JPH10234388A - 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造 - Google Patents
淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ナイセリア・ゴノロエアエ外層膜タンパク
質をコードするＤＮＡ配列を提供する。 【解決手段】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株のプ
ロテインＩＢの全長のアミノ酸配列をコードする実質的
に精製された核酸分子であって、該アミノ酸配列が図９
に示される核酸分子。
質をコードするＤＮＡ配列を提供する。 【解決手段】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株のプ
ロテインＩＢの全長のアミノ酸配列をコードする実質的
に精製された核酸分子であって、該アミノ酸配列が図９
に示される核酸分子。
Description
１．序 論 現在、淋疾は世界で最も広がった性病の１つであり、米
国では毎年数百万例が発生している。この疾患の病原菌
は淋菌ナイセリア・ゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）であり、この細菌はその歴史
を通して伝統的な抗生物質治療に対する耐性およびある
程度までの正常ヒト血清の抗菌活性に対する耐性の両方
を発達させてきた。伝統的手段による感染の防御が不可
能であるために、この感染を効果的に阻止しうるワクチ
ンの開発が極めて重要となっている。本発明は、特定の
ナイセリア・ゴノロエアエ外層膜タンパク質をコードす
るＤＮＡ配列を提供し、またこの特定ＤＮＡ配列のクロ
ーン化産物は前記ワクチンの適当な主成分を提供する。
また、本発明は淋菌感染を検出するための診断用プロー
ブとして有用な種−特異的オリゴヌクレオチド配列をも
提供する。
国では毎年数百万例が発生している。この疾患の病原菌
は淋菌ナイセリア・ゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）であり、この細菌はその歴史
を通して伝統的な抗生物質治療に対する耐性およびある
程度までの正常ヒト血清の抗菌活性に対する耐性の両方
を発達させてきた。伝統的手段による感染の防御が不可
能であるために、この感染を効果的に阻止しうるワクチ
ンの開発が極めて重要となっている。本発明は、特定の
ナイセリア・ゴノロエアエ外層膜タンパク質をコードす
るＤＮＡ配列を提供し、またこの特定ＤＮＡ配列のクロ
ーン化産物は前記ワクチンの適当な主成分を提供する。
また、本発明は淋菌感染を検出するための診断用プロー
ブとして有用な種−特異的オリゴヌクレオチド配列をも
提供する。
２．発明の背景 脊椎動物における任意の特定の感染因子に対する防御免
疫応答の発生は、初めに宿主免疫系に適当な刺激が与え
られるか否かの如何による。感染性生物自体は一般に、
またはその細胞膜組成の性質によるか、またはそれが宿
主体内に放出する代謝産物により、多数の刺激性化合物
（すなわち、抗原）を提供する。これらの物質（通常、
タンパク質、リポ多糖類、糖タンパクのような比較的大
きい分子）は免疫系によって異物として認識され、そし
て侵入生物を排除または無力にしようとして宿主から１
種またはそれ以上の異なる種類の反応をひき出す。この
抗原は細胞性免疫を与える感作リンパ球（Ｔ細胞）の生
産を惹起しうる。あるいはまた、抗原は遊離抗体の合成
および血液または他の体液中への遊離抗体の放出を刺激
することができる（体液性免疫）。身体の防御免疫応答
の発生はこれらの系の一方または両方の刺激閾値に達す
るか否かの如何によっている。感染に対する一時的免疫
は、多くの場合同種または異種の別の個体から前以て産
生された抗体を与えることによって付与されうる。これ
は受動免疫として知られている。このような免疫の例と
しては、母親の抗体の胎盤移入および母乳を通しての抗
体の移入により胎児や新生児に与えられる防御がある。
その他の例としては、はしか、水ぼうそう、肝炎、天然
痘および破傷風にさらされた際のその作用を阻止もしく
は軽減するためにしばしば用いられるプールされた成人
γ−グロブリンがある。しかしながら、これら獲得抗体
は抗原との相互作用により徐々に利用されるか、または
生体により異化作用を受け、その結果終局的には防御が
失われる。より永続的な形態の防御は能動免疫により与
えられる。ワクチン接種では免疫系に対する一次刺激と
して無害のまたは毒性のない形の抗原（例えば、死滅し
たまたは遺伝学的に変えられた細菌、もしくは細胞壁か
ら単離した糖タンパク）を使用することにより能動防御
免疫が賦与される。これは最高に達しその後減少する抗
体産生においてやや遅い応答を引き起こす。しかしなが
ら、身体は抗原の存在を警戒しており、その次に、恐ら
くは生きた毒性の強い生物にさらされると、より一層速
やかで豊富な抗体産生を伴う二次応答が観察される。こ
の二次応答は一般に微生物が全面的な感染を引き起こす
に足るほどに定着するのを阻止するに十分であろう。ワ
クチンはいろいろな形をとることができ、そのうちのあ
るものは所望の防御効果を賦与するのに他のものよりも
有効てある。歴史的にみると、多くのワクチンは対象の
疾患を起こす微生物を死滅または不活性化し、その死滅
細胞を能動免疫原として用いることにより製造されてき
た。この種のワクチンは腸チフス、コレラおよびポリオ
（ソークワクチン）に対して使用されている。この種の
ワクチンがかかえる問題は、微生物を殺すのに必要な処
理（例えば、ホルムアルデヒド）が往々にして微生物の
有用な抗原を変性または破壊し、従って不完全な弱い免
疫しか得られない場合があるということである。ワクチ
ンの別の形は弱毒化微生物を使用するものである。弱毒
化微生物はまだ生きていて投与後体内で増殖できるが、
無発病性となすために何らかの方法で改変されているも
のであるか、あるいは他の生物には発病力があるがヒト
には無毒の株である。弱毒化生物を使用することの利点
は、弱毒化が通常その抗原性に影響を及ぼさず、従って
免疫系により効果的な刺激を与えることである。はし
か、風疹およびポリオ（セービンワクチン）の弱毒化ワ
クチンが広く用いられている。弱毒化は代表的には微生
物の増殖条件を変えるか、または、最近では微生物の毒
性を遺伝子的に修飾することにより達成される。大体に
おいて、弱毒化ワクチンは死滅ワクチンよりも効果的で
あるが、生存微生物が毒性状態に戻って病気の症状を引
き起こす可能性があるという危険が存在する。微生物全
体使用ワクチンに関連した諸問題のために、近年ではワ
クチン組成物中における活性物質として個々の感染防御
抗原を使用することがより一般的になってきている。感
染防御性応答を刺激する生物の特定抗原の分離および同
定は必ずしも単純ではないが、ひとたび同定されると、
この方法は欠点が付随することのない、微生物全体使用
ワクチンに代わるべき有効な代替物を提供するものであ
る。この目的に使用しうる代表的な抗原の種類の例をあ
げれば、精製された細胞またはカプシド成分、例えばバ
クテリアトキシン（トキソイドを生成させるには解毒さ
れねばならない）、細菌またはウイルスのトキシンサブ
ユニット、細胞壁多糖類、もしくはカプシド糖タンパク
である。これらの成分は免疫性を賦与するのにはしばし
ば非常に効果的であるが、実際の精製の点で困難が生ず
る。対象の抗原を無関係の細胞物質（これらの存在は往
々にして所望免疫生成反応と同時に不利な免疫学的また
は代謝上の応答を引き起こしうる）から多かれ少なかれ
完全に単離することが決定的に重要である。必要とされ
る精製方法はしばしば複雑で、退屈で、しかも費用が莫
大にかかり、その結果を必ずしも完全に予想できるわけ
ではない。この問題は、ある場合には、微生物抗原上の
エピトープに相当する小型ペプチド配列の合成によって
回避できる。いくつかの状況においては、アミノ酸配列
が天然のエピトープ配列に一致するが、そのコンホメー
ションが適切な免疫応答を誘起させるに足るほど親抗原
のそれに類似していないかもしれないという欠点がこの
技術には存在する。これらの種類の前記ワクチンに付随
する欠点の多くは組換えＤＮＡ技術の使用により回避で
きる。重要な微生物抗原の全部または一部をコードする
遺伝子をクローニングすることができれば、実質的に夾
雑するタンパク性または遺伝子物質を含まない比較的大
量の必要な免疫原性物質のより経済的で便利な供給源が
得られる。簡単に説明すると、精製抗原を得るためのこ
の方法は、抗原をコードする特定ＤＮＡ配列をＤＮＡベ
クターに挿入して、宿主細胞内で複製しうる組換えＤＮ
Ａ分子を生成させることを包含する。現在、組換えＤＮ
Ａ分子を作製しうる方法は数多く存在する。より優れた
既知技術の１つは、ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒによっ
て米国特許第４２３７２２４号に開示されたものである
（この特許の教示内容は参照としてここにとり込まれる
ものとする）。この方法では制限酵素および連結反応を
用いて組換えプラスミドを作製し、次に得られたプラス
ミドを単細胞宿主細胞に挿入し、これにより形質転換さ
れた宿主細胞が外来ＤＮＡの複製を開始する。バクテリ
オファージベクターを利用する別法は米国特許第４３０
４８６３号に開示されている（これも参照としてここに
とり込まれる）。クローニング法はすぐに利用できるワ
クチン製造のための経済的で、都合のよい供給源を提供
する可能性が最も大きい。しかしながら、免疫原性をも
つことが知られている抗原の適当な遺伝子を初めに単離
し、その塩基配列を決定し、適切な複製、転写および翻
訳が可能なようにプラスミドに挿入し、その後適合性の
宿主細胞に挿入せねばならない点で困難がないわけでは
ない。もしも遺伝子の転写、ＲＮＡの翻訳、またはポリ
ペプチドの翻訳後プロセッシングおよび区画化のいずれ
か１つが正しく行われないならば、所望の遺伝子産物の
発現が失敗する可能性は非常に大きい。クローン化挿入
物が転写されるためには、宿主ＲＮＡポリメラーゼが認
識できるプロモーターの存在が必要である。適正な翻訳
にはＲＮＡがリボソーム結合部位を有することが必要で
ある。タンパク質の翻訳後修飾にはしばしばタンパク質
を細胞膜を通ってその外へ導く機能をするシグナル配列
の切断が包含される。また、タンパク質の立体配置やア
ミノ酸配列が宿主の細胞内のプロテアーゼの作用から保
護されない場合には、生産された外来タンパク質の宿主
微生物による分解が起こりうる。従って、ナイセリア
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ワクチンを最終的に製造する理
想的な方法であるとは考えられるが、これらの技術が以
前に淋疾のワクチン製造に応用されたことはない。 ２．２．淋菌抗原 ナイセリア・ゴノロエアエのいくつかの抗原は広く研究
され分類されている。例えば、淋菌のピリ（線毛）は分
子量が約２００００のタンパクサブユニットから主に成
っており、抗原性を有することが判明している（Ｂｕｃ
ｈａｎａｎ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２
８９６−２９０９，１９７３）。この物質の合成物はワ
クチンとてし製剤化された（Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ等、Ｐ
ｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ ３３：３１４−３３１，１９
８３）。また、ナイセリア・ゴノロエアエのリポ多糖類
も抗原性があり、β−１，４−結合ガラクトース−グル
コース残基が主要な抗原決定基である。しかしながら、
近年この分野における研究の最大の関心は恐らく、タン
パク質複合体である外層膜タンパク（このタンパク質の
免疫原性における役割はまだ十分に理解されていない）
に集中している。外層膜タンパク質の組成は株によって
やや変化することが知られており、これに基づいて少な
くとも１６種類の異なる血清型が同定されている（Ｊｏ
ｈｎｓｔｏｎ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３：７４１
−７５８，１９７６）。淋菌の膜部分を用いた数多くの
ワクチン組成物が以前に、例えば米国特許第４２０３９
７１号、同第４２８８５５７号および同第４６８１７６
１号に記載されている。しかしながら、これらの組成物
の大部分はタンパク質と他の物質との混合物を含有して
おり、細菌細胞から活性成分を単離および分離するには
かなり手の込んだ精製操作を必要とする。従って、これ
らのワクチンは希望する免疫特異性を有しない可能性が
あり、しかも商業的量のワクチンを製造するためには大
変な量の微生物原料が必要である。 ２．２．１．淋菌プロテインＩ プロテインＩまたはＰＩとして知られる特定の外層膜タ
ンパク質もワクチン組成物主成分として使用可能な候補
者として提案される。ＰＩはポーリン（ｐｏｒｉｎ）と
して機能するナイセリア・ゴノロエアエの主要な外層膜
タンパク質であり（Ｄｏｕｇｌａｓ等、ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ１２：３０５−
３０９，１９８１）、このタンパク質は細胞において低
分子量物質を疎水性脂質外層膜を横切って通過させるよ
うに作用すると考えられている。ＰＩが関心を集める多
くの特徴が存在する：第一に、それがナイセリアの血清
型特異性に少なくとも幾分かは関与しており、比較的少
数の抗原性プロテインＩ血清型が存在する。また、特定
のＰＩ血清型を保有する多数の淋菌が複雑な淋菌感染に
関係している。さらに、それは天然の状態で表面に露出
していると思われ、また、オプソニンの生産を刺激する
と思われる（Ｓａｒａｆｉａｎ等、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｄｉｓ．１４８．１０２５−１０３２，１９８３）。オ
プソニンは感染性微生物の表面に結合して食細胞による
微生物の飲み込みを促進する抗体である。その免疫原性
はワクチン接種マウスにおいてすでに立証されている
（Ｊｉｓ−ｋｏｏｔ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５
４：３３３−３３８，１９８６）。主要な２種類のＰＩ
分子であるＰＩＡおよびＰＩＢ（Ｂａｒｒｅｒａ等、Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４４：５６５−５６８，１９
８４）がペプチドマッピングおよびタンパク質加水分解
に対する感受性に基づいて淋菌において証明されている
（Ｂｌａｋｅ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３３：２
１２−２２２，１９８１）。この分類は血清群パターン
（Ｓａｎｄｓｔｒｕｍ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
３５：２２９−２３９，１９８２；Ｓａｎｄｓｔｒｕｍ
等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３８：４６２−４７
０，１９８２）および病因と関連のあることが分かっ
た。タンパク質ＩＡを発現する淋菌は全身感染に関係し
ており、一方タンパク質ＩＢを発現するものは局所感染
と関係している（Ｂｕｃｈａｎａｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．３２：９８５−９９４，１９８１；Ｈｉｌ
ｄｅｂｒａｎｄｔ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２
０：２６７−２７３，１９７８）。可能性のあるワクチ
ン候補としてのＰＩの開発に払われたあらゆる注意にも
かかわらず、まだＰＩに基づく有効なワクチンはつくら
れていない。さらに、その生産を制御する遺伝子配列も
まだ何ら解明されておらず、このタンパク質の構造につ
いてはほとんど知られていない。本発明は完全なＰＩ遺
伝子配列、ＰＩＡ構造遺伝子、およびクローン化遺伝子
産物について初めて説明するものである。さらに、新規
なＰＩＢ遺伝子配列と、これらの配列から誘導された特
異なＰＩＡ−ＰＩＢキメラについても説明する。後者の
キメラはエピトープマッピングの際に有用であり、ワク
チン開発の基礎となるものである。 ２．３．診断用プローブ この疾患に関して広範囲にゆきわたったもう一つの面は
早期検出および診断の重要性である。淋疾の診断に利用
できる標準的な細菌学的試験法はもちろんあるが、かか
る試験法は培養下のバクテリアの増殖を当てにしてお
り、時間がかかり、しかも一般にあまり特異的でない。
ナイセリア・ゴノロエアエは種々の血清型を有すること
が知られており、このことは前節で説明したように、こ
の疾患の非常に明確なパターンを示すものでありうる。
この疾患の適切な治療を行うためには、診断が迅速であ
るばかりでなく、できるだけ正確であることが決定的に
重要である。ＤＮＡ−およびＲＮＡ−プローブ技術の発
達により、診断における多くのかかる問題に対する解答
が与えられた。ブローブは代表的には対象となる特定遣
伝子の全部または一部と相補性であるＤＮＡまたはＲＮ
Ａの放射性標識された一本鎖であり、従って、相補性核
酸の一本鎖にさらされると、それにハイブリダイズする
であろう。ブローブはサザンブロッティングとして知ら
れる技法で用いられ、その場合対象遺伝子を含有する疑
いのある検体からのＤＮＡ断片をアガロースゲルで分離
し、変性させて一本鎖を生成させ、次にニトロ−セルロ
ースフィルターに移行させる。ここでそれらを予め選択
された標識されたプローブとインキュベートすると、そ
のものは相補鎖にハイブリダイズして、その標識により
目的遺伝子の存在が確認されよう。この種のプローブは
また、宿主細胞中の全ゲノムのＤＮＡ断片をクローニン
グすることにより確立されたゲノムライブラリーから、
対象遺伝子を含有する特定クローンを同定する際にも有
利に使用できる。ナイセリア・ゴノロエアエに関連して
開発された便利で、高度に正確なプローブ系はこれまで
存在していない。
疫応答の発生は、初めに宿主免疫系に適当な刺激が与え
られるか否かの如何による。感染性生物自体は一般に、
またはその細胞膜組成の性質によるか、またはそれが宿
主体内に放出する代謝産物により、多数の刺激性化合物
（すなわち、抗原）を提供する。これらの物質（通常、
タンパク質、リポ多糖類、糖タンパクのような比較的大
きい分子）は免疫系によって異物として認識され、そし
て侵入生物を排除または無力にしようとして宿主から１
種またはそれ以上の異なる種類の反応をひき出す。この
抗原は細胞性免疫を与える感作リンパ球（Ｔ細胞）の生
産を惹起しうる。あるいはまた、抗原は遊離抗体の合成
および血液または他の体液中への遊離抗体の放出を刺激
することができる（体液性免疫）。身体の防御免疫応答
の発生はこれらの系の一方または両方の刺激閾値に達す
るか否かの如何によっている。感染に対する一時的免疫
は、多くの場合同種または異種の別の個体から前以て産
生された抗体を与えることによって付与されうる。これ
は受動免疫として知られている。このような免疫の例と
しては、母親の抗体の胎盤移入および母乳を通しての抗
体の移入により胎児や新生児に与えられる防御がある。
その他の例としては、はしか、水ぼうそう、肝炎、天然
痘および破傷風にさらされた際のその作用を阻止もしく
は軽減するためにしばしば用いられるプールされた成人
γ−グロブリンがある。しかしながら、これら獲得抗体
は抗原との相互作用により徐々に利用されるか、または
生体により異化作用を受け、その結果終局的には防御が
失われる。より永続的な形態の防御は能動免疫により与
えられる。ワクチン接種では免疫系に対する一次刺激と
して無害のまたは毒性のない形の抗原（例えば、死滅し
たまたは遺伝学的に変えられた細菌、もしくは細胞壁か
ら単離した糖タンパク）を使用することにより能動防御
免疫が賦与される。これは最高に達しその後減少する抗
体産生においてやや遅い応答を引き起こす。しかしなが
ら、身体は抗原の存在を警戒しており、その次に、恐ら
くは生きた毒性の強い生物にさらされると、より一層速
やかで豊富な抗体産生を伴う二次応答が観察される。こ
の二次応答は一般に微生物が全面的な感染を引き起こす
に足るほどに定着するのを阻止するに十分であろう。ワ
クチンはいろいろな形をとることができ、そのうちのあ
るものは所望の防御効果を賦与するのに他のものよりも
有効てある。歴史的にみると、多くのワクチンは対象の
疾患を起こす微生物を死滅または不活性化し、その死滅
細胞を能動免疫原として用いることにより製造されてき
た。この種のワクチンは腸チフス、コレラおよびポリオ
（ソークワクチン）に対して使用されている。この種の
ワクチンがかかえる問題は、微生物を殺すのに必要な処
理（例えば、ホルムアルデヒド）が往々にして微生物の
有用な抗原を変性または破壊し、従って不完全な弱い免
疫しか得られない場合があるということである。ワクチ
ンの別の形は弱毒化微生物を使用するものである。弱毒
化微生物はまだ生きていて投与後体内で増殖できるが、
無発病性となすために何らかの方法で改変されているも
のであるか、あるいは他の生物には発病力があるがヒト
には無毒の株である。弱毒化生物を使用することの利点
は、弱毒化が通常その抗原性に影響を及ぼさず、従って
免疫系により効果的な刺激を与えることである。はし
か、風疹およびポリオ（セービンワクチン）の弱毒化ワ
クチンが広く用いられている。弱毒化は代表的には微生
物の増殖条件を変えるか、または、最近では微生物の毒
性を遺伝子的に修飾することにより達成される。大体に
おいて、弱毒化ワクチンは死滅ワクチンよりも効果的で
あるが、生存微生物が毒性状態に戻って病気の症状を引
き起こす可能性があるという危険が存在する。微生物全
体使用ワクチンに関連した諸問題のために、近年ではワ
クチン組成物中における活性物質として個々の感染防御
抗原を使用することがより一般的になってきている。感
染防御性応答を刺激する生物の特定抗原の分離および同
定は必ずしも単純ではないが、ひとたび同定されると、
この方法は欠点が付随することのない、微生物全体使用
ワクチンに代わるべき有効な代替物を提供するものであ
る。この目的に使用しうる代表的な抗原の種類の例をあ
げれば、精製された細胞またはカプシド成分、例えばバ
クテリアトキシン（トキソイドを生成させるには解毒さ
れねばならない）、細菌またはウイルスのトキシンサブ
ユニット、細胞壁多糖類、もしくはカプシド糖タンパク
である。これらの成分は免疫性を賦与するのにはしばし
ば非常に効果的であるが、実際の精製の点で困難が生ず
る。対象の抗原を無関係の細胞物質（これらの存在は往
々にして所望免疫生成反応と同時に不利な免疫学的また
は代謝上の応答を引き起こしうる）から多かれ少なかれ
完全に単離することが決定的に重要である。必要とされ
る精製方法はしばしば複雑で、退屈で、しかも費用が莫
大にかかり、その結果を必ずしも完全に予想できるわけ
ではない。この問題は、ある場合には、微生物抗原上の
エピトープに相当する小型ペプチド配列の合成によって
回避できる。いくつかの状況においては、アミノ酸配列
が天然のエピトープ配列に一致するが、そのコンホメー
ションが適切な免疫応答を誘起させるに足るほど親抗原
のそれに類似していないかもしれないという欠点がこの
技術には存在する。これらの種類の前記ワクチンに付随
する欠点の多くは組換えＤＮＡ技術の使用により回避で
きる。重要な微生物抗原の全部または一部をコードする
遺伝子をクローニングすることができれば、実質的に夾
雑するタンパク性または遺伝子物質を含まない比較的大
量の必要な免疫原性物質のより経済的で便利な供給源が
得られる。簡単に説明すると、精製抗原を得るためのこ
の方法は、抗原をコードする特定ＤＮＡ配列をＤＮＡベ
クターに挿入して、宿主細胞内で複製しうる組換えＤＮ
Ａ分子を生成させることを包含する。現在、組換えＤＮ
Ａ分子を作製しうる方法は数多く存在する。より優れた
既知技術の１つは、ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒによっ
て米国特許第４２３７２２４号に開示されたものである
（この特許の教示内容は参照としてここにとり込まれる
ものとする）。この方法では制限酵素および連結反応を
用いて組換えプラスミドを作製し、次に得られたプラス
ミドを単細胞宿主細胞に挿入し、これにより形質転換さ
れた宿主細胞が外来ＤＮＡの複製を開始する。バクテリ
オファージベクターを利用する別法は米国特許第４３０
４８６３号に開示されている（これも参照としてここに
とり込まれる）。クローニング法はすぐに利用できるワ
クチン製造のための経済的で、都合のよい供給源を提供
する可能性が最も大きい。しかしながら、免疫原性をも
つことが知られている抗原の適当な遺伝子を初めに単離
し、その塩基配列を決定し、適切な複製、転写および翻
訳が可能なようにプラスミドに挿入し、その後適合性の
宿主細胞に挿入せねばならない点で困難がないわけでは
ない。もしも遺伝子の転写、ＲＮＡの翻訳、またはポリ
ペプチドの翻訳後プロセッシングおよび区画化のいずれ
か１つが正しく行われないならば、所望の遺伝子産物の
発現が失敗する可能性は非常に大きい。クローン化挿入
物が転写されるためには、宿主ＲＮＡポリメラーゼが認
識できるプロモーターの存在が必要である。適正な翻訳
にはＲＮＡがリボソーム結合部位を有することが必要で
ある。タンパク質の翻訳後修飾にはしばしばタンパク質
を細胞膜を通ってその外へ導く機能をするシグナル配列
の切断が包含される。また、タンパク質の立体配置やア
ミノ酸配列が宿主の細胞内のプロテアーゼの作用から保
護されない場合には、生産された外来タンパク質の宿主
微生物による分解が起こりうる。従って、ナイセリア
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ワクチンを最終的に製造する理
想的な方法であるとは考えられるが、これらの技術が以
前に淋疾のワクチン製造に応用されたことはない。 ２．２．淋菌抗原 ナイセリア・ゴノロエアエのいくつかの抗原は広く研究
され分類されている。例えば、淋菌のピリ（線毛）は分
子量が約２００００のタンパクサブユニットから主に成
っており、抗原性を有することが判明している（Ｂｕｃ
ｈａｎａｎ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２
８９６−２９０９，１９７３）。この物質の合成物はワ
クチンとてし製剤化された（Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ等、Ｐ
ｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ ３３：３１４−３３１，１９
８３）。また、ナイセリア・ゴノロエアエのリポ多糖類
も抗原性があり、β−１，４−結合ガラクトース−グル
コース残基が主要な抗原決定基である。しかしながら、
近年この分野における研究の最大の関心は恐らく、タン
パク質複合体である外層膜タンパク（このタンパク質の
免疫原性における役割はまだ十分に理解されていない）
に集中している。外層膜タンパク質の組成は株によって
やや変化することが知られており、これに基づいて少な
くとも１６種類の異なる血清型が同定されている（Ｊｏ
ｈｎｓｔｏｎ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３：７４１
−７５８，１９７６）。淋菌の膜部分を用いた数多くの
ワクチン組成物が以前に、例えば米国特許第４２０３９
７１号、同第４２８８５５７号および同第４６８１７６
１号に記載されている。しかしながら、これらの組成物
の大部分はタンパク質と他の物質との混合物を含有して
おり、細菌細胞から活性成分を単離および分離するには
かなり手の込んだ精製操作を必要とする。従って、これ
らのワクチンは希望する免疫特異性を有しない可能性が
あり、しかも商業的量のワクチンを製造するためには大
変な量の微生物原料が必要である。 ２．２．１．淋菌プロテインＩ プロテインＩまたはＰＩとして知られる特定の外層膜タ
ンパク質もワクチン組成物主成分として使用可能な候補
者として提案される。ＰＩはポーリン（ｐｏｒｉｎ）と
して機能するナイセリア・ゴノロエアエの主要な外層膜
タンパク質であり（Ｄｏｕｇｌａｓ等、ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ１２：３０５−
３０９，１９８１）、このタンパク質は細胞において低
分子量物質を疎水性脂質外層膜を横切って通過させるよ
うに作用すると考えられている。ＰＩが関心を集める多
くの特徴が存在する：第一に、それがナイセリアの血清
型特異性に少なくとも幾分かは関与しており、比較的少
数の抗原性プロテインＩ血清型が存在する。また、特定
のＰＩ血清型を保有する多数の淋菌が複雑な淋菌感染に
関係している。さらに、それは天然の状態で表面に露出
していると思われ、また、オプソニンの生産を刺激する
と思われる（Ｓａｒａｆｉａｎ等、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｄｉｓ．１４８．１０２５−１０３２，１９８３）。オ
