８　、Ｊ１７Ｃ１ ５５／４；Ｍ２２　、Ｔ２２／１４６／１　：Ｍ２３　、Ｔ２３／１０２／ＲＢ ５　；Ｍ２４゜Ｃ９８／１３５／２：Ｍ２Ｓ　、Ｂ５４６／１３６／１　：Ｍ２ ７　、Ｔ２７／８７／１；Ｍ２Ｓ　、Ｔ２８／１５０Ａ１５　；Ｍ２９　、Ｄ２ ３　；Ｍ２Ｏ。 Ｄ２４／１２６／３　；Ｍ３１　、Ｊ１３７／６９／３　；Ｍ３２　、Ｃ１２１ ／３９／８　；Ｍ３３　、Ｃ１０７／１０２／２　：Ｍ３６　、Ｃ１１９／８３ ／２；Ｍ３７　、Ｃ２４２；Ｍ２Ｒ、Ｃ９４／８０／２　；Ｍ３９　、Ｃ９５／ ９５／１　；Ｍ２Ｏ、Ｃ１４３／２５／９　；Ｍ４１　、Ｃｌ０Ｉ／１０３／４ 　；Ｍ４２　、Ｃ１１３１５５１５；Ｍ４３　、Ｃ１２６／１７０／２　：Ｍ４ ６　。 ＣｌＯ３／４１１５　；Ｍ４７　、Ｃ７４４／ＲＢ４／６１５　；Ｍ２Ｓ　。 Ｂ　４０３／４８１５　；Ｍ４９　、Ｂ７３７／１３７／２　；Ｍ２Ｏ、Ｂ５１ ４／３３／６　；Ｍ５１　、Ａ３０９／７７／１　；Ｍ５２　、Ａ３７１／１０ ６／２；Ｍ５３　、Ａ９５２／９４／３　；Ｍ５４　、Ａ９５３／８７／３　； Ｍ２Ｓ　。 Ａ９２８／７３／１　；Ｍ５６　、Ａ９６３　；Ｍ５７　、Ａ９９５／９１／２ 　；Ｍ２Ｓ、Ｄ３１５／８７／３　：　Ｍ２Ｏ、Ｄ３３５／３８／３　；　Ｍ６ ３　。 Ｄ４５９１５０／２　；　Ｍ６６　、Ｄ７９４／７６／２　；　Ｍ６７　。 Ｄ７９５／９５／１　；　Ａ群、Ｊ１７Ａ４；Ｂ！！−ｆ、０９０−Ｒ；６群、 Ｃ７４；Ｄ群、Ｄ７６；Ｅ群、に１３１；Ｆ群。 Ｆ６８Ｃ；Ｇ群、ＤＩ６６Ｂ；Ｈ群、　Ｆ　９０　Ａ　；　Ｌ群。 Ｄ］６７Ａ；Ｍ群、Ｄ１６８．Ａ”Ｘ“：８群、Ｃ５５９；０群、Ｂ５６１ｏ次 のＡ群でＭ型にタイピングされるジョーシア州アトランタのセンター・フォー・ ディ／−ズ・コントロールから入手された株も使用された。Ｍ２゜５Ｓ６３３　 ；Ｍ９．５Ｓ７５４　：Ｍｌ３．５Ｓ９３６　；Ｍｌ７，５Ｓ６３１；Ｍｌ９， ５Ｓ４００；Ｍ３４゜５Ｓ１３４　：Ｍ５９．５Ｓ９１３及びＭ６２．５Ｓ９８ ４゜１５４、１−１−５５２　（１９７９）　〕が記載した特異的ＤＮＡ配列を みつける手段を用いて、抽出されたＤＮＡの標本についてドツト・／・イブリダ イセーションが行われた。ボッチャンらの方法〔セル９：２６９−２８７（１９ ７６）〕で二ツク翻訳により３２ｐ″′Ｃａｍしたのち、交雑を行うにあたって 、種々の微生物原から得られたＤＮＡ抽出物は室温て１５分間０．６　Ｎ　Ｎａ ＯＨ中で変性され、ついで０℃で１０分間変性された。さらに、試料は２Ｍ酢酸 アンモニウムで中和され、ＤＮＡの両分はベセス゛ダ・リサーチ・ラボラトリ− の多枝管中のノ【イオダインＡ　０．２ミクロン・ナイロン・フィルターにュー ヨーク州グレ／・コープ、ポール・フィルトレーショ／−・コーポレー／ヨン） 上にスポットされた。交雑は１．８　Ｍ　トリス堪酸塩を含み、０２Ｍのトリス 塩基を含む緩衝液中でニック翻訳された３２　ｐプローブを少なくとも２Ｘ１０ ６ｃｐｍ／フィルターの割合で加え、フィルターを一夜６４℃に保持することに より行われた。フィルターは、ついオートラジオグラフィーに付された。露光は 一８０℃で２−４日行われた。 これらの夫験結果の要約を第３表に示す。 ｅｍｍ６ブローブによるＤＮＡ交雑 Ａ群　１，２，３，４．．５，６，８，９゜１１、．１２，１３，１４，１．５ ，１７゜１８．１９，２２，２３，２４，２５゜２７．２８，２９，３０，３１ ，３２゜３３．３４，３６．３７，３８，３９゜４０．４１，４２，４３，４６ ．．４７゜４８．４９，５０，５１，５２，５３゜５４−．５５，５６，５７， ５８，５９゜６０．６２，６３，６６．６７．６８゜Ａ４８６．Ａ７１２．Ｄ３ ６６、Ｄ７８０Ｍ−Ａ群株　Ｊ１７Ａ４．　へ４８６変性　Ｔ２８１５］、／／ ’４他の連鎖球菌群　Ｃ、Ｇ　Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ。 