プソニンは感染性微生物の表面に結合して食細胞による
微生物の飲み込みを促進する抗体である。その免疫原性
はワクチン接種マウスにおいてすでに立証されている
（Ｊｉｓ−ｋｏｏｔ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５
４：３３３−３３８，１９８６）。主要な２種類のＰＩ
分子であるＰＩＡおよびＰＩＢ（Ｂａｒｒｅｒａ等、Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４４：５６５−５６８，１９
８４）がペプチドマッピングおよびタンパク質加水分解
に対する感受性に基づいて淋菌において証明されている
（Ｂｌａｋｅ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３３：２
１２−２２２，１９８１）。この分類は血清群パターン
（Ｓａｎｄｓｔｒｕｍ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
３５：２２９−２３９，１９８２；Ｓａｎｄｓｔｒｕｍ
等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３８：４６２−４７
０，１９８２）および病因と関連のあることが分かっ
た。タンパク質ＩＡを発現する淋菌は全身感染に関係し
ており、一方タンパク質ＩＢを発現するものは局所感染
と関係している（Ｂｕｃｈａｎａｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．３２：９８５−９９４，１９８１；Ｈｉｌ
ｄｅｂｒａｎｄｔ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２
０：２６７−２７３，１９７８）。可能性のあるワクチ
ン候補としてのＰＩの開発に払われたあらゆる注意にも
かかわらず、まだＰＩに基づく有効なワクチンはつくら
れていない。さらに、その生産を制御する遺伝子配列も
まだ何ら解明されておらず、このタンパク質の構造につ
いてはほとんど知られていない。本発明は完全なＰＩ遺
伝子配列、ＰＩＡ構造遺伝子、およびクローン化遺伝子
産物について初めて説明するものである。さらに、新規
なＰＩＢ遺伝子配列と、これらの配列から誘導された特
異なＰＩＡ−ＰＩＢキメラについても説明する。後者の
キメラはエピトープマッピングの際に有用であり、ワク
チン開発の基礎となるものである。 ２．３．診断用プローブ この疾患に関して広範囲にゆきわたったもう一つの面は
早期検出および診断の重要性である。淋疾の診断に利用
できる標準的な細菌学的試験法はもちろんあるが、かか
る試験法は培養下のバクテリアの増殖を当てにしてお
り、時間がかかり、しかも一般にあまり特異的でない。
ナイセリア・ゴノロエアエは種々の血清型を有すること
が知られており、このことは前節で説明したように、こ
の疾患の非常に明確なパターンを示すものでありうる。
この疾患の適切な治療を行うためには、診断が迅速であ
るばかりでなく、できるだけ正確であることが決定的に
重要である。ＤＮＡ−およびＲＮＡ−プローブ技術の発
達により、診断における多くのかかる問題に対する解答
が与えられた。ブローブは代表的には対象となる特定遣
伝子の全部または一部と相補性であるＤＮＡまたはＲＮ
Ａの放射性標識された一本鎖であり、従って、相補性核
酸の一本鎖にさらされると、それにハイブリダイズする
であろう。ブローブはサザンブロッティングとして知ら
れる技法で用いられ、その場合対象遺伝子を含有する疑
いのある検体からのＤＮＡ断片をアガロースゲルで分離
し、変性させて一本鎖を生成させ、次にニトロ−セルロ
ースフィルターに移行させる。ここでそれらを予め選択
された標識されたプローブとインキュベートすると、そ
のものは相補鎖にハイブリダイズして、その標識により
目的遺伝子の存在が確認されよう。この種のプローブは
また、宿主細胞中の全ゲノムのＤＮＡ断片をクローニン
グすることにより確立されたゲノムライブラリーから、
対象遺伝子を含有する特定クローンを同定する際にも有
利に使用できる。ナイセリア・ゴノロエアエに関連して
開発された便利で、高度に正確なプローブ系はこれまで
存在していない。
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｎ．ゴノロ
エアエの数種類のオリゴヌクレオチドプローブを提供す
ることを目的とする。それらのうちのあるものは一般に
Ｎ．ゴノロエアエのプロテインＩにハイブリダイズする
が、他のバクテリアにはハイブリダイズせず、そして他
のものはＰＩＡ抗原のみを発現するＮ．ゴノロエアエ血
清型に特異的である。こうして、淋菌感染を検出するた
めの信頼できる診断方法が提供されるばかりでなく、個
人が感染している可能性のある特定のカテゴリーの確認
方法も提供される。それらの方法を提供することも本発
明の目的である。
エアエの数種類のオリゴヌクレオチドプローブを提供す
ることを目的とする。それらのうちのあるものは一般に
Ｎ．ゴノロエアエのプロテインＩにハイブリダイズする
が、他のバクテリアにはハイブリダイズせず、そして他
のものはＰＩＡ抗原のみを発現するＮ．ゴノロエアエ血
清型に特異的である。こうして、淋菌感染を検出するた
めの信頼できる診断方法が提供されるばかりでなく、個
人が感染している可能性のある特定のカテゴリーの確認
方法も提供される。それらの方法を提供することも本発
明の目的である。
３．発明の要約 ナイセリア・ゴノロエアエのプロテインＩＡおよびプロ
テインＩＢの完全なヌクレオチド配列、並びにそれらの
予測されるアミノ酸配列が開示される。また、単細胞宿
主生物中でＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子をクローニングし
て発現させるための、並びにＰＩＡ−ＰＩＢキメラタン
パク質産物をクローニングして発現させるための方法お
よび組成物も開示される。さらに、新規な宿主生物を培
養して遺伝子産物を生産させる方法も開示される。用い
られた組換えＤＮＡ法の生産物は、淋疾を予防するため
のワクチン組成物において免疫原として全体または抗原
部分を使用するのに適している。ＰＩＡおよびＰＩＢ遺
伝子は新規なオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ断片
とのハイブリダイゼーションにより細菌ゲノムから単離
された。一旦特定のＤＮＡセグメントがつきとめられた
らそのヌクレオチド配列を決定しそしてアミノ酸配列が
予測された。次にそれぞれの遺伝子を、その遺伝子の複
製単位として作用するプラスミドクローニングベクター
に挿入した。次にこの組換えプラスミドを用いて適合性
宿主細胞を形質転換し、それにより遺伝子産物が発現さ
れる。また、発現された産物の単離方法およびワクチン
組成物への各産物の製剤化法もここに開示される。特
に、ハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を包含する
ワクチン組成物が提唱される。さらに、ＰＩＡおよびＰ
ＩＢ遺伝子のヌクレオチド配列の決定に基づいて、本発
明は淋菌感染の検出および診断に有用なオリゴヌクレオ
チドプローブの配列をも提供するものである。これに関
して、本発明はまた、ここに記載のオリゴヌクレオチド
プローブの１種またはそれ以上を含有する診断試験キッ
トをも提供する。 ４．図面の説明 第１図：Ｒ１０株のＰＩの残基１−１２のアミノ酸配
列、縮重塩基を含むコード化ｍＲＮＡ、および合成され
たオリゴヌクレオチド。縮重が存在する場合は、塩基配
列の決定がなされた他の淋菌遺伝子からのコドン利用デ
ータに基づいて塩基配列を選択した。 第２図：ＰＩ遺伝子部分を含むＦＡ１９ゲノムＤＮＡの
Ｓａｕ３ＡＩおよびＴａｑＩ断片。この断片をベクター
プラスミドｐＧＥＭ−２にクローン化して、ここに示す
名称の組換えプラスミドを得た。ゲノム上のＰＩコード
領域の相対的な位置は断片の上の空白ボックスで示し
（斜線ボックスはＮ末端シグナル配列に相当する）、オ
リゴヌクレオチドプローブの相対的位置を断片の下に示
す。 第３図：ＦＡ１９のＰＩ遺伝子のＤＮＡ配列。予測され
るアミノ酸配列をＤＮＡ配列の上に示し、そしてリボソ
ーム結合部位（ＲＢＳ）、およびｐＵＮＣ７の作製に用
いられるＴａｑＩおよびＳａｕ３ＡＩ部位、およびＨａ
ｅＩＩＩ部位（−３５および−１０）が示される。各行
の最後の塩基の番号を右側に示す。 第４図：Ｎ．ゴノロエアエの主要な外層膜タンパク質、
ＰＩ、ＰＩＩおよびＰＩＩＩ、並びに大腸菌ポーリンＯ
ｍｐＦおよびＯｍｐＣのハイドロパシー（ｈｙｄｒｏｐ
ａｔｈｙ）パターン；ｓｐ−シグナルペプチド；ａ．
ａ．−アミノ酸残基。 第５図：ｐＵＮＣ７の作製工程図。ＰＩ遺伝子プロモー
ターの−３５および−１０領域間の好都合なＨａｅＩＩ
Ｉ部位により−３５領域および上流配列を除去でき、次
にＰＩ遺伝子をファージＴ７プロモーターの制御下にベ
クタープラスミドｐＧＥＭ−２に挿入した。太い線はｐ
ＧＥＭ−２ＤＮＡを、そして細い線はＦＡ１９ＤＮＡを
表す。ＰＩ’−ＰＩ遺伝子部分（点線はこの遺伝子の欠
失セグメントの方向を示す）；ＰＴ７−ファージＴ７プ
ロモーター；ＭＣＳ−多重クローニング部位；制限酵素
部位：Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ、Ｈ−ＨａｅＩＩＩ、Ｂ−Ｂａ
ｍＨＩ、（Ｈ）−ＨａｅＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩ接合点
（部位は存在せず）、Ｔ−ＴａｑＩ。 第６図：ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるｐＵＮＣ７上のＰ
Ｉ遺伝子の発現。Ａ：全細胞溶解物の１５％ゲル上にお
けるＮａＤｏｄＳＯ４−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、クーマシーブルーで染色。マーカータンパク質の寸
法を左側に示す。ＰＩが示されており、そして中央の矢
印はレーン４では明らかに失われているタンパク質を示
す。 Ｂ：６種類のＰＩＡ ＭＡｂを用いて検索したＡにおけ
るゲルのウエスターンブロットのオートラジオグラフ。
レーン１：ＦＡ１９；レーン２：ＩＰＴＧなしで１６時
間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レーン
３：ＩＰＴＧを用いて３時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＵＮＣ７；レーン４：ＩＰＴＧを用いて１６時間
増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レーン５：
ＩＰＴＧなしで１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）
ｐＧＥＭ−２；レーン６：ＩＰＴＧを用いて１６時間増
殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２。 第７図：ＦＡ１９のＰＩ構造遺伝子に隣接したｍＴｎ３
− 表す。ｍＴｎ３−ＣＡＴは長さが１．６６ｋｂであり、
尺度に応じて描かれていない。ＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１
のゲノム上のＰＩ遺伝子の位置は線上の空白ボックスで
示され、斜線ボックスはシグナル配列を示す。ＰＩ’：
クローン化構築物中に存在するＰＩ遺伝子部分。制限酵
素部位：Ｎ−ＮｏｔＩ；Ｂ−ＢａｍＨＩ；Ｓ−Ｓａｕ３
ＡＩ。 第８図：ＰＩ遺伝子の配列決定のためにクローン化した
ＭＳ１１ ＤＮＡの断片。ＰＩ遺伝子の位置は線上の空
白ボックスで示され、斜線ボックスはシグナル配列を示
す。オリゴヌクレオチドＮＣ１およびＮＣ１２の配列の
位置が示してある。大きい方の断片はベクタープラスミ
ドｐＧＥＭ−３にクローン化され、小さい方の断片はλ
ｇｔ１１中にクローン化して、表示した名称の構築物と
なした。制限酵素部位：Ｈｆ−ＨｉｎｆＩ；Ｋ−Ｋｐｎ
Ｉ；Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ；Ｈｃ−ＨｉｎｃＩＩ。 第９図；ＭＳ１１のＰＩＢ遺伝子のＤＮＡ配列。予測さ
れるアミノ酸配列はＤＮＡ配列の上に示してあり、シグ
ナルペプチドも示される。推定ブロモーター配列（−３
５および−１０）およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）
も示され、関連する制限酵素部位も同様に示される。各
行の最後の塩基の番号を右側に示す。Ｒ１０のＰＩＢ配
列（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ等、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
４：８１３５−８１３９，１９８７）との相違を示すた
めに、塩基（制限酵素部位を構成するものを除く）には
下線が引いてあり、アミノ酸は丸で囲ってある。 第１０図：ＦＡ１９ ＰＩＡおよびＭＳ１１ ＰＩＢの
アミノ酸配列の比較、並びにハイブリッドＰＩ遺伝子の
構造。ＰＩＡ遺伝子配列は白の捧で、そしてＰＩＢは黒
の棒で示す。ＰＩ遺伝子類の上と下はアミノ酸配列の比
較であり、垂直線は１個の相違に相当し、黒のブロック
は連続して広がった相違に相当する。アミノ酸残基の数
は上の目盛で示され、そして塩基対の数は下の目盛で示
される。ハイブリッドを分析するのに使用されたオリゴ
ヌクレオチドはこれらの遺伝子の間に示してあり、点線
は他の遺伝子上の等しい位置を示す。ハイブリッド遺伝
子構造（クラス１−９）を下に示し、交差が起こったオ
リゴヌクレオチド配列間の領域を傾斜域で表す。種々の
ハイブリッドクラスのＰＩ血清型を第１表に示す。 第１１図：全細胞溶解物の１５％ゲル上でのＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシーブルー
染色を用いて検出した、ＢＬ２１（ＤＥ３）中における
ｐＵＮＣＨ２５上のＰＩＢ遺伝子の発現。ＰＩタンパク
質バンドが示してある。レーン１：ＭＳ１１；レーン
２：ＩＰＴＧなしで増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵ
ＮＣＨ２５；レーン３−５：ＩＰＴＧを用いて増殖させ
たＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣＨ２５。ＩＰＴＧ（５０
μｇ／ｍｌ）は下記細胞密度すなわちレーン３：５×１
０８細胞／ｍｌ；レーン４：１０９細胞／ｍｌ；レーン
５：２×１０９細胞／ｍｌで増殖培地に加えた。ＰＩの
発現は生長周期の早期に培養物が誘導された場合に最大
である。 ５．発明の説明 本発明は、淋疾感染予防用のワクチン組成物の製造に有
用なＮ．ゴノロエアエＰＩＡ、ＰＩＢ、およびキメラＰ
ＩＡ／ＰＩＢタンパク質の使用に関する。これらのタン
パク質は組換えＤＮＡ技術または化学的合成法により製
造できる。以前には適当なＮ．ゴノロエアエ株からの化
学的単離法を使用することが可能であったが、この方法
はワクチン接種後に阻止（抗防御）抗体を惹起するある
種の他の淋菌タンパク質による汚染を生じうる。ＰＩタ
ンパク質は抗体の生成を刺激することが知られているの
で、Ｎ．ゴノロエアエによる感染から被接種者を効果的
に防御する免疫原として、そのタンパク質全体またはそ
の免疫原部分を使用することができる。ここに記載の組
換えプラスミドにより、安定で宿主細胞による分解に対
し抵抗性を有する大量のＰＩタンパク質を宿主細胞中に
産生させることができ、その結果ワクチン組成物に適す
る物質の豊富な供給原が得られる。このワクチン製剤は
他の抗防御性淋菌タンパク質による汚染がない。本発明
を説明するために、本発明にいくつかの工程に分けて以
下に論ずる、すなわち：１）ＰＩＡ遺伝子または遺伝子
断片の同定および単離；２）適合性宿主細胞の形質転換
に用いられる適当なクローニングベクターへの遺伝子ま
たは遺伝子断片の挿入；３）その遺伝子を複製させ発現
させる形質転換宿主細胞の同定および増殖；および４）
遺伝子生産物の同定および精製。本発明によれば、ＰＩ
タンパク質は第３図または第９図のクローン化配列、も
しくはそのハイブリッドを適切なクローニング／発現ベ
クターに挿入し、適当な宿主細胞を形質転換し、次に遺
伝子産物を同定および精製することにより生産されるう
る。あるいはまた、第３図または第９図の推定アミノ酸
配列部分、またはそのハイブリッドは当分野でよく知ら
れた化学的合成技術を用いて合成することもできる。ま
た、ＰＩＡおよびＰＩＢ配列に基づくオリゴヌクレオチ
ドもここに開示され、これらのオリゴヌクレオチドはサ
ザンブロット、ドットブロット、スロットブロットなど
のハイブリダイゼーションの技術によるＮ．ゴノロエア
エ感染の確認および診断に有用である。 ５．１．ＰＩＡ遺伝子の同定、単離、および配列決定 ＰＩＡタンパク質のヌクレオチドコード配列は第３図に
示される。すでに述べたように、ＰＩＡタンパク質はす
べてのＮ．ゴノロエアエによって生産されるわけではな
い；任意の所定の株はＰＩＡまたはＰＩＢのいずれかを
生産するが両方は生産しないであろう。ＰＩＡの存在は
淋菌血清群Ｉ、血清型Ｉ−３、と関係があり、従って血
清型１−３と関連のある淋菌株はどれもＰＩＡ ＤＮＡ
源として使用できる。既知のＮ．ゴノロエアエ株の中
で、ＰＩＡにより特徴づけられる株はＦＡ１９、ＦＡ１
３０、Ｗ−Ｕｅ、Ｂ−２、Ｇ−７、５０２９、Ｒ−１
１、Ｅ−５、Ｄ−４、Ｖ−１５である（Ｋｎａｐｐ等、
Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１５０：４４−４８，１９８
４）。本発明の実施において、第３図に示す配列は種々
の方法で得ることができる。例えば、ひとたび適当なＰ
ＩＡ含有株が定められたら、その生物のＤＮＡを単離
し、ＤＮＡ断片を生成させ、そしてＰＩＡ遺伝子配列を
含有する断片を同定することが必要である。あるいはま
た、その遺伝子または遺伝子セグメントは合成すること
ができよう。Ｎ．ゴノロエアエＤＮＡは多くの異なる方
法で断片化しうる；最も好ましい方法はＤＮＡを特定の
配列で切断する制限酵素での処理である。その他の方法
にはマグネシウムの存在下でのＤＮａｓｅによるＤＮＡ
の処理、または音波処理のような物理的破壊が含まれ
る。制限酵素を用いる場合、ＤＮＡを処理するのに１種
類の酵素または酵素類の組合せを用いることができる。
唯一の必要条件は、核酸の消化がＰＩＡの抗原部位をコ
ードする領域を破壊しないということである。断片化
後、線状ＤＮＡの個々の断片を、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＰＡＧＥ）、アガロースゲル、またはカラ
ムクロマトグラフィーのような多数の既知技法の任意の
ものを用いて、大きさに基づいて分離する。分離した断
片によりプラスミド作製および形質転換のための遺伝子
物質が提供される。対象となる遺伝子配列を含有するＤ
ＮＡ断片の同定は多くの方法により達成できる。例え
ば、モノクローナル抗体のような免疫試薬が使用されう
る。ＰＩＡに対するモノクローナル抗体は数多く誘導さ
れており（Ｔａｍ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．３
６：１０４２−１０５３，１９８２）、そしてこれらは
種々のＤＮＡ断片により形質転換されたそれぞれの宿主
細胞から生産された産物を検査するのに使用されうる、
すなわちＰＩＡモノクローナル抗体と反応する産物によ
り、ＰＩ遺伝子を含有する断片で形質転換された細胞が
同定される。また、ＤＮＡ断片の塩基配列決定によりそ
れぞれのアミノ酸配列を予測でき、次に既知の任意の部
分アミノ酸配列と比較して、相当するＤＮＡ配列を含有
する断片を同定することができる。もう１つの一般的技
法はサザンブロッティングである（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７８：５０３，１９７５）。この
方法では、制限断片をゲル上の適所で変性し、そしてブ
ロッティングにより固形基質代表的にはニトロセルロー
スフィルターに移す。次に、フィルターをこのタンパク
質の既知のまたは仮定した部分ＤＮＡ配列を含有する放
射性標識オリゴヌクレオチドにさらす。選択されたオリ
ゴヌクレオチドと相補性であるブロットされたＤＮＡが
それにハイブリダイズしてそれによりＰＩ遺伝子を含有
するＤＮＡ断片の大きさが確認されよう。以下に詳述す
る実施例において、ＰＩＡをコードする遺伝子は２種の
新規なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
により同定および単離された。ＰＩＢのＮ末端アミノ酸
部分の既知配列（Ｂｌａｋｅ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．３６：２７７−２８５，１９８２；Ｂｌａｋｅ，
Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，
Ｇ．Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ編、２５１−２５８，１９８
５，ＡＳＭ）、および既知ＤＮＡ配列を有する種々の他
の淋菌タンパク質に伴うコドン使用規則に基づいて、有
用なオリゴヌクレオチドを推定する試みがなされた。特
に、次のようなＮＣ１およびＮＣ２と呼ばれる２つの配
列が作製された： サザンブロットハイブリダイゼーションで用いられる場
合、上記のオリゴマーは淋菌ゲノムから得られたＤＮＡ
制限断片をスクリーニングするのに使用された；両方の
プローブともＰＩＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を同定
することに成功した。同定された遺伝子がＰＩＡ遺伝子
であることの証明は、遺伝子産物の分子量と天然タンパ
ク質の分子量との比較、およびＰＩＡ特異的モノクロー
ナル抗体のその免疫反応性により行われた。しかしなが
ら、この有用性のほかに、これらのオリゴヌクレオチド
はそれぞれ淋菌のＰＩＡおよびＰＩＢ株の両方とハイブ
リダイズしうることも確認された。従って、これらの正
常な化合物は悩める個体のＮ．ゴノロエアエ感染の検出
および同定に、サザンブロットハイブリダイゼーション
において診断用プローブとして使用することもできる。
ＰＡ遺伝子を含有する断片の同定に続いて Ｓａｎｇｅ
ｒ（ＰＮＡＳ ＵＳＡ７４：５４６３−５４６７，１９
７７）の方法に従って関連部分の塩基配列が決定され
る。Ｓａｎｇｅｒの方法はＤＮＡ鋳型からの相補性ＤＮ
Ａ鎖の酵素による合成を利用するものである。相補鎖の
合成はデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）の取込みに
より停止される。４つの別々の反応（それぞれｄｄＡＴ
Ｐ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、またはｄｄＴＴＰを含
有）が行われ、その結果４組のＤＮＡ断片が形成され、
所定の組の各断片はその末端に特定のジデオキシヌクレ
オチドをもつであろう。次にＤＮＡ断片をポリアクリル
アミドゲル上で分離し、各断片の末端ヌクレオチドの同
一性の知識よりその塩基配列を決定しそして最短断片か
ら最長断片までを読み取る。鋳型として用いられる一本
鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで化学
的に処理すると得られる。しかしながら、Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３０
９，１９８１）がクローニングベクターとして開発した
Ｍ１３ｍｐクローニングベクターを使用することがより
効果的である。Ｍ１３は一本（＋）鎖ＤＮＡを含有する
大腸菌の雄菌特異的線維状バクテリオファージである。
この（＋）鎖は相補性（−）鎖合成用の鋳型として使用
される。二本鎖型のＤＮＡが複製型すなわちＲＦ型であ
り、細胞あたり約２００コピーに増殖する。この二本鎖
型を細胞から分離してクローニングベクターとして使用
できる。いったん増殖が止まると、２本の鎖のうち一方
のみが産生され続け、そして一本鎖がファージ粒子に組
み込まれる。Ｍ１３の利点は、粒子がクローン化した鎖
の一方に相同な一本鎖ＤＮＡを有しており、それ故にＳ
ａｎｇｅｒ法における鋳型として使用できる点にある。
３５０塩基までの塩基配列を単一クローンから決定で
き、これよりも長い断片の塩基配列決定は重複する断片
の塩基配列を解析することにより達成できる。前記技法
を使用するすることにより、第３図に示したＰＩＡ遺伝
子のヌクレオチド配列が得られた。第３図には推定アミ
ノ酸配列も示してある。ＰＩＡ遺伝子の塩基配列決定
（重複する断片の塩基配列を別々に決定することにより
達成された）によりさらに２つの他のオリゴヌクレオチ
ドプローブの同定および作製ができた。両プローブは次
の配列を有する１７ヌクレオチドオリゴマーである： ＮＣ８：５’ＧＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣ３’ および ＮＣ１１：５’ＣＧＧＴＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＣ
３’ これらのプローブは両方ともＰＩＡ遺伝子のみに特異的
であって、ＰＩＢ ＤＮＡ配列にはハイブリダイズしな
い。従って、これらのプローブは共に感染にＰＩＡ生物
によるか、ＰＩＢ生物によるのかを判断する診断試験に
おいて有用である。先に述べたように、これらのタンパ
ク質の各々は全身的かまたは局所的の淋菌感染の特定パ
ターンを示し、従って感染患者の治療プログラムを計画
する上で非常に重要でありうる。単離した遺伝子または
化学的に合成したＤＮＡ配列は形質転換宿主細胞の増
殖、形質転換細胞からの組換えＤＮＡの単離、および単
離した組換えＤＮＡからの挿入遺伝子の回収により、さ
らに遺伝子コピーを生成されるのに使用されうる。 ５．２．ＰＩＢ遺伝子の同定、単離および配列決定 ＰＩＢタンパク質のヌクレオチド配列を第９図に示す。
この配列はＮ．ゴノロエアエＭＳ１１株から単離され
た。ＰＩＢの存在は血清群４−９と関係しており、これ
らの血清群と関連した株はどれもＰＩＢ ＤＮＡの供給
源として使用できる。既知の淋菌株中で、ＰＩＢの存在
により特徴づけられる株はＭＳ１１、ＦＡ６１４０、Ｆ
６２およびＲ１０である。ＰＩＢタンパク質の調製、同
定、および配列決定の技術は前記５．１節で説明したＰ
ＩＡタンパク質に適用した手法と実質的に同じである。
ＰＩＢ遺伝子の詳細な同定は、ＮＣ１およびＮＣ１２プ
ローブ（５’−ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＴＣ−
３’）の使用、並びにハイブリッドＰＩタンパク質のＰ
ＩＢ部分にあるＫｐｎＩ制限部位の同定（Ｄａｎｉｅｌ
ｓｓｏｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９
−５３３，１９８６）により助けられた。ＰＩＡと同様
にこの遺伝子のクローニングはクローニングベクターに
重複配列を別々にクローニングすることにより達成され
た。 ５．３．組換えＤＮＡ技術によるＰＩＡ、ＰＩＢまたは
ＰＩＡ／ＰＩＢハイブリッドの生成 ＰＩＡのヌクレオチドコード配列を第３図に示す。ＰＩ
Ｂのヌクレオチドコード配列を第９図に示す。本発明の
実施において、ヌクレオチド配列またはその機能上の同
等物がＰＩＡまたはＰＩＢ生成物の発現を指示する組換
え分子中に組み込まれる。また、第３図および第９図か
ら誘導されたハイブリッド配列を作製してハイブリッド
ＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を生産させることもできる。
ヌクレオチドコード配列の縮重ゆえに、第３図または第
９図に示したと実質的に同じアミノ酸配列をコードする
他のＤＮＡ配列も、ＰＩＡまたはＰＩＢをクローニング
および発現させるために本発明の実施においてそれぞれ
使用することができる。第３図または第９図のヌクレオ
チド配列のかかる変更には種々のヌクレオチド残基の欠
失、付加または置換が包含され、同一のまたは機能的に
等価の遺伝子生成物をコードする配列が生成される。そ
の遺伝子産物はアミノ酸残基の欠失、付加または置換を
含有できる。置換は関与する残基の極性、電荷、溶解
度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に
基づいて行われうる。例えば、負に荷電したアミノ酸に
はアスパラギン酸およびグルタミン酸が包含され、正に
荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが包含さ
れる。同様の親水値を有する非荷電極性ヘッド基または
非極性ヘッド基をもつアミノ酸には次のものが包含され
る、すなわちロイシン、イソロイシン、バリン；グリシ
ン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、ト
レオニン；フェニルアラニン、チロシン。 ５．３．１．ＰＩ遺伝子クローニング／発現ベクターの