Ｌ、Ｍ、Ｎ、０ 他のダラム陽性　な　し　ストレフトコツカス・ブノイカス・アウレウス（Ｓｔ ａｐｈｙｌｏ−ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）バチルス１スブチリス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ） ＊　Ａ４８６変異株はＡ群変異株である。 全体としてドツト・プロット実験は、ｅｍｍ６ブローブとＡ群連鎖球圀の５６棟 中の５６の異なるＭｕから得られるＤＮＡ、及びＡ群株のタイプ分けできない４ 種及びすてにＭ−と特徴づけられている２つの株との間に交雑が認められた。ダ ラム陽性菌であるスタフィロコッカス・オウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ ｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）又はバチルス・ｚブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ 目ｉｓ）からのＤＮＡ、連鎖球菌ランスフィールドＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ，Ｌ、Ｍ 、Ｎ又は０群からのＤＮＡ、又はストレプトコッカス・プノイモニエ（５ｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）からのＤＮＡとは交雑は見られ なかった。しかし、Ｃ群及びＧ群連釦球菌ＤＮＡとは交雑がみられた。この知見 は、Ｇ群連鎖球菌はしばしばヒトの感染に関係し、ある株はその外面に機能的に Ｍ蛋白質と同様な分子を有しているらしいので予期し得ない知見ではなかった〔 ウールコック、インフェク７ヨン・アンド・インムノロ）　−１０：　５６８（ １９７４）：］。 Ｇ群連鎖球菌も壕だ広範囲のヒトへの感染を起すことが報告されている。これら の生物の毒性が必ずＭ様畑胞表面蛋白質の存在によるかどうかははっきりしない が、そういうこともありうるところである。ヒト感染物から分離したＧ群連鎖球 菌の３株を試験したところ、１２型Ｍ細胞蛋白質が株中に存在することがわかっ た〔マクステッド及びボタ−、ジャーナル・オン・ゼネラル・マイクロバイオロ ジー１且：１］９（１９６７＞］。 試験されたＡ群株の中に、機能的にＭ（すなわち、保護的Ｍ蛋白質を生成せず賞 菌性化されたもの）が３株あった。これらのＭ−株の２種からのＤＮＡは、それ にも拘わらず江二亙遺伝子プローブと交雑し、少なくとも機能的（ｎｏｎｆｕｎ ｃｔｉｏｎａｌ）であるかわずかな量しか合成しないような変異株であろう。１ つのＭ−株からのＤＮＡはプローブと交雑せず、その株中では！遺伝子は実質的 に除去されていることを示唆していた。 ドツト・プロット実験の結果は、棟々のＭ型Ａ群連鎖球菌株から得られるＤＮＡ を抽出し、Ｎｃｉｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化する実験により確かめられた。得 られるＤＮＡ断片の試料は、マニアティスら、上掲魯、１５０−１６１に記載の アガロース・ゲル・電気泳動で分離され、ｅｍｍ旦の３２ｐで標識されたプロー ブと交雑され、雑種ＤＮＡ断片の位置がオートラジオグラフィーで示された。結 果は第５図に示す。 第５図において、第１列は３２　ｐで標識された１ｏ９゜７．７４　、５．１５ 　、２．４４　、１．８０及び０．６０　ｋｂノＤＮＡ分子サイズのマーカーを 示す。第２列ないし第１０列は連鎖球菌Ｍの型６，４７，５，１９，２６，１１ ，２４゜ト試験から予期されたように、Ｔ２８１５１／４のＭ−株からのＤＮＡ は交雑しなかった（第１１列）が、Ｔ２８／１５０　Ａ１５のＭ＋株（第１２列 ）は交雑した。 次表に示すプラスミドを有する次表の大腸菌は、イリノイ州ベオリアのアグリカ ルチュラル・リサーチ・カルチュア・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託されてお り、次の薔託査ぢを付与されている。 Ｋ−１２，Ｃ６００ＮＲｐＪＲ８４２，１３ＮＲＲＬ　Ｂ−１５５２９ラムダ　 ｃ　１８５７ に−１２，Ｃ６００ＮＲｐＪＲ３４２ＮＲＲＬ　Ｂ−１５５３５ラムダ　ｃ　１ ８５７ 寄託微生物は本発明の幾多の態様を代表することを意図したものであるから、本 発明は薔託された微生物により範囲として限定さるべきものではない。小火、こ こに示され、記載されたところに加えて、この発明のオ■々の修飾は、以上の記 載と給料の図面から、当該技術の専門家にとっては明らかとなるであろう。かが る修飾は、下記する請求の範囲のうちに入るべきことを意図している。 不明＃１書中でヌクレオタイドについての塩基対の大きさは概略のものであって 、記載の目的のために使用されたものである。 浄書（内容に変更なし） 第２区 垢３１図 第１＋１塑 ＋７２　ＡＴＧ　ＢＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＣＡＣＳ　ＡＡＴ　ＡＧＡ　Ｃ ＡＣＴＡＴ　ＴＣＧ　ＣＴＴ　ＡＧＡ　ＭＡ　２１３Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　 Ａｓｎ　Ａｓｎ　ＴＩＹ　Ａｓｎ　〜Ｉ　Ｈｌｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｓｕ　Ａ ｒｇ　Ｌｙｓ２１４ＴｒＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＢＧＴ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＴＣＡ 　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＡＧＴ　ＧＴＡ　２５５しｅｕ　 Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｉ　 Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ｓａｒ　Ｖａｔ２５６ＡＴＡ　ＧＧＧ　ＢＣＡ　ＢＧＡ　ＴＴ Ａ　ＧＴＴ　ＧＴＣＡＡＴ　ＡＣＴ　ＭＴ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＡＧＴ　ＧＣＡ　 ２９７１１ｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔ ｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ａｌ。 ３８２ＣＡＡＧＣｒ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＧＡＣＡＡＧ　ＴＴＡ　ＡＣＡ　ＡＣＴ ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＡＡＣＴＴＡ　４２３Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｓ ｎ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　しｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｘ　Ａｓｎ 　Ｌ＠ｕ４２４　ＡＱＡ　ＧＡＴ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＡＭ　ＡＡＣＴＴＡ　ＡＣ Ａ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＡＡＣＴＴＡ　４６５Ｔｈｒ　Ａｓｐ　 Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｃ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　 Ｌｙｓ　Ａｓｈ　Ｌｅｕ４６６ＡＣＡ　ＧＡＴ　Ｃ４７２ Ｔｈｒ　Ａｓｐ 第Ｓ図 手続補正書（自発） 国際調査報告 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，４識別記号　庁内整理番号優先権主張　０１ｇ８拝６月１８日 ［相］米国（Ｕ　Ｓ）［株］６２１７１６＠発　明　者　フイシエツテイ、ビン セント　アメエイ　ド、； リカ合衆国、１１５５２　ニューヨーク、ウェスト　ヘンプステッジョーン　コ ート　４４８