作製 第３図に示すＰＩＡ遺伝子配列、第９図に示すＰＩＢ遺
伝子配列、およびハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢ配列、も
しくはこれらの機能的同等物は適当なクローニング発現
ベクターに挿入できる。終局的に挿入遺伝子の転写およ
び翻訳を達成するためには、その遺伝子は選ばれた宿主
細胞と適合するプロモーターの制御下に置かねばならな
い。プロモーターとはＲＮＡポリメラーゼが結合して転
写を開始するＤＮＡの領域である。選ばれるプロモータ
ーは宿主細胞生物から単離されたいずれのものでもよ
い。例えば、宿主系として通常用いられる大腸菌は菌そ
れ自体と、またはそのバクテリオファージと、もしくは
そのプラスミドと関連した、ｌａｃまたはｒｅｃＡプロ
モーターのような多数のプロモーターを有する。またラ
ムダファージＰＬおよびＰＲプロモーターのような、合
成的にまたは組換えにより作られたプロモーターを使用
して、それに隣接するＤＮＡセグメントの高レベル生産
を誘導することもできる。遺伝子を効率よく転写および
翻訳させるには、開始シグナルも必要である。例えば大
腸菌のｍＲＮＡでは、リボソーム結合物には翻訳開始コ
ドン（ＡＵＧまたはＧＵＧ）および１６ＳリボソームＲ
ＮＡの３’末端の塩基と相補性であるもう１つの配列が
包含される。後者の配列（シャイン−ダルガルノまたは
Ｓ−Ｄ配列）のいくつかは大腸菌や他の適当な種類の宿
主細胞において確認されている。宿主細胞系と適合しう
る任意のＳＤ−ＡＴＧ配列が使用できる。これらには大
腸菌ファージラムダのｃｒｏ遺伝子またはＮ遺伝子、あ
るいは大腸菌のトリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢまたはＡ
遺伝子が含まれるが、それらに限定されるわけではな
い。インビトロでＤＮＡ断片をクローニングベクターに
挿入する方法は数多く存在する。ＤＮＡリガーゼは二重
ＤＮＡ鎖中の隣接ヌクレオチド間の一本鎖ニックを閉じ
る酵素である；従って、この酵素はある種の制限酵素に
より生成された付着末端同士を共有結合で連結させるの
に使用することができる。また、ＤＮＡリガーゼを使用
して平滑末端間のホスホジエステル結合の形成を触媒す
ることもできる。最後に、酵素ターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼを用いて断片の末端で
３’ホモポリマー一本鎖尾部を形成させることができ
る。すなわち第一の分子の３’末端にオリゴ（ｄＡ）配
列を、そして第二の分子の３’末端にオリゴ（ｄＴ）配
列を付加することにより、２種類の分子がアニーリング
して環状ダイマーを形成させることができる。これらの
方法のどれを使っても、遺伝子セグメントプロモーター
および他の制御エレメントをベクターの特定部位に連結
することが可能である。こうして、ＰＩタンパク質をコ
ードする遺伝子がベクタープロモーターおよび制御エレ
メントに対して特別の関係で所定のベクターに連結さ
れ、その結果前記配列はベクターＡＴＧ配列に関して正
しい読み枠で挿入される。使用されるベクターは形質転
換細胞を同定しうるよう代表的にはアンピシリン耐性ま
たはテトラサイクリン耐性のようなマーカー機能を有し
ていよう。使用するベクターは既知の発現ベクターまた
はそれらの誘導体のいずれであってもよい。最も頻繁に
用いられるベクターはプラスミドベクター（例．ｐＢＲ
３２２、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５、ｐＡＣＹＣ１７７、
ｐＫＨ４７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＢ１１０、ｐｍＢ
９、ｐＢＲ３２５、Ｃｏｌ Ｅｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＢ
Ｒ３１３、ｐＭＬ２１、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ１また
はＲＰ４）；バクテリオファージベクター（例．ラムダ
ｇｔ１１、ラムダｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、Ｃｈａｒｏ
ｎ２８、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、ラムダｇｔ−１−ラムダＢ
Ｃ、ラムダ−ｇｔ−１−ラムダＢ、Ｍ１３ｍｐ７、Ｍ１
３ｍｐ８、Ｍ１３ｍｐ９）；ＳＶ４０およびアデノウイ
ルスベクター、並びに酵母ベクターである。 ５．４．ＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子生成物の同定および
精製 先に述べたように、ＰＩＡおよびＰＩＢをコードする遺
伝子セグメントは本来は上記の新規なオリゴヌクレオチ
ド配列とのハイブリダイゼーションにより同定された。
選択された断片がＰＩＡをコードする構造遺伝子である
という同一性は、天然ＰＩＡとの分子量比較により、お
よびコロニーラジオイムノアッセイで試験された６種類
すべてのＰＩＡモノクローナル抗体との反応性により証
明された。ＰＩＢ生成物の同一性もＰＩＢ特異的モノク
ローナル抗体との反応により証明された。クローン化Ｐ
ＩＡまたはＰＩＢ遺伝子を発現する大腸菌宿主細胞は、
適切なモノクローナル抗体と反応するＰＩタンパク質を
豊富に産生する。ＰＩＡタンパク質の精製操作はＴｅｅ
ｒｌｉｎｋ等（Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａ，Ｇ．Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ編、２５９−２
６４，１９８５，ＡＳＭ）に詳細に記載されている。 ５．５．ＰＩＡ／Ｂハイブリッドの作製 本発明に関連して、多数のハイブリッドＰＩＡ／Ｂ遺伝
子配列およびタンパク質が作られた。ハイブリッド遺伝
子はＳｅｉｆｅｒｔ等（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉ−ｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．８，ｐ．１２３−１３４，Ｓｅｔｔ
ｉｎ等編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ ８３：７３５−７３９，１９８６）に従
って改良されたシャトル突然変異誘発法を用いて、ＰＩ
Ａ産生株にＰＩ遺伝子に隣接して選択マーカーを挿入す
ることにより作製された。この場合、選択マーカーは選
択可能なクロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）を付与す
るクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）遺伝子であった。次にＣＡＴ ＤＮＡを含有
するＰＩＡ株をＰＩＢ含有受容株を形質転換するために
ＤＮＡ供与株として使用した。相互交雑（ｒｅｃｉｐｒ
ｏｃａｌ ｃｒｏｓｓ）も行われた。推定上のハイブリ
ッドはＣｍｒで選択し、イムノブロッティングでＰＩに
ついて調べて同定した。次の形質転換体すべてが観察さ
れた：（１）供与株ＤＮＡが存在した、または（２）受
容株ＤＮＡが保持されていた、または（３）そのＤＮＡ
がどちらの親のＤＮＡとも相違していた。真のハイブリ
ッドＰＩＡ／Ｂ株は程良く高い頻度で両方の種類の交雑
において発生し、多くの異なる血清型が同定可能であっ
た。これらのハイブリッド遺伝子およびタンパク質を入
手できることにより、既知モノクローナル抗体のエピト
ープの位置を解明することができ、また防御抗体の生産
を誘導することが知られているエピトープ（従って、有
用なワクチンの開発において最も重要なエピトープであ
る）を含有するＰＩＡ／Ｂハイブリッドタンパク質の同
定、そして最終的にはその合成による構築が可能となっ
た。これらのハイブリッドの作製および同定の細部につ
いては以下の７節で述べることにする。 ５．６．合成法によるＰＩＡ、ＰＩＢおよびハイブリッ
ドタンパク質の製造 もう一つの態様においては、第３図および第９図に示し
た遺伝子配列によりコードされるタンパク質並びにそれ
ぞれの一部を含有するキメラタンパク質を当分野でよく
知られた技法を使って化学的に容易に合成できる（Ｊ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ：３
６１，１９８６）。最終実施においては、タンパク質配
列内部の防御エピトープが同定されると、その分子の単
離された活性領域のペプチド合成によりワクチン製造用
の基本物質の単純で比較的安価な製造方法が提供され
る。ペプチド合成の使用はまた、ハイブリッドＰＩＡ／
ＰＩＢタンパク質の、または、好ましくはＰＩＡとＰＩ
Ｂタンパク質の両方の防御エピトープを含有する合成ペ
プチドの便利な構築手段を提供するものてある。従っ
て、本発明は開示した配列による、遺伝子組換えにより
製造されたタンパク質および合成的に製造されたタンパ
ク質の両方を包含するものである。また、完全なタンパ
ク質の断片、好ましくは親タンパク質分子の抗原性を保
持する断片、そして最も好ましくは防御抗体の生産を惹
起するエピトープを含有する断片も本発明に包含され
る。さらに、配列内の１個またはそれ以上のアミノ酸残
基を化学的に同等のアミノ酸で置き換えることによっ
て、完全なタンパク質およびペプチド断片配列内で置換
を行うことが可能であることも認識されよう；例えば、
アスパラギン酸およびグルタミン酸のような負に荷電し
た残基は相互交換でき、リジンやアルギニンのような正
に荷電した残基も同様に交換できる。疎水性残基にはト
リプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイ
シン、バリンおよびアラニンが包含される。既知配列か
らのある種の欠失または既知配列への付加を行い、しか
もまだ所望の抗原活性を保持させることも可能である。
これらの２種のタンパク質の配列に関する本情報が与え
られたことにより、分子を適当に改変しかつ活性が保持
されているかどうか判定することは当分野の技術の範囲
内である。従って本発明はさらに、クローン化したもの
であろうと合成的に製造したものであろうと、親分子の
抗原性が実質的に保持されている請求したタンパク質の
相同物、類似物、および断片を包含するものである。 ５．７．ワクチンの製剤 精製された形態の遺伝子産物または合成によるＰＩＡペ
プチドは淋菌感染予防用のワクチン組成物を調製するの
に有用である。完全なＰＩＡタンパク質またはその任意
の活性断片がこの種の組成物中で免疫源物質として使用
できる。遺伝子生成物が融合タンパク質の一部分として
発現された場合には、そのタンパク質を全体として使用
できるしあるいは宿主細胞タンパク質を切断して非融合
ＰＩＡタンパク質を生成させることもできる。組換えＤ
ＮＡ技術により作られたＰＩＡタンパク質は標準的なタ
ンパク質分離法を用いて宿主細胞から分離できる。次に
精製タンパクを通常使用される任意の医薬上許容しうる
担体例えば水、生理食塩水、エタノール、ポリオール
（例．グリセロール、プロピレングリコール）、または
植物油、並びに当分野で知られた任意のワクチンアジュ
バントと組み合わせる。ＰＩＡ産物はまたワクチン製剤
に使用するためにリボソーム内に取り込ませることもで
きる。ここで用いる“医薬上許容しうる担体”とはあら
ゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌
剤、等張剤、吸収遅延剤などを包含する。医薬上活性な
物質に対するかかる作用剤の使用は当分野で知られてい
る。慣用媒体が活性成分と不適合でない限り、治療組成
物中におけるその使用が意図される。補助的な活性成分
も混入できる。本発明の特に有用な実施態様は、活性免
疫原としてハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を用
いたワクチンである。ＰＩＡとＰＩＢの両方のエピトー
プを発現する。実験的に誘導された淋菌は文献（Ｄａｎ
ｉｅｌｓｓｏｎ，Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９−
５３３）に報告されているが、キメラタンパク質の構造
は同定されず、そのタンパク質をワクチンに使用する可
能性については全く触れられていない。かかるワクチン
により両方の種類の淋菌感染（すなわち、プロテインＩ
Ａ含有株に関連した全身感染およびプロテインＩＡまた
はプロテインＩＢ含有株に関連した局所感染）に対して
個体を免疫できるという利点が得られる。本発明に関連
して述べた特定プローブの入手可能性が示されたことに
より、かかる適当なハイブリッドタンパク質は当分野技
術者に知られた技法を使って容易に得ることができる。
原則的には、キメラ遺伝子は個々のタンパクの遺伝子を
初めに単離することにより作製できる。本発明のＰＩＡ
特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＩＡ遺伝
子の単離方法はすでに上で説明した。同様の操作がＰＩ
Ｂ遺伝子の単離および同定に使用できる。ＰＩＢタンパ
ク質のみを産生する菌株例えばＭＳ１１、Ｒ１０、ＦＡ
６１４０、Ｆ６２などが多数同定されている。上記の非
ＰＩＡ特異的ＤＮＡ配列は、ＰＩＢ特異的菌株由来のＰ
Ｉ配列を含有する制限断片をＰＩＢ菌株の遺伝子ライブ
ラリーから単離するのに好都合に使用できる。正しい産
物が発現されたことの証明は、推定ＰＩＢ断片による宿
主微生物の形質転換および発現、そして任意の既知ＰＩ
Ｂ特異的モノクローナル抗体（Ｒ．Ｃ．Ｎｏｗｉｎｓｋ
ｉ，Ｋｎａｐｐ，Ｊ．Ｓ．，Ｔａｍ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ
Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，
１５０：４４−４８，１９８４）との反応による発現産
物の同定から得られる。ひとたび個々の遺伝子断片が単
離されたら、それらは当業上知られた任意の方法を用い
て容易にクローン化され、組み立てられる。次にＰＩＡ
配列部分を、キメラタンパク質が転写および翻訳可能な
形態（例えば、翻訳終止配列により中断されてない形
態）でコードされるように、ＰＩＢ配列部分に連結させ
る。次に、全キメラ配列を選択マーカーおよび制御エレ
メントを含有するベクターに連結させることができる。
次にこのベクターを用いて、回収可能な量の遺伝子生成
物を発現しうる宿主微生物を形質転換する。もちろん別
法として出発点でＰＩＡ遺伝子をすでに含有するベクタ
ー（例えば、大腸菌ＮＲＲＬ Ｂ−１８２６３に含有さ
れるプラスミド）を使用してもよい。ＰＩＢ配列を上記
のようにして単離し、その全部または一部をプラスミド
中のＰＩＡ遺伝子に隣接してまたはＰＩＡ遺伝子の内部
に連結させて目的とするキメラ遺伝子の転写および翻訳
を行わせることもできる。しかしながら好ましくはＰＩ
Ａ／ＰＩＢハイブリッドは５．６節で説明したようにし
て作製し、ハイブリッド遺伝子をそこから単離して形質
転換用のベクターを作製する。このようにして作製した
ベクターを使って再度宿主微生物を形質転換する。この
ようにして、遺伝子生成物の発現によりキメラタンパク
質の供給源が提供され、このキメラタンパク質ＰＩＡま
たはＰＩＢタンパク単独と同じ方法でワクチン製剤中に
容易に配合できる。また別の実施態様においては、ワク
チン製剤に有用なハイブリッドタンパク質は今や配列が
明らかとなったタンパク質の防御エピトープを単離およ
び同定することにより合成的によって製造することもで
きる。先に述べたように、組換えキメラタンパク質が容
易に入手しうることにより、問題のエピトープをより容
易に同定でき、それにより最終的には免疫を賦与するの
に必要なハイブリッドタンパク質のその部分のみを含有
する“簡素化された”ハイブリッドを合成方法により構
築することができる。
テインＩＢの完全なヌクレオチド配列、並びにそれらの
予測されるアミノ酸配列が開示される。また、単細胞宿
主生物中でＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子をクローニングし
て発現させるための、並びにＰＩＡ−ＰＩＢキメラタン
パク質産物をクローニングして発現させるための方法お
よび組成物も開示される。さらに、新規な宿主生物を培
養して遺伝子産物を生産させる方法も開示される。用い
られた組換えＤＮＡ法の生産物は、淋疾を予防するため
のワクチン組成物において免疫原として全体または抗原
部分を使用するのに適している。ＰＩＡおよびＰＩＢ遺
伝子は新規なオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ断片
とのハイブリダイゼーションにより細菌ゲノムから単離
された。一旦特定のＤＮＡセグメントがつきとめられた
らそのヌクレオチド配列を決定しそしてアミノ酸配列が
予測された。次にそれぞれの遺伝子を、その遺伝子の複
製単位として作用するプラスミドクローニングベクター
に挿入した。次にこの組換えプラスミドを用いて適合性
宿主細胞を形質転換し、それにより遺伝子産物が発現さ
れる。また、発現された産物の単離方法およびワクチン
組成物への各産物の製剤化法もここに開示される。特
に、ハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を包含する
ワクチン組成物が提唱される。さらに、ＰＩＡおよびＰ
ＩＢ遺伝子のヌクレオチド配列の決定に基づいて、本発
明は淋菌感染の検出および診断に有用なオリゴヌクレオ
チドプローブの配列をも提供するものである。これに関
して、本発明はまた、ここに記載のオリゴヌクレオチド
プローブの１種またはそれ以上を含有する診断試験キッ
トをも提供する。 ４．図面の説明 第１図：Ｒ１０株のＰＩの残基１−１２のアミノ酸配
列、縮重塩基を含むコード化ｍＲＮＡ、および合成され
たオリゴヌクレオチド。縮重が存在する場合は、塩基配
列の決定がなされた他の淋菌遺伝子からのコドン利用デ
ータに基づいて塩基配列を選択した。 第２図：ＰＩ遺伝子部分を含むＦＡ１９ゲノムＤＮＡの
Ｓａｕ３ＡＩおよびＴａｑＩ断片。この断片をベクター
プラスミドｐＧＥＭ−２にクローン化して、ここに示す
名称の組換えプラスミドを得た。ゲノム上のＰＩコード
領域の相対的な位置は断片の上の空白ボックスで示し
（斜線ボックスはＮ末端シグナル配列に相当する）、オ
リゴヌクレオチドプローブの相対的位置を断片の下に示
す。 第３図：ＦＡ１９のＰＩ遺伝子のＤＮＡ配列。予測され
るアミノ酸配列をＤＮＡ配列の上に示し、そしてリボソ
ーム結合部位（ＲＢＳ）、およびｐＵＮＣ７の作製に用
いられるＴａｑＩおよびＳａｕ３ＡＩ部位、およびＨａ
ｅＩＩＩ部位（−３５および−１０）が示される。各行
の最後の塩基の番号を右側に示す。 第４図：Ｎ．ゴノロエアエの主要な外層膜タンパク質、
ＰＩ、ＰＩＩおよびＰＩＩＩ、並びに大腸菌ポーリンＯ
ｍｐＦおよびＯｍｐＣのハイドロパシー（ｈｙｄｒｏｐ
ａｔｈｙ）パターン；ｓｐ−シグナルペプチド；ａ．
ａ．−アミノ酸残基。 第５図：ｐＵＮＣ７の作製工程図。ＰＩ遺伝子プロモー
ターの−３５および−１０領域間の好都合なＨａｅＩＩ
Ｉ部位により−３５領域および上流配列を除去でき、次
にＰＩ遺伝子をファージＴ７プロモーターの制御下にベ
クタープラスミドｐＧＥＭ−２に挿入した。太い線はｐ
ＧＥＭ−２ＤＮＡを、そして細い線はＦＡ１９ＤＮＡを
表す。ＰＩ’−ＰＩ遺伝子部分（点線はこの遺伝子の欠
失セグメントの方向を示す）；ＰＴ７−ファージＴ７プ
ロモーター；ＭＣＳ−多重クローニング部位；制限酵素
部位：Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ、Ｈ−ＨａｅＩＩＩ、Ｂ−Ｂａ
ｍＨＩ、（Ｈ）−ＨａｅＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩ接合点
（部位は存在せず）、Ｔ−ＴａｑＩ。 第６図：ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるｐＵＮＣ７上のＰ
Ｉ遺伝子の発現。Ａ：全細胞溶解物の１５％ゲル上にお
けるＮａＤｏｄＳＯ４−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、クーマシーブルーで染色。マーカータンパク質の寸
法を左側に示す。ＰＩが示されており、そして中央の矢
印はレーン４では明らかに失われているタンパク質を示
す。 Ｂ：６種類のＰＩＡ ＭＡｂを用いて検索したＡにおけ
るゲルのウエスターンブロットのオートラジオグラフ。
レーン１：ＦＡ１９；レーン２：ＩＰＴＧなしで１６時
間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レーン
３：ＩＰＴＧを用いて３時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＵＮＣ７；レーン４：ＩＰＴＧを用いて１６時間
増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レーン５：
ＩＰＴＧなしで１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）
ｐＧＥＭ−２；レーン６：ＩＰＴＧを用いて１６時間増
殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２。 第７図：ＦＡ１９のＰＩ構造遺伝子に隣接したｍＴｎ３
− 表す。ｍＴｎ３−ＣＡＴは長さが１．６６ｋｂであり、
尺度に応じて描かれていない。ＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１
のゲノム上のＰＩ遺伝子の位置は線上の空白ボックスで
示され、斜線ボックスはシグナル配列を示す。ＰＩ’：
クローン化構築物中に存在するＰＩ遺伝子部分。制限酵
素部位：Ｎ−ＮｏｔＩ；Ｂ−ＢａｍＨＩ；Ｓ−Ｓａｕ３
ＡＩ。 第８図：ＰＩ遺伝子の配列決定のためにクローン化した
ＭＳ１１ ＤＮＡの断片。ＰＩ遺伝子の位置は線上の空
白ボックスで示され、斜線ボックスはシグナル配列を示
す。オリゴヌクレオチドＮＣ１およびＮＣ１２の配列の
位置が示してある。大きい方の断片はベクタープラスミ
ドｐＧＥＭ−３にクローン化され、小さい方の断片はλ
ｇｔ１１中にクローン化して、表示した名称の構築物と
なした。制限酵素部位：Ｈｆ−ＨｉｎｆＩ；Ｋ−Ｋｐｎ
Ｉ；Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ；Ｈｃ−ＨｉｎｃＩＩ。 第９図；ＭＳ１１のＰＩＢ遺伝子のＤＮＡ配列。予測さ
れるアミノ酸配列はＤＮＡ配列の上に示してあり、シグ
ナルペプチドも示される。推定ブロモーター配列（−３
５および−１０）およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）
も示され、関連する制限酵素部位も同様に示される。各
行の最後の塩基の番号を右側に示す。Ｒ１０のＰＩＢ配
列（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ等、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
４：８１３５−８１３９，１９８７）との相違を示すた
めに、塩基（制限酵素部位を構成するものを除く）には
下線が引いてあり、アミノ酸は丸で囲ってある。 第１０図：ＦＡ１９ ＰＩＡおよびＭＳ１１ ＰＩＢの
アミノ酸配列の比較、並びにハイブリッドＰＩ遺伝子の
構造。ＰＩＡ遺伝子配列は白の捧で、そしてＰＩＢは黒
の棒で示す。ＰＩ遺伝子類の上と下はアミノ酸配列の比
較であり、垂直線は１個の相違に相当し、黒のブロック
は連続して広がった相違に相当する。アミノ酸残基の数
は上の目盛で示され、そして塩基対の数は下の目盛で示
される。ハイブリッドを分析するのに使用されたオリゴ
ヌクレオチドはこれらの遺伝子の間に示してあり、点線
は他の遺伝子上の等しい位置を示す。ハイブリッド遺伝
子構造（クラス１−９）を下に示し、交差が起こったオ
リゴヌクレオチド配列間の領域を傾斜域で表す。種々の
ハイブリッドクラスのＰＩ血清型を第１表に示す。 第１１図：全細胞溶解物の１５％ゲル上でのＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシーブルー
染色を用いて検出した、ＢＬ２１（ＤＥ３）中における
ｐＵＮＣＨ２５上のＰＩＢ遺伝子の発現。ＰＩタンパク
質バンドが示してある。レーン１：ＭＳ１１；レーン
２：ＩＰＴＧなしで増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵ
ＮＣＨ２５；レーン３−５：ＩＰＴＧを用いて増殖させ
たＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣＨ２５。ＩＰＴＧ（５０
μｇ／ｍｌ）は下記細胞密度すなわちレーン３：５×１
０８細胞／ｍｌ；レーン４：１０９細胞／ｍｌ；レーン
５：２×１０９細胞／ｍｌで増殖培地に加えた。ＰＩの
発現は生長周期の早期に培養物が誘導された場合に最大
である。 ５．発明の説明 本発明は、淋疾感染予防用のワクチン組成物の製造に有
用なＮ．ゴノロエアエＰＩＡ、ＰＩＢ、およびキメラＰ
ＩＡ／ＰＩＢタンパク質の使用に関する。これらのタン
パク質は組換えＤＮＡ技術または化学的合成法により製
造できる。以前には適当なＮ．ゴノロエアエ株からの化
学的単離法を使用することが可能であったが、この方法
はワクチン接種後に阻止（抗防御）抗体を惹起するある
種の他の淋菌タンパク質による汚染を生じうる。ＰＩタ
ンパク質は抗体の生成を刺激することが知られているの
で、Ｎ．ゴノロエアエによる感染から被接種者を効果的
に防御する免疫原として、そのタンパク質全体またはそ
の免疫原部分を使用することができる。ここに記載の組
換えプラスミドにより、安定で宿主細胞による分解に対
し抵抗性を有する大量のＰＩタンパク質を宿主細胞中に
産生させることができ、その結果ワクチン組成物に適す
る物質の豊富な供給原が得られる。このワクチン製剤は
他の抗防御性淋菌タンパク質による汚染がない。本発明
を説明するために、本発明にいくつかの工程に分けて以
下に論ずる、すなわち：１）ＰＩＡ遺伝子または遺伝子
断片の同定および単離；２）適合性宿主細胞の形質転換
に用いられる適当なクローニングベクターへの遺伝子ま
たは遺伝子断片の挿入；３）その遺伝子を複製させ発現
させる形質転換宿主細胞の同定および増殖；および４）
遺伝子生産物の同定および精製。本発明によれば、ＰＩ
タンパク質は第３図または第９図のクローン化配列、も
しくはそのハイブリッドを適切なクローニング／発現ベ
クターに挿入し、適当な宿主細胞を形質転換し、次に遺
伝子産物を同定および精製することにより生産されるう
る。あるいはまた、第３図または第９図の推定アミノ酸
配列部分、またはそのハイブリッドは当分野でよく知ら
れた化学的合成技術を用いて合成することもできる。ま
た、ＰＩＡおよびＰＩＢ配列に基づくオリゴヌクレオチ
ドもここに開示され、これらのオリゴヌクレオチドはサ
ザンブロット、ドットブロット、スロットブロットなど
のハイブリダイゼーションの技術によるＮ．ゴノロエア
エ感染の確認および診断に有用である。 ５．１．ＰＩＡ遺伝子の同定、単離、および配列決定 ＰＩＡタンパク質のヌクレオチドコード配列は第３図に
示される。すでに述べたように、ＰＩＡタンパク質はす
べてのＮ．ゴノロエアエによって生産されるわけではな
い；任意の所定の株はＰＩＡまたはＰＩＢのいずれかを
生産するが両方は生産しないであろう。ＰＩＡの存在は
淋菌血清群Ｉ、血清型Ｉ−３、と関係があり、従って血
清型１−３と関連のある淋菌株はどれもＰＩＡ ＤＮＡ
源として使用できる。既知のＮ．ゴノロエアエ株の中
で、ＰＩＡにより特徴づけられる株はＦＡ１９、ＦＡ１
３０、Ｗ−Ｕｅ、Ｂ−２、Ｇ−７、５０２９、Ｒ−１
１、Ｅ−５、Ｄ−４、Ｖ−１５である（Ｋｎａｐｐ等、
Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１５０：４４−４８，１９８
４）。本発明の実施において、第３図に示す配列は種々
の方法で得ることができる。例えば、ひとたび適当なＰ
ＩＡ含有株が定められたら、その生物のＤＮＡを単離
し、ＤＮＡ断片を生成させ、そしてＰＩＡ遺伝子配列を
含有する断片を同定することが必要である。あるいはま
た、その遺伝子または遺伝子セグメントは合成すること
ができよう。Ｎ．ゴノロエアエＤＮＡは多くの異なる方
法で断片化しうる；最も好ましい方法はＤＮＡを特定の
配列で切断する制限酵素での処理である。その他の方法
にはマグネシウムの存在下でのＤＮａｓｅによるＤＮＡ
の処理、または音波処理のような物理的破壊が含まれ
る。制限酵素を用いる場合、ＤＮＡを処理するのに１種
類の酵素または酵素類の組合せを用いることができる。
唯一の必要条件は、核酸の消化がＰＩＡの抗原部位をコ
ードする領域を破壊しないということである。断片化
後、線状ＤＮＡの個々の断片を、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＰＡＧＥ）、アガロースゲル、またはカラ
ムクロマトグラフィーのような多数の既知技法の任意の
ものを用いて、大きさに基づいて分離する。分離した断
片によりプラスミド作製および形質転換のための遺伝子
物質が提供される。対象となる遺伝子配列を含有するＤ
ＮＡ断片の同定は多くの方法により達成できる。例え
ば、モノクローナル抗体のような免疫試薬が使用されう
る。ＰＩＡに対するモノクローナル抗体は数多く誘導さ
れており（Ｔａｍ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．３
６：１０４２−１０５３，１９８２）、そしてこれらは
種々のＤＮＡ断片により形質転換されたそれぞれの宿主
細胞から生産された産物を検査するのに使用されうる、
すなわちＰＩＡモノクローナル抗体と反応する産物によ
り、ＰＩ遺伝子を含有する断片で形質転換された細胞が
同定される。また、ＤＮＡ断片の塩基配列決定によりそ
れぞれのアミノ酸配列を予測でき、次に既知の任意の部
分アミノ酸配列と比較して、相当するＤＮＡ配列を含有
する断片を同定することができる。もう１つの一般的技
法はサザンブロッティングである（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７８：５０３，１９７５）。この
方法では、制限断片をゲル上の適所で変性し、そしてブ
ロッティングにより固形基質代表的にはニトロセルロー
スフィルターに移す。次に、フィルターをこのタンパク
質の既知のまたは仮定した部分ＤＮＡ配列を含有する放
射性標識オリゴヌクレオチドにさらす。選択されたオリ
ゴヌクレオチドと相補性であるブロットされたＤＮＡが
それにハイブリダイズしてそれによりＰＩ遺伝子を含有
するＤＮＡ断片の大きさが確認されよう。以下に詳述す
る実施例において、ＰＩＡをコードする遺伝子は２種の
新規なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
により同定および単離された。ＰＩＢのＮ末端アミノ酸
部分の既知配列（Ｂｌａｋｅ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．３６：２７７−２８５，１９８２；Ｂｌａｋｅ，
Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，
Ｇ．Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ編、２５１−２５８，１９８
５，ＡＳＭ）、および既知ＤＮＡ配列を有する種々の他
の淋菌タンパク質に伴うコドン使用規則に基づいて、有
用なオリゴヌクレオチドを推定する試みがなされた。特
に、次のようなＮＣ１およびＮＣ２と呼ばれる２つの配
列が作製された： サザンブロットハイブリダイゼーションで用いられる場
合、上記のオリゴマーは淋菌ゲノムから得られたＤＮＡ
制限断片をスクリーニングするのに使用された；両方の
プローブともＰＩＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を同定
することに成功した。同定された遺伝子がＰＩＡ遺伝子
であることの証明は、遺伝子産物の分子量と天然タンパ
ク質の分子量との比較、およびＰＩＡ特異的モノクロー
ナル抗体のその免疫反応性により行われた。しかしなが
ら、この有用性のほかに、これらのオリゴヌクレオチド
はそれぞれ淋菌のＰＩＡおよびＰＩＢ株の両方とハイブ
リダイズしうることも確認された。従って、これらの正
常な化合物は悩める個体のＮ．ゴノロエアエ感染の検出
および同定に、サザンブロットハイブリダイゼーション
において診断用プローブとして使用することもできる。
ＰＡ遺伝子を含有する断片の同定に続いて Ｓａｎｇｅ
ｒ（ＰＮＡＳ ＵＳＡ７４：５４６３−５４６７，１９
７７）の方法に従って関連部分の塩基配列が決定され
る。Ｓａｎｇｅｒの方法はＤＮＡ鋳型からの相補性ＤＮ
Ａ鎖の酵素による合成を利用するものである。相補鎖の
合成はデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）の取込みに
より停止される。４つの別々の反応（それぞれｄｄＡＴ
Ｐ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、またはｄｄＴＴＰを含
有）が行われ、その結果４組のＤＮＡ断片が形成され、
所定の組の各断片はその末端に特定のジデオキシヌクレ
オチドをもつであろう。次にＤＮＡ断片をポリアクリル
アミドゲル上で分離し、各断片の末端ヌクレオチドの同
一性の知識よりその塩基配列を決定しそして最短断片か
ら最長断片までを読み取る。鋳型として用いられる一本
鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで化学
的に処理すると得られる。しかしながら、Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３０
９，１９８１）がクローニングベクターとして開発した
Ｍ１３ｍｐクローニングベクターを使用することがより
効果的である。Ｍ１３は一本（＋）鎖ＤＮＡを含有する
大腸菌の雄菌特異的線維状バクテリオファージである。
この（＋）鎖は相補性（−）鎖合成用の鋳型として使用
される。二本鎖型のＤＮＡが複製型すなわちＲＦ型であ
り、細胞あたり約２００コピーに増殖する。この二本鎖
型を細胞から分離してクローニングベクターとして使用
できる。いったん増殖が止まると、２本の鎖のうち一方
のみが産生され続け、そして一本鎖がファージ粒子に組
み込まれる。Ｍ１３の利点は、粒子がクローン化した鎖
の一方に相同な一本鎖ＤＮＡを有しており、それ故にＳ
ａｎｇｅｒ法における鋳型として使用できる点にある。
３５０塩基までの塩基配列を単一クローンから決定で
き、これよりも長い断片の塩基配列決定は重複する断片
の塩基配列を解析することにより達成できる。前記技法
を使用するすることにより、第３図に示したＰＩＡ遺伝
子のヌクレオチド配列が得られた。第３図には推定アミ
ノ酸配列も示してある。ＰＩＡ遺伝子の塩基配列決定
（重複する断片の塩基配列を別々に決定することにより
達成された）によりさらに２つの他のオリゴヌクレオチ
ドプローブの同定および作製ができた。両プローブは次
の配列を有する１７ヌクレオチドオリゴマーである： ＮＣ８：５’ＧＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣ３’ および ＮＣ１１：５’ＣＧＧＴＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＣ
３’ これらのプローブは両方ともＰＩＡ遺伝子のみに特異的
であって、ＰＩＢ ＤＮＡ配列にはハイブリダイズしな
い。従って、これらのプローブは共に感染にＰＩＡ生物
によるか、ＰＩＢ生物によるのかを判断する診断試験に
おいて有用である。先に述べたように、これらのタンパ
ク質の各々は全身的かまたは局所的の淋菌感染の特定パ
ターンを示し、従って感染患者の治療プログラムを計画
する上で非常に重要でありうる。単離した遺伝子または
化学的に合成したＤＮＡ配列は形質転換宿主細胞の増
殖、形質転換細胞からの組換えＤＮＡの単離、および単
離した組換えＤＮＡからの挿入遺伝子の回収により、さ
らに遺伝子コピーを生成されるのに使用されうる。 ５．２．ＰＩＢ遺伝子の同定、単離および配列決定 ＰＩＢタンパク質のヌクレオチド配列を第９図に示す。
この配列はＮ．ゴノロエアエＭＳ１１株から単離され
た。ＰＩＢの存在は血清群４−９と関係しており、これ
らの血清群と関連した株はどれもＰＩＢ ＤＮＡの供給
源として使用できる。既知の淋菌株中で、ＰＩＢの存在
により特徴づけられる株はＭＳ１１、ＦＡ６１４０、Ｆ
６２およびＲ１０である。ＰＩＢタンパク質の調製、同
定、および配列決定の技術は前記５．１節で説明したＰ
ＩＡタンパク質に適用した手法と実質的に同じである。
ＰＩＢ遺伝子の詳細な同定は、ＮＣ１およびＮＣ１２プ
ローブ（５’−ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＴＣ−
３’）の使用、並びにハイブリッドＰＩタンパク質のＰ
ＩＢ部分にあるＫｐｎＩ制限部位の同定（Ｄａｎｉｅｌ
ｓｓｏｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９
−５３３，１９８６）により助けられた。ＰＩＡと同様
にこの遺伝子のクローニングはクローニングベクターに
重複配列を別々にクローニングすることにより達成され
た。 ５．３．組換えＤＮＡ技術によるＰＩＡ、ＰＩＢまたは
ＰＩＡ／ＰＩＢハイブリッドの生成 ＰＩＡのヌクレオチドコード配列を第３図に示す。ＰＩ
Ｂのヌクレオチドコード配列を第９図に示す。本発明の
実施において、ヌクレオチド配列またはその機能上の同
等物がＰＩＡまたはＰＩＢ生成物の発現を指示する組換
え分子中に組み込まれる。また、第３図および第９図か
ら誘導されたハイブリッド配列を作製してハイブリッド
ＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を生産させることもできる。
ヌクレオチドコード配列の縮重ゆえに、第３図または第
９図に示したと実質的に同じアミノ酸配列をコードする
他のＤＮＡ配列も、ＰＩＡまたはＰＩＢをクローニング
および発現させるために本発明の実施においてそれぞれ
使用することができる。第３図または第９図のヌクレオ
チド配列のかかる変更には種々のヌクレオチド残基の欠
失、付加または置換が包含され、同一のまたは機能的に
等価の遺伝子生成物をコードする配列が生成される。そ
の遺伝子産物はアミノ酸残基の欠失、付加または置換を
含有できる。置換は関与する残基の極性、電荷、溶解
度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に
基づいて行われうる。例えば、負に荷電したアミノ酸に
はアスパラギン酸およびグルタミン酸が包含され、正に
荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが包含さ
れる。同様の親水値を有する非荷電極性ヘッド基または
非極性ヘッド基をもつアミノ酸には次のものが包含され
る、すなわちロイシン、イソロイシン、バリン；グリシ
ン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、ト
レオニン；フェニルアラニン、チロシン。 ５．３．１．ＰＩ遺伝子クローニング／発現ベクターの
作製 第３図に示すＰＩＡ遺伝子配列、第９図に示すＰＩＢ遺
伝子配列、およびハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢ配列、も
しくはこれらの機能的同等物は適当なクローニング発現
ベクターに挿入できる。終局的に挿入遺伝子の転写およ
び翻訳を達成するためには、その遺伝子は選ばれた宿主
細胞と適合するプロモーターの制御下に置かねばならな
い。プロモーターとはＲＮＡポリメラーゼが結合して転
写を開始するＤＮＡの領域である。選ばれるプロモータ
ーは宿主細胞生物から単離されたいずれのものでもよ
い。例えば、宿主系として通常用いられる大腸菌は菌そ
れ自体と、またはそのバクテリオファージと、もしくは
そのプラスミドと関連した、ｌａｃまたはｒｅｃＡプロ
モーターのような多数のプロモーターを有する。またラ
ムダファージＰＬおよびＰＲプロモーターのような、合
成的にまたは組換えにより作られたプロモーターを使用
して、それに隣接するＤＮＡセグメントの高レベル生産
を誘導することもできる。遺伝子を効率よく転写および
翻訳させるには、開始シグナルも必要である。例えば大
腸菌のｍＲＮＡでは、リボソーム結合物には翻訳開始コ
ドン（ＡＵＧまたはＧＵＧ）および１６ＳリボソームＲ
ＮＡの３’末端の塩基と相補性であるもう１つの配列が
包含される。後者の配列（シャイン−ダルガルノまたは
Ｓ−Ｄ配列）のいくつかは大腸菌や他の適当な種類の宿
主細胞において確認されている。宿主細胞系と適合しう
る任意のＳＤ−ＡＴＧ配列が使用できる。これらには大
腸菌ファージラムダのｃｒｏ遺伝子またはＮ遺伝子、あ
るいは大腸菌のトリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢまたはＡ
遺伝子が含まれるが、それらに限定されるわけではな
い。インビトロでＤＮＡ断片をクローニングベクターに
挿入する方法は数多く存在する。ＤＮＡリガーゼは二重
ＤＮＡ鎖中の隣接ヌクレオチド間の一本鎖ニックを閉じ
る酵素である；従って、この酵素はある種の制限酵素に
より生成された付着末端同士を共有結合で連結させるの
に使用することができる。また、ＤＮＡリガーゼを使用
して平滑末端間のホスホジエステル結合の形成を触媒す
ることもできる。最後に、酵素ターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼを用いて断片の末端で
３’ホモポリマー一本鎖尾部を形成させることができ
る。すなわち第一の分子の３’末端にオリゴ（ｄＡ）配
列を、そして第二の分子の３’末端にオリゴ（ｄＴ）配
列を付加することにより、２種類の分子がアニーリング
して環状ダイマーを形成させることができる。これらの
方法のどれを使っても、遺伝子セグメントプロモーター
および他の制御エレメントをベクターの特定部位に連結
することが可能である。こうして、ＰＩタンパク質をコ
ードする遺伝子がベクタープロモーターおよび制御エレ
メントに対して特別の関係で所定のベクターに連結さ
れ、その結果前記配列はベクターＡＴＧ配列に関して正
しい読み枠で挿入される。使用されるベクターは形質転
換細胞を同定しうるよう代表的にはアンピシリン耐性ま
たはテトラサイクリン耐性のようなマーカー機能を有し
ていよう。使用するベクターは既知の発現ベクターまた
はそれらの誘導体のいずれであってもよい。最も頻繁に
用いられるベクターはプラスミドベクター（例．ｐＢＲ
３２２、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５、ｐＡＣＹＣ１７７、
ｐＫＨ４７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＢ１１０、ｐｍＢ
９、ｐＢＲ３２５、Ｃｏｌ Ｅｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＢ
Ｒ３１３、ｐＭＬ２１、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ１また
はＲＰ４）；バクテリオファージベクター（例．ラムダ
ｇｔ１１、ラムダｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、Ｃｈａｒｏ
ｎ２８、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、ラムダｇｔ−１−ラムダＢ
Ｃ、ラムダ−ｇｔ−１−ラムダＢ、Ｍ１３ｍｐ７、Ｍ１
３ｍｐ８、Ｍ１３ｍｐ９）；ＳＶ４０およびアデノウイ
ルスベクター、並びに酵母ベクターである。 ５．４．ＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子生成物の同定および
精製 先に述べたように、ＰＩＡおよびＰＩＢをコードする遺
伝子セグメントは本来は上記の新規なオリゴヌクレオチ
ド配列とのハイブリダイゼーションにより同定された。
選択された断片がＰＩＡをコードする構造遺伝子である
という同一性は、天然ＰＩＡとの分子量比較により、お
よびコロニーラジオイムノアッセイで試験された６種類
すべてのＰＩＡモノクローナル抗体との反応性により証
明された。ＰＩＢ生成物の同一性もＰＩＢ特異的モノク
ローナル抗体との反応により証明された。クローン化Ｐ
ＩＡまたはＰＩＢ遺伝子を発現する大腸菌宿主細胞は、
適切なモノクローナル抗体と反応するＰＩタンパク質を
豊富に産生する。ＰＩＡタンパク質の精製操作はＴｅｅ
ｒｌｉｎｋ等（Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａ，Ｇ．Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ編、２５９−２
６４，１９８５，ＡＳＭ）に詳細に記載されている。 ５．５．ＰＩＡ／Ｂハイブリッドの作製 本発明に関連して、多数のハイブリッドＰＩＡ／Ｂ遺伝
子配列およびタンパク質が作られた。ハイブリッド遺伝
子はＳｅｉｆｅｒｔ等（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉ−ｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．８，ｐ．１２３−１３４，Ｓｅｔｔ
ｉｎ等編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ ８３：７３５−７３９，１９８６）に従
って改良されたシャトル突然変異誘発法を用いて、ＰＩ
Ａ産生株にＰＩ遺伝子に隣接して選択マーカーを挿入す
ることにより作製された。この場合、選択マーカーは選
択可能なクロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）を付与す
るクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）遺伝子であった。次にＣＡＴ ＤＮＡを含有
するＰＩＡ株をＰＩＢ含有受容株を形質転換するために
ＤＮＡ供与株として使用した。相互交雑（ｒｅｃｉｐｒ
ｏｃａｌ ｃｒｏｓｓ）も行われた。推定上のハイブリ
ッドはＣｍｒで選択し、イムノブロッティングでＰＩに
ついて調べて同定した。次の形質転換体すべてが観察さ
れた：（１）供与株ＤＮＡが存在した、または（２）受
容株ＤＮＡが保持されていた、または（３）そのＤＮＡ
がどちらの親のＤＮＡとも相違していた。真のハイブリ
ッドＰＩＡ／Ｂ株は程良く高い頻度で両方の種類の交雑
において発生し、多くの異なる血清型が同定可能であっ
た。これらのハイブリッド遺伝子およびタンパク質を入
手できることにより、既知モノクローナル抗体のエピト
ープの位置を解明することができ、また防御抗体の生産
を誘導することが知られているエピトープ（従って、有
用なワクチンの開発において最も重要なエピトープであ
る）を含有するＰＩＡ／Ｂハイブリッドタンパク質の同
定、そして最終的にはその合成による構築が可能となっ
た。これらのハイブリッドの作製および同定の細部につ
いては以下の７節で述べることにする。 ５．６．合成法によるＰＩＡ、ＰＩＢおよびハイブリッ
ドタンパク質の製造 もう一つの態様においては、第３図および第９図に示し
た遺伝子配列によりコードされるタンパク質並びにそれ
ぞれの一部を含有するキメラタンパク質を当分野でよく
知られた技法を使って化学的に容易に合成できる（Ｊ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ：３
６１，１９８６）。最終実施においては、タンパク質配
列内部の防御エピトープが同定されると、その分子の単
離された活性領域のペプチド合成によりワクチン製造用
の基本物質の単純で比較的安価な製造方法が提供され
る。ペプチド合成の使用はまた、ハイブリッドＰＩＡ／
ＰＩＢタンパク質の、または、好ましくはＰＩＡとＰＩ
Ｂタンパク質の両方の防御エピトープを含有する合成ペ
プチドの便利な構築手段を提供するものてある。従っ
て、本発明は開示した配列による、遺伝子組換えにより
製造されたタンパク質および合成的に製造されたタンパ
ク質の両方を包含するものである。また、完全なタンパ
ク質の断片、好ましくは親タンパク質分子の抗原性を保
持する断片、そして最も好ましくは防御抗体の生産を惹
起するエピトープを含有する断片も本発明に包含され
る。さらに、配列内の１個またはそれ以上のアミノ酸残
基を化学的に同等のアミノ酸で置き換えることによっ
て、完全なタンパク質およびペプチド断片配列内で置換
を行うことが可能であることも認識されよう；例えば、
アスパラギン酸およびグルタミン酸のような負に荷電し
た残基は相互交換でき、リジンやアルギニンのような正
に荷電した残基も同様に交換できる。疎水性残基にはト
リプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイ
シン、バリンおよびアラニンが包含される。既知配列か
らのある種の欠失または既知配列への付加を行い、しか
もまだ所望の抗原活性を保持させることも可能である。
これらの２種のタンパク質の配列に関する本情報が与え
られたことにより、分子を適当に改変しかつ活性が保持
されているかどうか判定することは当分野の技術の範囲
内である。従って本発明はさらに、クローン化したもの
であろうと合成的に製造したものであろうと、親分子の
抗原性が実質的に保持されている請求したタンパク質の
相同物、類似物、および断片を包含するものである。 ５．７．ワクチンの製剤 精製された形態の遺伝子産物または合成によるＰＩＡペ
プチドは淋菌感染予防用のワクチン組成物を調製するの
に有用である。完全なＰＩＡタンパク質またはその任意
の活性断片がこの種の組成物中で免疫源物質として使用
できる。遺伝子生成物が融合タンパク質の一部分として
発現された場合には、そのタンパク質を全体として使用
できるしあるいは宿主細胞タンパク質を切断して非融合
ＰＩＡタンパク質を生成させることもできる。組換えＤ
ＮＡ技術により作られたＰＩＡタンパク質は標準的なタ
ンパク質分離法を用いて宿主細胞から分離できる。次に
精製タンパクを通常使用される任意の医薬上許容しうる
担体例えば水、生理食塩水、エタノール、ポリオール
（例．グリセロール、プロピレングリコール）、または
植物油、並びに当分野で知られた任意のワクチンアジュ
バントと組み合わせる。ＰＩＡ産物はまたワクチン製剤
に使用するためにリボソーム内に取り込ませることもで
きる。ここで用いる“医薬上許容しうる担体”とはあら
ゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌
剤、等張剤、吸収遅延剤などを包含する。医薬上活性な
物質に対するかかる作用剤の使用は当分野で知られてい
る。慣用媒体が活性成分と不適合でない限り、治療組成
物中におけるその使用が意図される。補助的な活性成分
も混入できる。本発明の特に有用な実施態様は、活性免
疫原としてハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を用
いたワクチンである。ＰＩＡとＰＩＢの両方のエピトー
プを発現する。実験的に誘導された淋菌は文献（Ｄａｎ
ｉｅｌｓｓｏｎ，Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９−
５３３）に報告されているが、キメラタンパク質の構造
は同定されず、そのタンパク質をワクチンに使用する可
能性については全く触れられていない。かかるワクチン
により両方の種類の淋菌感染（すなわち、プロテインＩ
Ａ含有株に関連した全身感染およびプロテインＩＡまた
はプロテインＩＢ含有株に関連した局所感染）に対して
個体を免疫できるという利点が得られる。本発明に関連
して述べた特定プローブの入手可能性が示されたことに
より、かかる適当なハイブリッドタンパク質は当分野技
術者に知られた技法を使って容易に得ることができる。
原則的には、キメラ遺伝子は個々のタンパクの遺伝子を
初めに単離することにより作製できる。本発明のＰＩＡ
特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＩＡ遺伝
子の単離方法はすでに上で説明した。同様の操作がＰＩ
Ｂ遺伝子の単離および同定に使用できる。ＰＩＢタンパ
ク質のみを産生する菌株例えばＭＳ１１、Ｒ１０、ＦＡ
６１４０、Ｆ６２などが多数同定されている。上記の非
ＰＩＡ特異的ＤＮＡ配列は、ＰＩＢ特異的菌株由来のＰ
Ｉ配列を含有する制限断片をＰＩＢ菌株の遺伝子ライブ
ラリーから単離するのに好都合に使用できる。正しい産
物が発現されたことの証明は、推定ＰＩＢ断片による宿
主微生物の形質転換および発現、そして任意の既知ＰＩ
Ｂ特異的モノクローナル抗体（Ｒ．Ｃ．Ｎｏｗｉｎｓｋ
ｉ，Ｋｎａｐｐ，Ｊ．Ｓ．，Ｔａｍ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ
Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，
１５０：４４−４８，１９８４）との反応による発現産
物の同定から得られる。ひとたび個々の遺伝子断片が単
離されたら、それらは当業上知られた任意の方法を用い
て容易にクローン化され、組み立てられる。次にＰＩＡ
配列部分を、キメラタンパク質が転写および翻訳可能な
形態（例えば、翻訳終止配列により中断されてない形
態）でコードされるように、ＰＩＢ配列部分に連結させ
る。次に、全キメラ配列を選択マーカーおよび制御エレ
メントを含有するベクターに連結させることができる。
次にこのベクターを用いて、回収可能な量の遺伝子生成
物を発現しうる宿主微生物を形質転換する。もちろん別
法として出発点でＰＩＡ遺伝子をすでに含有するベクタ
ー（例えば、大腸菌ＮＲＲＬ Ｂ−１８２６３に含有さ
れるプラスミド）を使用してもよい。ＰＩＢ配列を上記
のようにして単離し、その全部または一部をプラスミド
中のＰＩＡ遺伝子に隣接してまたはＰＩＡ遺伝子の内部
に連結させて目的とするキメラ遺伝子の転写および翻訳
を行わせることもできる。しかしながら好ましくはＰＩ
Ａ／ＰＩＢハイブリッドは５．６節で説明したようにし
て作製し、ハイブリッド遺伝子をそこから単離して形質
転換用のベクターを作製する。このようにして作製した
ベクターを使って再度宿主微生物を形質転換する。この
ようにして、遺伝子生成物の発現によりキメラタンパク
質の供給源が提供され、このキメラタンパク質ＰＩＡま
たはＰＩＢタンパク単独と同じ方法でワクチン製剤中に
容易に配合できる。また別の実施態様においては、ワク
チン製剤に有用なハイブリッドタンパク質は今や配列が
明らかとなったタンパク質の防御エピトープを単離およ
び同定することにより合成的によって製造することもで
きる。先に述べたように、組換えキメラタンパク質が容
易に入手しうることにより、問題のエピトープをより容
易に同定でき、それにより最終的には免疫を賦与するの
に必要なハイブリッドタンパク質のその部分のみを含有
する“簡素化された”ハイブリッドを合成方法により構
築することができる。
６．実施例１：ＰＩＡ遺伝子の同定、単離および発現 本発明の方法にしたがって、淋菌ＤＮＡの断片を得、個
々の断片を別々にクローニングし、次いで外来の誘導可
能プロモーターとともに遺伝子を再構築することによ
り、ＰＩＡ遺伝子配列を決定した。前述のように、オリ
ゴヌクレオチドＮＣ１とのハイブリッド形成により、Ｐ
ＩＡ遺伝子配列の部分を有する２個の推定断片を同定し
た。次に関連する制限フラグメントをそれぞれｐＧＥＭ
−２プラスミドベクターに結合し、適当な宿主に形質転
換した。オリゴＮＣ１とハイブリッド形成した形質転換
体を単離した。これらのクローンからプラスミドＤＮＡ
を調製し、適当な制限酵素で消化し、再びＮＣ１をプロ
ーブとして探査した。ＮＣ１とハイブリッド形成した個
々の断片を、次いで別々にｐＧＥＭ−２プラスミドに再
連結して、２つの別個のプラスミド、ｐＵＮＣ３および
ｐＵＮＣ１１を得た。７５０ｂｐ断片のＤＮＡ配列の同
一性は、それに由来するより小さな制限断片をＭ１３ｍ
ｐＲＦ ＤＮＡにサブクローニングし、次いでサンガー
法（ＰＮＡＳＵＳＡ ７４，５４６３−５４６７，１９
７７）にしたがって配列決定することにより決定され
た。この配列から、新規オリゴヌクレオチドを合成し
た。ＮＣ８と命名したこの新規オリゴヌクレオチドを、
すでにクローニングされた９００ｂｐ断片に隣接する８
５０ｂｐ断片を同定するために使用し、この断片をｐＧ
ＥＭ−２にクローニングしてｐＵＮＣ１５を生成させ、
サンガー法（上記）により配列決定した。プラスミド調
製、配列決定、ハイブリッド形成および形質転換に関す
る操作法の詳細、を以下に述べる。 ６．１．プラスミドの調製に用いられる一般的操作法 以下の小節には、ＤＮＡ単離、酵素反応、断片の単離お
よび結合反応に用いられる一般的操作法が記載される。 ６．１．１．制限酵素に関する条件 この実験に用いられる制限酵素は、特に指示しない限り
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，
Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手
される。Ｎ．ゴノロエアエ培養物は、ケロッグの添加物
（Ｋｅｌｌｏｇｇ’ｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）Ｉおよ
びＩＩ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．８５：１２７４−１
２７９，１９６３）を含有するＧＣ基礎培地（ＤＩＦＣ
Ｏ）中で５％ＣＯ２雰囲気下で増殖させる。Ｍａｎｅｓ
ｓら（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２８：３２１−３
３０）に記載された淋菌株ＦＡ１９から、Ｓｔｅｒｎら
（Ｃｅｌｌ ３７：４４７−４５６，１９８４）の方法