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．、　（ａ）連鎖球菌蛋白質の免疫反応性と抗原的決定部位とを有するポリペ ブタイドをコードするＤＮＡ配列を含み、単細胞生物中で複製、転写及び翻訳さ れうる組換えプラスミド金倉む単細胞生物を培養し、（ｂ）かかるポリペブタイ トを培養吻から単離することを含む 連鎖球菌Ｍ又はＭ様蛋白質の免疫反応性と抗原的決定部位とを有するポリペブタ イドの製造法。 ２そのポリペブタイドが免投原住である請求の範囲第１項記載の方法。 ３、そのポリペブタイドが抗原として用いられたとき、オブソニノク抗体を肪出 しうるポリペブタイドである請求の範囲第１項記載の方法。 ４　組換えプラスミドが形質転換により単細胞生物中に導入される請求の範囲第 １項記載の方法。 ５組換えプラスミドが形質導入により単細胞生物に導入される請求の範囲第１項 記載の方法。 ６組換えプラスミドか形質転換により単細胞生物に導入される請求の範囲第１項 記載の方法。 ７Ｍ蛋白質がＡ群連鎖球菌の１員から得られるものである請求の範囲第１項記載 の方法。 ８Ｍ様蛋白質がＧ群連鎖球菌の１員から得られるものである請求の範囲第１項記 載の方法。 ９Ｍ様蛋白質がＧ群連鎖琢凶の１員から得られるものて必る請求の範囲第１項記 載の方法。 １０　単細胞生物が真核生物である請求の範囲第１項記載の方法。 １１　単細胞生物が原核生物である請求の範囲第１項記載の方法。 １２　原核生物が大腸菌である請求の範囲第１１項記載の方法。 １３　連鎖球菌Ｍ蛋白質の免疫反応性と抗原的決定部位とを有するポリペブタイ ドをコードするＤＮ八へ列を含み、単細胞生物中で複製、転写及び翻訳されうる 組換えプラスミドを誘導することからなる゛連鎖球菌Ｍ蛋白質の免疫反応性と抗 原的決定部位とを有するポリペフリイドをコードするＤＮＡ配列を有する単細胞 の製造法。 １４　ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｙｏｇ ｅｎｅｓ　）の免疫反応性と抗原的活性部位とを有するポリペブタイドをコード するストレプトコッカス・ピオゲネスＭ蛋白質又はそのいずれかの一部をコード する精製されたＤＮＡ配列。 １５、Ｍ蛋白質がＡ群連鎖球菌の１負から得られるものである請求の範囲第１４ 項記載の精製されたＤＮＡ配列。 １６、Ｍ様蛋白質がＧ群連鎖球菌の１員から得られるものである請求の範囲第１ ４項記載の精製されたＤＮＡ配列。 １７、　Ｍ様蛋白質がＧ群連鎖球菌の１員から得られるものである請求の範囲第 １４項記載の精製されたＤＮＡ配列。 １８、請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド。 １９　さらにｐ　Ｊ　ＲＳ、４２レプリコンの必須部分を含む請求の範囲第１８ 項記載の組換えプラスミド。 ２０　そのＤＮＡ配列が発現制御要素の制御下にある請求の範囲第１８項記載の 組換えプラスミド。 ２１　ベクターがｐＪＲ８４２、特許請求の範囲第１８項記載の組換えプラスミ ド。 ２２　ベクターがｐＪＲ８４２１３である請求の範囲第１８項記載の組換えブラ スミ゛ド。 ２、特許請求の範囲第１８項記載の組換えプラスミドを含む単細胞生物。 ２、特許請求の範囲第１９須記載の組換えプラスミドを含む単細胞生物。 ２、特許請求の範囲第２０項記載の組換えプラスミドを含む２、特許請求の範囲 第２１項記載の組換えプラスミドを含む単細胞生物。 ２７、請求の範囲第２２項記載の組換えプラスミドを含む単細胞生物。 ２８請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ配列を含む大腸菌（′ＦＪｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）。 ２９梢求の範囲第１８項記載の組換えベクターを含む大腸菌。 ３０、ＮＲＲＬに寄託され、受託番号ＮαＢ　−１，５５３５を付与された請求 の範囲第２６項記載の大腸菌、又はその変異株、組換え体、又はその生体内ある いは試験管・内での遺伝子工学的誘導株。 ３１、ＮＲＲＬに寄託され、受託番号ＮαＢ−１５５２９を付与された請求の範 囲第２７項記載の大腸菌、又はその変異株、組換え体、又はその生体内あるいは 試験管内での遺伝子工学的誘導株。 ３２　請求の範囲第２３項記載の細菌の単細胞生物により生成されるストレプト コッカス・ピオゲネスＭ　蛋白質の免疫反応性と抗原的決定部位とを有するポリ ペブタイド。 ３３　請求の範囲第２９項記載の大腸菌が生成するストレプトコッカス 部位とを有するポリペブタイド。 ３４　請求の範囲第３２項記載のポリペブタイド及びそれに適合しつる薬学的ア ７ユハントとを含櫓するワクチン製剤。 ３５　下記を含んでなる病原性連鎖球体１の含有か疑われる臨床的試料中の病原 性連鎖球菌を検出する方法。 （ａ）相補的配列と交雑せしめつる条件下に該試料の溶菌物とＭ蛋白質遺伝子又 は遺伝子断片のグローブとを接触せしめ、 （ｂ）＝臨床試料溶菌物中の何らかの相補的ヌクレオヂト配列とそのプローブど の間に生じた何らかの交雑を検出する。 ３６　交雑が液体培地中で行われる請求の範囲第３５項記載の方法。 ３７　交雑が固体抗体上で行われる請求の範囲第３５項記載の方法。 ３８　該プローブが放射稼的に標舷される請求の範囲第３５項記載の方法。 ３９　該グローブが生物的に細分され、該交雑が比色定量指示系に結合するアビ ジンを用いて検出される請求の範囲第３５項記載の方法。 ４０、該グローブか生物的に細分され、該交雑かフルオレラセン分子に結合する アビジンを用いで検出される請求の範囲第３５項記載の方法。 ４１、該プローブかＩＶＩ　６蛋白質をコードする遺伝子である請求の範囲第３ ５項記載の方法。 ４２　検出される病原性連鎖球菌がＡ群である請求の範囲第３５項記載の方法。 ４３　検出される病原性連鎖球菌が６群である請求の範囲第３５項記載の方法。 ４４　検出される病原性連鎖球菌がＧ＃である請求の範囲第３５項記載の方法。 ４５、該試料が咽喉洗疎液から採取されて得られる請求の範囲第３５項記載の方 法。 ４６、　Ｍ蛋白質をコートするストレプトコッカス・ピオヶ４５ ネス遺伝子に結合しつる精製されたＤＮＡプローブ。 ４７　該プローブがＮ　Ｒ　Ｒ　Ｌに寄託され、受託番号Ｎｉｌ　Ｂ　−１５５ ２９を付与された大腸菌又はその変異株、組換え体又は生体内又は試験管内での 遺伝子下学的訪゛導株から得られたものである請求の範囲第４６項記載の精製さ れたＤＮＡプローブ。 ４８　該プローブがＮＲＲＬに寄託され、勺託ー笛ー弓Ｎｆｌ　ｆ３　−１、　 ５　５　３　５を付与された大腸菌又はそ７ｊ）変異株、組み換え体、又は生体 内又は試験層内−〔の遺伝イニ「学的誘導株から得られたものである請求の範囲 第４６項記載の精製されたＤＮＡプローブ。 範囲第４６項記載の精製されたＤＮＡプローブ。、５０　該プローブが比色定量 インノケーターに結合−４−ろアビジンと結合するものである請求の範囲第４６ ．１Ｊ′Ｉ記載の精製されたＤＮＡプローブ。 ５１　該プローブかフルオレラセン分子と結合する了七′：５ンと結合するもの である請求の範囲第４６埴ｊ　Ｍｅ　ｎ，１１の精製されたＤＮＡプローブ。 ５２　該プローブが放射性同位元素でｉ＝　ａｙさす＋７．−ものである請求の 範囲第４６項記載の精製さね／こＤＮＡプＣｌ　−