にしたがって、消化に必要なＤＮＡを単離した。この菌
株はプロティンＩＡを生産することが知られている。下
記の条件下で全ての消化を行った。約２０μｌのＤＮＡ
試料を、２−１０倍過剰の制限酵素中で３７℃で１−３
時間インキュベートした。この条件の例外は、ＴａｑＩ
に関して温度６５℃、ＳｍａＩに関して３０℃である。 ６．１．２．制限酵素緩衝液 ＡｃｃＩ、ＭｓｐＩおよびＲｓａＩ消化に用いた緩衝液
は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌおよび１０ｍＭＭｇＣｌ２
からなり、ｐＨ８である。ＡｖａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＴａｑＩ消化に用いた緩衝液は、５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ ＮａＣ
ｌからなり、ｐＨ８である。ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩお
よびＳａｌＩ消化に用いた緩衝液は、５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌからなり、ｐＨ８である。ＨｉｎｃＩＩ、Ｓａｕ３
ＡＩおよびＳｍａＩ消化に用いた緩衝液は、２０ｍＭト
リス−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌからなり、ｐＨ７．４である。０．５Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．５）を最終濃度１０ｍＭとなるように添加し
て反応を停止させる。 ６．１．３．関連する制限断片の同定 大腸菌株ＨＢ１０１（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８２）において、
ｐＢＲ３２２のＰＩＡを他のベクタープラスミド上にク
ローニングする初期の試みは、否定的な結果の繰り返し
であった。したがって、ＰＩＡ遺伝子またはそのタンパ
ク質を含有する断片を、オリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリッド形成によって同定することを試みること
にした。Ｎ．ゴノロエアエ菌株Ｒ１０のＰＩＢの公知の
Ｎ−末端アミノ酸配列（Ｂｌａｋｅら、Ｉｎｆｅｃ
ｔ．，Ｉｍｍｕｎ．３６：２７７−２８５，１９８２）
に基づいて、２つのプローブを設計した。２つの他の淋
菌タンパク質であるピリンＭｅｙｅｒら、ＰＮＡＳ Ｕ
ＳＡ ８１：６１１０−６１１４，１９８４）およびＰ
ＩＩの遺伝子配列から得られた限られた量のコドン使用
データとともに、この情報をＮＣ１およびＮＣ２と命名
された第２図に示す１対のオリゴヌクレオチドを構築し
た。ＮＣ１はただ一つの配列であり、ＮＣ２は正しい配
列を同定する確率を高めることを意図したヌクレオチド
の混合集団である。コロニーハイブリッド形成アッセイ
において、これら両方のオリゴヌクレオチドはＦＡ１９
とハイブリッド形成したが、ｐＢＲ３２２またはｐＧＥ
Ｍ−２のいずれか一方を含有するＨＢ１０１とはハイブ
リッド形成しなかった。制限エンドヌクレアーゼ消化さ
れたＤＮＡをアガロースゲルで操作し、Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎのブロット法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３
−５１７，１９７８）によりゲルからニトロセルロース
フィルターへ移した。ＮＣ１およびＮＣ２オリゴプロー
ブをＭａｎｉａｔｉｓらの方法（上記）にしたがってポ
リヌクレオチドキナーゼを用いてγ−Ｐ３２ＡＴＰ（Ｉ
ＣＮＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃ
ａｌｉｆ．）で標識した。下記の緩衝液中で末端標識を
行った。トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、
０．１ｍＭスペルミジンおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ。
ニトロセルロースフィルター上のＤＮＡに対する標識オ
リゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、４×ＳＳＰＥ
（０．１８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ
４［ｐＨ７．４］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、２×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔの溶液（１×＝０．０２％ウシ血清アルブミ
ン、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピ
ロリジン）、２０ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２％
ドデシル硫酸ナトリウムおよび５０μｇ／ｍｌサケ精液
ＤＮＡ中で、ハイブリッド形成反応液１ｍｌ当り１０６
ｃｐｍの標識オリゴヌクレオチドを用いて一晩行った。
フィルターを１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、５ｍＭピロリン酸ナト
リウムおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中で洗浄
した。ハイブリッド形成および洗浄の温度は、ＮＣ１お
よびＮＣ２についてそれぞれ４６℃および４０℃であっ
た。フィルターを５×ＳＳＣ中で洗浄し、乾燥し、Ｋｏ
ｄａｋ Ｘ線フィルムに暴露した。１個のフラグメント
に対するハイブリッド形成が個々の場合に起こった。関
連する断片はＥｃｏＲＩ−１０ｋｂ、ＳａｌＩ−５．５
ｋｂ、Ｓａｕ３ＡＩ−９００ｂｐおよびＴａｑＩ−７５
０ｂｐであった。ＮＣ１およびＮＣ２の両者について同
一の結果が観察された。 ６．１．４．断片のクローニング ｐＢＲ３２２にクローニングされたＥｃｏＲＩまたはＳ
ａｌＩ消化ＤＮＡを含有するＨＢ１０１のコロニーライ
ブラリーを、コロニーハイブリッド形成法によってオリ
ゴヌクレオチドＮＣ１をプローブとして探査すると、陽
性のコロニーは観察されなかった。このことはＰＩが大
腸菌に対して致死的てあることを示唆する先の観察を支
持した。ＦＡ１９ＤＮＡのより小さな断片、すなわちオ
リゴヌクレオチドとハイブリッド形成したＳａｕ３ＡＩ
およびＴａｑＩ消化物は、全ＰＩ遺伝子を含有していな
いと推定され、クローニングのための候補として選択さ
れた。各断片について、本格的に同じ操作にしたがっ
た。Ｓａｕ３ＡＩ断片については、全ＦＡ１９ ＤＮＡ
をＳａｕ３ＡＩで完全に消化した。プラスミドｐＧＥＭ
−２（Ｐｒｏｍｅｇａ ＢｉｏｔｅｃＭａｄｉｓｏｎ，
Ｗｉｓ．より入手）ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、Ｓａ
ｕ３ＡＩ断片に結合した。ＤＮＡ断片の結合はＴ４リガ
ーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅ
ｖｅｒｌｅｙ，Ｍａｓｓ．）を用い４℃で１６時間、次
のバッファー中で行った。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％（ｗ／ｖ）ポ
リエチレングリコール８０００、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ。ＭａｎｄｅｌおよびＨｉｇａの塩化カルシ
ウム法（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．５３：１５４，１９７
０）により、この組換えプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１
を形質転換した。これについて概説すると、細菌細胞を
５０ｍＭ ＣａＣｌ２および１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８、の氷冷滅菌溶液に懸濁し、次いで結合緩衝液中
でプラスミドＤＮＡと混合する。約２０００個の形質転
換が回収された。細菌コロニーを、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ
およびＨｏｇｎｅｓｓの方法（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
２：３９６１−３９６５，１９７５）にしたがってハイ
ブリッド形成により調製されたニトロセルロースフィル
ター上に移し、オリゴＮＣｌとのハイブリッド形成を観
察した。１個のコロニーが実際にこのオリゴヌクレオチ
ドとハイブリッド形成した。プラスミドＤＮＡを増幅
し、集め、Ｓａｕ３ＡＩで消化し、すでに述べたサザン
ハイブリッド形成法によってオリゴＮＣｌをプローブと
して探査した。９００ｂｐの１個の断片がこのオリゴヌ
クレオチドとハイブリッド形成し、これは先のサザンハ
イブリッド形成によって同定されたＦＡ１９のＳａｕ３
ＡＩゲノム断片と同じ大きさであった。この断片を切り
取り、アガロースゲルから電気的に溶出し（ｅｌｅｃｔ
ｒｏｅｌｕｔｅ）、ＢａｍＨｌ消化ｐＧＥＭ−２プラス
ミドに再び結合させて、組換えプラスミドｐＵＮＣ３を
作成した（第２図）。オリゴＮＣ１とハイブリッド形成
したＦＡ１９の７５０ｂｐのＴａｑＩ断片を用いて実質
的に前記と同じ操作を行った。しかし、ＴａｑＩ断片は
ｐＧＥＭ−２のＡｃｃＩ消化部位に結合して、組換えプ
ラスミドＰＵＮＣ１１を得た（第２図）。 ６．１．５．サブクローニングおよび断片の配列決定 配列決定に先立って、７５０ｂｐのＴａｑＩ断片を酵素
ＲｓａＩおよびＭｓｐＩを用いて消化して、３００ｂｐ
以下のより小さな制限断片とした。次いで断片の末端を
修復し、Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ら（Ｇｅｎｅ ２６：１
０１−１０６，１９８３）により記載されたようにし
て、Ｍ１３ ｍｐ１８ ＲＦ ＤＮＡのＳｍａＩ部位に
結合した。次いで、このクローニングベクターによって
作成された１本鎖ＤＮＡは、Ｓａｎｇｅｒらの方法（Ｐ
ＮＡＳＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７，１９７７）
によって配列決定するための鋳型として用いられる。Ｓ
ａｎｇｅｒ（上記）およびそれに含まれる参考文献（Ｂ
ＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）に記載の方
法にしたがって、ジデオキシヌクレオチドを調製するこ
とができる。各ＤＮＡ試料につき４個のウェル、すなわ
ちジデオキシヌクレオチドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよ
びｄｄＧのそれぞれについて１個のウェルを用意する。
各ウェルに、鋳型ＤＮＡ２μｌ、ならびにプライマー混
合物（ＢＲＬ由来の１１μｌの（２２ｎｇ）Ｍ１３ １
７塩基プライマー、１１μｌのＴＭ（１００ｍＭトリス
＋５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．５）および６６μｌ
のＨ２Ｏ（１０クローンにつき）からなる）２μｌを添
加する。これらを回転させ、プラスチックラップでおお
い、５６℃で５０−６０分間インキュベートする。イン
キュベートした後、２μｌの適当なＮＴＰ混合液を各ウ
ェルに添加する。各混合液は１０−５００μＭのｄｄＮ
ＴＰおよび各６．２５μＭの通常のｄＮＴＰを含有す
る。ＮＴＰ混合液の添加後、２μｌのクレノウ混合液を
各ウェルに添加した。このクレノウ混合液は、１１μｌ
のクレノウ（１Ｕ／μｌに希釈）、１１μｌの０．１Ｍ
ジチオスレイトール、４．４μｌの３５Ｓ−ｄＡＴＰお
よび６１．６μｌのＨ２Ｏからなる。この混合物を回転
させ、プラスチックラップでおおい、３０℃で１５分間
再度インキュベートする。各ウェルに２μｌの追跡用混
合液（４種の全てのｄＮＴＰ０．２５ｍＭ）を加え、回
転させ、３０℃で１５分間再度インキュベートする。次
いで２μｌのホルムアミド色素を各ウェルに加えた後、
おおいをせずに８０℃で１５分間インキュベートする。
この時点で、これらの混合物をゲルにすぐ負荷でき、あ
るいはラップして−８０℃で保存することができる。こ
の操作法て使用したゲルは下記の組成を有する。 ゲルを６０ワットの定出力で３−４時間操作し、次いで
１０％酢酸および１０％メタノール中で１５分間固定し
たのち、これらを紙の上で乾燥し、ＫｏｄａｋＸ線フィ
ルムに暴露する。ＴａｑＩ断片について決定された配列
に基づいて、新規オリゴヌクレオチドであるＮＣ８を作
成した。５’ＧＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣ３’
の配列を有するこの新規オリゴヌクレオチドは、前もっ
てクローニングされた９００ｂｐの断片に隣接する８５
０ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片を同定するためにサザンハイ
ブリッド形成に用いられ、この８５０ｂｐはｐＧＥＭ−
２にクローニングされてプラスミドｐＵＮＣ１５（第２
図）を生成し、前記の手法で配列決定された。ＰＩ遺伝
子の全配列を第３図に示す。この配列の唯一の大きな読
みとり枠は塩基８４と１０６２の間に存在しており、こ
れは３２６個アミノ酸タンパク質に相当する。種々のＰ
Ｉタンパク質の刊行されたＮ−末端アミノ酸配列（Ｂｌ
ａｋｅ，上記）から、成熟タンパク質の最初の残基はお
そらく塩基１４１のアスパラギン酸であった。このこと
は３０７アミノ酸の成熟タンパク質および１９アミノ酸
のシグナルペプチドを与える。このタンパク質の推定の
大きさは３３，７８６ダルトンであり、これはＦＡ１９
におけるＰＩの見かけの分子量３５，０００に近い。こ
のシグナルペプチドは、このような配列に関連した共通
の特性を有すると思われ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５，１９８
５）、一続きの疎水性アミノ酸、豊富なアラニン残基お
よびＡｌａ−Ｘ−Ａｌａ切断部位を有する。また推定−
３５および−１０プロモーター配列、およびシグナル配
列の最初の残基のすぐ上流にＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒ
ｎｏリボゾーム結合部位も存在していた。上記プロモー
ター配列は配列および分離に関して大腸菌におけるこれ
らの配列に関するコンセンサスに近い（Ｈａｒｌｅｙ
ら、Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，１５：２３４３−２
３６１，１９８７）。予想されるＮ−末端アミノ酸配列
は、推定ＰＩＡタンパク質のアミノ酸配列決定により決
定されたものに合致し、（Ｂｌａｋｅ，Ｔｈｅ Ｐａｔ
ｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓｅｅｒｉａ，Ｇ．Ｋ．Ｓｃｈ
ｏｏｌｎｉｋ編、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，Ｗａｓｈ．）、Ｒ１０のＰＩＢタンパク質のそれ
ときわめて類似していた。予想されるタンパク質のヒド
ロパシープロフィールは、外層膜ポーリンタンパク質の
それに典型的であり、大腸菌０ｍｐＦおよび０ｍｐＣの
主要ポーリンと比較して優れており（第４図）、実質的
に疎水性伸長部をまったく持たない長い親水性領域によ
って特色付けられた。他の配列決定された淋菌外層膜タ
ンパク質のヒドロパシープロフィールとの相関はほとん
ど存在しなかった。 ６．２．遺伝子発現 完全なＰＩ遺伝子クローンを、ｐＵＮＣ３およびｐＵＮ
Ｃ１５のＳａｕ３ＡＩ断片の遺伝子の２つの部分を結合
させることによって回収する試みは、繰り返し失敗に終
わり、淋菌ＰＩは大腸菌にとって致死的であるという結
論に至った。したがって、ＰＩ遺伝子プロモーターの一
部分を除去し、ＰＩ遺伝子がｐＧＥＭ−２上でファージ
Ｔ７プロモーターの下流に位置するように、組換えプラ
スミドを構築した。大腸菌細胞は普通はＴ７プロモータ
ーから下流の遺伝子を転写するＴ７ポリメラーゼを含有
しないため、このプラスミドは安定に保持される。この
ようにして構築されたプラスミドがｐＵＮＣ７であり、
第５図に示したスキームにしたがって調製された。ＰＩ
遺伝子プロモーターの−３５と−１０領域の間の従来の
ＨａｅＩＩＩ部位により、−３５領域およびその上流配
列が容易に除去をできた。次に遺伝子の残りの部分をＴ
７プロモーターの制御下でｐＧＥＭ−２に挿入した。ｐ
ＵＮＣ７で形質転換されたＨＢ１０１は、コロニーラジ
オイムノアッセイで検出可能なＰＩを発現しなかった。
次に、ファージＴ７ポリメラーゼ遺伝子を有するがＬａ
ｃ ＵＶ５プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ，Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０，１９８６）の
制御下にある溶原菌である。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）
を、プラスミドｐＵＮＣ７で形質転換した。イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含
まない培地で生育させると、プラスミドｐＵＮＣ７を有
するＢＬ２１（ＤＥ３）は検出可能なＰＩを生産しなか
ったが、培地中にＴ７ポリメラーゼ生産を誘導するＩＰ
ＴＧが存在すると、ＰＩ遺伝子生産物はコロニーブロッ
トラジオイムノアッセイでＰＩＡモノクローナル抗体に
よって検出された。発現されたタンパク質は、生産物が
細胞を溶解することなくコロニーラジオイムノアッセイ
で検出されうることから、大腸菌クローンの内層膜を通
って有効に運び出されると思われる。このタンパク質
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第６図Ａ）およびウェスタンブ
ロッティング（第６図Ｂ）によって検出されたＦＡ１９
と比較して、同等の見かけの分子量を有し、ＩＰＴＧ存
在下で一晩生育させる間にクローンによって産生される
最も大量のタンパク質であるとも思われる。このタンパ
ク質生産は特にこの大腸菌株に致死的であり、安定な細
胞を回収することはできない。しかしＩＰＴＧ含有培地
での生育によって発現が誘導されないならば、ＰＩ遺伝
子を包含するプラスミドｐＵＮＣ７を有する菌株中に安
定に保持することがてきる。プラスミドｐＵＮＣ７を有
する菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）の生物学的に純粋な培養物
は、１９８７年１１月１３日に、ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈｅ
ｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ−
ｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）に受託番号ＮＲＲＬ ♯Ｂ−
１９２６３のもとに寄託された。 ７．実施例２：ＰＩＢ遺伝子の同定、単離、配列決定お
よび発現ならびにＰＩＡ／Ｂハイブリッドの構築および
発現 ｎｍｐ 遺伝子座がＰＩ構造遺伝子であること、そしてＰ
ＩＡおよびＰＩＢタンパク質が対立遺伝子であることを
示そうとする試みの結果として、ＰＩＢ遺伝子およびＰ
ＩＡ／Ｂハイブリッドの両者が同定および単離された。
順次行われる手順はＰＩＡ含有菌株への選択可能なマー
カーの挿入、それに続くＰＩＢ生産菌株の形質転換を包
含する。これらの操作法の輪郭を以下に詳細に述べる。 ７．１．ＰＩ遺伝子への選択可能なマーカーの挿入 ＦＡ１９（ＰＩＡ生産菌株）のＰＩ遺伝子の最初の４５
コドンおよび上流配列を含む、上記ｐＵＮＣ３の９００
ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片を、ＢａｍＨＩ消化ｐＨＳＳ６
に結合してプラスミドｐＮＣＳ２を作成した（第７
図）。次にこのプラスミドをシャトル突然変異誘発に付
した。シャトル突然変異誘発はＳａｉｆｅｒｔら（上
記）の方法の変法を用いて行った。標的のＤＮＡをｐＨ
ＳＳ６にサブクローニングし、大腸菌株ＲＤＰ１４６
（ｐＴＣＡ）に形質転換により導入し、続いて接合によ
りｐＯＸ３８：：ｍＴｎ３Ｃｍ−３（大腸菌Ｗ３１１
ｐｏｌＡ由来）を導入した。トランス接合体を３０℃で
一夜生育させて転位を起こさせ、続いて数時間３７℃で
生育させた。トランス接合体の「プール」（約１０００
コロニー）を再懸濁し、大腸菌ＮＳ２１１４Ｓｍとの接
合に際してドナーとして使用した。その場合、標的のプ
ラスミドへ転位する際に中間体として生じたプラスミド
同時組込み体が分解する（Ｓｅｉｆｅｒｔら、上記）。
こうして挿入されたトランスポゾンは、プラスミドｐＴ
ＣＡ上でトランスに与えられるトランスポザーゼ機能が
もはや存在しないため安定である。この場合に用いられ
たミニトランスポゾンは、Ｔｎ３のｂｌａ遺伝子がクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子により置き換えられたｍＴｎ３Ｃｍ−３であ
る。ｐＮＣＳ２の９００ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片内のｍ
Ｔｎ３Ｃｍ−３挿入部位をマッピングした後、種々の部
位にｍＴｎ３Ｃｍ−３を有する５種のこのような構築物
を、全挿入物を線状断片として放出させＮｏｔＩで消化
して、ＦＡ１９を形質転換するのに使用した。消化され
たプラスミドであるｐＮＣＳ３２（第７図）だけが、約
１×１０−７の頻度でＦＡ１９をＣｍｒに形質転換し
た。ｐＮＣＳ３２におけるｍＴｎ３Ｃｍ−３の挿入部位
はＰＩＡ遺伝子プロモーター配列の約３００ｂｐ上流で
あったが、他の４つのプラスミドの挿入部位はすべて、
ＰＩ遺伝子内ではないがより近接していた。形質転換体
ＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１（第７図）のゲノム中のｍＴｎ
３Ｃｍ−３の位置をサザンハイブリッド形成によって確
認した。先行する研究（Ｃａｎｎｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ，１４３：８４７−８５１，１９８０；Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：５４７−５５２，１９８
１）はＰＩの分子量および抗原性に影響を与えるｎｍｐ
遺伝子座が淋菌ゲノム上で抗生物質耐性マーカーｓｔｒ
およびｓｐｃと、ｓｔｒ−ｓｐｃと、ｎｍｐの順で近接
して結合しており、同時形質転換頻度はｓｔｒおよびｎ
ｍｐについて５％、ｓｐｃおよびｎｍｐについては約２
３％であることを示している。ＰＩ構造遺伝子に隣接す
るＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１のＣＡＴマーカーがｎｍｐ遺
伝子座と同じリンケージパターンを示したかどうかを調
べるために、菌株ＦＡ１３０（ＳｔｒｒＳｐｃｒＣ
ｍｓ）Ｓａｒｕｂｂｉら、Ｊ．Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌ．
１２０：１２８４−１２９２，１９７４）とＦＡ１９
ＣＡＴ Ｄ１（ＳｔｒｓＳｐｃｓＣｍｒ）の間で相互乗
り換えを行った。ＦＡ１３０ ＤＮＡをＦＡ１９ ＣＡ
ＴＤ１の形質転換に用いた場合に、ＳｔｒｒまたはＳｐ
ｃｒのいずれか一方を選択すると、同時形質転換頻度は
ｓｐｃおよびＣＡＴについて２６％（９９／３８３）、
ｓｔｒおよびＣＡＴについて７．５％（４０／５３７）
てあった。相互乗り換えにおいて、Ｃｍｒを選択する
と、同時形質転換頻度はｓｐｃおよびＣＡＴについて１
０％（１１／１１１）、ｓｔｒおよびＣＡＴについて１
％（１／１１１）であった。乗り換え程度の分析によ
り、遺伝子の順序がｓｔｒ…ｓｐｃ…ＣＡＴであること
が確認された。これらのデータはＣＡＴ遺伝子がｎｍｐ
遺伝子座と同じ様式でｓｔｒおよびｓｐｃマーカーと結
合していることを実証した。このことはｎｍｐ遺伝子座
がＰＩの構造遺伝子であることの強力な証拠を与える。
もう一つの乗り換えに際しては、ＰＩＢ菌株ＭＳ１１を
形質転換するためにＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１ ＤＮＡを
用い、Ｃｍｒを選択した。４５個の形質転換体のうち、
２４個は供与株のＰＩＡを獲得し、１３個は受容株ＰＩ
Ｂを保持し、そして８個は新規ハイブリッドＰＩＡ／Ｐ
ＩＢタンパク質を発現した。これはコロニーイムノブロ
ッティングにより検出された。近接して結合したＣＡＴ
遺伝子を選択するときの供与株ＰＩＡによる受容株ＰＩ
Ｂの置換は、これらの遺伝子の対立遺伝子としての性質
を確証するものであり、そしてハイブリッドタンパク質
が高頻度に出現することは、２つの対立遺伝子間の配列
相同性により遺伝子内組換えが起こることを示唆した。
これらのＰＩハイブリッド菌株の詳細な分析はＭＳ１１
のＰＩＢ配列に関する知識の如何に左右されるので、こ
の配列をクローニングして配列決定した。 ７．２．ＰＩＢ遺伝子のクローニング、配列決定及び発
現 完全無欠な淋菌ＰＩ遺伝子を大腸菌にクローニングする
ことはできないと思われるため、一緒になって完全な遺
伝子配列を含有するものであるＰＩＡについて上記した
クローニング断片の方法を、ＭＳ１１ ＰＩ遺伝子に採
用した。予めハイブリッドＰＩを有するとして特性決定
された菌株ＦＡ６１４９（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎら、Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９−５３３，１９８
６）のＰＩ遺伝子内からのＤＮＡ断片を、クローニング
して配列決定し、そして配列のＰＩＢ部分、遺伝子の開
始点から約３００ｂｐ、にＫｐｎＩ部位が存在すること
が判明した。ＫｐｎＩ部位下流のＰＩＢ遺伝子配列から
誘導されたオリゴヌクレオチドＮＣ１２（第８図）、お
よびこのタンパク質のＮ−末端に対応する遺伝子配列か
ら誘導されたＮＣ１（第１図）を、サザンハイブリッド
形成でのプローブとして用い、ＭＳ１１ ＰＩ遺伝子に
ＫｐｎＩ部位が存在することを確認した。ベクタープラ
スミドｐＧＥＭ−３にクローニングされたＫｐｎＩ／Ｈ
ｉｎｃＩＩ−消化ＭＳ１１ ＤＮＡを含有するＨＢ１０
１コロニーを、これらのオリゴヌクレオチドをプローブ
として探査し、ＮＣ１２とハイブリッド形成するコロニ
ーを検出し、そしてこれらのコロニーがＮＣ１２とハイ
ブリッド形成した１．８ｋｂのＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩ
断片を有するプラスミドを含有することを見いだした。
このプラスミドをｐＵＮＣＨ２２（第８図）と命名し
た。しかし繰り返し試みても、ＮＣ１とハイブリッド形
成するコロニーは検出されなかった。ＮＣ１はサザンハ
イブリッド形成でＭＳ１１ゲノムＤＮＡの７５０ｂｐの
ＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩ断片とハイブリッド形成したた
め、問題点は大きさにあるのではなく、コピー数の多い
ベクターにおいては、ＨＢ１０１に対して致命的である
この断片のＰＩ遺伝子部分の発現の問題である可能性が
高いと思われた。この理由から、プローブとしてオリゴ
ヌクレオチドＮＣ１を用いて、ＭＳ１１ＰＩ遺伝子の残
りの部分をλｇι１１における５４０ｂｐのＨｉｎｆＩ
断片として単離した。このクローンをλｇｔ１１．ＮＣ
１（第８図）と命名した。λｇｔ１１．ＮＣ１の５４０
ｂｐのＨｉｎｆＩ断片およびｐＵＮＣＨ２２のＫｐｎＩ
−Ｓａｕ３ＡＩフラグメントをさらに消化し、サブクロ
ーニングし、配列決定した。この配列を第９図に示す。
この配列から３５０アミノ酸のタンパク質が予想され、
そのうち最初の１９は推定シグナルペプチドである、Ｆ
Ａ１９およびＭＳ１１のＰＩ遺伝子の比較は、８０％の
ヌクレオチド配列相同性を示す。ＰＩＡ（ＦＡ１９）お
よびＰＩＢ（ＭＳ１１）の予想アミノ酸配列の比較を第
１０図に示す。これは長い相同領域が散在する数多くの
有意に相違する領域を示す。淋菌細胞全体に対して生じ
るＰＩ−特異的モノクローナル抗体はＰＩＡとＰＩＢと
の間で全く交差反応性ではないので（Ｋｎａｐｐら、
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５０：４４−４８，１９
８４）、相違領域の一部はおそらくタンパク質の表面に
露出した抗原性の部分に相当する。ＰＩＡの場合と同じ
方法を用いて完全なＰＩＢ遺伝子の発現を達成した
（６．２節）。ＰＩＢ遺伝子プロモーターの−３５およ
び−１０領域間のＮｃｉＩ部位から遺伝子内のＫｐｎＩ
部位までのλｇｔ１１．ＮＣ１挿入ＤＮＡの断片を、Ｈ
ｉｎｃＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたベクターｐＧ
ＥＭ−２内にｐＵＮＣＨ２２の７５０ｂｐのＫｐｎＩ−
Ｓａｕ３ＡＩ断片と一緒に連結させた。この結果、それ
自身のプロモーターを持たないがプラスミドベクター上
のＴ７プロモーターのすぐ下流に完全なＰＩＢコード配
列を生じた。この構築物（ｐＵＮＣＨ２５）をＢＬ２１
（ＤＥ３）に導入し、ＩＰＴＧ存在下に生育させると、
ＰＩＢの発現を検出することができた（第１１図）。プ
ラスミドｐＵＮＣＨ２５を有する生物学的に純粋な大腸
菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに受託番号
６７７７５のもとに寄託されている。 ７．３．ＰＩＡ／Ｂハイブリッド菌株の構築および分析 さらに、ＭＳ１１をＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１ ＤＮＡで
形質転換し（Ｂｉｓｗａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１２９：９８３−９９２，１９７７）、Ｃｍｒを選
択し、イムノブロッティングによりＰＩを検出すること
により、ＰＩＡ／Ｂハイブリッドを構築した。相互乗り
換えにおいて、ＰＩＢを保持しているＭＳ１１のＣｍｒ
形質転換体由来のＤＮＡをＦＡ１９の形質転換に使用
し、Ｃｍｒで選択し前記のようにＰＩを検出した。抗生
物質耐性を表現型として発現させるために、細胞をＧＣ
基礎ブロス中で、あるいは抗生物質を含有する軟寒天上
層を添加した。ＧＣ基礎寒天培地中で５時間インキュベ
ートした。受容株としてＦＡ１９を用い、Ｃｍｒで選択
するときは１μｇ／ｍｌの抗生物質を使用したが、ＭＳ
１１を受容株であるときは１０μｇ／ｍｌを用いた。Ｃ
ａｎｎｏｎらの方法の変法を用いてモノクローナル抗体
の結合について細菌株をアッセイした。ＧＣ基礎ブロス
中の高濃度細胞懸濁液を濾過マニホルドを用いてニトロ
セルロースに移し、クロロホルム蒸気中で溶解させた。
このフィルターを５％粉乳を含有するＴＢＳ（１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ２）に浸漬し、適当な抗体を含有するＴＢＳ中でイン
キュベートし、つぎにＴＢＳ中で洗浄した。二次抗体と
接合した抗マウスＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ
（Ｓｉｇｍａ）中でインキュベートし、さらに洗浄した
後、フィルターをニトロブルーテトラゾリウムおよび５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）を用いて製造業者の指示にしたがって展開
した。使用したモノクローナル抗体は、４Ａ１２，４Ｇ
５，２Ｆ１２，６Ｄ９，５Ｇ９，５Ｄ１（１０），１Ｄ
３（２６）およびＳＭ１０１（２７）（これらは全てＰ
ＩＡ特異的である）、ならびに１Ｆ５，３Ｃ８，２Ｄ４
および２Ｈ１（１０）（これらはＰＩＢ特異的である）
であった。ＳＭ１０１以外の全ての抗体はＭ．Ｔａｍ
（ＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）の厚意により腹水中
で供給され、１：２０００ないし１：１００００の希釈
で用いられた。ＳＭ１０１はＪ．Ｈｅｃｋｅｌｓ（Ｓｏ
ｕｔｈａｍｐｔｏｎ大学）の厚意により提供された。受
容株としてＦＡ１９を用いた３００個の形質転換体のう
ち、３個がハイブリッドＰＩを有した。１３個のハイブ
リッド菌株のうち、５個の異なるハイブリッドＰＩ血清
型が同定された（第Ｉ表）。次にハイブリッドＰＩ遺伝
子のどの部分がＰＩ配列であるか、そしてどれがＰＩＢ
配列であるかを評価するために、多数のＰＩＡ−及びＰ
ＩＢ−特異的オリゴヌクレオチド（第ＩＩ表および第１
０図）を用いるコロニーハイブリッド形成によりハイブ
リッド菌株を分析し、この方法により９個の異なるクラ
スが検出された（第１０図）構造を既知のハイブリッド
ＰＩの血清型の分析により、これらのモノクローナル抗
体についてのエピトープのおよその位置を決定すること
ができた。 クラス１ハイブリッドと反応するＰＩＡ特異的モノクロ
ーナル抗体４Ｇ５、２Ｆ１２およびＳＭ１０１のエピト
ープは、タンパク質のＮ−末端の近く、最初の６０残基
以内に存在するはずである。ハイブリッドクラス１、５
および６の比較は、ＳＭ１０１に対するエピトープが少
なくとも部分的には残基３４と６０の間の領域に存在す
ることが示唆される。Ｎ−末端６０残基はＰＩＡおよび
ＰＩＢ間で有意な相違を含み（第３図、第９図、第１０
図）、これはこれらの抗体の特異性の説明となりうる。
ハイブリッドクラス６−９と反応する６Ｄ９（ＰＩＡ特
異的）のエピトープは、残基１８７から２５０までのタ
ンパク質領域に存在し、この領域もまたＰＩＡおよびＰ
ＩＢの間で有意に異なる領域を含む。４Ａ１２，５Ｇ
９，５Ｄ１および１Ｄ３（すべてＰＩＡ特異的）のエピ
トープは、クラス９のハイブリッドタンパク質において
のみ検出され、したがっておそらくタンパク質のＮ−末
端およびＣ−末端部分の両方を含む複合エピトープであ
る。このことは、タンパク質が比較的に変性されるウェ
スタンブロットではＰＩとよく反応しないという観察に
よって支持される。ＭＳ１１のＰＩＢと反応する４個の
抗体のうち、ハイブリッドクラス７および８と反応する
７Ｆ５のエピトープはＮ−末端６０残基内に位置する
が、３Ｃ８，２Ｄ４および２Ｈ１のエピトープは分岐配
列を含有するタンパク質の中央部、残基１５０から２７
０までの間に存在すると思われ、この部分は長く伸びた
クラス９ハイブリッドタンパク質が３Ｄ８とのみ反応す
ることから、３Ｃ８のエピトープは２Ｄ４および２Ｈ１
のエピトープのわずかに上流に位置する。しかし、２Ｄ
４および２Ｈ１がウエスタンブロットではＰＩＢと反応
しないことから、これらのエピトープは比較的複雑であ
りうる。ハイブリッドＰＩＡ／Ｂ遺伝子を含有してハイ
ブリッドＰＩＡ／Ｂタンパク質を発現する形質転換微生
物ＦＡ６２４８の生物学的に純粋な培養物は、ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに受託番号
５３８０８のもとに寄託されている。 ７．４．考 察 リポーター遺伝子をＰＩ構造遺伝子の近くに挿入した本
研究は、ＰＩＡおよびＰＩＢ構造遺伝子が同じ遺伝子座
の対立遺伝子であることを実証するものであり、この遺
伝子座はすでにｎｍｐとして同定された（Ｃａｎｎｏｎ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４３：８４７−８５
１，１９８０）。淋菌ゲノム上の１個のＰＩ遺伝子の存
在は、天然に存在する菌株がＰＩＡまたはＰＩＢタンパ
ク質のいずれか一方を有し両方を持つことは決してな
く、そしてＰＩ血清型が安定に保持されるとの観察に符
号する。ＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子と推定アミノ酸配列
の比較は高度の相同性を示したが、有意に配列の異なる
領域が確認された。ＰＩハイブリッドは天然には生じな
いが、本発明者らが構築したＰＩハイブリッドはインビ
トロで安定に生存した。しかし、ＰＩＢＮ−末端とのハ
イブリッドＰＩの形成頻度が比較的低く、ＰＩ遺伝子内
で多重乗り換えの起こる頻度が驚異的に高いことは、あ
る種のクラスのハイブリッドＰＩをインビトロ生育した
淋菌が好むのかも知れない。ＰＩハィブリッドの構築お
よび分析によって、本発明者らはタンパク質のいくつか
の表面露出部分のおよその位置を決定することができ、
二次および四次構造の可能性に対する知見が与えられ
た。ＰＩＡおよびＰＩＢの両方のＮ−末端領域は、各タ
ンパク質の中央部にある少なくとも１つの別の領域とと
もに表面に露出しているとと思われる。多くのＰＩＡ特
異的モノクローナル抗体のエピトープはＮ−末端および
Ｃ−末端部分の両方がハイブリッドＰＩ内に存在すると
きにのみ同定されたことから、外層膜内でのＰＩＡの折
り畳み状態はＮ−末端およびＣ−末端部分が表面上で密
接に関連しているような状態かもしれない。外層膜内で
のＰＡのコンフォーメーションに関するこのようなモデ
ルは、非処理の淋菌内でのＰＩのタンパク質加水分解的
切断に基づく先行モデルのいくつかの態様と一致するが
（Ｂｌａｋｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３３：２
１２−２２２，１９８１；Ｊｕｄｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．５４：４０８−４１４，１９８６）、ＰＩ
ＡのＮ−末端およびＰＩＢの中央部分のみが表面に露出
している（Ｂｌａｋｅら、上記；Ｔｅｅｒｌｉｎｋ，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：６３−７６，１９８７）
との既報の示唆とは異なる。 ８．微生物の寄託 列挙したプラスミドを有する下記の大腸菌株は、ｔｈｅ
Ａｇｒｉｃｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ），Ｐｅｏ
ｒｉａ，ＩＬまたはｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ，ＭＤに寄託され、表記の受託番号が付与され
ている。 本発明は寄託された菌株により範囲を限定されるもので
はない。なぜならば各菌株は本発明の一態様の一つの説
明として意図されるからであり、機能的に同等な全ての
細胞系は本発明の範囲を包含される。実際、ここに示さ
れかつ記載されたことに加えて本発明を種々変更するこ
とは、前記記載から当業者に明らかになるであろう。こ
のような変更は添付の請求の範囲内に包含されるものと
する。また、ヌクレオチドについて与えられた全ての塩
基対の大きさは概数であり、説明の目的で用いられるこ
とは当然のことである。
々の断片を別々にクローニングし、次いで外来の誘導可
能プロモーターとともに遺伝子を再構築することによ
り、ＰＩＡ遺伝子配列を決定した。前述のように、オリ
ゴヌクレオチドＮＣ１とのハイブリッド形成により、Ｐ
ＩＡ遺伝子配列の部分を有する２個の推定断片を同定し
た。次に関連する制限フラグメントをそれぞれｐＧＥＭ
−２プラスミドベクターに結合し、適当な宿主に形質転
換した。オリゴＮＣ１とハイブリッド形成した形質転換
体を単離した。これらのクローンからプラスミドＤＮＡ
を調製し、適当な制限酵素で消化し、再びＮＣ１をプロ
ーブとして探査した。ＮＣ１とハイブリッド形成した個
々の断片を、次いで別々にｐＧＥＭ−２プラスミドに再
連結して、２つの別個のプラスミド、ｐＵＮＣ３および
ｐＵＮＣ１１を得た。７５０ｂｐ断片のＤＮＡ配列の同
一性は、それに由来するより小さな制限断片をＭ１３ｍ
ｐＲＦ ＤＮＡにサブクローニングし、次いでサンガー
法（ＰＮＡＳＵＳＡ ７４，５４６３−５４６７，１９
７７）にしたがって配列決定することにより決定され
た。この配列から、新規オリゴヌクレオチドを合成し
た。ＮＣ８と命名したこの新規オリゴヌクレオチドを、
すでにクローニングされた９００ｂｐ断片に隣接する８
５０ｂｐ断片を同定するために使用し、この断片をｐＧ
ＥＭ−２にクローニングしてｐＵＮＣ１５を生成させ、
サンガー法（上記）により配列決定した。プラスミド調
製、配列決定、ハイブリッド形成および形質転換に関す
る操作法の詳細、を以下に述べる。 ６．１．プラスミドの調製に用いられる一般的操作法 以下の小節には、ＤＮＡ単離、酵素反応、断片の単離お
よび結合反応に用いられる一般的操作法が記載される。 ６．１．１．制限酵素に関する条件 この実験に用いられる制限酵素は、特に指示しない限り
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，
Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手
される。Ｎ．ゴノロエアエ培養物は、ケロッグの添加物
（Ｋｅｌｌｏｇｇ’ｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）Ｉおよ
びＩＩ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．８５：１２７４−１
２７９，１９６３）を含有するＧＣ基礎培地（ＤＩＦＣ
Ｏ）中で５％ＣＯ２雰囲気下で増殖させる。Ｍａｎｅｓ
ｓら（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２８：３２１−３
３０）に記載された淋菌株ＦＡ１９から、Ｓｔｅｒｎら
（Ｃｅｌｌ ３７：４４７−４５６，１９８４）の方法
にしたがって、消化に必要なＤＮＡを単離した。この菌
株はプロティンＩＡを生産することが知られている。下
記の条件下で全ての消化を行った。約２０μｌのＤＮＡ
試料を、２−１０倍過剰の制限酵素中で３７℃で１−３
時間インキュベートした。この条件の例外は、ＴａｑＩ
に関して温度６５℃、ＳｍａＩに関して３０℃である。 ６．１．２．制限酵素緩衝液 ＡｃｃＩ、ＭｓｐＩおよびＲｓａＩ消化に用いた緩衝液
は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌおよび１０ｍＭＭｇＣｌ２
からなり、ｐＨ８である。ＡｖａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＴａｑＩ消化に用いた緩衝液は、５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ ＮａＣ
ｌからなり、ｐＨ８である。ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩお
よびＳａｌＩ消化に用いた緩衝液は、５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌからなり、ｐＨ８である。ＨｉｎｃＩＩ、Ｓａｕ３
ＡＩおよびＳｍａＩ消化に用いた緩衝液は、２０ｍＭト
リス−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌからなり、ｐＨ７．４である。０．５Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．５）を最終濃度１０ｍＭとなるように添加し
て反応を停止させる。 ６．１．３．関連する制限断片の同定 大腸菌株ＨＢ１０１（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８２）において、
ｐＢＲ３２２のＰＩＡを他のベクタープラスミド上にク
ローニングする初期の試みは、否定的な結果の繰り返し
であった。したがって、ＰＩＡ遺伝子またはそのタンパ
ク質を含有する断片を、オリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリッド形成によって同定することを試みること
にした。Ｎ．ゴノロエアエ菌株Ｒ１０のＰＩＢの公知の
Ｎ−末端アミノ酸配列（Ｂｌａｋｅら、Ｉｎｆｅｃ
ｔ．，Ｉｍｍｕｎ．３６：２７７−２８５，１９８２）
に基づいて、２つのプローブを設計した。２つの他の淋
菌タンパク質であるピリンＭｅｙｅｒら、ＰＮＡＳ Ｕ
ＳＡ ８１：６１１０−６１１４，１９８４）およびＰ
ＩＩの遺伝子配列から得られた限られた量のコドン使用
データとともに、この情報をＮＣ１およびＮＣ２と命名
された第２図に示す１対のオリゴヌクレオチドを構築し
た。ＮＣ１はただ一つの配列であり、ＮＣ２は正しい配
列を同定する確率を高めることを意図したヌクレオチド
の混合集団である。コロニーハイブリッド形成アッセイ
において、これら両方のオリゴヌクレオチドはＦＡ１９
とハイブリッド形成したが、ｐＢＲ３２２またはｐＧＥ
Ｍ−２のいずれか一方を含有するＨＢ１０１とはハイブ
リッド形成しなかった。制限エンドヌクレアーゼ消化さ
れたＤＮＡをアガロースゲルで操作し、Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎのブロット法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３
−５１７，１９７８）によりゲルからニトロセルロース
フィルターへ移した。ＮＣ１およびＮＣ２オリゴプロー
ブをＭａｎｉａｔｉｓらの方法（上記）にしたがってポ
リヌクレオチドキナーゼを用いてγ−Ｐ３２ＡＴＰ（Ｉ
ＣＮＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃ
ａｌｉｆ．）で標識した。下記の緩衝液中で末端標識を
行った。トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、
０．１ｍＭスペルミジンおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ。
ニトロセルロースフィルター上のＤＮＡに対する標識オ
リゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、４×ＳＳＰＥ
（０．１８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ
４［ｐＨ７．４］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、２×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔの溶液（１×＝０．０２％ウシ血清アルブミ
ン、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピ
ロリジン）、２０ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２％
ドデシル硫酸ナトリウムおよび５０μｇ／ｍｌサケ精液
ＤＮＡ中で、ハイブリッド形成反応液１ｍｌ当り１０６
ｃｐｍの標識オリゴヌクレオチドを用いて一晩行った。
フィルターを１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、５ｍＭピロリン酸ナト
リウムおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中で洗浄
した。ハイブリッド形成および洗浄の温度は、ＮＣ１お
よびＮＣ２についてそれぞれ４６℃および４０℃であっ
た。フィルターを５×ＳＳＣ中で洗浄し、乾燥し、Ｋｏ
ｄａｋ Ｘ線フィルムに暴露した。１個のフラグメント
に対するハイブリッド形成が個々の場合に起こった。関
連する断片はＥｃｏＲＩ−１０ｋｂ、ＳａｌＩ−５．５
ｋｂ、Ｓａｕ３ＡＩ−９００ｂｐおよびＴａｑＩ−７５
０ｂｐであった。ＮＣ１およびＮＣ２の両者について同
一の結果が観察された。 ６．１．４．断片のクローニング ｐＢＲ３２２にクローニングされたＥｃｏＲＩまたはＳ
ａｌＩ消化ＤＮＡを含有するＨＢ１０１のコロニーライ
ブラリーを、コロニーハイブリッド形成法によってオリ
ゴヌクレオチドＮＣ１をプローブとして探査すると、陽
性のコロニーは観察されなかった。このことはＰＩが大
腸菌に対して致死的てあることを示唆する先の観察を支
持した。ＦＡ１９ＤＮＡのより小さな断片、すなわちオ
リゴヌクレオチドとハイブリッド形成したＳａｕ３ＡＩ
およびＴａｑＩ消化物は、全ＰＩ遺伝子を含有していな
いと推定され、クローニングのための候補として選択さ
れた。各断片について、本格的に同じ操作にしたがっ
た。Ｓａｕ３ＡＩ断片については、全ＦＡ１９ ＤＮＡ
をＳａｕ３ＡＩで完全に消化した。プラスミドｐＧＥＭ
−２（Ｐｒｏｍｅｇａ ＢｉｏｔｅｃＭａｄｉｓｏｎ，
Ｗｉｓ．より入手）ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、Ｓａ
ｕ３ＡＩ断片に結合した。ＤＮＡ断片の結合はＴ４リガ
ーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅ
ｖｅｒｌｅｙ，Ｍａｓｓ．）を用い４℃で１６時間、次
のバッファー中で行った。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％（ｗ／ｖ）ポ
リエチレングリコール８０００、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ。ＭａｎｄｅｌおよびＨｉｇａの塩化カルシ
ウム法（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．５３：１５４，１９７
０）により、この組換えプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１
を形質転換した。これについて概説すると、細菌細胞を
５０ｍＭ ＣａＣｌ２および１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８、の氷冷滅菌溶液に懸濁し、次いで結合緩衝液中
でプラスミドＤＮＡと混合する。約２０００個の形質転
換が回収された。細菌コロニーを、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ
およびＨｏｇｎｅｓｓの方法（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
２：３９６１−３９６５，１９７５）にしたがってハイ
ブリッド形成により調製されたニトロセルロースフィル
ター上に移し、オリゴＮＣｌとのハイブリッド形成を観
察した。１個のコロニーが実際にこのオリゴヌクレオチ
ドとハイブリッド形成した。プラスミドＤＮＡを増幅
し、集め、Ｓａｕ３ＡＩで消化し、すでに述べたサザン
ハイブリッド形成法によってオリゴＮＣｌをプローブと
して探査した。９００ｂｐの１個の断片がこのオリゴヌ
クレオチドとハイブリッド形成し、これは先のサザンハ
イブリッド形成によって同定されたＦＡ１９のＳａｕ３
ＡＩゲノム断片と同じ大きさであった。この断片を切り
取り、アガロースゲルから電気的に溶出し（ｅｌｅｃｔ
ｒｏｅｌｕｔｅ）、ＢａｍＨｌ消化ｐＧＥＭ−２プラス
ミドに再び結合させて、組換えプラスミドｐＵＮＣ３を
作成した（第２図）。オリゴＮＣ１とハイブリッド形成
したＦＡ１９の７５０ｂｐのＴａｑＩ断片を用いて実質
的に前記と同じ操作を行った。しかし、ＴａｑＩ断片は
ｐＧＥＭ−２のＡｃｃＩ消化部位に結合して、組換えプ
ラスミドＰＵＮＣ１１を得た（第２図）。 ６．１．５．サブクローニングおよび断片の配列決定 配列決定に先立って、７５０ｂｐのＴａｑＩ断片を酵素
ＲｓａＩおよびＭｓｐＩを用いて消化して、３００ｂｐ
以下のより小さな制限断片とした。次いで断片の末端を
修復し、Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ら（Ｇｅｎｅ ２６：１
０１−１０６，１９８３）により記載されたようにし
て、Ｍ１３ ｍｐ１８ ＲＦ ＤＮＡのＳｍａＩ部位に
結合した。次いで、このクローニングベクターによって
作成された１本鎖ＤＮＡは、Ｓａｎｇｅｒらの方法（Ｐ
ＮＡＳＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７，１９７７）
によって配列決定するための鋳型として用いられる。Ｓ
ａｎｇｅｒ（上記）およびそれに含まれる参考文献（Ｂ
ＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）に記載の方
法にしたがって、ジデオキシヌクレオチドを調製するこ
とができる。各ＤＮＡ試料につき４個のウェル、すなわ
ちジデオキシヌクレオチドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよ
びｄｄＧのそれぞれについて１個のウェルを用意する。
各ウェルに、鋳型ＤＮＡ２μｌ、ならびにプライマー混
合物（ＢＲＬ由来の１１μｌの（２２ｎｇ）Ｍ１３ １
７塩基プライマー、１１μｌのＴＭ（１００ｍＭトリス
＋５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．５）および６６μｌ
のＨ２Ｏ（１０クローンにつき）からなる）２μｌを添
加する。これらを回転させ、プラスチックラップでおお
い、５６℃で５０−６０分間インキュベートする。イン
キュベートした後、２μｌの適当なＮＴＰ混合液を各ウ
ェルに添加する。各混合液は１０−５００μＭのｄｄＮ
ＴＰおよび各６．２５μＭの通常のｄＮＴＰを含有す
る。ＮＴＰ混合液の添加後、２μｌのクレノウ混合液を
各ウェルに添加した。このクレノウ混合液は、１１μｌ
のクレノウ（１Ｕ／μｌに希釈）、１１μｌの０．１Ｍ
ジチオスレイトール、４．４μｌの３５Ｓ−ｄＡＴＰお
よび６１．６μｌのＨ２Ｏからなる。この混合物を回転
させ、プラスチックラップでおおい、３０℃で１５分間
再度インキュベートする。各ウェルに２μｌの追跡用混
合液（４種の全てのｄＮＴＰ０．２５ｍＭ）を加え、回
転させ、３０℃で１５分間再度インキュベートする。次
いで２μｌのホルムアミド色素を各ウェルに加えた後、
おおいをせずに８０℃で１５分間インキュベートする。
この時点で、これらの混合物をゲルにすぐ負荷でき、あ
るいはラップして−８０℃で保存することができる。こ
の操作法て使用したゲルは下記の組成を有する。 ゲルを６０ワットの定出力で３−４時間操作し、次いで
１０％酢酸および１０％メタノール中で１５分間固定し
たのち、これらを紙の上で乾燥し、ＫｏｄａｋＸ線フィ
ルムに暴露する。ＴａｑＩ断片について決定された配列
に基づいて、新規オリゴヌクレオチドであるＮＣ８を作
成した。５’ＧＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣ３’
の配列を有するこの新規オリゴヌクレオチドは、前もっ
てクローニングされた９００ｂｐの断片に隣接する８５
０ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片を同定するためにサザンハイ
ブリッド形成に用いられ、この８５０ｂｐはｐＧＥＭ−
２にクローニングされてプラスミドｐＵＮＣ１５（第２
図）を生成し、前記の手法で配列決定された。ＰＩ遺伝
子の全配列を第３図に示す。この配列の唯一の大きな読
みとり枠は塩基８４と１０６２の間に存在しており、こ
れは３２６個アミノ酸タンパク質に相当する。種々のＰ
Ｉタンパク質の刊行されたＮ−末端アミノ酸配列（Ｂｌ
ａｋｅ，上記）から、成熟タンパク質の最初の残基はお
そらく塩基１４１のアスパラギン酸であった。このこと
は３０７アミノ酸の成熟タンパク質および１９アミノ酸
のシグナルペプチドを与える。このタンパク質の推定の
大きさは３３，７８６ダルトンであり、これはＦＡ１９
におけるＰＩの見かけの分子量３５，０００に近い。こ
のシグナルペプチドは、このような配列に関連した共通
の特性を有すると思われ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５，１９８
５）、一続きの疎水性アミノ酸、豊富なアラニン残基お
よびＡｌａ−Ｘ−Ａｌａ切断部位を有する。また推定−
３５および−１０プロモーター配列、およびシグナル配
列の最初の残基のすぐ上流にＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒ
ｎｏリボゾーム結合部位も存在していた。上記プロモー
ター配列は配列および分離に関して大腸菌におけるこれ
らの配列に関するコンセンサスに近い（Ｈａｒｌｅｙ
ら、Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，１５：２３４３−２
３６１，１９８７）。予想されるＮ−末端アミノ酸配列
は、推定ＰＩＡタンパク質のアミノ酸配列決定により決
定されたものに合致し、（Ｂｌａｋｅ，Ｔｈｅ Ｐａｔ
ｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓｅｅｒｉａ，Ｇ．Ｋ．Ｓｃｈ
ｏｏｌｎｉｋ編、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，Ｗａｓｈ．）、Ｒ１０のＰＩＢタンパク質のそれ
ときわめて類似していた。予想されるタンパク質のヒド
ロパシープロフィールは、外層膜ポーリンタンパク質の
それに典型的であり、大腸菌０ｍｐＦおよび０ｍｐＣの
主要ポーリンと比較して優れており（第４図）、実質的
に疎水性伸長部をまったく持たない長い親水性領域によ
って特色付けられた。他の配列決定された淋菌外層膜タ
ンパク質のヒドロパシープロフィールとの相関はほとん
ど存在しなかった。 ６．２．遺伝子発現 完全なＰＩ遺伝子クローンを、ｐＵＮＣ３およびｐＵＮ
Ｃ１５のＳａｕ３ＡＩ断片の遺伝子の２つの部分を結合
させることによって回収する試みは、繰り返し失敗に終
わり、淋菌ＰＩは大腸菌にとって致死的であるという結
論に至った。したがって、ＰＩ遺伝子プロモーターの一
部分を除去し、ＰＩ遺伝子がｐＧＥＭ−２上でファージ
Ｔ７プロモーターの下流に位置するように、組換えプラ
スミドを構築した。大腸菌細胞は普通はＴ７プロモータ
ーから下流の遺伝子を転写するＴ７ポリメラーゼを含有
しないため、このプラスミドは安定に保持される。この
ようにして構築されたプラスミドがｐＵＮＣ７であり、
第５図に示したスキームにしたがって調製された。ＰＩ
遺伝子プロモーターの−３５と−１０領域の間の従来の
ＨａｅＩＩＩ部位により、−３５領域およびその上流配
列が容易に除去をできた。次に遺伝子の残りの部分をＴ
７プロモーターの制御下でｐＧＥＭ−２に挿入した。ｐ
ＵＮＣ７で形質転換されたＨＢ１０１は、コロニーラジ
オイムノアッセイで検出可能なＰＩを発現しなかった。
次に、ファージＴ７ポリメラーゼ遺伝子を有するがＬａ
ｃ ＵＶ５プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ，Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０，１９８６）の
制御下にある溶原菌である。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）
を、プラスミドｐＵＮＣ７で形質転換した。イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含
まない培地で生育させると、プラスミドｐＵＮＣ７を有
するＢＬ２１（ＤＥ３）は検出可能なＰＩを生産しなか
ったが、培地中にＴ７ポリメラーゼ生産を誘導するＩＰ
ＴＧが存在すると、ＰＩ遺伝子生産物はコロニーブロッ
トラジオイムノアッセイでＰＩＡモノクローナル抗体に
よって検出された。発現されたタンパク質は、生産物が
細胞を溶解することなくコロニーラジオイムノアッセイ
で検出されうることから、大腸菌クローンの内層膜を通
って有効に運び出されると思われる。このタンパク質
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第６図Ａ）およびウェスタンブ
ロッティング（第６図Ｂ）によって検出されたＦＡ１９
と比較して、同等の見かけの分子量を有し、ＩＰＴＧ存
在下で一晩生育させる間にクローンによって産生される
最も大量のタンパク質であるとも思われる。このタンパ
ク質生産は特にこの大腸菌株に致死的であり、安定な細
胞を回収することはできない。しかしＩＰＴＧ含有培地
での生育によって発現が誘導されないならば、ＰＩ遺伝
子を包含するプラスミドｐＵＮＣ７を有する菌株中に安
定に保持することがてきる。プラスミドｐＵＮＣ７を有
する菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）の生物学的に純粋な培養物
は、１９８７年１１月１３日に、ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈｅ
ｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ−
ｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）に受託番号ＮＲＲＬ ♯Ｂ−
１９２６３のもとに寄託された。 ７．実施例２：ＰＩＢ遺伝子の同定、単離、配列決定お
よび発現ならびにＰＩＡ／Ｂハイブリッドの構築および
発現 ｎｍｐ 遺伝子座がＰＩ構造遺伝子であること、そしてＰ
ＩＡおよびＰＩＢタンパク質が対立遺伝子であることを
示そうとする試みの結果として、ＰＩＢ遺伝子およびＰ
ＩＡ／Ｂハイブリッドの両者が同定および単離された。
順次行われる手順はＰＩＡ含有菌株への選択可能なマー
カーの挿入、それに続くＰＩＢ生産菌株の形質転換を包
含する。これらの操作法の輪郭を以下に詳細に述べる。 ７．１．ＰＩ遺伝子への選択可能なマーカーの挿入 ＦＡ１９（ＰＩＡ生産菌株）のＰＩ遺伝子の最初の４５
コドンおよび上流配列を含む、上記ｐＵＮＣ３の９００
ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片を、ＢａｍＨＩ消化ｐＨＳＳ６
に結合してプラスミドｐＮＣＳ２を作成した（第７
図）。次にこのプラスミドをシャトル突然変異誘発に付
した。シャトル突然変異誘発はＳａｉｆｅｒｔら（上
記）の方法の変法を用いて行った。標的のＤＮＡをｐＨ
ＳＳ６にサブクローニングし、大腸菌株ＲＤＰ１４６
（ｐＴＣＡ）に形質転換により導入し、続いて接合によ
りｐＯＸ３８：：ｍＴｎ３Ｃｍ−３（大腸菌Ｗ３１１
ｐｏｌＡ由来）を導入した。トランス接合体を３０℃で
一夜生育させて転位を起こさせ、続いて数時間３７℃で
生育させた。トランス接合体の「プール」（約１０００
コロニー）を再懸濁し、大腸菌ＮＳ２１１４Ｓｍとの接
合に際してドナーとして使用した。その場合、標的のプ
ラスミドへ転位する際に中間体として生じたプラスミド
同時組込み体が分解する（Ｓｅｉｆｅｒｔら、上記）。
こうして挿入されたトランスポゾンは、プラスミドｐＴ
ＣＡ上でトランスに与えられるトランスポザーゼ機能が
もはや存在しないため安定である。この場合に用いられ
たミニトランスポゾンは、Ｔｎ３のｂｌａ遺伝子がクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子により置き換えられたｍＴｎ３Ｃｍ−３であ
る。ｐＮＣＳ２の９００ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片内のｍ
Ｔｎ３Ｃｍ−３挿入部位をマッピングした後、種々の部
位にｍＴｎ３Ｃｍ−３を有する５種のこのような構築物
を、全挿入物を線状断片として放出させＮｏｔＩで消化
して、ＦＡ１９を形質転換するのに使用した。消化され
たプラスミドであるｐＮＣＳ３２（第７図）だけが、約
１×１０−７の頻度でＦＡ１９をＣｍｒに形質転換し
た。ｐＮＣＳ３２におけるｍＴｎ３Ｃｍ−３の挿入部位
はＰＩＡ遺伝子プロモーター配列の約３００ｂｐ上流で
あったが、他の４つのプラスミドの挿入部位はすべて、
ＰＩ遺伝子内ではないがより近接していた。形質転換体
ＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１（第７図）のゲノム中のｍＴｎ
３Ｃｍ−３の位置をサザンハイブリッド形成によって確
認した。先行する研究（Ｃａｎｎｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ，１４３：８４７−８５１，１９８０；Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：５４７−５５２，１９８
１）はＰＩの分子量および抗原性に影響を与えるｎｍｐ
遺伝子座が淋菌ゲノム上で抗生物質耐性マーカーｓｔｒ
およびｓｐｃと、ｓｔｒ−ｓｐｃと、ｎｍｐの順で近接
して結合しており、同時形質転換頻度はｓｔｒおよびｎ
ｍｐについて５％、ｓｐｃおよびｎｍｐについては約２
３％であることを示している。ＰＩ構造遺伝子に隣接す
るＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１のＣＡＴマーカーがｎｍｐ遺
伝子座と同じリンケージパターンを示したかどうかを調
べるために、菌株ＦＡ１３０（ＳｔｒｒＳｐｃｒＣ
ｍｓ）Ｓａｒｕｂｂｉら、Ｊ．Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌ．
１２０：１２８４−１２９２，１９７４）とＦＡ１９
ＣＡＴ Ｄ１（ＳｔｒｓＳｐｃｓＣｍｒ）の間で相互乗
り換えを行った。ＦＡ１３０ ＤＮＡをＦＡ１９ ＣＡ
ＴＤ１の形質転換に用いた場合に、ＳｔｒｒまたはＳｐ
ｃｒのいずれか一方を選択すると、同時形質転換頻度は
ｓｐｃおよびＣＡＴについて２６％（９９／３８３）、
ｓｔｒおよびＣＡＴについて７．５％（４０／５３７）
てあった。相互乗り換えにおいて、Ｃｍｒを選択する
と、同時形質転換頻度はｓｐｃおよびＣＡＴについて１
０％（１１／１１１）、ｓｔｒおよびＣＡＴについて１
％（１／１１１）であった。乗り換え程度の分析によ
り、遺伝子の順序がｓｔｒ…ｓｐｃ…ＣＡＴであること
が確認された。これらのデータはＣＡＴ遺伝子がｎｍｐ
遺伝子座と同じ様式でｓｔｒおよびｓｐｃマーカーと結
合していることを実証した。このことはｎｍｐ遺伝子座
がＰＩの構造遺伝子であることの強力な証拠を与える。
もう一つの乗り換えに際しては、ＰＩＢ菌株ＭＳ１１を
形質転換するためにＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１ ＤＮＡを
用い、Ｃｍｒを選択した。４５個の形質転換体のうち、
２４個は供与株のＰＩＡを獲得し、１３個は受容株ＰＩ
Ｂを保持し、そして８個は新規ハイブリッドＰＩＡ／Ｐ
ＩＢタンパク質を発現した。これはコロニーイムノブロ
ッティングにより検出された。近接して結合したＣＡＴ
遺伝子を選択するときの供与株ＰＩＡによる受容株ＰＩ
Ｂの置換は、これらの遺伝子の対立遺伝子としての性質
を確証するものであり、そしてハイブリッドタンパク質
が高頻度に出現することは、２つの対立遺伝子間の配列
相同性により遺伝子内組換えが起こることを示唆した。
これらのＰＩハイブリッド菌株の詳細な分析はＭＳ１１
のＰＩＢ配列に関する知識の如何に左右されるので、こ
の配列をクローニングして配列決定した。 ７．２．ＰＩＢ遺伝子のクローニング、配列決定及び発
現 完全無欠な淋菌ＰＩ遺伝子を大腸菌にクローニングする
ことはできないと思われるため、一緒になって完全な遺
伝子配列を含有するものであるＰＩＡについて上記した
クローニング断片の方法を、ＭＳ１１ ＰＩ遺伝子に採
用した。予めハイブリッドＰＩを有するとして特性決定
された菌株ＦＡ６１４９（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎら、Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９−５３３，１９８
６）のＰＩ遺伝子内からのＤＮＡ断片を、クローニング
して配列決定し、そして配列のＰＩＢ部分、遺伝子の開
始点から約３００ｂｐ、にＫｐｎＩ部位が存在すること
が判明した。ＫｐｎＩ部位下流のＰＩＢ遺伝子配列から
誘導されたオリゴヌクレオチドＮＣ１２（第８図）、お
よびこのタンパク質のＮ−末端に対応する遺伝子配列か
ら誘導されたＮＣ１（第１図）を、サザンハイブリッド
形成でのプローブとして用い、ＭＳ１１ ＰＩ遺伝子に
ＫｐｎＩ部位が存在することを確認した。ベクタープラ
スミドｐＧＥＭ−３にクローニングされたＫｐｎＩ／Ｈ
ｉｎｃＩＩ−消化ＭＳ１１ ＤＮＡを含有するＨＢ１０
１コロニーを、これらのオリゴヌクレオチドをプローブ
として探査し、ＮＣ１２とハイブリッド形成するコロニ
ーを検出し、そしてこれらのコロニーがＮＣ１２とハイ
ブリッド形成した１．８ｋｂのＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩ
断片を有するプラスミドを含有することを見いだした。
このプラスミドをｐＵＮＣＨ２２（第８図）と命名し
た。しかし繰り返し試みても、ＮＣ１とハイブリッド形
成するコロニーは検出されなかった。ＮＣ１はサザンハ
イブリッド形成でＭＳ１１ゲノムＤＮＡの７５０ｂｐの
ＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩ断片とハイブリッド形成したた
め、問題点は大きさにあるのではなく、コピー数の多い
ベクターにおいては、ＨＢ１０１に対して致命的である
この断片のＰＩ遺伝子部分の発現の問題である可能性が
高いと思われた。この理由から、プローブとしてオリゴ
ヌクレオチドＮＣ１を用いて、ＭＳ１１ＰＩ遺伝子の残
りの部分をλｇι１１における５４０ｂｐのＨｉｎｆＩ
断片として単離した。このクローンをλｇｔ１１．ＮＣ
１（第８図）と命名した。λｇｔ１１．ＮＣ１の５４０
ｂｐのＨｉｎｆＩ断片およびｐＵＮＣＨ２２のＫｐｎＩ
−Ｓａｕ３ＡＩフラグメントをさらに消化し、サブクロ
ーニングし、配列決定した。この配列を第９図に示す。
この配列から３５０アミノ酸のタンパク質が予想され、
そのうち最初の１９は推定シグナルペプチドである、Ｆ
Ａ１９およびＭＳ１１のＰＩ遺伝子の比較は、８０％の
ヌクレオチド配列相同性を示す。ＰＩＡ（ＦＡ１９）お
よびＰＩＢ（ＭＳ１１）の予想アミノ酸配列の比較を第
１０図に示す。これは長い相同領域が散在する数多くの
有意に相違する領域を示す。淋菌細胞全体に対して生じ
るＰＩ−特異的モノクローナル抗体はＰＩＡとＰＩＢと
の間で全く交差反応性ではないので（Ｋｎａｐｐら、
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５０：４４−４８，１９
８４）、相違領域の一部はおそらくタンパク質の表面に
露出した抗原性の部分に相当する。ＰＩＡの場合と同じ
方法を用いて完全なＰＩＢ遺伝子の発現を達成した
（６．２節）。ＰＩＢ遺伝子プロモーターの−３５およ
び−１０領域間のＮｃｉＩ部位から遺伝子内のＫｐｎＩ
部位までのλｇｔ１１．ＮＣ１挿入ＤＮＡの断片を、Ｈ
ｉｎｃＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたベクターｐＧ
ＥＭ−２内にｐＵＮＣＨ２２の７５０ｂｐのＫｐｎＩ−
Ｓａｕ３ＡＩ断片と一緒に連結させた。この結果、それ
自身のプロモーターを持たないがプラスミドベクター上
のＴ７プロモーターのすぐ下流に完全なＰＩＢコード配
列を生じた。この構築物（ｐＵＮＣＨ２５）をＢＬ２１
（ＤＥ３）に導入し、ＩＰＴＧ存在下に生育させると、
ＰＩＢの発現を検出することができた（第１１図）。プ
ラスミドｐＵＮＣＨ２５を有する生物学的に純粋な大腸
菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに受託番号
６７７７５のもとに寄託されている。 ７．３．ＰＩＡ／Ｂハイブリッド菌株の構築および分析 さらに、ＭＳ１１をＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１ ＤＮＡで
形質転換し（Ｂｉｓｗａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１２９：９８３−９９２，１９７７）、Ｃｍｒを選
択し、イムノブロッティングによりＰＩを検出すること
により、ＰＩＡ／Ｂハイブリッドを構築した。相互乗り
換えにおいて、ＰＩＢを保持しているＭＳ１１のＣｍｒ
形質転換体由来のＤＮＡをＦＡ１９の形質転換に使用
し、Ｃｍｒで選択し前記のようにＰＩを検出した。抗生
物質耐性を表現型として発現させるために、細胞をＧＣ
基礎ブロス中で、あるいは抗生物質を含有する軟寒天上
層を添加した。ＧＣ基礎寒天培地中で５時間インキュベ
ートした。受容株としてＦＡ１９を用い、Ｃｍｒで選択
するときは１μｇ／ｍｌの抗生物質を使用したが、ＭＳ
１１を受容株であるときは１０μｇ／ｍｌを用いた。Ｃ
ａｎｎｏｎらの方法の変法を用いてモノクローナル抗体
の結合について細菌株をアッセイした。ＧＣ基礎ブロス
中の高濃度細胞懸濁液を濾過マニホルドを用いてニトロ
セルロースに移し、クロロホルム蒸気中で溶解させた。
このフィルターを５％粉乳を含有するＴＢＳ（１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ２）に浸漬し、適当な抗体を含有するＴＢＳ中でイン
キュベートし、つぎにＴＢＳ中で洗浄した。二次抗体と
接合した抗マウスＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ
（Ｓｉｇｍａ）中でインキュベートし、さらに洗浄した
後、フィルターをニトロブルーテトラゾリウムおよび５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）を用いて製造業者の指示にしたがって展開
した。使用したモノクローナル抗体は、４Ａ１２，４Ｇ
５，２Ｆ１２，６Ｄ９，５Ｇ９，５Ｄ１（１０），１Ｄ
３（２６）およびＳＭ１０１（２７）（これらは全てＰ
ＩＡ特異的である）、ならびに１Ｆ５，３Ｃ８，２Ｄ４
および２Ｈ１（１０）（これらはＰＩＢ特異的である）
であった。ＳＭ１０１以外の全ての抗体はＭ．Ｔａｍ
（ＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）の厚意により腹水中
で供給され、１：２０００ないし１：１００００の希釈
で用いられた。ＳＭ１０１はＪ．Ｈｅｃｋｅｌｓ（Ｓｏ
ｕｔｈａｍｐｔｏｎ大学）の厚意により提供された。受
容株としてＦＡ１９を用いた３００個の形質転換体のう
ち、３個がハイブリッドＰＩを有した。１３個のハイブ
リッド菌株のうち、５個の異なるハイブリッドＰＩ血清
型が同定された（第Ｉ表）。次にハイブリッドＰＩ遺伝
子のどの部分がＰＩ配列であるか、そしてどれがＰＩＢ
配列であるかを評価するために、多数のＰＩＡ−及びＰ
ＩＢ−特異的オリゴヌクレオチド（第ＩＩ表および第１
０図）を用いるコロニーハイブリッド形成によりハイブ
リッド菌株を分析し、この方法により９個の異なるクラ
スが検出された（第１０図）構造を既知のハイブリッド
ＰＩの血清型の分析により、これらのモノクローナル抗
体についてのエピトープのおよその位置を決定すること
ができた。 クラス１ハイブリッドと反応するＰＩＡ特異的モノクロ
ーナル抗体４Ｇ５、２Ｆ１２およびＳＭ１０１のエピト
ープは、タンパク質のＮ−末端の近く、最初の６０残基
以内に存在するはずである。ハイブリッドクラス１、５
および６の比較は、ＳＭ１０１に対するエピトープが少
なくとも部分的には残基３４と６０の間の領域に存在す
ることが示唆される。Ｎ−末端６０残基はＰＩＡおよび
ＰＩＢ間で有意な相違を含み（第３図、第９図、第１０
図）、これはこれらの抗体の特異性の説明となりうる。
ハイブリッドクラス６−９と反応する６Ｄ９（ＰＩＡ特
異的）のエピトープは、残基１８７から２５０までのタ
ンパク質領域に存在し、この領域もまたＰＩＡおよびＰ
ＩＢの間で有意に異なる領域を含む。４Ａ１２，５Ｇ
９，５Ｄ１および１Ｄ３（すべてＰＩＡ特異的）のエピ
トープは、クラス９のハイブリッドタンパク質において
のみ検出され、したがっておそらくタンパク質のＮ−末
端およびＣ−末端部分の両方を含む複合エピトープであ
る。このことは、タンパク質が比較的に変性されるウェ
スタンブロットではＰＩとよく反応しないという観察に
よって支持される。ＭＳ１１のＰＩＢと反応する４個の
抗体のうち、ハイブリッドクラス７および８と反応する
７Ｆ５のエピトープはＮ−末端６０残基内に位置する
が、３Ｃ８，２Ｄ４および２Ｈ１のエピトープは分岐配
列を含有するタンパク質の中央部、残基１５０から２７
０までの間に存在すると思われ、この部分は長く伸びた
クラス９ハイブリッドタンパク質が３Ｄ８とのみ反応す
ることから、３Ｃ８のエピトープは２Ｄ４および２Ｈ１
のエピトープのわずかに上流に位置する。しかし、２Ｄ
４および２Ｈ１がウエスタンブロットではＰＩＢと反応
しないことから、これらのエピトープは比較的複雑であ
りうる。ハイブリッドＰＩＡ／Ｂ遺伝子を含有してハイ
ブリッドＰＩＡ／Ｂタンパク質を発現する形質転換微生
物ＦＡ６２４８の生物学的に純粋な培養物は、ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに受託番号
５３８０８のもとに寄託されている。 ７．４．考 察 リポーター遺伝子をＰＩ構造遺伝子の近くに挿入した本
研究は、ＰＩＡおよびＰＩＢ構造遺伝子が同じ遺伝子座
の対立遺伝子であることを実証するものであり、この遺
伝子座はすでにｎｍｐとして同定された（Ｃａｎｎｏｎ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４３：８４７−８５
１，１９８０）。淋菌ゲノム上の１個のＰＩ遺伝子の存
在は、天然に存在する菌株がＰＩＡまたはＰＩＢタンパ
ク質のいずれか一方を有し両方を持つことは決してな
く、そしてＰＩ血清型が安定に保持されるとの観察に符
号する。ＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子と推定アミノ酸配列
の比較は高度の相同性を示したが、有意に配列の異なる
領域が確認された。ＰＩハイブリッドは天然には生じな
いが、本発明者らが構築したＰＩハイブリッドはインビ
トロで安定に生存した。しかし、ＰＩＢＮ−末端とのハ
イブリッドＰＩの形成頻度が比較的低く、ＰＩ遺伝子内
で多重乗り換えの起こる頻度が驚異的に高いことは、あ
る種のクラスのハイブリッドＰＩをインビトロ生育した
淋菌が好むのかも知れない。ＰＩハィブリッドの構築お
よび分析によって、本発明者らはタンパク質のいくつか
の表面露出部分のおよその位置を決定することができ、
二次および四次構造の可能性に対する知見が与えられ
た。ＰＩＡおよびＰＩＢの両方のＮ−末端領域は、各タ
ンパク質の中央部にある少なくとも１つの別の領域とと
もに表面に露出しているとと思われる。多くのＰＩＡ特
異的モノクローナル抗体のエピトープはＮ−末端および
Ｃ−末端部分の両方がハイブリッドＰＩ内に存在すると
きにのみ同定されたことから、外層膜内でのＰＩＡの折
り畳み状態はＮ−末端およびＣ−末端部分が表面上で密
接に関連しているような状態かもしれない。外層膜内で
のＰＡのコンフォーメーションに関するこのようなモデ
ルは、非処理の淋菌内でのＰＩのタンパク質加水分解的
切断に基づく先行モデルのいくつかの態様と一致するが
（Ｂｌａｋｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３３：２
１２−２２２，１９８１；Ｊｕｄｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．５４：４０８−４１４，１９８６）、ＰＩ
ＡのＮ−末端およびＰＩＢの中央部分のみが表面に露出
している（Ｂｌａｋｅら、上記；Ｔｅｅｒｌｉｎｋ，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：６３−７６，１９８７）
との既報の示唆とは異なる。 ８．微生物の寄託 列挙したプラスミドを有する下記の大腸菌株は、ｔｈｅ
Ａｇｒｉｃｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ），Ｐｅｏ
ｒｉａ，ＩＬまたはｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ，ＭＤに寄託され、表記の受託番号が付与され
ている。 本発明は寄託された菌株により範囲を限定されるもので
はない。なぜならば各菌株は本発明の一態様の一つの説
明として意図されるからであり、機能的に同等な全ての
細胞系は本発明の範囲を包含される。実際、ここに示さ
れかつ記載されたことに加えて本発明を種々変更するこ
とは、前記記載から当業者に明らかになるであろう。こ
のような変更は添付の請求の範囲内に包含されるものと
する。また、ヌクレオチドについて与えられた全ての塩
基対の大きさは概数であり、説明の目的で用いられるこ
とは当然のことである。
【図１】第１図：Ｒ１０株のＰＩの残基１−１２のアミ
ノ酸配列、縮重塩基を含むコード化ｍＲＮＡ、および合
成されたオリゴヌクレオチド。縮重が存在する場合は、
塩基配列の決定がなされた他の淋菌遺伝子からのコドン
利用データに基づいて塩基配列を選択した。
ノ酸配列、縮重塩基を含むコード化ｍＲＮＡ、および合
成されたオリゴヌクレオチド。縮重が存在する場合は、
塩基配列の決定がなされた他の淋菌遺伝子からのコドン
利用データに基づいて塩基配列を選択した。
【図２】第２図：ＰＩ遺伝子部分を含むＦＡ１９ゲノム
ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩおよびＴａｑＩ断片。この断片を
ベクタープラスミドｐＧＥＭ−２にクローン化して、こ
こに示す名称の組換えプラスミドを得た。ゲノム上のＰ
Ｉコード領域の相対的な位置は断片の上の空白ボックス
で示し（斜線ボックスはＮ末端シグナル配列に相当す
る）、オリゴヌクレオチドプローブの相対的位置を断片
の下に示す。
ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩおよびＴａｑＩ断片。この断片を
ベクタープラスミドｐＧＥＭ−２にクローン化して、こ
こに示す名称の組換えプラスミドを得た。ゲノム上のＰ
Ｉコード領域の相対的な位置は断片の上の空白ボックス
で示し（斜線ボックスはＮ末端シグナル配列に相当す
る）、オリゴヌクレオチドプローブの相対的位置を断片
の下に示す。
【図３】第３図：ＦＡ１９のＰＩ遺伝子のＤＮＡ配列。
予測されるアミノ酸配列をＤＮＡ配列の上に示し、そし
てリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、およびｐＵＮＣ７の
作製に用いられるＴａｑＩおよびＳａｕ３ＡＩ部位、お
よびＨａｅＩＩＩ部位（−３５および−１０）が示され
る。各行の最後の塩基の番号を右側に示す。
予測されるアミノ酸配列をＤＮＡ配列の上に示し、そし
てリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、およびｐＵＮＣ７の
作製に用いられるＴａｑＩおよびＳａｕ３ＡＩ部位、お
よびＨａｅＩＩＩ部位（−３５および−１０）が示され
る。各行の最後の塩基の番号を右側に示す。
【図４】第４図：Ｎ．ゴノロエアエの主要な外層膜タン
パク質、ＰＩ、ＰＩＩおよびＰＩＩＩ、並びに大腸菌ポ
ーリンＯｍｐＦおよびＯｍｐＣのハイドロパシー（ｈｙ
ｄｒｏｐａｔｈｙ）パターン；ｓｐ−シグナルペプチ
ド；ａ．ａ．−アミノ酸残基。
パク質、ＰＩ、ＰＩＩおよびＰＩＩＩ、並びに大腸菌ポ
ーリンＯｍｐＦおよびＯｍｐＣのハイドロパシー（ｈｙ
ｄｒｏｐａｔｈｙ）パターン；ｓｐ−シグナルペプチ
ド；ａ．ａ．−アミノ酸残基。
【図５】第５図：ｐＵＮＣ７の作製工程図。ＰＩ遺伝子
プロモーターの−３５および−１０領域間の好都合なＨ
ａｅＩＩＩ部位により−３５領域および上流配列を除去
でき、次にＰＩ遺伝子をファージＴ７プロモーターの制
御下にベクタープラスミドｐＧＥＭ−２に挿入した。太
い線はｐＧＥＭ−２ ＤＮＡを、そして細い線はＦＡ１
９ ＤＮＡを表す。ＰＩ’−ＰＩ遺伝子部分（点線はこ
の遺伝子の欠失セグメントの方向を示す）；Ｐｒ７，−
ファージＴ７プロモーター；ＭＣＳ−多重クローニング
部位；制限酵素部位：Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ、Ｈ−ＨａｅＩ
ＩＩ、Ｂ−ＢａｍＨＩ、（Ｈ）−ＨａｅＩＩＩ／Ｈｉｎ
ｃＩＩ接合点（部位は存在せず）、Ｔ−ＴａｑＩ。
プロモーターの−３５および−１０領域間の好都合なＨ
ａｅＩＩＩ部位により−３５領域および上流配列を除去
でき、次にＰＩ遺伝子をファージＴ７プロモーターの制
御下にベクタープラスミドｐＧＥＭ−２に挿入した。太
い線はｐＧＥＭ−２ ＤＮＡを、そして細い線はＦＡ１
９ ＤＮＡを表す。ＰＩ’−ＰＩ遺伝子部分（点線はこ
の遺伝子の欠失セグメントの方向を示す）；Ｐｒ７，−
ファージＴ７プロモーター；ＭＣＳ−多重クローニング
部位；制限酵素部位：Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ、Ｈ−ＨａｅＩ
ＩＩ、Ｂ−ＢａｍＨＩ、（Ｈ）−ＨａｅＩＩＩ／Ｈｉｎ
ｃＩＩ接合点（部位は存在せず）、Ｔ−ＴａｑＩ。
【図６】第６図：ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるｐＵＮＣ
７上のＰＩ遺伝子の発現。Ａ：全細胞溶解物の１５％ゲ
ル上におけるＮａＤｏｄＳＯ４−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動、クーマシーブルーで染色。マーカータンパ
ク質の寸法を左側に示す。ＰＩが示されており、そして
中央の矢印はレーン４では明らかに失われているタンパ
ク質を示す。Ｂ：６種類のＰＩＡ ＭＡｂを用いて検索
したＡにおけるゲルのウエスターンブロットのオートラ
ジオグラフ。レーン１：ＦＡ１９；レーン２：ＩＰＴＧ
なしで１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ
７；レーン３：ＩＰＴＧを用いて３時間増殖させたＢＬ
２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レーン４：ＩＰＴＧを用い
て１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；
レーン５：ＩＰＴＧなしで１６時間増殖させたＢＬ２１
（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２；レーン６：ＩＰＴＧを用いて
１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２。
７上のＰＩ遺伝子の発現。Ａ：全細胞溶解物の１５％ゲ
ル上におけるＮａＤｏｄＳＯ４−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動、クーマシーブルーで染色。マーカータンパ
ク質の寸法を左側に示す。ＰＩが示されており、そして
中央の矢印はレーン４では明らかに失われているタンパ
ク質を示す。Ｂ：６種類のＰＩＡ ＭＡｂを用いて検索
したＡにおけるゲルのウエスターンブロットのオートラ
ジオグラフ。レーン１：ＦＡ１９；レーン２：ＩＰＴＧ
なしで１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ
７；レーン３：ＩＰＴＧを用いて３時間増殖させたＢＬ
２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レーン４：ＩＰＴＧを用い
て１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；
レーン５：ＩＰＴＧなしで１６時間増殖させたＢＬ２１
（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２；レーン６：ＩＰＴＧを用いて
１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２。
【図７】第７図：ＦＡ１９のＰＩ構造遺伝子に隣接した
ｍＴｎ３− 表す。ｍＴｎ３−ＣＡＴは長さが１．６６ｋｂてあり、
尺度に応じて描かれていない。ＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１
のゲノム上のＰＩ遺伝子の位置は線上の空白ボックスで
示され、斜線ボックスはシグナル配列を示す。ＰＩ’：
クローン化構築物中に存在するＰＩ遺伝子部分。制限酵
素部位：Ｎ−ＮｏｔＩ；Ｂ−ＢａｍＨＩ；Ｓ−Ｓａｕ３
ＡＩ。
ｍＴｎ３− 表す。ｍＴｎ３−ＣＡＴは長さが１．６６ｋｂてあり、
尺度に応じて描かれていない。ＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１
のゲノム上のＰＩ遺伝子の位置は線上の空白ボックスで
示され、斜線ボックスはシグナル配列を示す。ＰＩ’：
クローン化構築物中に存在するＰＩ遺伝子部分。制限酵
素部位：Ｎ−ＮｏｔＩ；Ｂ−ＢａｍＨＩ；Ｓ−Ｓａｕ３
ＡＩ。
【図８】第８図：ＰＩ遺伝子の配列決定のためにクロー
ン化したＭＳ１１ ＤＮＡの断片。ＰＩ遺伝子の位置は
線上の空白ボックスで示され、斜線ボックスはシグナル
配列を示す。オリゴヌクレオチドＮＣ１およびＮＣ１２
の配列の位置が示してある。大きい方の断片はベクター
プラスミドｐＧＥＭ−３にクローン化され、小さい方の
断片はλｇｔ１１中にクローン化して、表示した名称の
構築物となした。制限酵素部位：Ｈｆ−ＨｉｎｆＩ；Ｋ
−ＫｐｎＩ；Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ；Ｈｃ−ＨｉｎｃＩＩ。
ン化したＭＳ１１ ＤＮＡの断片。ＰＩ遺伝子の位置は
線上の空白ボックスで示され、斜線ボックスはシグナル
配列を示す。オリゴヌクレオチドＮＣ１およびＮＣ１２
の配列の位置が示してある。大きい方の断片はベクター
プラスミドｐＧＥＭ−３にクローン化され、小さい方の
断片はλｇｔ１１中にクローン化して、表示した名称の
構築物となした。制限酵素部位：Ｈｆ−ＨｉｎｆＩ；Ｋ
−ＫｐｎＩ；Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ；Ｈｃ−ＨｉｎｃＩＩ。
【図９】第９図；ＭＳ１１のＰＩＢ遺伝子のＤＮＡ配
列。予測されるアミノ酸配列はＤＮＡ配列の上に示して
あり、シグナルペプチドも示される。推定プロモーター
配列（−３５および−１０）およびリボソーム結合部位
（ＲＢＳ）も示され、関連する制限酵素部位も同様に示
される。各行の最後の塩基の番号を右側に示す。Ｒ１０
のＰＩＢ配列（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ等、ＰＮＡＳ Ｕ
ＳＡ ８４：８１３５−８１３９，１９８７）との相違
を示すために、塩基（制限酵素部位を構成するものを除
く）には下線が引いてあり、アミノ酸は丸で囲ってあ
る。
列。予測されるアミノ酸配列はＤＮＡ配列の上に示して
あり、シグナルペプチドも示される。推定プロモーター
配列（−３５および−１０）およびリボソーム結合部位
（ＲＢＳ）も示され、関連する制限酵素部位も同様に示
される。各行の最後の塩基の番号を右側に示す。Ｒ１０
のＰＩＢ配列（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ等、ＰＮＡＳ Ｕ
ＳＡ ８４：８１３５−８１３９，１９８７）との相違
を示すために、塩基（制限酵素部位を構成するものを除
く）には下線が引いてあり、アミノ酸は丸で囲ってあ
る。
【図１０】第１０図：ＦＡ１９ ＰＩＡおよびＭＳ１１
ＰＩＢのアミノ酸配列の比較、並びにハイブリッドＰ
Ｉ遺伝子の構造。ＰＩＡ遺伝子配列は白の棒で、そして
ＰＩＢは黒の棒で示す。ＰＩ遺伝子類の上と下はアミノ
酸配列の比較であり、垂直線は１個の相違に相当し、黒
のブロックは連続して広がった相違に相当する。アミノ
酸残基の数は上の目盛で示され、そして塩基対の数は下
の目盛で示される。ハイブリッドを分析するのに使用さ
れたオリゴヌクレオチドはこれらの遺伝子の間に示して
あり、点線は他の遺伝子上の等しい位置を示す。ハイブ
リッド遺伝子構造（クラス１−９）を下に示し、交差が
起こったオリゴヌクレオチド配列間の領域を傾斜域で表
す。種々のハイブリッドクラスのＰＩ血清型を第１表に
示す。
ＰＩＢのアミノ酸配列の比較、並びにハイブリッドＰ
Ｉ遺伝子の構造。ＰＩＡ遺伝子配列は白の棒で、そして
ＰＩＢは黒の棒で示す。ＰＩ遺伝子類の上と下はアミノ
酸配列の比較であり、垂直線は１個の相違に相当し、黒
のブロックは連続して広がった相違に相当する。アミノ
酸残基の数は上の目盛で示され、そして塩基対の数は下
の目盛で示される。ハイブリッドを分析するのに使用さ
れたオリゴヌクレオチドはこれらの遺伝子の間に示して
あり、点線は他の遺伝子上の等しい位置を示す。ハイブ
リッド遺伝子構造（クラス１−９）を下に示し、交差が
起こったオリゴヌクレオチド配列間の領域を傾斜域で表
す。種々のハイブリッドクラスのＰＩ血清型を第１表に
示す。
【図１１】第１１図：全細胞溶解物の１５％ゲル上での
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマ
シーブルー染色を用いて検出した、ＢＬ２１（ＤＥ３）
中におけるｐＵＮＣＨ２５上のＰＩＢ遺伝子の発現。Ｐ
Ｉタンパク質バンドが示してある。レーン１：ＭＳ１
１；レーン２：ＩＰＴＧなしで増殖させたＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）ｐＵＮＣＨ２５；レーン３−５：ＩＰＴＧを用い
て増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣＨ２５。ＩＰ
ＴＧ（５０μｇ／ｍｌ）は下記細胞密度すなわちレーン
３：５×１０８細胞／ｍｌ；レーン４：１０９細胞／ｍ
ｌ；レーン５：２×１０９細胞／ｍｌで増殖培地に加え
た。ＰＩの発現は生長周期の早期に培養物が誘導された
場合に最大である。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマ
シーブルー染色を用いて検出した、ＢＬ２１（ＤＥ３）
中におけるｐＵＮＣＨ２５上のＰＩＢ遺伝子の発現。Ｐ
Ｉタンパク質バンドが示してある。レーン１：ＭＳ１
１；レーン２：ＩＰＴＧなしで増殖させたＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）ｐＵＮＣＨ２５；レーン３−５：ＩＰＴＧを用い
て増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣＨ２５。ＩＰ
ＴＧ（５０μｇ／ｍｌ）は下記細胞密度すなわちレーン
３：５×１０８細胞／ｍｌ；レーン４：１０９細胞／ｍ
ｌ；レーン５：２×１０９細胞／ｍｌで増殖培地に加え
た。ＰＩの発現は生長周期の早期に培養物が誘導された
場合に最大である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｇ０１Ｎ 33/571 Ｇ０１Ｎ 33/571 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:36） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:36） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (53)
- 【請求項１】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株のプ
ロテインＩＢの全長のアミノ酸配列をコードする実質的
に精製された核酸分子であって、該アミノ酸配列が図９
に示される核酸分子。 - 【請求項２】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株のプ
ロテインＩＢのアミノ酸配列をコードする実質的に精製
された核酸分子であって、該アミノ酸配列が図９に示さ
れる核酸分子。 - 【請求項３】図９に示される核酸配列を有する、ナイセ
リア・ゴノロエアエＭＳ１１株のプロテインＩＢの実質
的に精製されたｃＤＮＡ。 - 【請求項４】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株のプ
ロテインＩＢの少なくとも一部のアミノ酸配列をコード
する請求の範囲１、２又は３項の核酸分子を含む組換え
ベクターであって、該ベクターは宿主細胞中で安定に保
持され、かつ、タンパク質発現は誘導可能なプロモータ
ーによって制御されているベクター。 - 【請求項５】プラスミドである請求の範囲第４項の組換
えベクター。 - 【請求項６】プラスミドがｐＧＥＭ−２から誘導される
請求の範囲第４項の組換えベクター。 - 【請求項７】プラスミドがｐＵＮＣＨ２５である請求の
範囲第６項の組換えベクター。 - 【請求項８】請求の範囲第４項のベクターを含む宿主生
物。 - 【請求項９】請求の範囲第４項のベクターを含有する単
細胞生物。 - 【請求項１０】請求の範囲第５項のベクターを含有する
単細胞生物。 - 【請求項１１】請求の範囲第７項のベクターを含有する
単細胞生物。 - 【請求項１２】ＡＴＣＣ番号６７７７５と同一の特性を
有する請求の範囲第１１項の単細胞生物。 - 【請求項１３】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株の
全長のＰＩＢタンパク質の生産方法であって、 （ａ）全長のＰＩＢタンパク質をコードするＤＮＡ配列
を有する複製可能な組換えベクターを含む宿主細胞を、
インデューサーの非存在下で培養し、配列は誘導可能な
プロモーターによって制御され、宿主細胞内で安定に保
持されるものであり、 （ｂ）それに続いて、全長のＰＩＢタンパク質が選択的
に発現されるようにインデューサーの存在下で宿主細胞
を培養する、ことを含む方法。 - 【請求項１４】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株の
ＰＩＢペプチドの生産方法であって、 （ａ）ＰＩＢペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する
複製可能な組換えベクターを含む宿主細胞を、インデュ
ーサーの非存在下で培養し、配列は誘導可能なプロモー
ターによって制御され、宿主細胞内で安定に保持される
ものであり、 （ｂ）それに続いて、ＰＩＢペプチドが選択的に発現さ
れるようにインデューサーの存在下で宿主細胞を培養す
る、ことを含む方法。 - 【請求項１５】ベクターがプラスミドである請求の範囲
第１３又は１４項の方法。 - 【請求項１６】プラスミドが、図９に示す配列又はそれ
らの一部分、突然変異体若しくは組換え体を含むもので
ある請求の範囲第１５項の方法。 - 【請求項１７】プラスミドがｐＧＥＭ−２から誘導され
る請求の範囲第１６項の方法。 - 【請求項１８】プラスミドがｐＵＮＣＨ２５である請求
の範囲第１７項の方法。 - 【請求項１９】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株の
実質的に精製されたＰＩＢポリペプチド組成物であっ
て、該組成物が実質的に他のナイセリア・ゴノロエアエ
タンパク質を含まない組成物。 - 【請求項２０】請求の範囲１３、１４、１５、１６、１
７又は１８項の方法によって生産されたポリペプチド組
成物であって、該組成物が実質的に他のナイセリア・ゴ
ノロエアエタンパク質を含まない組成物。 - 【請求項２１】請求の範囲第１３又１４項の方法によっ
て生産された、実質的に精製されたポリペプチド組成物
であって、ＰＩＢポリペプチドをコードする核酸配列
が、図９に示された核酸配列又はその相補配列は選択的
にハイブリダイズする組成物。 - 【請求項２２】ナイセリア・ゴノロエアエのプロテイン
ＩＡとプロテインＩＢとのキメラアミノ酸配列をコード
する、実質的に精製された核酸配列分子。 - 【請求項２３】ナイセリア・ゴノロエアエの少なくとも
一部のプロテインＩＡ又はプロテインＩＢのアミノ酸配
列をコードする請求の範囲２２項の核酸分子を含む組換
えベクターであって、該ベクターは宿主細胞中で安定に
保持され、かつ、タンパク質発現は誘導可能なプロモー
ターによって制御されているベクター。 - 【請求項２４】請求の範囲第２２項の配列を含有する宿
主生物。 - 【請求項２５】請求の範囲第２３項のベクターを含有す
る単細胞生物。 - 【請求項２６】ナイセリア・ゴノロエアエのプロテイン
ＩＡ及びプロテインＩＢの少なくとも一つの免疫反応性
及び抗原決定基を含む、請求の範囲第２２項のキメラハ
イブリッドタンパク質。 - 【請求項２７】請求の範囲第１３又は１４項の方法によ
り生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを、医
薬上許容されうる担体と組み合わせて含有する、ナイセ
リア・ゴノロエアエ感染症の予防又は治療のためのワク
チン組成物。 - 【請求項２８】請求の範囲第１６項の方法により生産さ
れた免疫原的に有効な量のポリペプチドを、医薬上許容
されうる担体と組み合わせて含有する、ナイセリア・ゴ
ノロエアエ感染症の予防又は治療のためのワクチン組成
物。 - 【請求項２９】請求の範囲第１８項の方法により生産さ
れた免疫原的に有効な量のポリペプチドを、医薬上許容
されうる担体と組み合わせて含有する、ナイセリア・ゴ
ノロエアエ感染症の予防又は治療のためのワクチン組成
物。 - 【請求項３０】請求の範囲第２１又は２６項の免疫原的
に有効な量のポリペプチドを、医薬上許容されうる担体
と組み合わせて含有する、ナイセリア・ゴノロエアエ感
染症の予防又は治療のためのワクチン組成物。 - 【請求項３１】請求の範囲第１３又は１４項の方法によ
り生産された、医療に使用するためのポリペプチド。 - 【請求項３２】請求の範囲第１６項の方法により生産さ
れたポリペプチド。 - 【請求項３３】請求の範囲第１８項の方法により生産さ
れたポリペプチド。 - 【請求項３４】請求の範囲第２１項の方法により生産さ
れたポリペプチド。 - 【請求項３５】ＭＳ１１のプロテインＩＢをコードする
ナイセリア・ゴノロエアエのＤＮＡ配列の一部分と相補
的であり、かつ、これとハイブリッド形成できるＤＮＡ
配列を含有することを特徴とする、ナイセリア・ゴノロ
エアエの同定に有用なＤＮＡプローブ。 - 【請求項３６】配列：５’ＡＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴＧＡ
ＴＧＧＣ３’を有する請求の範囲第３５項のＤＮＡプロ
ーブ。 - 【請求項３７】 を有する請求の範囲第３５項のＤＮＡプローブ。
- 【請求項３８】分析的に検出可能な試薬で標識された請
求の範囲第３５、３６又は３７項のプローブ。 - 【請求項３９】プロテインＩＢをコードするナイセリア
・ゴノロエアエのＤＮＡ配列の一部分と相補的であり、
かつ、これとハイブリッド形成できるＤＮＡ配列を含有
することを特徴とする、ナイセリア・ゴノロエアエの同
定に有用なＤＮＡプローブ。 - 【請求項４０】配列：５’ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧ
ＣＡＣＴ３’を有する請求の範囲第３９項のＤＮＡプロ
ーブ。 - 【請求項４１】配列：５’ＣＡＡＧＧＴＧＣＣＴＣＣＧ
ＴＣＧＣ３’を有する請求の範囲第３９項のＤＮＡプロ
ーブ。 - 【請求項４２】配列：５’ＧＣＡＧＣＧＴＡＣＡＡＴＡ
ＣＧＡＣ３’を有する請求の範囲第３９項のＤＮＡプロ
ーブ。 - 【請求項４３】配列：５’ＡＧＧＣＡＣＴＧＴＴＧＡＴ
ＡＧＴＧＣ３’を有する請求の範囲第３９項のＤＮＡプ
ローブ。 - 【請求項４４】分析的に検出可能な試薬で標識された請
求の範囲第３９、４０、４１、４２又は４３項のプロー
ブ。 - 【請求項４５】ナイセリア・ゴノロエアエを含有する疑
いのある検体中からナイセリア・ゴノロエアエを検出す
る方法であって、 （ａ）プロテインＩをコードするナイセリア・ゴノロエ
アエのＤＮＡゲノムの一部分と相補的であるプローブ
を、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成を促進する条件下
で該検体と接触させ、そして、 （ｂ）形成されたハイブリッドすべてを検出し、それに
よって該検体中のナイセリア・ゴノロエアエの存在を検
出する、ことを含む方法。 - 【請求項４６】プローブが請求の範囲第３６項のプロー
ブである請求の範囲第４５項の方法。 - 【請求項４７】プローブが請求の範囲第３７項のプロー
ブである請求の範囲第４５項の方法。 - 【請求項４８】プロテインＩがプロテインＩＢである請
求の範囲第４５項の方法。 - 【請求項４９】プローブが請求の範囲第４０、４１、４
２又は４３項のプローブである請求の範囲第４８項の方
法。 - 【請求項５０】プローブが分析的に検出可能な試薬で標
識された請求の範囲第４５、４６、４７、又は４８項の
方法。 - 【請求項５１】プローブが分析的に検出可能な試薬で標
識された請求の範囲第４９項の方法。 - 【請求項５２】請求の範囲第３５〜４４項のいずれか１
項のプローブのうち少なくとも一つを含む診断テストキ
ット。 - 【請求項５３】ＡＴＣＣ ５３８０８と同一の特性を有
するナイセリア・ゴノロエアエ菌株。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12472787A | 1987-11-24 | 1987-11-24 | |
| US24275888A | 1988-09-09 | 1988-09-09 | |
| US242758 | 1988-09-09 | ||
| US124727 | 1988-09-09 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1500595A Division JP2803058B2 (ja) | 1987-11-24 | 1988-11-23 | 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10234388A true JPH10234388A (ja) | 1998-09-08 |
| JP3388171B2 JP3388171B2 (ja) | 2003-03-17 |
Family
ID=26822891
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1500595A Expired - Lifetime JP2803058B2 (ja) | 1987-11-24 | 1988-11-23 | 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造 |
| JP04415498A Expired - Lifetime JP3388171B2 (ja) | 1987-11-24 | 1998-01-22 | 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1500595A Expired - Lifetime JP2803058B2 (ja) | 1987-11-24 | 1988-11-23 | 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造 |
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|---|---|
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| EP (2) | EP0395706B1 (ja) |
| JP (2) | JP2803058B2 (ja) |
| KR (1) | KR970011309B1 (ja) |
| AT (1) | ATE169958T1 (ja) |
| AU (1) | AU629807B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340506C (ja) |
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| DK (1) | DK175831B1 (ja) |
| FI (1) | FI102189B1 (ja) |
| NO (1) | NO302622B1 (ja) |
| WO (1) | WO1989004873A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003525049A (ja) * | 2000-02-28 | 2003-08-26 | カイロン エセ．ピー．アー． | ナイセリア属のタンパク質のハイブリッド発現 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340506C (en) * | 1987-11-24 | 1999-04-20 | Nicholas H. Carbonetti | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines |
| US7118757B1 (en) * | 1988-12-19 | 2006-10-10 | Wyeth Holdings Corporation | Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine |
| ES2127217T3 (es) * | 1991-03-14 | 1999-04-16 | Imclone Systems Inc | Epitopos de porina hibridos de recombinacion. |
| AU7408494A (en) * | 1993-07-30 | 1995-02-28 | University Of North Carolina At Chapel Hill, The | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines in e. coli and salmonella |
| US7252828B2 (en) | 1998-07-15 | 2007-08-07 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections |
| ID30407A (id) * | 1999-05-13 | 2001-11-29 | American Cyanamid Co | Formulasi-formulasi kombinasi bahan penambah |
| ATE435028T1 (de) * | 1999-09-30 | 2009-07-15 | Isis Innovation | Impfstoff gegen neisseria infektion |
| SK5482003A3 (en) * | 2000-11-10 | 2004-03-02 | Wyeth Corp | Adjuvant combination formulations |
| WO2004043407A2 (en) | 2002-11-12 | 2004-05-27 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for treating staphylococcal infections |
| WO2004043405A2 (en) | 2002-11-12 | 2004-05-27 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections |
| SI1745075T1 (sl) | 2004-04-21 | 2013-07-31 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Poli-N-acetilglukozamin (PNAG/dPNAG) vezavni peptidi in postopki za njihovo uporabo |
| US7037698B2 (en) | 2004-05-19 | 2006-05-02 | Amano Enzyme Inc. | Pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase |
| KR101785373B1 (ko) | 2008-07-21 | 2017-10-16 | 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. | 합성 베타-1,6 글루코사민 올리고당에 관한 방법 및 조성물 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| US4203971A (en) * | 1978-03-23 | 1980-05-20 | Government Of The United States | Neisseria gonorrhoeae vaccine |
| DE2814039C3 (de) * | 1978-03-31 | 1981-02-19 | Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf), 3300 Braunschweig | Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien |
| US4351761A (en) * | 1978-05-15 | 1982-09-28 | Research Corporation | Purified antigen to test for Neisseria gonorrhoeae antibodies |
| US4288557A (en) * | 1978-10-12 | 1981-09-08 | Merck & Co., Inc. | Antigenic complex from N. gonorrhoeae |
| US4220638A (en) * | 1978-10-12 | 1980-09-02 | Merck & Co., Inc. | Antigenic complex from N. Gonorrhoeae |
| US4239749A (en) * | 1979-09-27 | 1980-12-16 | United States Of America | Neisseria gonorrhoeae vaccine |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| WO1983003354A1 (en) * | 1982-03-30 | 1983-10-13 | Us Army | Neisseria gonorrhoeae vaccine |
| EP0178863A1 (en) * | 1984-10-15 | 1986-04-23 | Schering Corporation | Novel expression systems utilizing bacteriophage T7 promoters and gene sequences |
| US4681761A (en) * | 1985-10-24 | 1987-07-21 | State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University | Major iron-regulated protein of Neisseria gonorrhoeae and its use as vaccine |
| US4786592A (en) * | 1986-06-18 | 1988-11-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Neisseria gonorrhoeae lectin useful as a vaccine and diagnostic marker and means for producing this lectin |
| CA1340506C (en) * | 1987-11-24 | 1999-04-20 | Nicholas H. Carbonetti | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines |
-
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Cited By (2)
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